CN101279104A - 一种含有生长因子的胶原蛋白海绵的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种含有生长因子的胶原蛋白海绵的制备方法涉及含有表皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的胶原蛋白海绵的制备方法。本发明就是提供一种促进慢性创面愈合并具有主动修复功能的含有生长因子的胶原蛋白海绵的制备方法。本发明采用如下技术方案：1.用动物的皮或结缔组织生产胶原蛋白酶解液；2.用表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子分别加入胶原蛋白的酶解液中；3.将含有表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子的胶原蛋白酶解液经真空冷冻干燥成海绵状；4.将含有表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子的胶原蛋白海绵切割、包装、钴60照射灭菌。

Description

一种含有生长因子的胶原蛋白海绵的制备方法

技术领域：

本发明涉及含有表皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的胶原蛋白海绵的制备方法。

背景技术：

1、在正常情况下，健康人的创伤愈合因子(细胞生长因子)显得并不十分重要。但对患有多种慢性难愈合创面的患者来讲，创伤愈合因子则显神奇功效，因此这才是各种细胞生长因子的主要应用方向。

在患有某些疾病时，如糖尿病、动脉硬化、慢性静脉扩张与阻塞、褥疮、红斑狼疮、类风湿关节炎、老年人等，可能因代谢异常，局部或全身营养不足而造成创伤难以愈合。如糖尿病患者的腿足伤可长达几年甚至几十年不愈合。Knighton研究小组曾使用病人自体的血小板源创伤愈合因子(Platelet-derivedwound healing factor，PDWHF)，实际上是多种生长因子的混合物，治疗难愈合的创伤，包括糖尿病人的腿足伤、褥疮、动脉供血不足及静脉回流不畅患者的溃疡等。结果获得预想不到的效果，治愈率达97％，平均治疗时间为10.6周。接着又报道用PDWHF治疗的19个病人中有14人痊愈，而给安慰剂的对照组12个病人8周后仍有9人未愈合。

某些治疗措施也会引起创伤不愈症，如接受化疗、放疗和类固醇治疗的病人，因体内某些细胞受到抑制而失去分泌某些生长因子的作用，致使病人的创伤难以愈合。如接受皮质激素治疗的病人，体内的巨噬细胞受到抑制，失去了分泌TGF-β的功能，因而影响创伤愈合，在这种情况下使用创伤愈合因子将更显必要。

有些组织的损伤本来就较其它组织难以愈合，如角膜损伤、颅骨损伤等，这也是使用创伤愈合因子的首选病例之一。

2、随着生长因子在临床的应用，给这些难愈合创面的治疗带来了新的思路。表皮生长因子(EGF)是表皮细胞的有丝分裂原，能促进表皮细胞的分裂与增殖。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能有效地促进成纤维细胞和血管内皮细胞的分裂与增殖。这两种生长因子在创面愈合过程中起到非常重要的作用。此两种生长因子的联合使用在临床治疗上已获可喜的效果。薛斌等人对58名有慢性难愈合创面的病人同时使用EGF和bFGF发现，联合使用这两种生长因子明显促进伤口愈合。(薛斌等，中国临床康复第8卷第2期2004-01-15)

3、EGF和bFGF等生长因子在创伤主动修复过程中的作用越来越广泛地被人们认识，但大多数生长因子的活性在常温下会迅速下降。作为液体药剂使用时在伤口处又易流失。所以，在临床使用时有诸多不便，不能充分发挥其疗效。

发明内容：

本发明就是针对上述问题，提供一种促进慢性创面愈合并具有主动修复功能的含有生长因子的胶原蛋白海绵的制备方法。

本发明采用如下技术方案：

1、用动物的皮或结缔组织生产胶原蛋白酶解液；

2、用表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子分别加入胶原蛋白的酶解液中，表皮细胞生长因子的浓度为120IU/ml-250IU/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为200AU/ml-350AU/ml；

3、将含有表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子的胶原蛋白酶解液经真空冷冻干燥成海绵状；

4、将含有表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子的胶原蛋白海绵切割、包装、钴60照射灭菌。

发明的有益效果：

本发明在成纤维细胞生长因子胶原蛋白海绵的基础上提供了一个表皮生长因子和成纤维细胞生长因子胶原蛋白海绵的新组合材料，这种新材料作为外科敷料对于伤口特别是慢性创口的愈合有促进作用。这种含主动修复活性的生物源敷料正在临床上使用，效果明显。

经实验表明，由于本发明中使用的两种因子主动修复功能的互补性，表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子联合使用制成胶原蛋白海绵在临床应用上有更好的疗效。尤其是对慢性难愈合创面的修复是其它创伤敷料所不能及的。

具体实施方式：

实施例1：

1、胶原蛋白酶解液的制取：

将去脂肪清理干净的新鲜的猪皮或牛皮或结缔组织放入不锈钢桶中，加入碳酸钠溶液浸泡15-30分钟。捞出后，用纯净水反复冲洗，沥去水分，将动物结缔组织切碎，称重。放入绞肉机中绞碎。加入75％的乙醇溶液浸泡10-25分钟。捞出后用纯净水洗净。沥去水分，称重。按1kg皮/15-30L水的比例加入纯净水，转至搅拌锅中。在匀浆液中加入适量盐酸溶液使溶液呈酸性。加入适量胃蛋白酶溶液，在室温下，密闭搅拌15-24小时，使成粘稠，胶质流体。加入适量饱和氯化钠溶液，搅拌3小时。7000rpm离心，收集沉淀。溶于稀盐酸溶液中。装入透析袋中，用纯净水透析48小时。调至PH中性，得到胶原蛋白酶解液。

在酶解液中加入生长因子，其中表皮生长因子终浓度为200IU/ml，成纤维生长因子终浓度为250AU/ml；搅拌均匀，放入不锈钢盘中。

将不锈钢盘置于真空冷冻干燥机中，冻干10-16小时。取出冻干蛋白海绵，按临床需要切割成不同规格的产品。内包装密封。将包装密封的含生长因子的胶原蛋白海绵用钴60照射灭菌。灭菌后的产品供临床实验使用。

生长因子胶原蛋白海绵加速慢性难愈合创面愈合的临床试验：

1、材料与方法：

1.1临床资料：本组28例共33个创面，其中男18例，女10例；年龄10-90岁；创伤性溃疡12例，共14个创面；压迫性溃疡9例，共12个创面；糖尿病溃疡4例；放射性溃疡3例；病程最短者30天，最长者10年(表1)。在本项研究中，将由各种原因引起的，经治疗4周未愈合的创面定为慢性难愈合创面。本组33个创面均是经常规4周未愈合者。

表128例共33个慢性体表溃疡的相关资料

组别	创面数/例数	溃疡大小	病程(天)
				创伤性溃疡	14/12	1.0×3.0-5.0×10.0	30-90
压迫性溃疡	12/9	2.0×3.0-16.0×18.0	38-365
				糖尿病溃疡	4/4	1.5×1.5-6.0×8.0	45-60
放射性溃疡	3/3	2.5×3.0-10.0×18.0	45-3650

1.2材料来源：

生长因子胶原蛋白海绵(生物蛋白海绵)，由辽宁绿谷药械有限公司制备。

1.3治疗方法：

所有创面经生物蛋白海绵治疗前均进行清创，常规消毒，对糖尿病溃疡患者需同时控制血糖。生物蛋白海绵用前储于4℃恒温水箱。用时将生物蛋白海绵完全覆盖创面，并略超出创缘0.5cm。若创面渗出较少或炎症反应较重时，可用庆大霉素注射液湿润后再覆盖。同时，注意全身抗炎治疗。每日一次，以7天为一个疗程。同时，可视创面愈合情况，适当延长换用时间(2-3天)。

1.4疗效判定与统计学分析：

由于慢性难愈合创面病因、病程以及溃疡分布的显著差异，因而临床实验中很难合适的组间对照。由于本组入选病例为经常规方法治疗4周未愈合的创面，故我们在研究中除统计每一创面完全愈合所需的时间外，还以4个疗程(28天)为疗效判定标准。

表2生物蛋白海绵对不同创面的疗效

2、结果：

本组28例33个创面中，应用生物蛋白海绵2周内愈合者20个创面，3周内愈合者3个创面，4周内愈合者8个创面，超过4周愈合者2个创面。全组总有效率100％，4周内总愈合率93.9％。有关不同病因创面的疗效情况见表2。

分析采用生物蛋白海绵对不同病因所致创面的愈合比例，可见14个创伤性溃疡在治疗早期(2周以内)愈合13个创面，占92.9％，而糖尿病溃疡和压迫性溃疡则分别为75％和25％，与创伤性溃疡相比差异显著(P＜0.05)。由此可见，生物蛋白海绵对不同病因的慢性愈合创面疗效各异。

Claims (3)

1. 一种含有生长因子的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于

1)、用动物的皮或结缔组织生产胶原蛋白酶解液；

2)、用表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子分别加入胶原蛋白的酶解液中，表皮细胞生长因子的浓度为120IU/ml-250IU/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为200AU/ml-350AU/ml；

3)、将含有表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子的胶原蛋白酶解液经真空冷冻干燥成海绵状；

4)、将含表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子的胶原蛋白海绵切割、包装、钴60照射灭菌。

2. 根据权利要求1所述的一种含有生长因子的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于酶解的过程是在室温下进行的。

3. 根据权利要求1所述的一种含有生长因子的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于表皮生长因子终浓度为200IU/ml，成纤维生长因子终浓度为250AU/ml。