CN101278061B

CN101278061B - 用于扩增、定量和鉴定核酸的方法

Info

Publication number: CN101278061B
Application number: CN200680036534.3A
Authority: CN
Inventors: 基思·斯坦利
Original assignee: Corbett Life Science Pty Ltd
Current assignee: MTPCR Pte. Ltd.
Priority date: 2005-09-01
Filing date: 2006-08-31
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2026-08-31
Also published as: CN101278061A; AU2005205791B1

Abstract

本发明涉及从核酸分子库中扩增以及任选地定量和/或鉴定多种选定核酸分子的改进方法。使用第一轮多重扩增，其中允许扩增反应进行到扩增子之间对反应组分发生显著竞争之前的点。其后是第二轮扩增，其通常包含荧光报告子以允许定量每种选定的核酸序列。所述方法可用于从多种来源(如基因表达产物)中扩增和定量核酸，由此，可以从很有限的样品中和从已降解的存档样品中扩增和定量许多这样的产物。

Description

用于扩增、定量和鉴定核酸的方法

技术领域

本发明涉及核酸扩增、鉴定和定量的方法，尤其是用于诊断、法医和研究用途的扩增、定量或鉴定多种基因或基因表达产物的改进方法。本发明还涉及从少量和已发生降解的核酸样品中更准确地扩增、鉴定和定量多种核酸序列。

具体地，本发明涉及同时扩增和定量多种核酸分子，并将参考本申请在下文中进行描述。但是应理解，本发明不限于此特定用途领域。

背景技术

本说明书全文中任何现有技术的讨论不应以任何方式认为是承认此现有技术是公知的，或构成本领域普通知识的一部分。

用于分析基因表达的已知方法包括使用PCR或巢式PCR以从代表许多不同基因的cDNA分子库中扩增代表单个基因表达产物的选定cDNA序列。在单基因PCR反应中，一般在一轮PCR中使用一对引物扩增来自单个基因的基因表达产物。在典型的巢式PCR扩增反应中，通过两次连续PCR反应扩增单个特别稀有的序列，每一次反应各由使用单个巢式引物组合的30-40个循环组成。巢式PCR通常用于获得稀有序列的克隆，通常不考虑用于定量基因表达或鉴定基因。为了使用PCR定量基因表达的水平，通常使用常规定量实时PCR(qPCR)检测PCR产物在每个扩增循环后的实时积累，以估计每种目的PCR产物的量。这通常应用可检测的报告子例如嵌入染料、小沟结合染料或荧光探针，由此使用光来激发报告子发出荧光，所得荧光通常使用CCD照相机或光电倍增检测系统检测，例如在US 6,713,297中公开的，其通过引用并入本文。尽管单基因分析方法现已成为常规，但是当多重PCR中必须在同一PCR反应内扩增多种基因表达产物时，就会产生困难。在多重扩增反应中，每一种单独的基因表达产物必须在PCR过程中竞争反应组分，使得在PCR反应开始时以高拷贝数存在的高表达基因产物通过隔绝关键反应组分而有效阻止低拷贝数基因产物的扩增。这会产生可能仅代表少数高表达基因的扩增基因产物库。重复实验中存在很大的变异，使得对这些产物的分析更为复杂，从而准确定量基因表达变得十分困难。尽管对引物和反应组分的优化可在一定程度上减轻这一问题，但是这通常包括大量的实验，并且随着在多重反应中待分析基因数量的增加而变得更为困难得多，这样，能在多方面优化的系统中可靠分析的基因最大数量通常为四种基因。基因表达分析通常需要估计每种基因的表达量，这在多重PCR中更为复杂。

多重PCR的现有方法

解决这一问题的现有方法包括应用荧光检测系统例如Taqman探针，通过与每种基因表达产物结合并释放特定的可检测荧光来对它们分别进行检测(Exner M.M.和Lewinski.M.A.(2002))。使用LightCycler和ABI PRISM 7700序列检测系统的多重实时PCR反应的灵敏度取决于DNA聚合酶的浓度(Molecular and CellularProbes.2002 Oct；16(5)：351-7)。这些探针及其应用描述于美国专利号5,210,015；5,487,972；5,804,375；5,994,056；5,538,848和6,030,787，它们通过引用并入本文。这需要实时热循环仪器，以检测不同波长的荧光。另外，Taqman探针售价昂贵，并且可能由于探针结合的特定序列要求而限制可分析的特定序列区域。

其它荧光方法包括应用通用检测系统，例如SYBR绿染料，它在嵌入到来自任何基因表达产物的扩增DNA时发出荧光，如美国专利No.5,436,134和5,658,751所公开，其通过引用并入本文。尽管SYBR绿染料并不昂贵，而且具有优异的荧光特性，但是它通常不适于在多重PCR中估计基因表达水平，因为无法可靠地对每种基因产物确定荧光来源。

即使不考虑用作检测系统的荧光探针或SYBR绿染料，多重PCR仍然有基因表达产物竞争反应组分的相同问题，从而阻碍了对多种基因的基因表达的准确定量。

高通量方法

多重基因表达测量的替代方法包括应用微阵列。微阵列可用于同时定量数千种基因的表达。但是微阵列通常需要大量的操作员训练，大量的样品RNA以及昂贵的设备。另外，尽管可分析的基因数量大，但是所得的基因表达定量不准确得多，经常导致假阳性。

因此，需要简单且廉价的方法，其适用于需要准确定量多种基因表达或需要检测特定核酸或需要产生多种核酸产物的任何情况。本发明特别适用于从极少量的样品中扩增和检测核酸，所述样品例如血点、激光切割显微术样品、单细胞和包含已部分断裂的核酸的样品，例如取自陈年样品和甲醛固定石蜡包埋(flrmalin-fixedparaffin-embedded，FFPE)切片的样品。但是，本发明的方法同样可用于较大样品和高质量的样品。可使用本发明的情况实例包括但不仅限于：诊断；预后；法医；环境和产品测试和监测；生物武器检测；研究等。

因此，本发明的一个目的是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或者提供可用的替代方法。

发明内容

本发明涉及核酸扩增和定量的方法，特别是用于诊断、法医和研究用途的扩增和定量或鉴定多种基因表达产物的改进方法。所述方法特别适用于使用少量起始材料定量或鉴定多种基因的表达，还可用于已发生降解的样品，例如获得自档案或法医材料的样品。本领域技术人员会理解，本发明的方法同样可用于扩增来自其它来源(例如基因组DNA或病毒DNA)的核酸。本发明包括使用两轮串联的扩增操作，包括扩增多种选定核酸序列的第一轮多重扩增反应，以及接下来的多个第二轮扩增反应，所述多个第二轮扩增反应通常各自进一步扩增所述选定的核酸序列之一。

根据本发明的第一个方面，提供了从核酸分子库中扩增多种选定核酸分子的方法，其包括：

(a)在第一轮多重扩增反应中扩增多种选定的核酸分子，所述反应包含多种外部引物对，每对引物对一种选定核酸序列具有特异性，其中允许所述扩增反应进行到扩增子之间对反应组分发生显著竞争之前的点；和

(b)在多个第二轮扩增反应中进一步扩增所述选定的核酸分子，每个反应各包含作为模板的已完成多重反应的一部分以及至少一对内部引物，每对引物对一种所述选定核酸序列具有特异性，使得每个第二轮反应分别进一步扩增多种选定核酸分子中的亚组。

根据本发明的第二方面，提供了从核酸分子库中扩增多种选定核酸分子的方法，其包括：

(b)在多个第二轮扩增反应中进一步扩增所述选定的核酸分子，每个反应包含作为模板的已完成多重反应物的一部分以及至少一对引物，每对引物包含内部引物和一种所述外部引物，并对一种所述选定核酸序列具有特异性，使得每个第二轮反应分别进一步扩增多种选定核酸分子中的亚组。

根据本发明的第三方面，提供了在核酸分子库中估计选定核酸分子的数量的方法，其包括：

(a)在第一轮多重扩增反应中扩增多种选定的核酸分子，所述反应包含多种外部引物对，每对引物对一种选定核酸序列具有特异性，其中允许所述扩增反应进行到扩增子之间对反应组分发生显著竞争之前的点；

(b)在多个第二轮扩增反应中进一步扩增所述选定的核酸分子，每个反应各包含可检测报告子、作为模板的已完成多重反应的一部分以及至少一对内部引物，每对引物对一种所述选定核酸序列具有特异性，由此每个第二轮反应分别进一步扩增多种选定核酸分子中的亚组；和

(c)通过可检测报告子来监测每个第二轮扩增反应，从而估计每种选定序列的选定核酸分子的数量。

根据本发明的第四方面，提供了估计核酸分子库中选定核酸分子的数量的方法，其包括：

(b)在多个第二轮扩增反应中进一步扩增所述选定的核酸分子，每个反应包含可检测报告子、作为模板的已完成多重反应的一部分以及至少一对引物，每对引物包含内部引物和一种所述外部引物，并对一种选定核酸序列具有特异性，使得每个第二轮反应分别进一步扩增所述多种选定核酸分子中的亚组；和

在本发明的一个实施方案中，根据第一和第三方面使用完全为巢式形式的多重串联聚合酶链式反应(MultiplexTandem-Polymerase Chain Reaction，MT-PCR)方法，由此每种选定的核酸分子在第一轮扩增中使用一对外部引物进行扩增，在第二轮扩增中使用两种内部引物进行扩增。

在本发明的另一个实施方案中，根据第二和第四方面使用半巢式MT-PCR方法，由此在第一轮扩增中使用一对外部引物扩增每种选定的核酸分子，在第二轮扩增中使用包含在第一轮扩增中所用外部引物中的一种以及一种内部引物的引物对进一步扩增选定的核酸序列。

优选地，所述荧光报告子是SYBR绿或SYTO-9染料。

本领域技术人员会理解，还预期可使用其它的荧光染料。

在一些实施方案中，所述荧光报告子是荧光探针。

在一些实施方案中，第二轮扩增反应包含多种引物对和多种荧光探针，使得每种选定序列的多种选定核酸分子均被扩增，并通过荧光探针来定量，每种荧光探针分别对一种选定的核酸序列具有特异性。

本领域技术人员应了解，所述第二轮扩增反应可同时或依次实施。

优选地，所述核酸分子包括DNA分子。

优选地，第二轮扩增反应中所包含引物的Tm高于第一轮扩增反应中所包含的至少一种外部引物，使得在第二轮扩增反应中的寡核苷酸引发显著偏向于对具有该较高Tm的引物有利。

在一些实施方案中，至少一种外部引物包含UTP核苷酸，由此所述引物适于通过UNG酶进行消化，在第一轮扩增结束时通过UNG酶消化而除去外部引物，由此基本防止了第一轮引物对第二轮扩增反应的污染。

优选地，根据在反应起始时使用的核酸量来选择所使用的多重扩增循环数，从而通过将其扩增至扩增子之间对反应组分发生显著竞争之前的点来使得扩增过程中扩增子之间对反应组分的任何竞争效应最小化，同时提供对每种选定核酸序列的特异性扩增。例如，当使用约50ng至约500ng的核酸时，优选约10个循环的多重扩增。当使用约0.5ng至约50ng的核酸时，优选约15个循环的多重扩增。当使用约0.01ng至约0.5ng的核酸时，优选约20个循环的多重扩增。本领域技术人员从本发明说明书提供的教导中将十分清楚，当输入更少量的核酸时，可使用更大的扩增循环数。

优选地，使第一轮多重扩增反应进行约1至约30轮。更优选地，第一轮多重扩增反应允许进行约5至约25轮，更优选地，使第一轮多重扩增反应进行约5至约20轮，最优选地，使第一轮多重扩增反应进行约10至约20轮。

尽管通常可使用标准多重PCR反应来扩增、定量和鉴定仅为有限数目的不同序列(例如4种序列)，但是令人惊奇地发现，本发明的方法可用于扩增、定量和/或鉴定超过150种选定的序列。优选地，本发明的多重扩增反应扩增多于约4种选定的核酸分子。更优选地，所述多重扩增反应扩增约4至150种选定的核酸分子。更优选地，所述多重扩增反应扩增约10至150种选定的核酸分子，最优选地，所述多重扩增反应扩增约20至100种选定的核酸分子。

本领域技术人员应理解，对于给定的样品和引物组，在第一轮多重扩增反应中可有效扩增的选定核酸分子的最高数目必须在每种情况下根据所需的扩增水平和在第二轮扩增中所得定量的准确度来确定。

优选地，所述方法用于检测多态性、突变、插入和缺失的方法中。

在一个实施方案中，在第二轮扩增中使用荧光探针，以检测核酸变体，例如多态性、突变、SNP、甲基化(亚硫酸氢盐处理之后)、插入和缺失。

在一些实施方案中，所述方法用于疾病和病症的诊断。

在一些实施方案中，所述方法用于瘤的诊断。

在一些实施方案中，所述瘤是乳腺癌。

在一些实施方案中，所述瘤是结肠直肠癌。

本领域技术人员应了解，本发明的方法将可用于可通过任何给定核酸序列的扩增和/或定量来检测的任何疾病或病症的诊断测试。

在一些实施方案中，所述方法用于检测和鉴定选定的生物。

在一些实施方案中，通过高分辨率熔解分析(high resolutionmelt analysis)来检测和鉴定所述生物。

优选地，所述生物选自细菌、病毒、真菌、支原体和寄生虫。

优选地，所述方法包括高分辨率熔解曲线分析，优选产生分辨率范围为约0.05℃到约0.02℃、更优选分辨率小于0.02℃的熔解曲线。

本领域技术人员应了解，本发明的方法可应用于任何可被扩增的遗传材料，其中此材料可来源于任何生物。

优选地，所述扩增反应在热循环装置中自动进行。

优选地，所述热循环装置是多孔实时热循环装置。

在一些实施方案中，所述热循环装置是连续流PCR装置。

在一些实施方案中，所述热循环装置是旋转式热循环装置。

根据本发明的第五个方面，提供了鉴定和/或定量至少一种选定的核酸序列的方法，其包括如下步骤：

(i)将一种或多种选定核酸序列与一种或多种可检测报告子混合；

(ii)通过测定所述一种或多种可检测报告子产生的所述信号来产生熔解曲线；

(iii)由所述熔解曲线鉴定和/或定量所述一种或多种选定的核酸序列。

优选地，产生分辨率范围为约0.05℃到约0.02℃、更优选分辨率小于0.02℃的熔解曲线。

附图说明

图1.显示在MT-PCR中引物的排列的示意图，举例说明了串联和半串联实施方案(分别为A和B)，每种方案均以扩增和定量4种不同基因的基因表达产物(1-4)的方法来显示。

图2A.通过半串联MT-PCR对单个RNA样品实施的24种一式三份的基因表达测量，其在Corbett Research RG3000上使用表1和表2的引物以及所述方法一式三份进行测量。

图2B.图2A所示24种基因测量的相关熔解曲线。

图2C.如使用Bioanalyzer分析的图2A所示24种基因的经MT-PCR所形成的产物。

图3A.使用来源于单个FFPE材料切片的cDNA进行的24种基因表达产物扩增曲线(每种均为一式三份)，其已首先使用15个循环的多重PCR作为72种选定基因表达产物的库而进行了扩增，其中24种随后在第二轮PCR中进行定量。

图3B.图3A中所示24种基因测量的熔解曲线。

图4A.如所示在最初20个循环的多重扩增之后第二轮PCR中得自10pg输入RNA的24种基因表达产物扩增曲线(每种均为一式三份)。

图4B.图4A中所示24种基因测量的熔解曲线。

图5.确定合适的多重扩增循环数，以避免在扩增过程中扩增子之间对反应组分的竞争。目前的一组基因中丰度最高的基因(BTF3)在多重PCR步骤条件下的PCR。展示了使用来自5ng、50ng和500ng输入RNA的cDNA开始每个扩增的扩增曲线。

图6A.相对于比较基因的基因表达定量在不同的输入RNA量下保持不变。

图6B.改变多重扩增循环数及其对基因表达定量的影响。

图7A.第二轮扩增之后获得的熔解曲线，用于测试在串联MT-PCR的第二轮扩增反应中使用0.5单位Taq/反应的效果。

图7B.与图7A所示相同的实验，其中使用1.0单位的Taq。

图7C.第二轮扩增之后获得的熔解曲线，用于测试在串联MT-PCR的多重扩增步骤之前使用20单位逆转录酶进行逆转录的效果。

图7D.与图7C所示相同的实验，其中使用200单位的逆转录酶。

图8.MT-PCR的其他诊断潜力。EGFR基因在15种细胞系中的表达，其中BT20和SKBR3已知为过表达EGFR。

图9A.通过MT-PCR定量炎性基因，显示了一式三份来自人皮肤活检样品的17种炎性基因的表达。

图9B.图9A中扩增产物的相应熔解曲线。

图9C.图9A中扩增产物的Bioanalyzer分析。

图10A.在人乳腺癌细胞系中通过高分辨率熔解分析TP53的高变区。

图10B.在人乳腺癌细胞系中通过高分辨率熔解分析无突变的TP53区域。

图11A.通过高分辨率熔解分析多种细菌菌株中的16S RNA扩增子。

图11B.图11A所示的归一化熔解曲线的差异曲线。

优选实施方案

称为多重串联聚合酶链式反应(Multiplex Tandem PlymeraseChain Reactionk，MT-PCR)的两轮串联PCR方法设计用于从相对少量的核酸样品中在更少的时间内以更少的花费准确测量一大组基因的表达。多重PCR所固有的许多基因表达产物竞争反应组分的问题被本发明所克服，其中将多重扩增限制在预定的循环数，以使扩增子之间的竞争最小化。通过使用两轮扩增提高了灵敏度，使得可以使用从前仅足以定量单个选定序列的产物(如单基因表达产物)的样品量来测量所有选定的核酸序列，通常是一组基因的表达产物。由于第二轮核酸扩增可使用快速循环参数，所以总处理时间也得到降低。

在一个优选实施方案中，通过使用SYBR-绿DNA测量而不使用昂贵的标记寡核苷酸探针使费用降低，所述寡核苷酸探针是从前在多重反应中检测多种序列所必需的。

在另一个实施方案中，还可使用荧光探针例如Taqman探针，以在第二轮扩增反应中检测和定量单个选定核酸或多种选定核酸的扩增产物。

为分析临床样品的基因表达水平，首先从合适组织中提取RNA，通常来自保存于甲醛中的活检样品、血样或其它组织。然后通过逆转录从RNA样品制备cDNA，这可使用随机六聚物(用于随机引发)来实现以制备来自大量表达序列的cDNA，或者更优选地通过基因特异性方法实现。

在一个优选实施方案中，使用多基因特异性引发法，利用对选定的目的核酸具有特异性的每对外部引物进行逆转录反应(RT反应)。这些相同的外部引物其后用于在第一轮多重扩增中扩增特异性目的基因表达产物，其方法在下文描述。将相同的引物用于逆转录，第一轮扩增减少了反应混合物中所使用的寡核苷酸的数量。基因特异性引发还减少了与RNA降解有关的问题，使得MT-PCR可用于提取自已保存多年的甲醛固定石蜡包埋(FFPE)标本的RNA。RT反应进行约1分钟，这足以产生后续扩增所需的cDNA。多重扩增扩增子通常长度小于约150bp，这有助于高效的逆转录和后续扩增。还在反应中使用少量RT酶而还获得了改善的结果，在一个优选实施方案中，在RT反应中使用约1单位/μl的MMLV或superscript III酶。

逆转录酶是PCR反应的抑制剂，在多重扩增之前除去或变性该酶是有用的。在一个优选实施方案中，在多重扩增步骤之前通过约95℃的加热步骤变性逆转录酶。这也使cDNA变性，使其准备好进行第一轮多重扩增。

优选地，在第一轮反应中加入载体蛋白以稳定所述酶。明胶由于其廉价且在约95℃时稳定而适用于此目的，但是BSA、晶体蛋白(crystalin)及其它蛋白质或稳定剂是也可使用的合适替代品。

第一轮多重扩增通常含有外部引物和在多重扩增中共扩增许多表达基因或序列产物所必需的组分。

对于本领域技术人员来说很明显的是，反应的形式可根据所使用的设备进行选择。例如，当使用可用于操作72个扩增反应的“基因盘(Gene-Disc)”(Corbett Research，Sydney，Australia)时，使用一个这样的盘可一式三份地定量约24种基因的表达产物，或定量72种单独的基因，或者可使用96孔板的形式一式三份地定量约32种基因表达产物，或者也可根据所需的统计可靠性选择数目。

下文所述的形式涉及使用Corbett Research“基因盘”，但是本领域技术人员会理解，可以为方便起见而使用任何其它的合适形式，例如384孔板、96孔板或连续流式装置。

优选地，在每个第一轮多重扩增中，使用约72对外部引物同时扩增约72种序列，每对引物代表一种基因或其它表达序列的表达产物。

优选地，设计所述外部引物以扩增由扩增子组成的DNA片段，所述扩增子对于完全巢式MT-PCR是来自每个基因表达产物的约250bp或更短的DNA，或对于半巢式MT-PCR是约150bp或更短的DNA。

本领域技术人员应了解，还可以使用标准实验室操作将本发明用于更长长度的选定核酸序列，其中改变条件，例如可以增加RT反应所用的时长和扩增过程中的延伸时长，以实现合适的cDNA合成和扩增。

为了克服在多重扩增过程中扩增子之间竞争反应组分的问题，所述扩增反应进行相对低的循环数，这取决于所使用的RNA输入水平。在一个自动化装置中，可使用嵌入荧光染料(如SYBR-绿染料)来测量在多重扩增反应中总DNA合成的水平，以确保不超过这个点。可根据选定核酸的相对丰度和可用样品大小来优化第一轮多重扩增中的循环数，使得在第一轮多重扩增中这些扩增子的扩增所产生的多核苷酸量不高于在使反应进行至超过不再发生进一步扩增的循环数时反应中所产生的多核苷酸总量的约5％。通过所述方法的这一改动，防止了选定核酸序列的库(例如基因表达产物)扩增至多重扩增过程中各个扩增子之间对反应组分发生显著竞争的水平。因为所合成的核酸总量仍然是相对小的，所以试剂总是大大过量，因此在多重扩增反应过程中扩增子之间的竞争被显著最小化。

根据检测反应所需的灵敏度选择多重反应的循环数。优选地，使用约10个循环的多重扩增来检测来自约50-500ng RNA样品的基因表达。优选地，使用约15个循环来检测来自约0.5-50ng RNA的基因表达，优选地，使用约20个循环来检测来自约0.01-0.5ng RNA的基因表达。本领域技术人员应了解，当输入RNA量更低时可使用更高的多重反应循环数。

在实践中，当使用相同类型和量的样品时，在使用相同多重扩增循环数的MT-PCR测定之间进行基因表达的比较。

在一个优选实施方案中，此第一轮扩增使用10ng的输入RNA或DNA进行15个循环，反应混合物中包含高水平的核苷三磷酸(约0.3mM)，以进一步降低扩增子之间竞争的可能性。在第一轮多重扩增中外部引物的浓度也减少到约0.1μM，以使当所述反应产物被转移到第二轮扩增反应时进一步减少这些引物的浓度，由此减少这些引物对第二轮扩增反应的影响。

尽管这减少了多重扩增中扩增子之间竞争的重要问题，但是使用这种低扩增循环数所获得的扩增不提供足以准确检测或定量表达核酸序列的扩增，完成的多重扩增反应混合物中仍然含有来自许多表达核酸序列的扩增产物的库。在分开的第二轮扩增反应中对该库中特定选定序列的进一步扩增使得每种基因或表达序列的扩增产物扩增至足以在基本为个体的基础上进行分析，由此准确检测和定量来自原始核酸序列库的每种选定核酸序列。

减少第二轮PCR中所使用的引物和Taq聚合酶的量还降低了形成非特异性产物(例如引物二聚体)的可能性。在一些实施方案中，约0.5单位的Taq用于每个20μl的第二轮扩增反应，并且引物浓度降低到约0.2μM。优选地，加入约0.2％DMSO以在此条件下促进富含GC的扩增子的扩增。

在一个优选实施方案中，约35个循环的第二阶段扩增通常足以允许准确定量来自低表达基因的基因表达产物。本领域技术人员应了解，也可改变第一和第二轮扩增的循环数，以允许在当核酸在第一轮多重扩增反应之前扩增自不同量起始材料的情况下定量所述核酸，这样，所使用的起始材料量越低，通常所需的第一和第二轮扩增循环数越高。

在一个实施方案中，从完成的第一轮多重扩增反应中取出等分试样，加入到许多独立的管中，每个管中含有独立的第二轮扩增反应混合物。此等分试样可在加入到第二轮反应混合物中之前进行稀释，或者可转移少量的第一轮产物使得在加入到第二轮扩增反应混合物时发生合适的等分试样稀释水平。

优选地，在加入到每个第二轮反应管前对第一轮多重扩增产物进行25×稀释，其中当所述等分试样稀释在第二轮扩增反应中时进一步稀释到约100×的水平。本领域技术人员应了解，稀释水平可变化，但是这通常应该高至足以防止残余的第一轮外部引物影响第二轮扩增中每种所选核酸序列定量的准确度。

此稀释步骤确保从第一轮多重扩增反应传递进入第二轮扩增的第一轮外部引物的量不显著，使得第二轮扩增中进一步引发基本上由第二轮引物指导，由此基本上只扩增由选定的第二轮引物所引发的所选分子。

优选地，每个单独的第二轮扩增反应包含一对内部引物，对其进行选择，以与第一轮多重扩增中所扩增的选定基因或表达序列之一的一个扩增子的部分区域互补。每对内部引物扩增一个较短的扩增子，在一个优选实施方案中，这些较短的扩增子为约70-90bp或更短。

在一个替代实施方案中，在第二轮扩增反应中另外加入一定量的一种第一轮外部引物与一种相应的内部引物组合，以在半巢式MT-PCR中进一步扩增所选核酸序列，其中此扩增子优选约150bp或更短。

这样，通过在第二轮扩增中使每种目的基因或表达序列的扩增反应分开(其中发生一批扩增)，每种扩增子在独立的状态下在无其它序列竞争的情况下进行扩增，以便于对其进行进一步分析。

在一个优选实施方案中，通过在第二轮PCR反应管中加入干燥形式的第二轮引物来减少处理时间。合适的反应管实例包括“基因盘”(Corbett Research)、96孔PCR板或384孔PCR板(AppliedBiosystems，USA)。然后在第二轮扩增之前将第一轮扩增产物/反应组分混合物加入到反应管中。

优选地，还使用快速循环条件进行第二轮扩增反应，以减少错误引发的发生并减少处理时间。

方便地，在本发明的一个实施方案中，基于72孔“基因盘”形式在第一轮多重扩增含有约36种基因的外部引物，使得每个扩增以一式二份进行，其中使用逆转录自约10ng总RNA的cDNA。第一轮扩增反应含有外部引物，2％DMSO的存在下每种引物的浓度为约0.1μM。在约10个扩增循环的第一轮结束时，反应产物被稀释约25×，约5μl的这些稀释产物被加入到第二轮扩增中。对于第二轮扩增，使用快速循环，因为模板中已经富集了目的基因。另外，内部引物设计成在多重扩增所产生的所选扩增子内部发生结合。这些内部引物能够扩增约70-90bp的短扩增子，使得在第二轮扩增中使用短的延伸时间。通常第二轮扩增循环条件是95℃1秒、60℃10秒和72℃10秒。

本领域技术人员应了解，可在第一轮多重反应中扩增的序列数可有所不同，只要包括的其他第一轮外部引物对在第二轮扩增中不导致产生不希望的其他产物或者在第二轮中不影响所选扩增子定量的准确性即可。

因为加入到第二轮扩增的反应产物富含选定的目的核酸序列，所以第二轮可使用快速循环条件，并含有浓度有限的引物和酶，这有益于在第二轮扩增中形成唯一且正确的扩增子产物。这使得第二轮扩增产物基本上不被非特异性DNA分子或引物二聚体污染，否则它们将使分析更为复杂或者无法进行。

在第二轮扩增中使用的反应混合物优选包含可检测报告子组分，例如荧光染料或含荧光团的探针比如Taqman探针，本领域技术人员应了解，使用这样的探针需要特定的退火温度。

在一个优选的实施方案中，所述报告子组分是SYBR-绿染料，其以非特异性的方式响应于扩增DNA的存在而发出荧光，这样，荧光水平与第二轮扩增反应中存在的扩增DNA的量成正比。在扩增过程中优选在实时PCR仪器中监测第二轮扩增反应，使得此荧光的显色受到监测，从而对每个反应中存在的表达序列或基因产物的量进行定量。

在一个替代实施方案中，第二轮扩增反应可包含多种选定核酸序列的引物，由此选定核酸序列的检测和定量通过使用荧光探针例如Taqman探针或其它合适标记寡核苷酸探针进行。

在另一个实施方案中，本发明的方法可用于分析DNA，以检测与多种性状(例如哺乳动物疾病的流行性状和易感性)、SNP、甲基化(亚硫酸氢盐反应之后)、遗传疾病等相关的特定序列。

本领域技术人员应了解，本发明允许分析少量样品，使得此方法可用于但不仅限于法医分析以及检测寄生虫、病毒、真菌、细菌和支原体、食品污染、组织、水、土壤空气等的污染，包括生物武器检测。

在又一个实施方案中，在PCR之前对核酸的处理以及PCR反应的制备使用适合的装置自动进行，所述装置例如CAS1200机器人(Corbett Research)、MultiPROBEII核酸工作站(PerkinElmer Lifeand Analytical Sciences)和epMotion^TM 5075工作站(Eppendorf)或者本领域公知的其它这样的装置。

优选地，所述核酸扩增系统是PCR系统，如US 4,683,202，US4,683,195和US 4,965,188中所述的，其通过引用并入本文。

优选地，对核酸的扩增、检测和定量通过在自动化定量PCR热循环装置中操作并监测反应来实现，所述装置例如Rotor GeneRG6000(Corbett Research)、Applied Biosystems 7900HT或者其它合适装置，其实例公开于例如EP1157744和US 6,713,297，其通过引用并入本文。

优选地，所述基因表达测量相对于在同一批MT-PCR中进行的比较基因进行表示，并且仅与在基本相似的条件下进行的基因表达测量进行比较。

在另一些实施方案中，所述扩增反应可以是连接酶链式反应、自持续序列复制(self-sustaining sequence replication)、滚环扩增(rolling circle amplification)、链置换扩增(strand displacementamplification)、等温DNA扩增(isothermal DNA amplification)等。

本领域技术人员还应了解，本发明的方法可应用于任何活细胞或生物，包括但不仅限于：哺乳动物(包括人)；鸟类；鱼类；植物；爬行类；节肢动物；腹足动物；细菌；病毒；真菌和支原体。

本领域技术人员还应了解，本发明的方法可用于检测样品中选定核酸的水平，所述样品为例如可获得约0.01ng RNA的单个哺乳动物细胞，还例如来自单个FFPE组织切片，其中可获得约10ngRNA。

优选地，所述扩增反应通过多孔实时热循环仪或连续流体PCR装置中的流体机器人自动处理。

在另一个实施方案中，第二轮扩增包含内部引物，其与外部引物相比在较高的温度下退火(较高的Tm)，使得第二轮扩增中的退火步骤在较高温度下进行，以使用内部引物特异性引发第二轮扩增，从而基本上防止第二轮扩增反应中外部引物的引发。

在另一个实施方案中，在一种或多种外部引物中掺入一个或多个UTP核苷酸，使得这些引物可被UNG酶消化，由此，所述外部引物可在第一轮扩增结束时被除去，从而基本阻止了第一轮引物污染第二轮扩增反应。

在另一个实施方案中，所述方法可用于诊断方法，例如诊断肿瘤，其选自多种良性和恶性实体瘤以及白血病的形式等。

所述核酸分子包括RNA、DNA和cDNA分子，但是应理解，还预期可使用相关变体，只要它们可被扩增即可。

可掺入寡核苷酸探针中的荧光部分实例包括但不仅限于：羧基-X-罗丹明、荧光素、6-四甲基罗丹明-5(6)-羧酰胺、BODIPY493/503^TM、BODIPY-Fl-X^TM、(4，6-二氯三嗪基)氨基荧光素、6-羧基荧光素、6-((5-二甲基氨基萘-1-磺酰基)氨基)己酸酯、Oregon绿500^TM、Oregon绿488^TM、Rhodol绿^TM、Oregon绿514^TM、罗丹明绿-X^TM、NBD-X、四氯荧光素、2’，4’，5’，7’-四溴砜荧光素、BODIPY-Fl BR2^TM、BODIPY-R6G^TM、6-羧基-4’-5’-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、BODIPY-530/550^TM、六氯荧光素、羧基罗丹明6G^TM、BODIPY 558/568^TM、BODIPY-TMR-X^TM、1-(3-羧基苄基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)溴化吡啶、BODIPY-564/570^TM、Cy3^TM、6-(四甲基罗丹明-5(6)-羧酰胺基)己酸酯、罗丹明红-X^TM、BODIPY-576/589^TM、BODIPY-581/591^TM、Texas红-X^TM、Cy3.5^TM、BODIPY-TR-X^TM、Cy5^TM、羧基萘荧光素、Cy 5.5^TM。

定义

在本说明书的上下文中，术语“可检测报告子”指提供用于测定核酸量的可检测手段的组分，这包括放射性标记的组分和荧光报告子，例如染料和掺入了荧光基团的探针(例如Taqman探针)等等。

在本说明书的上下文中，术语“荧光报告子”指可检测报告子，其为(1)掺入了能发出荧光的核苷酸碱基的寡核苷酸序列，其结合特异性靶DNA序列，并以允许定量所述核酸的量的方式发出特定的可检测荧光(也称为探针或荧光探针)或(2)染料(例如SYBR-绿染料)，其结合DNA，从而以允许对所述序列进行检测和/或定量和/或鉴定的方式发出荧光。

在本说明书的上下文中，术语“探针”或“荧光探针”指掺入了能够发出荧光的核苷酸碱基的寡核苷酸序列，其结合特异性靶DNA序列，并以允许定量所述核酸的量的方式发出特定的可检测荧光。这也落入“可检测报告子”和“荧光报告子”的定义之中。

在本说明书的上下文中，术语“聚合酶链式反应”及其缩写“PCR”根据本领域技术人员所理解的其一般意义使用。PCR方法的实例可见于普通分子生物学教科书和本领域中所使用的参考手册。例如PCR Technology：Principles and Applications for DNAAmplification(1989)H A Erlich.编辑Stockton Press，New York。PCR的一个实例通常用于通过使用热稳定聚合酶和一些试剂以及两种短引物来扩增选定的核酸序列，其中通过包含与序列结合的引物来“选择”待扩增的序列。一种引物通过互补碱基配对与待扩增序列一端的(+)链结合，另一种引物与另一端的(-)链结合。由于新合成的DNA链(扩增子)可接着作为相同引物序列的额外模板，因此引物退火、链延伸和解链的连续轮次产生该选定序列快速且高度特异性的扩增。

在本说明书的上下文中，术语“扩增子”指通过核酸扩增过程例如PCR产生的新合成的DNA链。

在本说明书的上下文中，术语“引物”和“寡核苷酸”指长度短的多核苷酸链DNA，其用于在核酸扩增(通常在PCR反应中)或逆转录反应中起始扩增(复制)过程。

在本说明书的上下文中，术语“外部引物”指在一种或多种相应内部引物所结合区域外侧的位点与选定的核酸序列或扩增子结合的引物，如图1所示。在本说明书的上下文中，术语“内部引物”指与选定扩增子结合的引物，其结合位置在所述外部引物结合位置的内侧，如图1所示。

在本说明书的上下文中，术语“巢式PCR”、“完全巢式PCR”或“串联PCR”指两轮或更多轮(步骤)的核酸扩增，通常包括两轮PCR，其中第一轮PCR使用一对外部引物来扩增选定核酸分子，第二轮扩增使用一对内部引物使来自选定的经扩增核酸分子的扩增子进一步扩增，所述内部引物在外部引物结合位置的内侧结合扩增子。

在本说明书的上下文中，术语“半巢式PCR”或“半串联PCR”指一种PCR反应类型，其中第一轮外部引物中的一个也包含在第二轮扩增反应中，与相应的内部引物一起引发选定扩增子的扩增，所述内部引物在其他第一轮引物结合位置的内侧位置上与相同的扩增子结合。

在本说明书的上下文中，术语“多重PCR”或“多重核酸扩增”或“多重扩增”指核酸扩增反应(通常为PCR)，其包括多于一对引物，使得两种或更多种不同的选定核酸序列在一个单独反应管中通过该反应被扩增，如图1所示。

在本说明书的上下文中，术语“选定的核酸分子”和“选定的核酸序列”指具有特定核酸序列的核酸分子。例如，在基因表达分析的上下文中，一种选定的核酸序列指特定基因的基因表达产物，其具有特定的核酸序列，而多种选定的核酸序列指多种特定基因的基因表达产物。

在本说明书的上下文中，术语“核酸”指由核苷酸亚基组成的复杂有机酸分子。两种主要的核酸是DNA和RNA。这包括所有核酸的亚类，例如基因组DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、cDNA等。它还指多种形式的RNA例如mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA等。

在本说明书的上下文中，术语“cDNA”指通过逆转录从mRNA产生的DNA序列。cDNA的命名是由于其序列与原始mRNA序列互补。

在本说明书的上下文中，术语“哺乳动物”包含人、宠物(例如猫和狗)以及家畜(例如马、牛、猪、绵羊等)。

在本说明书的上下文中，术语“干燥的”指干燥形式的物质，常为晶体或粉末。

在本说明书的上下文中，术语“生物”指任何物种的植物、动物、细菌、真菌、病毒、支原体或经遗传改造的生物，并扩展到寄生性DNA序列等。

在本说明书的上下文中，术语“Tm”在应用于寡核苷酸引物时，指寡核苷酸有50％的概率与其互补核酸序列以双链形式结合时的温度。

在本说明书的上下文中，术语“UTP”指三磷酸尿苷。

在本说明书的上下文中，术语“尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)”指能够在含有脱氧尿苷的DNA中水解脱氧核糖糖基与尿嘧啶之间N-糖苷键的酶。

在本说明书的上下文中，短语“扩增子之间对反应组分发生显著竞争之前的点”指扩增反应中的循环或阶段，在该循环或阶段之后，选定核酸序列的进一步扩增将对第二轮扩增中所得定量的准确性有害。不限于任何特定机制或理论地，所说的对定量的准确性有害被认为是由于扩增序列(扩增子)之间对反应组分(例如dNTP和引物)的竞争所致。随着循环数的增加，这些组分逐渐变得越来越稀少，由此在反应中浓度越来越低。随着可用反应组分变得越来越有限，这有利于扩增更丰富的核酸种类，其干扰了第二轮扩增反应中定量的准确性。因此，根据输入核酸的量选择多重扩增的最佳循环数，以使扩增过程中扩增子之间对反应组分的任何竞争作用最小化，同时提供对每个选定核酸序列的特异性扩增。在实践中，例如当使用50-500ng核酸时，约10个循环的多重扩增足以将选定核酸分子扩增至扩增子之间对反应组分发生显著竞争之前的点。类似地，当使用0.5-50ng核酸时，优选约15个循环的多重扩增。当使用0.01-0.5ng核酸时，优选约20个循环的多重扩增。当输入更低量的核酸时，可使用更大的多重扩增循环数。本发明方法中所使用的多重扩增反应循环数通常不引起产生这样大量的选定核酸序列产物，以致于不利地影响第二轮扩增中所估计定量的准确性。

本发明将参考非限制性实施例进行更具体的描述。

实施例

实施例1.MT-PCR可用于测定许多不同基因的表达，其使用来自单个样品的多重扩增，并在第二轮扩增中加入SYBR-绿检测系统。

使用通用报告子例如SYBR-绿报告子染料对多个基因表达产物进行多重扩增和测定目前是不可能的。但是，MT-PCR方法能够同时扩增许多基因的表达产物。MT-PCR方法概述于图1，它是显示MT-PCR中引物排列的示意图，展示了串联和半串联实施方案。反向外部引物以“RT”标出，通常用于在所示扩增反应之前的逆转录反应过程中引发合成对每种基因具有特异性的cDNA。两种方法均以扩增和定量4种不同基因(1-4)的基因表达产物的方法显示，但其在实践中通常可用于扩增72个不同基因的表达产物。在串联MT-PCR中，使用外部引物作为多重引物，而内部引物在第二轮扩增反应中定量核酸时使用。在半串联MT-PCR中，一种内部引物在第一轮多重扩增反应和第二轮扩增反应中共用。

为了证明MT-PCR方法在定量多种基因的表达产物上特别有效，从MCF7人上皮细胞中提取50ng RNA，用于72孔“基因盘”形式的半串联MT-PCR测定，以使用SYBR-绿检测来同时定量72种不同基因的表达产物。在该方法的第一阶段中使用72种寡核苷酸引物对，其中24种示于表1和2。每对引物对一种给定的基因表达产物具有特异性，将这些与逆转录酶和Taq聚合酶一起加入到50ngRNA中。在55℃下1分钟逆转录反应之后(其中反向基因特异性PCR引物发挥逆转录引物作用)，所述逆转录酶在95℃下变性5分钟，接着将72种基因共扩增10个循环。每个循环保持温度在95℃5秒、60℃20秒以及72℃20秒。然后，将富含72种基因的相应扩增子的所得产物分成等分试样，使用多重扩增中所用外部引物中的一种和相应的选定扩增子特异性内部引物一式三份对每个等分试样进行扩增和定量，其中使用如图1所示的半串联MT-PCR方法。对于此阶段，使用95℃1秒、60℃10秒和72℃10秒的循环。所述测定的两个阶段都在RG3000 Rotor-Gene实时热循环仪(Corbett Research)中进行，其可组合任何数量的保持温度和循环条件。72个扩增反应的结果示于表2A，代表以一式三份进行的24种基因表达测量。此结果显示，每种基因表达产物均以可再现的形式扩增，因为对应于一式三份的单个基因测量的每组三条线都具有几乎相同的曲线。重要的是，这些产物还以高特异性扩增，因为如图2B所示的相应熔解曲线证明，在这些反应中次要扩增产物检测不到，并且图2C中所示的Bioanalyzer“凝胶”图像展示了在每种情况下每个反应均得到单一的扩增产物。

表1.半串联MT-PCR第一轮引物

基因	正向	反向
			ESR1	GATGAATCTGCAGGGAGG	TCGGTGGATATGGTCCTTCT
top2A	TGCTACACATTTCCCAGATGA	GATTCTTGGTTTTGGCAGGA
			CCND1	GCGGAGGAGAACAAACAGAT	TGAGGCGGTAGTAGGACAGG
PTEN	TGGCACTGTTGTTTCACAAG	AGGTAACGGCTGAGGGAACT
			MDM2	GAGCAGGCAAATGTGCAATA	TTTTTGTGCACCAACAGACTTT
TP53	GGAGCACTAAGCGAGCACTG	CCTCATTCAGCTCGGAAC
			VEGF	CAAGATCCGCAGACGTGTAA	GGAGGCTCCTTCCTCCTG
MYC	TGCTCCATGAGGAGACACC	CTCTGACCTTTTGCCAGGAG
			PgR	GTCAGTGGGCAGATGCTGTA	AGCCCTTCCAAAGGAATTGT
BSG	TGGGCCTGGTACAAGATCAC	GCCTCCATGTTCAGGTTCTC
			GSTM3	GGGAAATTCTCATGGTTTGC	CGATTTTCTCCAAAGCCTCA
MKI67	CCCCACCTCAGAGAGTTTTG	GGGCGTTTTTGCTACGTTT
			MELK	GGAGCAAAAGGAAGGGTTCT	TGCATTGTCACTTTCCCAAA
MAD2L1	TCCTGGAAAGATGGCAGTTT	TGGCAGAAATGTCACCGTAG
			BUB1	CTCAGCAACAAACCATGGAA	TCCACATATCCAAATGAGGAAG
TPD52	GCAAGACGTGACAGCAACAT	TTCCAGCTTTTTGGTGATGA
			HPRT	GCAGACTTTGCTTTCCTTGG	TTTCAAATCCAACAAAGTCTGG
NAT1	ATTCAAGCCAGGAAGAAGCA	TCGGATCTGGTGTTGAAGAA
			E2F1	ATCAAAGCCCCTCCTGAGAC	TGGTGGTGGTGACACTATGG
TGFB2	GCATGCCCGTATTTATGGAG	TTGGGTGTTTTGCCAATGTA
			TGFB3	GGGCTTTGGACACCAATTAC	GCAGATGCTTCAGGGTTCAG
SMAD4	AGGACAGCAGCAGAATGGAT	GGAATGCAAGCTCATTGTGA
			RELA	CTCCTGTGCGTGTCTCCAT	GGTCCGCTGAAAGGACTCTT
BTF3	CAGGAAAAACTCGCCAAACT	TGGATCACTGTTCCTTGGTTT

表2.半串联MT-PCR第二轮引物

基因	正向	反向
			ESR1	GATGAATCTGCAGGGAGG	TCCAGAGACTTCAGGGTGCT
top2A	TGCTACACATTTCCCAGATGA	CGGTAGTGGAGGTGGAAGAC
			CCND1	GCGGAGGAGAACAAACAGAT	GGCGGATTGGAAATGAACT
PTEN	TGGCACTGTTGTTTCACAAG	TCACCTTTAGCTGGCAGACC
			MDM2	GAGCAGGCAAATGTGCAATA	AAGCAATGGCTTTGGTCTAA
TP53	GGAGCACTAAGCGAGCACTG	CACGGATCTGAAGGGTGAAA
			VEGF	CAAGATCCGCAGACGTGTAA	TCACATCTGCAAGTACGTTCG
MYC	TGCTCCATGAGGAGACACC	CCTGCCTCTTTTCCACAGAA
			PgR	GTCAGTGGGCAGATGCTGTA	TGCCACATGGTAAGGCATAA
BSG	TGGGCCTGGTACAAGATCAC	GCGAGGAACTCACGAAGAAC
			GSTM3	GGGAAATTCTCATGGTTTGC	CAGGCACTTGGGGTCAAATA
MKI67	CCCCACCTCAGAGAGTTTTG	GGGCTTGCAGAGCATTTATC
			MELK	GGAGCAAAAGGAAGGGTTCT	CAACAGTTGATCTGGATTCACTAA
MAD2L1	TCCTGGAAAGATGGCAGTTT	CGGATTTCATCCTGGATAGC
			BUB1	CTCAGCAACAAACCATGGAA	GTGCCAAAGAGCATGCAATA
TPD52	GCAAGACGTGACAGCAACAT	GAGCCAACAGACGAAAAAGC
			HPRT	GCAGACTTTGCTTTCCTTGG	ACACTTCGTGGGGTCCTTTT
NAT1	ATTCAAGCCAGGAAGAAGCA	CAATGTCCATGATCCCCTTT
			E2F1	ATCAAAGCCCCTCCTGAGAC	CTCAGGGCACAGGAAAACAT
TGFB2	GCATGCCCGTATTTATGGAG	GCAGCAAGGAGAAGCAGATG
			TGFB3	GGGCTTTGGACACCAATTAC	GCAGATGCTTCAGGGTTCAG
SMAD4	AGGACAGCAGCAGAATGGAT	GTTTTGGTGGTGAGGCAAAT
			RELA	CTCCTGTGCGTGTCTCCAT	GTTTCTCCTCAATCCGGTGA
BTF3	CAGGAAAAACTCGCCAAACT	TCATCTGCTGTGGCTGTTCT

实施例2.MT-PCR可用于从少量已断裂核酸的样品(例如在存档FFPE组织样品中存在的)中定量核酸(例如基因表达产物)。

人们非常期望能定量来自存档甲醛固定石蜡包埋(FFPE)样品的基因表达，但是受到了这些标本中低RNA回收(约10ng/10μm切片)的限制，还受到所回收的分子高度断裂性质的限制。不可能使用寡聚-dT引物进行线性RNA扩增或逆转录，因为不太可能任何RNA片段都含有RNA的3’端和待测量的扩增子。因此，目前的方法只允许使用基因特异性或随机引发的逆转录来定量来自每个样品中数目很小的基因的表达。

为了证明MT-PCR方法在高度断裂和降解的核酸中同时扩增许多基因上特别有效，首先从FFPE异种移植标本的单个切片中提取RNA，所述切片在RNA提取前已保存十年。使用蛋白酶K消化和硅胶柱纯化(Ambion)从直径4mm、厚度10μm的切片中提取RNA。将从FFPE切片中所提取总RNA的三分之一(估计含有约3ng)用于如实施例1所述的半串联MT-PCR方法，其中使用表1和2所示的外部和内部引物，使用15个循环的多重扩增。一式三份扩增的24种基因的基因表达谱示于图3A。这表明，所述方法可用于在极少量断裂RNA中有效且可再现地扩增和定量基因表达产物，如扩增曲线的高度再现性所示。重要的是，这些产物还以高特异性扩增，因为次要扩增产物在这些反应中检测不到，如图3B所示的相应熔解曲线所示，所述曲线展示了每种情况下每个反应均产生以单峰代表的单个扩增产物。此结果证明，所述方法可有效地用于从极少量核酸模板中扩增许多不同的核酸序列，所述模板例如得自单个细胞、激光切割的组织活检、法医样品等。

实施例3.MT-PCR用于扩增和定量得自单细胞和激光切割微样品中的核酸的用途

使用包括20个多重扩增循环的MT-PCR方法来扩增和定量24种基因的表达产物，其中使用仅为10pg RNA的样品，这相当于通常得自单个哺乳动物细胞的总RNA模板的大致量。图4A显示从10pg MCF7 RNA中定量24种基因，图4B显示每种扩增产物的相应熔解曲线。24种基因表达产物中的20种被检测和定量，没有不希望的次要扩增产物。此结果证明，所述方法可有效地用于从极少量核酸模板中扩增许多不同的核酸序列，所述模板例如得自单个细胞、激光切割的组织活检、法医样品等。如所示，有必要在多重扩增步骤中使用相对大的循环数，以从这样的少量样品中有效扩增所述核酸，在此情况下20个循环是充分的。所述方法特别可用于法医应用等，在这些情况下样品经常大小非常有限并且同时核酸为高度降解/断裂的结构。

实施例4.建立合适的MT-PCR的反应条件和参数。

为了对给定的多重反应系统建立合适的多重扩增循环数，必须根据经验对给定的样品/引物系统确定合适的循环数。理想情况下，多重扩增步骤应该进行足够的循环数以提供足够的扩增水平，以便于第二轮扩增中对每种选定核酸序列进行准确定量。但是，多重扩增的循环数还必须受到限制，使其不允许进行至超过某一循环数，在该循环数之后选定核酸序列的进一步扩增将对第二轮扩增中所获得定量的准确性有害。对定量的准确性有害认为是由于扩增序列(扩增子)之间对反应组分(例如dNTP和引物)的竞争所致。随着循环数的增加，这些组分逐渐变得越来越稀少，由此在反应中浓度越来越低。

作为建立用于给定的第一轮多重扩增反应的合适循环数的指导，最丰富的mRNA种类或核酸序列的指数扩增在第一轮扩增中必须不显著增加。所述显著增加可通过以下步骤来检查：使用单独的RT反应(每个反应中包含不同的RNA输入量)，然后通过包含SYBT-绿染料以监测反应来检测在第一轮扩增过程中所产生核酸的量。在这种情况下扩增反应只包含对一种选定核酸序列(选定的最丰富的RNA种类)具有特异性的引物，因而此反应不是多重扩增反应，而是单一反应。如图5所示，输入50-500ng RNA在最初10轮反应中只产生少量来自丰富RNA的核酸，显示这是使用此输入RNA范围时的合适循环数。作为建立所用的合适多重扩增循环数的一般原则，多重扩增应避免进行到超过合成总量百分数5％的多核苷酸的点，所述总量是指允许所述反应进行足够的循环数时通常产生的量，在该循环数后进一步的循环不再产生进一步的扩增。

因此，常规研究应用中推荐10个循环的多重PCR。这可与通常使用约50ng RNA分析单个基因的基因表达产物的常规qPCR相比。

对于5-50ng的RNA输入，前15个循环的反应只产生少量最丰富RNA的核酸，如图5所示，因此此量级的样品推荐15个循环的多重PCR，其包括对来自FFPE切片的RNA样品的分析。

对于0.01-5ng RNA的输入，在显著扩增丰富RNA种类之前20个循环的多重扩增是可能的，如图5所示。因此20个循环的多重PCR推荐用于法医、微生物和激光切割显微术样品。实践中，如果在多重扩增步骤中使用25个或更多个循环的扩增来分析极少量样品，则这种更高的循环数有利于形成引物二聚体和次要产物，但是本领域技术人员应了解，在一些情况下使用多于25个循环的多重PCR是可行的。类似的灵敏度范围适用于DNA以及RNA的分析。

为了直接比较改变输入RNA模板量或多重扩增循环数时定量的准确性，改变这些参数对24种基因的基因表达产物进行扩增和定量。在使用0.1ng或1.0ng的RNA(图6A)以及使用10或15个循环的多重扩增(图6B)时，比较在35个循环的第二轮扩增中所得的定量。在每种情况中，以对同一串联MT-PCR测定中比较基因的比值来对23种基因的表达进行定量和比较，以使数据归一化。图6A显示，当使用0.1或1ng的RNA时获得相似的测量，给出0.96的相关系数，证明所使用RNA量的倍数改变可得到相似的相对定量值。当使用不同多重扩增循环数测定相同RNA量时，相关性仍高于0.96，但是与预计一致，在绝对倍数差异上出现系统误差(图6B)。这证明，当对核酸量进行定量例如对基因表达进行定量时，每个重复实验应该只在使用相同多重扩增循环数的情况下进行比较。

实施例5.建立用于串联PCR的适当的Taq聚合酶、引物浓度和逆转录酶，以使引物二聚体的形成最小化。

为了定量少量表达基因的基因表达产物，通常必须使用更高的扩增循环数以扩增足以进行分析的产物。在这些情况下，经常形成引物二聚体，其可能使通过常规方法的有效定量变的复杂或者对其造成阻碍。为了使用本发明的方法使这一问题最小化，在扩增和定量一组稀有基因(ERBB2、ESR1、TP53、MYC和GEM)的基因表达产物的实验中，优化了应包含在第二轮扩增反应中的Taq聚合酶的水平。在将约0.5单位的Taq掺入到含有约0.2μM引物和2％DMSO的20μl反应中时获得了最佳性能，其产生如图7A所示干净的熔解曲线。在第二轮扩增反应中使用0.5U或1.0U Taq之间的比较通过分别示于图7A和7B的所得熔解曲线进行说明，这证明当使用较高水平的Taq(例如1.0U)时，可形成引物二聚体。

然后在后续扩增之前从RNA模板合成cDNA过程中改变逆转录酶(MMLV)量的情况下进行相似实验。然后使用所述方法扩增选定的高表达(TOP2A、BTF3、MDM2、RPL35)基因和低表达基因(ESR1)，通过图7C和7D所示熔解曲线来展示逆转录(RT)反应中MMLV量的变化对于其后第二轮扩增反应质量的影响。图7C中熔解曲线显示，当之前的RT反应中使用20U的MMLV时未获得显著的次要扩增产物。但是，当使用约200U的较高水平MMLV时，导致之后扩增出非特异性产物，如图7D中所示的熔解曲线中的多个峰所示。使用Superscript III逆转录酶(Invitrogen)也获得类似结果。因此，推荐在典型的20μl RT反应中使用约20U逆转录酶。

实施例6.在多个实验中比较定量估值的再现性。

在不同的4天，从50ng的同一批RNA进行十次独立的MT-PCR反应。如实施例1所述，使用第一轮中10个循环的多重PCR来实施串联MT-PCR。在单个实验中，将20μl RT混合物分为3×6μl的等分试样，用于3组各24种基因的测量，然后进行平均得到表3所示的数据。比较10个实验之间的这些测量的平均值。一种基因(NatI)从RNA中未得到，得出平坦的循环曲线。对于所有23种检测基因，Ct值的变异系数从0.01到0.05变化，平均值为0.03，证明在MT-PCR实验之间的特别高水平的精确度。

表3.在多个实验之间比较基因表达定量的估值。

基因	1.0	2.0	3.0	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0	9.0	10.0	平均值	SD	CV
														ESR1top2ACCND1PTENMDM2TP53VEGFMYCPgRBSGGSTM3MKI67MELKMAD2L1BUB1TPD52HPRTNAT1E2F1TGFB2TGFB3SMAD4NFkBBTF3	28.119.818.518.320.719.826.224.021.518.220.317.321.124.225.423.426.50.020.123.025.323.625.014.2	28.120.719.619.121.720.026.625.322.218.621.118.322.324.526.224.626.00.021.224.526.724.726.814.9	28.221.519.819.422.420.426.724.922.419.222.018.423.124.726.424.426.00.020.624.626.124.425.914.9	28.020.918.918.821.520.026.724.521.918.421.617.822.524.226.724.325.60.020.523.926.324.126.114.6	28.021.518.518.521.019.125.723.422.517.920.717.922.123.926.023.524.90.019.723.824.923.624.114.6	27.820.117.717.820.318.125.022.521.217.119.717.421.323.025.223.023.90.019.023.123.623.023.214.1	27.720.416.918.020.218.124.222.620.916.820.516.621.623.224.722.824.90.018.222.622.422.523.113.6	27.520.117.718.421.019.324.823.120.917.719.817.321.323.224.722.725.60.019.423.024.323.323.714.0	27.719.718.218.120.719.125.422.920.817.819.617.421.223.125.022.724.80.019.322.824.523.424.314.2	27.619.718.118.820.419.026.422.921.017.819.917.521.422.624.923.024.20.019.423.324.223.323.814.1	27.920.418.418.521.019.325.823.621.518.020.517.621.823.725.523.425.20.019.723.524.823.624.614.3	0.240.690.880.510.700.780.891.000.670.700.830.530.670.720.740.740.840.000.880.701.320.661.290.42	0.010.030.050.030.030.040.030.040.030.040.040.030.030.030.030.030.030.040.030.050.030.050.03

														平均值													0.03

实施例7.MT-PCR在使用细胞系模型的诊断中用于癌症相关基因表达定量的用途。

7.1测量肿瘤来源细胞系中的基因表达

相信肿瘤来源的人乳腺癌细胞系保留了相当多的其来源肿瘤细胞的遗传背景和生理特性。在本研究中，我们通过半巢式MT-PCR在15种人乳腺癌细胞系中一式三份测定了24种基因的表达水平。

7.2材料

将2μl 100μM浓度的表4中所列24对引物中的每一种与4μl水混合，从而制成外部引物混合物。

用干燥的引物制备Corbett Research“基因盘”

在0.2ml管中制备各含有一对表5中所示引物的外部引物混合物，其含有10μl 100μM正向引物原液、10μl 100μM相应反向引物原液和605μl水。然后使用CAS1200机器人(Corbett Research)将每种引物混合物一式三份地等分出5μl进入Corbett Research基因盘。然后将这些等分试样在基因盘中用SpeedVac干燥仪加热干燥15分钟，然后使用基因盘热封器在160℃将所述盘密封。然后将每个盘保存于4℃待用。

RT-PCR和PCR原液

明胶-不含RNA酶(5ml)

将50mg明胶(Sigma G-2625)加入5.0ml水和5μl DEPC中，然后在60℃孵育1小时，期间不时进行混合，然后保存在-20℃待用。

10×RT缓冲液(10ml)

含有30mM MgCl₂、300mM KCl、1mM DTT和0.1mg/ml明胶的500mM TrisHCl(pH8.5)。以0.5ml的等分试样保存在20℃待用。

10×PCR缓冲液(10ml)

含有500mM KCl、30mM MgSO₄和1μg/ml明胶的200mMTrisHCl(pH8.5)。以0.5ml的等分试样保存在20℃待用。

7.3方法

简言之，使用RNeasy方法(Qiagen)从每种细胞系的培养物中提取RNA并稀释，使得每个MT-PCR反应使用50ng。RT-PCR反应混合物制备于0.2ml薄壁PCR管中，包含：50ng总RNA、每种引物终浓度均为0.1μM的外部引物混合物、0.3mM的dNTP(Roche)、RT-PCR缓冲液、2％DMSO、0.5μl的RNA酶抑制剂、20单位MMLV(Invitrogen)、1单位Taq DNA聚合酶(Invitrogen)。

第一轮多重扩增

将每个管置于RG3000(Corbett Research)中，按照如下进行热处理：55℃1分钟(逆转录)、95℃5分钟(RT变性)，然后是95℃10秒、60℃20秒、72℃20秒的10个循环。这完成了多重PCR步骤，将产物1∶50稀释于水中。

第二轮扩增反应混合物

将500μl的多重扩增产物加入每个1.5ml的PCR反应混合物中以达到以下终浓度：0.2mM dNTP、2％DMSO、25U/ml Taq、PCR缓冲液、1∶20000稀释的SYBR-绿。然后将20μl的PCR反应混合物加入基因盘(含有干燥的内部引物)中的每个位置，PCR进行95℃1秒、60℃10秒和72℃10秒的35个循环。在72℃延伸步骤结束时测量荧光。应注意，此方法使用串联和半串联MT-PCR也可成功应用。

7.4结果

使用串联MT-PCR对每种细胞系中表皮生长因子受体基因(EGFR)的表达进行定量。使用内部比较基因对得自每种细胞系的数据进行归一化，以获得15种细胞系的每一种中EGFR表达的相对定量，然后如图8中所示将其并列进行比较。可见，EGFR只在15个细胞系中的2种中高表达，即BT20和SKBR3。BT20和SKBR3均已知过表达此基因，这一结果在图8中并列定量比较的MT-PCR定量结果中准确地反映出来。这类信息在癌症患者的治疗中具有价值，并且在一些情况下为确定合适的药物治疗提供必要的信息。

表4.串联MT-PCR第一轮外部引物

基因	正向	反向
			ERBB2	ACATGACCCCAGCCCTCTAC	AGAGAGTCTTGGCCCTTTCC
ESR1	TGGAGATCTTCGACATGCTG	GCCATCAGGTGGATCAAAGT
			EGFR	CTTGCAGCGATACAGCTCAG	GGTCCTGGTAGTGTGGGTCT
top2A	GCTGATGATGTTAAGGGCAGT	GATTCTTGGTTTTGGCAGGA
			CCND1	TCCTCTCCAAAATGCCAGAG	TGAGGCGGTAGTAGGACAGG
PTEN	CAGTCAGAGGCGCTATGTGT	AGGTAACGGCTGAGGGAACT
			CDH1	AGCGTGTGTGACTGTGAAGG	CTCTTCTCCGCCTCCTTCTT
CDKN1A	CCATGTGGACCTGTCACTGT	AAGATGTAGAGCGGGCCTTT
			MDM2	GAAGGAAACTGGGGAGTCTTG	TTTTTGTGCACCAACAGACTTT
BTF3	CCTTATTCGCTCCGACAAGA	TGGATCACTGTTCCTTGGTTT
			RPL35	AAGGAGGAGCTGCTGAAACA	GCATGGCACGTGTCTTCTTA
VEGF	GAGCGGAGAAAGCATTTGTT	GGAGGCTCCTTCCTCCTG
			TP53	CTTCGAGATGTTCCGAGAGC	TCTGAGTCAGGCCCTTCTGT
MYC	CCTACCCTCTCAACGACAGC	CTCTGACCTTTTGCCAGGAG
			PgR	TGGTGTTTGGTCTAGGATGGA	AGCCCTTCCAAAGGAATTGT
BSG	TGCTGGTCTGCAAGTCAGAG	GCCTCCATGTTCAGGTTCTC
			MKI67	AGCAACCGCAGTTGACAAG	GGGCGTTTTTGCTACGTTT
GSTM3	TTGGAAGAGCTACCTGGACAA	CGATTTTCTCCAAAGCCTCA
			GEM	CTTCGAGAAGGCATCTGAGC	CCCTCAAACAGCTCCTTCAC
MELK	AAAGGGGGTTGGATAAGGTT	TGCATTGTCACTTTCCCAAA
			MAD2L1	TGTGGTGGAACAACTGAAAG	TGGCAGAAATGTCACCGTAG
BUB1	CAGCAAAGTGTGAAACATCTGG	TCCACATATCCAAATGAGGAAG
			TPD52	GAGATCAAGCGGAAACTTGG	TTCCAGCTTTTTGGTGATGA
HPRT	GACCAGTCAACAGGGGACAT	TTTCAAATCCAACAAAGTCTGG

表5.串联MT-PCR第二轮内部引物

	正向引物	反向引物
			ERBB2	GTACCCCTGCCCTCTGAGAC	CGAACATCTGGCTGGTTCAC
ESR1	GATGAATCTGCAGGGAGAGG	TCCAGAGACTTCAGGGTGCT
			EGFR	TCCTCCCAGTGCCTGAATAC	GGGTTCAGAGGCTGATTGTG
top2A	TGCTACACATTTCCCAGATGA	CGGTAGTGGAGGTGGAAGAC
			CCND1	GCGGAGGAGAACAAACAGAT	GGCGGATTGGAAATGAACT
PTEN	TGGCACTGTTGTTTCACAAG	TCACCTTTAGCTGGCAGACC
			CDH1	ATTGCAAATTCCTGCCATTC	CAGCAAGAGCAGCAGAATCA
CDKN1A	GACTCTCAGGGTCGAAAACG	GGATTAGGGCTTCCTCTTGG
			MDM2	GAGCAGGCAAATGTGCAATA	AAGCAATGGCTTTGGTCTAA
BTF3	CAGGAAAAACTCGCCAAACT	TCATCTGCTGTGGCTGTTCT
			RPL35	GACCTGAAGGTGGAGCTGTC	ACTGTGAGAACACGGGCAAT
VEGF	CAAGATCCGCAGACGTGTAA	TCACATCTGCAAGTACGTTCG
			TP53	GGAGCACTAAGCGAGCACTG	CACGGATCTGAAGGGTGAAA
MYC	TGCTCCATGAGGAGACACC	CCTGCCTCTTTTCCACAGAA
			PgR	GTCAGTGGGCAGATGCTGTA	TGCCACATGGTAAGGCATAA
BSG	TGGGCCTGGTACAAGATCAC	GCGAGGAACTCACGAAGAAC
			MKI67	CCCCACCTCAGAGAGTTTTG	GGGCTTGCAGAGCATTTATC
GSTM3	GGGAAATTCTCATGGTTTGC	CAGGCACTTGGGGTCAAATA
			GEM	TGGTTGGCAACAAAAGTGAC	ACAGCTGCAGAGGTCTCGAT
MELK	GGAGCAAAAGGAAGGGTTCT	CAACAGTTGATCTGGATTCACTAA
			MAD2L1	TCCTGGAAAGATGGCAGTTT	CGGATTTCATCCTGGATAGC
BUB1	CTCAGCAACAAACCATGGAA	GTGCCAAAGAGCATGCAATA
			TPD52	GCAAGACGTGACAGCAACAT	GAGCCAACAGACGAAAAAGC
HPRT	GCAGACTTTGCTTTCCTTGG	ACACTTCGTGGGGTCCTTTT

实施例8.MT-PCR可广泛用于任何可通过PCR测量的基因：定量内皮细胞中炎性基因的表达

为了证明MT-PCR在其它临床相关领域的其他应用，从分离自人皮肤活检的100ng RNA中定量17种炎性基因的表达，使用第一轮10个循环的多重扩增和之后35个循环的第二轮扩增进行分析。所有17种基因一式三份均高效且准确地扩增，如图9A所示。应注意，一式三份的测定显示，每种基因表达产物的均以高度再现性测量。图9B中所示的相应熔解曲线还显示，每个第二轮扩增均得到不含非特异性产物、引物二聚体等污染的单一产物，即便是在35个循环的第二轮扩增后也是如此。通过使用Bioanalyzer(AgilentTechnologies)进行分析来进一步确认扩增的特异性，如图9C所示，其清楚地显示，在每个反应中存在单一PCR产物。通过证明在标准PCR反应中单独测定时它们产生单一产物而验证了在此MT-PCR测定中使用的基因。然后它们一起用于之前对一组癌症相关基因进行过优化的高度多重MT-PCR反应，而没有进一步优化。这个例子证明，任何单独测定时良好运行的PCR反应在加入到高度多重MT-PCR反应而没有进一步优化时都很可能以基本相似的形式运行。

实施例9.MT-PCR与高分辨熔解分析结合以用于鉴定靶序列。

MT-PCR方法也可与高分辨熔解曲线分析结合，以用于多种用途，例如鉴定靶DNA序列、检测异源样品中不同病毒或细菌菌株、检测和定量SNP、DNA甲基化(亚硫酸氢盐处理之后)和基因分型(genotyping)。优选使用使双链扩增子DNA饱和的嵌入染料如SYTO9、Eva绿或LC绿的熔解曲线分析实例包括检测多种病毒毒株(Varga，A和James，D(2006)J.of Virol.Methods 132：146-153)、不同细菌种类(Bell CA和Patel R.(2005)Diagn Microbiol Infect Dis.53(4)：301-6)、DNA甲基化分析(Worm等，(2001)Clinical Chemistry47：1183-1189)和用于癌症诊断的突变和基因分型分析(Bernard，P.S.和Wittwer，C.T(2002)Clinical Chemistry 48(8)：1178-1185；PowellB.L.等，(2002)Carcinogenesis 23(2)：311-315)。高分辨率熔解分析显然对任何可通过PCR测量的基因具有广泛可用性。

为获得来自扩增反应(可含有一种或多种MT-PCR产物)的熔解曲线谱，将产物逐渐从约60℃加热到约95℃，其中荧光报告子(例如SYTO-9染料)在DNA从双链形式变为单链形式的温度下从扩增产物中迅速解离，造成在特征温度下所发出荧光的降低。这种荧光的改变受到连续监测或者在温度梯度下定期监测，然后将荧光改变对温度梯度轴作图，获得熔解曲线谱。因为每种特定的靶PCR产物具有特定的熔解温度(Tm)，因此可通过其不同的熔解温度对其进行鉴定，如图10A和10B中所示。Rotor-gene 6000(CorbettResearch)精确的温度控制允许待测熔解温度有小于0.02℃的准确度。这足以区分通过MT-PCR扩增的靶标中的小突变，或者证实反应中扩增了正确的靶标。在图10A中，通过MT-PCR从选自2种人乳腺癌细胞系的8个样品中扩增TP53基因中易突变的区域，并通过Rotor-gene 6000上的高分辨率熔解进行分析。可以看出，来自SKBR3细胞系的扩增产物显示突变体TP53基因区(熔解温度86.46℃)，这可轻易地与具有野生型TP53基因区域(熔解温度87.16℃)的MCF7细胞系扩增产物区分开来。由于TP53基因中的一些高变基序已知具有治疗后果，因此这种分析和其他类似分析可用于预测药物，如Powell等(上文)所述。图10B显示对不显示些突变的TP35基因区进行的比较研究。此区域也使用MT-PCR在来自两种细胞系的样品上进行扩增。在这种情况下，所述曲线表明来自SKBR3和MCF7的MT-PCR扩增产物是相同的，具有相同的84.90℃的熔解温度。另外应注意，优化第二轮扩增反应组分以提高熔解谱的准确性和可靠性是有利的，在这一点上，第二轮扩增混合物中不包含DMSO经常是有益的。

实施例10.MT-PCR与高分辨率熔解分析结合以用于细菌鉴定

仍使用实施例9中所述的高分辨率熔解曲线分析方法，但是提供比较DNA样品，使得在熔解曲线归一化之后测试DNA可与对照DNA进行比较，以得到高灵敏度的与对照的一致性或不相似性测量。在图11A和11B中，显示了许多细菌DNA提取物在使用肠球菌(Enterococcus)16S rRNA基因特异性引物进行扩增之后的熔解曲线。其它细菌与16S序列的相似性意味着它们也产生PCR产物，即使在通过MT-PCR进行巢式扩增之后。在对图11A中所示区域之间的熔解曲线归一化之后，一条熔解曲线被鉴定为真正的肠球菌熔解曲线，将所有其它的熔解曲线与之进行比较(图11B)。在此图中，水平线来自比较肠球菌和被以98％置信度鉴定的另一个肠球菌样品。其余的熔解曲线显示为不同的细菌，因为它们可能是肠球菌的置信度水平非常低(表5)。MT-PCR特别适用于高分辨率熔解分析，因为产物的纯度提高了结果的可靠性。另外，就法医分析而言，MT-PCR的灵敏度非常适用于痕量的人组织，就组织分型(tissuetyping)而言，可同时测定大量靶标使得所述方法非常准确。

表5

样品	基因型	置信度％
			肠球菌(比较物)	肠球菌	100
葡萄球菌	变异	0.62
			肠杆菌	变异	0.26
链球菌	变异	0.23
			葡萄球菌	变异	0.38
肠球菌	肠球菌	98.28

本领域技术人员应理解，可使用多种热循环平台和检测系统(包括多种荧光报告子)来实施MT-PCR方法和包含或联合了高分辨率熔解曲线分析的MT-PCR方法。例如，尽管可使用Rotor-gene6000实施扩增反应和熔解曲线分析，但是也可使用其它一些系统来完成，例如Light cycler(Roche)、ABI PRISM7000、7700和7900(Applied Biosystems)、SmartCycler(Cepheid)、iCylcer^TM(BioRad)和其它一些如本领域技术人员已知的这样的平台。因此，可以使用多种荧光报告子例如SYBR-绿I、SYT09、LC绿、Eva绿、Lightcycler探针、LUX^TM荧光引物等实施MT-PCR和包含或联合了高分辨率熔解曲线分析的MT-PCR，这对本领域技术人员来说是很明显的。

尽管参考许多优选实施方案对本发明进行了描述，但是本领域技术人员应理解，在不脱离本发明范围的情况下，多种改变和修饰都是可能的。

Claims

1.从核酸分子库中扩增多种选定的核酸分子的方法，其包括：

(a)在第一轮多重反应中扩增多种选定的核酸分子，所述反应包含多种外部引物对，每对引物对一种选定核酸序列具有特异性并且在所述反应中过量存在，其中允许所述反应进行到扩增子之间对反应组分发生显著竞争之前的点；

(b)稀释从所述第一轮多重反应进入多个第二轮扩增反应的所述扩增子和残余反应组分，每个所述第二轮扩增反应均包含至少一对内部引物，每对引物对一种所述选定核酸序列具有特异性，其中所述稀释为25倍稀释，使得第二轮扩增中的进一步引发基本上由所述内部引物指导，由此基本上只扩增由所述内部引物所引发的所述选定核酸序列；和

(c)在所述多个第二轮扩增反应中进一步扩增所述选定的核酸分子，使得每个第二轮反应由所述内部引物分别进一步扩增所述多种选定核酸分子中的亚组。

2.从核酸分子库中扩增多种选定核酸分子的方法，其包括：

(a)在第一轮多重反应中扩增多种选定的核酸分子，所述反应包含含有外部引物的多种第一轮引物对，每对引物对一种选定核酸序列具有特异性并且在所述反应中过量存在，其中允许所述反应进行到扩增子之间对反应组分发生显著竞争之前的点；

(b)稀释从所述第一轮多重反应进入多个第二轮扩增反应的所述扩增子和残余反应组分，每个所述第二轮扩增反应均包含至少一对第二轮引物，每对引物包含内部引物和一种所述外部引物，并对一种所述选定核酸序列具有特异性，其中所述稀释为25倍稀释，使得第二轮扩增中的进一步引发基本上由所述第二轮引物指导，由此基本上只扩增由所述第二轮引物所引发的所述选定核酸序列；和

(c)在所述多个第二轮扩增反应中进一步扩增所述选定的核酸分子，使得每个第二轮反应由所述第二轮引物分别进一步扩增所述多种选定核酸分子中的亚组。

3.估计来自核酸分子库的选定核酸分子数目的方法，其包括：

(a)在第一轮多重反应中扩增多种选定的核酸分子，所述反应包含多种外部引物对，每对引物对一种选定核酸序列具有特异性并且在所述反应中过量存在，其中允许所述扩增反应进行到扩增子之间对反应组分发生显著竞争之前的点；

(b)稀释从所述第一轮多重反应进入多个第二轮扩增反应的所述扩增子和残余反应组分，每个所述第二轮扩增反应均包含可检测报告子和至少一对内部引物，每对引物对一种所述选定核酸序列具有特异性，其中所述稀释为25倍稀释，使得第二轮扩增中的进一步引发基本上由所述内部引物指导，由此基本上只扩增由所述内部引物所引发的所述选定核酸序列；

(c)在所述多个第二轮扩增反应中进一步扩增所述选定的核酸分子，由此每个第二轮反应由所述内部引物分别进一步扩增所述多种选定核酸分子中的亚组；和

(d)通过所述可检测报告子来监测每个第二轮扩增反应，从而估计每种选定序列的选定核酸分子的数量。

4.估计来自核酸分子库的选定核酸分子数目的方法，其包括：

(b)稀释从所述第一轮多重反应进入多个第二轮扩增反应的所述扩增子和残余反应组分，每个所述第二轮扩增反应均包含可检测报告子和至少一对第二轮引物，每对引物包含内部引物和一种所述外部引物，并对一种所述选定核酸序列具有特异性，其中所述稀释为25倍稀释，使得第二轮扩增中的进一步引发基本上由所述第二轮引物指导，由此基本上只扩增由所述第二轮引物所引发的所述选定核酸序列；

(c)在所述多个第二轮扩增反应中进一步扩增所述选定的核酸分子，使得每个第二轮反应分别进一步扩增所述多种选定核酸分子中的亚组；和

5.根据权利要求3或4的估计来自核酸分子库的选定核酸分子数目的方法，其中所述可检测报告子是嵌入双链DNA的染料。

6.根据权利要求3或4的估计来自核酸分子库的选定核酸分子数目的方法，其中所述可检测报告子是与单链DNA相互作用的荧光探针。

7.根据权利要求3或4的估计来自核酸分子库的选定核酸分子数目的方法，其中所述第二轮扩增反应包含多种引物对和多种荧光探针，从而扩增每种选定序列的多种选定核酸分子和定量。

8.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述核酸分子包括DNA分子。

9.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述第二轮扩增反应中所包含的所述引物的Tm高于所述第一轮扩增反应中所包含的所述外部引物中至少一种，使得所述第二轮扩增反应中的所述寡核苷酸引发显著偏向于对所述具有较高Tm的所述引物有利。

10.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中至少一种所述外部引物包含UTP核苷酸，由此所述引物可被UNG酶消化。

11.根据权利要求10的方法，其中所述外部引物在所述第一轮扩增结束时通过UNG酶消化被除去，从而基本阻止所述第一轮引物对所述第二轮扩增反应的污染。

12.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述第一轮多重反应允许进行1至30个循环。

13.根据权利要求12的方法，其中所述第一轮多重反应允许进行5至25个循环。

14.根据权利要求13的方法，其中所述第一轮多重反应允许进行5至20个循环。

15.根据权利要求14的方法，其中所述第一轮多重反应允许进行10至20个循环。

16.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述方法扩增多于4种的选定核酸分子。

17.根据权利要求16的方法，其中所述方法扩增4至150种选定的核酸分子。

18.根据权利要求17的方法，其中所述方法扩增10至150种选定的核酸分子。

19.根据权利要求18的方法，其中所述方法扩增20至100种选定的核酸分子。

20.根据权利要求1-4中任一项的方法，其用于检测多态性或突变的方法中。

21.根据权利要求1至4中任一项的方法，其用于检测和鉴定选定的生物。

22.根据权利要求21的方法，其中通过所述核酸产物的测序来检测和鉴定所述生物。

23.根据权利要求21的方法，其中所述生物选自细菌、病毒、真菌、支原体和寄生虫或其组合。

24.根据权利要求20的方法，其中所述方法包括熔解曲线分析。

25.根据权利要求24的方法，其中产生分辨率范围是0.05℃到0.02℃的所述熔解曲线。

26.根据权利要求24的方法，其中产生分辨率小于0.02℃的所述熔解曲线。

27.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述扩增反应在热循环装置中自动进行。

28.根据权利要求27的方法，其中所述热循环装置是多孔实时热循环装置。

29.根据权利要求27的方法，其中所述热循环装置是连续流PCR装置。

30.根据权利要求27的方法，其中所述热循环装置是旋转式热循环装置。

31.根据权利要求20的方法，其中所述突变是插入或缺失。