CN101283998B - 溴酚类化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗恶性肿瘤的药物，具体地说是溴酚类化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。本发明溴酚化合物及其钠盐、酯和醚等衍生物对蛋白质酪氨酸激酶有较好的抑制作用，可用于高表达C-kit受体的恶性肿瘤的防治。

Description

溴酚类化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及治疗恶性肿瘤的药物，具体地说是海洋溴酚类化合物的制备方法、药理活性、用途及药学上可接受的盐、酯、醚和其它明显的化学等价物；该化合物及其衍生物作为蛋白质酪氨酸激酶(protein tyrosinekinase，PTK)抑制剂，可用于治疗各种高表达C-kit受体的恶性肿瘤。

背景技术

随着分子肿瘤学的发展，抗肿瘤药物的研究也从传统的细胞毒药物趋向作用于分子靶点的新型药物。蛋白酪氨酸激酶(PTK)是癌症治疗的标靶之一，原癌基因C-kit是HZ4猫科肉瘤病毒kit癌基因的同源物，位于4号染色体长臂上，编码145-165kDa跨膜受体(CD117)，具有酪氨酸激酶活性。它的产物是III型酪氨酸蛋白激酶生长因子受体，其结构类似于巨噬细胞集落刺激因子和血小板衍生物生长因子受体，属免疫球蛋白超家族成员，具有胞外5个免疫球蛋白样类似结构的配体结合区、跨膜区、膜内近膜区和酪氨酸蛋白激酶区。在正常组织中，C-kit蛋白在肥大细胞、间质细胞、黑素细胞和乳腺上皮细胞表达。C-kit信号通路的自分泌和旁分泌刺激参与人肿瘤的发生，并在多种肿瘤中起到癌基因的作用。C-kit蛋白是生长因子和干细胞因子(SCF)受体，它和配体干细胞因子间的相互作用可激活内在的酪氨酸激酶，随之使细胞内蛋白磷酸化，导致细胞内信号传导途径的激活。原癌基因C-kit突变会引起C-kit蛋白的胞外段或胞内段发生变化，导致C-kit蛋白受体持续开放，各种底物蛋白不断自身磷酸化，使得调节细胞分化、增殖、凋亡、趋化和粘附等特性的传导信号级联释放并扩大，通过该途径促进了细胞生长，抑制了细胞凋亡，细胞正常生物学特性消失而发展为肿瘤细胞。C-kit的致癌潜能已经在许多实验中得到证实，Hines等发现，转染了C-kit的MCF-7乳腺癌细胞系在培养基中的生长及增殖速率增快，而且这种增殖可被抗C-kit抗体所阻抑；Caruana等对转染了C-kit基因的重组NIH3T3成纤维细胞进行培养，发现C-kit的活化可促进细胞增殖并且产生一个变异的表现型，这已经在细胞克隆及裸鼠肿瘤模型中得到了证实。近年来，越来越多的研究者研究关于把C-kit受体作为分子靶治疗高表达C-kit受体的肿瘤，寻找小分子蛋白酪氨酸激酶抑制剂，从而开发高效的新型抗癌药物。

从现代药物研究开发的历史可见，每次创新药物的开发应用，首先来自某类新型天然先导化合物的发现，海洋是生命的起源地，在海洋独特的生态环境中，大多海藻能产生一些很有特色的活性物质。发明人从一种海洋红藻中得到一个结构新颖的溴酚类化合物，活性测试表明其对PTK酶有很强的抑制活性，可用于高表达C-kit受体的恶性肿瘤的防治，包括胃肠道间质瘤(GIST)、肥大细胞增生型白血病、生殖细胞肿瘤、小细胞肺癌、急性白血病、成神经细胞瘤、黑色素瘤、卵巢癌和乳腺癌等。

发明内容

本发明目的是提供了一种溴酚类药物在制备治疗高表达C-kit受体恶性肿瘤药物中的应用，溴酚化合物及其钠盐、酯和醚等衍生物对蛋白质酪氨酸激酶有较好的抑制作用，可用于高表达C-kit受体的恶性肿瘤的防治。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种具有蛋白质酪氨酸激酶(PTK)抑制活性的海洋溴酚类化合物及其药物学上可接受的盐、酯、醚和其它明显的化学等价物，可用于高表达C-kit受体的恶性肿瘤的防治。

溴酚化合物结构如下：

3-(2，3--二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃

3-(2，3-dibromo-4，5-dihydroxy-phenyl)-4-bromo-5，6-dihydroxy-1，3-dihydroiso-benzofuran

溴酚化合物的提取、分离及结构鉴定：

风干的小粘膜藻样品粉碎后用95％乙醇提取，提取液减压浓缩；浓缩物用蒸馏水悬浮后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩。乙酸乙酯萃取部位进行硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮梯度洗脱，直至二者体积比为1：1，改用氯仿-甲醇梯度洗脱，最后用95％乙醇洗脱，薄层色谱检查，合并成分相似的洗脱液，减压浓缩得24个部分L₁～L₂₄。L₁₁-L₁₅[石油醚：丙酮＝5：1]洗脱部分经过Sephadex LH-20色谱、硅胶色谱和反相HPLC等分离纯化技术得到纯化合物compound1，经波谱分析，此化合物为3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃(中文)；3-(2，3-dibromo-4，5-dihydroxy-phenyl)-4-bromo-5，6-dihydroxy-1，3-dihydroiso-benzofuran(英文)。

上述化合物具有以下理化特性：

红色粉末(Me₂CO)，C₁₄H₉Br₃O₅，Mp：132～134℃，

+6°(MeOH，c0.16)；HREIMS m/z493.7971(calcd.for C₁₄H₉ ⁷⁹Br₃O₅，493.8000)；EIMS m/z500/498/496/494[M]⁺(8/36/35/10％)，297/295/293(35/77/40)，231/229(100/98)；IR 

cm^-1:3415，3386，2866，1595，1464，1408，1358，1308，1277，1163，1024，858,812；¹H-NMR(Me₂CO-d₆，500MHz)δ：6.88(1H，s，H-6′)，6.45(1H，s，H-7)，6.31(1H，s，H-6)，5.03(1H，d，J＝12.0Hz，H-7′a)，4.94(1H，d，J＝12.0Hz，H-7′b)；¹³C-NMR(Me₂CO-d₆，125MHz)δ：147.0(s，C-5′)，145.4(s，C-5)，145.3(s，C-4)，143.5(s，C-4′)，133.5(s，C-1′)，133.2(s，C-1)，132.8(s，C-2′)，117.5(s，C-2)，115.2(d，C-6)，113.8(s，C-3)，107.5(d，C-6′)，105.0(s，C-3′)，87.9(d，C-7)，73.5(t，C-7′)。

酪氨酸激酶活性抑制活性测试：

采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)，受体激酶为C-kit，阳性对照药物Glivic(格列卫)。

细胞的恶性转化及生长与细胞中酪氨酸激酶表达水平有关，酪氨酸激酶抑制剂能够阻断那些存在酪氨酸激酶过量表达及活性增加的肿瘤细胞的生长，抑制肿瘤细胞的增殖。大多数细胞生长因子受体含有酪氨酸激酶的肽链序列，故这类受体通称为酪氨酸激酶受体。根据肽链序列的相似性及结构特点，这些受体被分成若干家族：第1类以上皮生长因子受体(EGFR)为代表，此类受体的高表达常见于上皮细胞肿瘤；第2类为胰岛素受体家族，包括胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体(IGF-R)和胰岛素相关受体(IRR)等，在血液细胞肿瘤中常见此类受体的高表达；第3类为血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)家族，包括PDGFRα，PDGFβ，克隆刺激因子(CSF-1a)，C-kit等，此类受体在脑肿瘤和血液细胞肿瘤等中常见高表达；第4类为纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族，包括有FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4和角化细胞生长因子受体等，此类受体在血管生成方面起重要作用；第5类为血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)，是血管生成的重要正性调节因子；另外，还有肝细胞生长因子受体(HGFR)类、Fibroneetin III型受体类及神经细胞生长因子受体(NGFR)家族等。

C-kit受体作为III型蛋白酪氨酸激酶受体超家族成员，利用蛋白酪氨酸激酶抑制剂可抑制其激酶活性来治疗高表达C-kit受体的多种肿瘤，通过作用C-kit受体，抑制酪氨酸受体磷酸化，抑制酪氨酸激酶异常激活，从而有效地抑制高表达C-kit受体的多种肿瘤。

本发明具有如下优点：(1)、来源丰富：我国是海洋大国，拥有丰富的海洋生物资源，褐藻小粘膜藻分布尤其广泛。(2)、疗效显著：作为极具海洋特色的多卤代化合物，溴酚类药物是一种新型、高效的酪氨酸激酶抑制剂，在小鼠体内表现出显著的抗肿瘤疗效。(3)、副作用小：溴酚类药物来源于海洋褐藻，属纯天然生物制品，相比化学合成类药物具有高效低毒的优点。

具体实施方式

实施例1溴酚化合物的提取、分离及结构鉴定

采集并风干褐藻小粘膜藻Leathesia nana样品8.25kg(干重)，用95％乙醇提取三次，每次72小时；提取液40℃下减压浓缩的乙醇提取物710g，浓缩物用蒸馏水悬浮后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩，得乙酸乙酯相浸膏125g，正丁醇相浸膏70g。乙酸乙酯萃取部位进行硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮梯度洗脱，直至二者体积比为1：1，改用氯仿-甲醇梯度洗脱，最后用95％乙醇洗脱，薄层色谱检查，合并成分相似的洗脱液，减压浓缩得24个部分L₁～L₂₄。L₁₁-L₁₅[石油醚：丙酮＝5：1]洗脱部分经过Sephadex LH-20色谱、硅胶色谱和反相HPLC等分离纯化技术得到纯化合物18mg，经波谱分析，此化合物为3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃。

实施例2溴酚化合物衍生物的合成

[钠盐制备]

(1)药品：3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃、乙醇、40％的NaOH溶液；

(2)仪器：烧杯、pH酸度计、恒温槽；、

(3)制备方法：称取200mg样品溶解在50mL乙醇中，然后加入浓度为40％的NaOH溶液200mL.用70℃水浴保温8h，减压浓缩，采用正相硅胶色谱(氯仿：丙酮＝3：1为洗脱剂)进行分离、纯化，得红色结晶compound2(25mg)，产率为10.6％，HREIMS m/z581.7297(calcd.for C₁₄H₅ ⁷⁹Br₃Na₃O₅，581.7278)。

[酯化反应]

(1)药品：3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃、乙酸酐、浓硫酸；

(2)仪器：烧杯、三口烧瓶、磁力搅拌加热器；

(3)制备方法：在200mL的圆底烧瓶中，依次加入3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃200mg，乙酸酐(120mL)，加热回流4h.反应变为澄清，继续反应2h，冷却后，加大量水使过量的乙酸酐完全水解成乙酸，再用氯仿萃取，分出有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发浓缩，采用正相硅胶色谱(氯仿：丙酮＝3：1为洗脱剂)进行分离、纯化，得油状物compound3(36mg)，产率为13.4％，HREIMS m/z661.8487(calcd.for C₂₂H₁₇ ⁷⁹Br₃O₉，661.8423)。

[醚化反应]

(1)药品：3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃、硫酸二甲酯、氢氧化钾、丙酮、碳酸氢钠、蒸馏水、乙酸乙酯；

(2)仪器：烧杯、三口烧瓶、磁力搅拌加热器；

(3)制备方法：取200mg3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃于100mL三口烧瓶中，加入50mL丙酮搅拌使其溶解，再加入一定量的KOH，剧烈搅拌，硫酸二甲酯逐滴加入，20min内滴完，反应完毕后把丙酮减压蒸出，回收。剩余物加温热5％NaHCO₃，蒸馏水各10mL洗涤，得粗产品，乙酸乙酯中重结晶得淡红色晶体compound4(8.6mg)，产率为3.7％，HREIMS m/z549.8632(calcd.for C₁₈H₁₇ ⁷⁹Br₃O₅，549.8626)。

实施例3酪氨酸激酶活性抑制活性测性

采用双抗体夹心ELISA法。按C-kit试剂盒说明，将化合物样品稀释成一定浓度(1μg/mL)加入到96孔板中，除空白孔外，分别加人100μL血清标本，再加人生物素化抗体工作液50μL，混匀后于25℃孵育60min，洗板4次，分别于各孔(包括空白孔)加入辣根过氧化酶标记的亲和素100μL，于25℃孵育30min。加底物显色液(OPD)100μL于各孔避光室温孵育15min后，每孔加终止液(1.8N硫酸)100μL并立即置于检测仪中测定490nm的光吸收值检测底物磷酸化。阳性对照：Glivic(格列卫)，可竞争性地结合C-kit酪氨酸激酶ATP结合域，抑制酪氨酸受体磷酸化。

表1对蛋白质酪氨酸激酶活性的抑制率(％)

Figure 1 Inhibition of protein tyrosine kinase

[实验结论]：溴酚化合物及其钠盐、酯和醚等衍生物对蛋白质酪氨酸激酶有较好的抑制作用，可用于高表达C-kit受体的恶性肿瘤的防治。

实施例4 细胞毒活性测试

(1)实验材料

瘤株：Bel-7402人肝癌细胞株；PC-3M人胰腺癌细胞株；MCF-7人乳腺癌细胞株；A549人肺癌细胞株；A2780人卵巢癌细胞株；K562人白血病细胞株；中国医学科学院协和医科大学药物研究所药理研究室提供。

MTT(购自Sigma公司)，用生理盐水溶解，配制成5mg/mL的工作液，-20℃保存；二甲基亚砜(DMSO)为西安化学试剂厂生产，分析纯。

(2)实验方法(MTT分析法)

原理：MTT分析法是代谢还原四氮唑盐3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)为基础。活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶(Formazan)，而死细胞此酶消失，MTT不被还原，用DMSO溶解Formanzan后可用酶标仪在550nm波长处检测光密度。MTT法操作简便，敏感，可重复性强及信号-噪音比好。

方法：取对数生长期的Bel-7402、PC-3M、MCF-7、A549、A2780和K562细胞株，采用RPMI1640pH7.4的完全培养基，在37℃、5％CO2条件下常规培养，调整为适当浓度后接种于96孔培养板，每孔90μL，化合物1-4用DMSO溶解为10mg/mL，再用RPMI1640培养液稀释至所需浓度后加入接种的细胞中，每孔10μL，使其浓度分别为0.01，0.1，1，10和100μL/mL，每个浓度均设4复孔。同时设相应浓度的DMSO溶媒对照和化合物显色浓度的平行空白对照，以消除DMSO和样品颜色的干扰。采用改良的MTT法，化合物与细胞接触48小时后，每孔加入5mg/mL MTT20μL，37℃条件下，5％CO2继续培养4小时，，快翻法除去上清液，每孔加入DMSO100μL，微型振荡器震荡10分钟，于酶标仪在570nm波长处检测每孔OD值，计算抑制率，并用LOGIT法计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

(3)实验结果(见表2)

表2细胞毒活性测试结果

Table2 Cytotoxicity of compounds(MTT)

结果表明，溴酚化合物及其钠盐、酯和醚等衍生物对以上肿瘤细胞具有不同程度的细胞毒活性，提示其具有一定的抗肿瘤功效。

实施例5体内动物试验

1、实验材料

(1)瘤株

小鼠肉瘤S₁₈₀实体瘤，中国医学科学院协和医科大学药物研究所引进，山东医学科学院药物研究所药理室低温冻存保种，复苏后传代5、6、7代的细胞悬液。

(2)实验动物

青岛市实验动物中心提供纯种昆明小鼠，雌雄各半，体重18-23g，随机分组。

2、试验方法

(1)小鼠S₁₈₀荷瘤鼠造模

选取接种S₁₈₀实体瘤7～8d后生长良好的小鼠，急性处死；抽取腹水瘤细胞，用生理盐水洗涤离心2次，换用RPMI-1640培养液再洗一次；将肿瘤细胞悬液放入含10％小牛血清、青霉素100IU/mL的RPMI-1640培养液中，稀释成最终浓度(10⁴～10⁷)个/mL的单细胞悬液。苔盼蓝(Trypanblue)染色检查活细胞数，成活率95％以上即可接种。昆明小鼠50只，每只于左前肢腋窝皮下接种0.2mL S₁₈₀瘤细胞悬液，整个操作过程30min内完成；24h后随机分为5组，10只/组，雌雄各半，分笼喂养。

(2)分组及给药

受试组：药物[3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃]用5％的乙醇溶解，稀释成相应的给药浓度，以0.4mL/只(4.94mg/kg)灌胃作为高剂量组；以0.4mL/只(2.47mg/kg)灌胃作为中剂量组；以0.4mL/只(1.24mg/kg)灌胃作为低剂量组。每日灌服ig一次，连续7d；阳性对照组：以1.5mg/mL环磷酰胺溶液0.4mL/只灌胃作为阳性对照组；溶媒对照组：等体积5％乙醇灌胃，每日一次；隔天称体重，观察小鼠生长情况。末次给药24h后，颈椎脱臼处死小鼠，取瘤块和胸腺，计算肿瘤生长的抑制率(抑瘤率)和胸腺指数。

(3)指标检测

a抑瘤率

抑瘤率(％)＝(空白对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重×100％

见表3。结果显示，低、中、高剂量组的平均瘤重均低于空白对照组，且呈剂量依赖性，高剂量组的瘤重和阳性对照组的瘤重与空白对照组比较差异均有显著性。表中^*表示与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)。

表3小鼠瘤重及抑瘤率(±s，n＝10)Table3Weight of Tumor and Inhibition Ratios(±s，n＝10)

b胸腺指数

胸腺指数＝(胸腺重量/体重)

见表4。阳性对照组的胸腺指数明显下降，低、中、高剂量组的胸腺指数上升，其中中剂量组较为明显；中剂量组同阳性对照组有显著差异；说明环磷酰胺可抑制荷瘤鼠的胸腺，而中剂量组明显可使胸腺增大。表中*表示与环磷酰胺阳性对照组比较有显著行差异(P<0.05)。

表4胸腺指数(±s，n＝10)

Table4Index of Thymus(±s，n＝10)

正常机体的免疫防御处于平衡状态，而肿瘤患者的免疫功能失去平衡；化疗作为肿瘤治疗的主要手段存在毒副作用，免疫抑制是其中之一。机体的免疫状态影响着肿瘤形成，增强机体的免疫功能是肿瘤防治的有效途径。研究表明接种肿瘤细胞后，动物的免疫器官胸腺的重量降低；注射环磷酰胺组胸腺指数显著低于其它各组，表明环磷酰胺有免疫抑制作用。本实验各剂量组的胸腺指数上升，且呈剂量依赖性，表明药物[3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃]可提高胸腺的免疫功能。

Claims (2)

1.溴酚类化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述溴酚类化合物为3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃及其钠盐。

2.溴酚类化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述制备治疗恶性肿瘤药物是指制备治疗各种高表达C-kit受体的恶性肿瘤药物，所述溴酚类化合物为3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃或其钠盐。