CN101277715B - 神经变性疾病的治疗 - Google Patents

神经变性疾病的治疗 Download PDF

Info

Publication number
CN101277715B
CN101277715B CN2006800360941A CN200680036094A CN101277715B CN 101277715 B CN101277715 B CN 101277715B CN 2006800360941 A CN2006800360941 A CN 2006800360941A CN 200680036094 A CN200680036094 A CN 200680036094A CN 101277715 B CN101277715 B CN 101277715B
Authority
CN
China
Prior art keywords
molecule
erythropoiesis
erythropoietin
purposes
epo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2006800360941A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101277715A (zh
Inventor
A·哈泽尔贝克
F·赫廷
J·胡维勒
M·雅尔斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37622051&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN101277715(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN101277715A publication Critical patent/CN101277715A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101277715B publication Critical patent/CN101277715B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及红细胞生成分子在制备治疗脑和脊髓的神经变性疾病的药物中的用途，通过向需要此种治疗的患者的血液流路中施与有效量的药物而治疗脑和脊髓的神经变性疾病，其中所述红细胞生成分子包含选自人红细胞生成素及其类似物的具有至少一个游离氨基的红细胞生成素部分，所述人红细胞生成素类似物具有通过添加一至六个糖基化位点或重排至少一个糖基化位点而修饰的人红细胞生成素的序列；所述红细胞生成素部分与n个式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚(乙二醇)基团共价连接；本发明还涉及包含本发明的红细胞生成分子的试剂盒。

Description

神经变性疾病的治疗
本发明涉及使用新型红细胞生成剂(NEA)治疗脑和脊髓的神经变性疾病的方法。
商业可获得的蛋白治疗剂如人红细胞生成素(EPO)的生物利用率受限于它们短的血浆半寿期和易受蛋白酶降解。这些缺点阻止了它们达到最大的临床潜能。通过对EPO及其类似物进行化学修饰，已研发了新型红细胞生成剂。这些新型红细胞生成剂提供了有效和延长了的红细胞生成活性，允许最佳地控制患有肾病、AIDS和正在化疗的癌症患者的贫血症。
本发明涉及通过将治疗有效量的新型红细胞生成剂(NEA)施与需要此种治疗的患者而治疗脑和脊髓的神经变性疾病的方法，其中所述新型红细胞生成剂是经化学修饰的人红细胞生成素或经化学修饰的人红细胞生成素类似物，其包含具有特定分子量的共价连接的聚(乙二醇)基团和接头结构。
附图简述：
图1描述了注射后2和6小时大鼠血清中EPO和本发明NEA的浓度。
图2描述了注射后2和6小时大鼠体液(liquor)中EPO和本发明NEA的浓度。
图3描述了注射后2和6小时大鼠体液和血清中EPO和本发明NEA的浓度。
具体地，本发明使用的NEA是经化学修饰的红细胞生成分子，其优选地具有至少一个游离氨基并包含选自人红细胞生成素及其类似物的红细胞生成素部分，所述人红细胞生成素类似物具有通过添加一至六个糖基化位点或重排至少一个糖基化位点而修饰的人红细胞生成素的序列；所述红细胞生成素部分与n个式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚(乙二醇)基团共价连接，其中每一聚(乙二醇)基团的-CO(即羰基)与所述的氨基之一形成酰胺键；其中R为低级烷基；x为2或3，m为约450至约900；n为1至3；且选择n和m，从而使产生的NEA减去未修饰的红细胞生成素部分后的分子量为约20千道尔顿至约100千道尔顿。这样的NEA已经描述在如美国专利6,583,272中，其根据需要的程度，在此引入作为参考。
本发明中所用的NEA与EPO在生化和功能上是不同的。总之，体内和体外的数据显示，与红细胞生成素相比，NEA呈现出相当低的与红细胞生成素受体的结合亲和性，并与之更快解离。与人红细胞生成素(hEPO)相比，这些NEA呈现出明显有利的临床特性，包括体内增加的循环半寿期和血浆存留时间、降低的清除率和提高的临床活性。
涉及本发明NEA的不同特性的一些上述观察可能可以通过一种新的作用方式来解释。与红细胞生成素受体(EPO-R)的迅速解离和延长的血清半寿期可能导致通过与该受体的多种相互作用而产生增强和持续的红细胞生成效应。由于空间原因，这些多种相互作用可能足够诱导EPO-R信号级联，但没有紧密到足以导致强结合以致于受体/分子复合体内在化并降解。统计上而言，只有某些百分比的分子可能发生这样一种强结合。总体上，这种作用方式会导致一种分子在降解前激活多于一个受体的效应。
重要的是，这些NEA的有利性质允许施用频率减少、更稳定地控制血红蛋白、允许最佳地控制患有肾病、AIDS和正在化疗的癌症患者的贫血症。预期这些好处会带来更好的治疗效果和患者生活质量的提高。
天然存在的人红细胞生成素(hEPO)在体内不同组织中合成(例如肾脏、脑等)，是体液因子，其尤其刺激血红细胞产生(Carnot，P和Deflandre，C(1906)C.R.Acad.Sci.143：432；Erslev，AJ(1953 Blood 8：349；Reissmann，KR(1950)Blood 5：372；Jaeobson，LO，Goldwasser，E，Freid，W和Plzak，LF(1957)Nature 179：6331-4)。天然存在的EPO刺激骨髓中定向类红系祖细胞的分裂和分化，通过结合至红系前体细胞上的受体发挥其生物学功能(Krantz，BS(1991)Blood 77：419)。
近年来，EPO除了用来治疗贫血外，这种分子还被推定为提供了神经和心肌保护效应。见综述论文W.Jelkmann和K.Wagner，Ann.Hematol83：673-686(2004)。
本发明提供了本发明所述的NEA在治疗脑和脊髓的神经变性疾病中的用途，通过在血液流路(blood circuit)中导入NEA来实现。本发明基于以下发现，尽管本发明所述的NEA相对较大，仍能够穿过血脑屏障作为脑和脊髓中神经元的神经保护剂。由于NEA具有上文所述的这些独特而优越的临床特性，预计将它用来治疗神经变性疾病也会比采用红细胞生成素的治疗具有更好的临床效果。
利用重组DNA技术通过生物合成已制备出红细胞生成素(Egrie，JC，Strickland，TW，Lane，J等人(1986)Immunobiol.72：213-224)，并且是通过将克隆的人EPO基因插入并在中国仓鼠的卵巢组织细胞(CHO细胞)中表达的产物。hEPO的主要的、完全加工形式的一级结构见SEQ ID NO：1。在Cys7-Cys161之间和在Cys29-Cys33之间有两个二硫桥。不含糖部分的EPO多肽链的分子量为18,236道尔顿。在完整的EPO分子中，分子量的大约40％为在该蛋白质的糖基化位点糖基化的糖基团(Sasaki，H，Bothner，B，Dell，A和Fukuda，M(1987)J.Biol.Chem.262：12059)。
术语“红细胞生成素”或“EPO”指具有示于(SEQ ID NO：1)或(SEQID NO：2)的氨基酸序列或基本与之同源的氨基酸序列的糖基化蛋白，其生物特性涉及刺激血红细胞的产生以及刺激骨髓中定向红系祖细胞的分裂与分化。此外，“红细胞生成素”指显示本领域已知的至少一种生物学性质或结合亲和性的糖基化蛋白。从而，分子包括只显示神经保护效应。如这里所用的，这些术语包括经过特意修饰的此类蛋白质，例如经定点诱变法或随机突变法修饰。这些术语还包括具有一至六个额外糖基化位点的类似物，在糖蛋白的羧基端具有至少一个额外氨基酸的类似物(其中额外氨基酸包括至少一个糖基化位点)，以及具有如下氨基酸序列的类似物，即氨基酸序列包括至少一个糖基化位点的重排。这些术语包括天然和重组产生的人红细胞生成素。
红细胞生成素结合特定的跨膜受体(EPO-R)。有功能的人EPO-R是细胞因子I类受体超家族的一员，表现为两个同样的484个氨基酸的糖蛋白链的同型二聚体。每条链包含胞外结构域、疏水跨膜序列和连接蛋白酪氨酸激酶JAK2的胞质结构域。未修饰的EPO与受体亚基结合，两个结合位点的解离常数差别很大。EPO与受体的结合导致构象发生改变，EPO-R的两个亚基结合更加紧密，使得两个JAK分子发生自体磷酸化，产生复杂的信号级联。已经表明EPO诱导的信号通路在刺激后30-60分钟回复到接近基本的水平。EPO的效应被造血细胞磷酸酶(HCP)的作用终止，导致EPO/EPO-R复合体的内在化与降解。
近来，已经表明EPO比最初设想的更象是多效性的存活生长因子。人们认为，EPO具有神经营养和神经保护的功能(Cerami A等人(2002)Nephrol.Dial.Transplant.17：8-12；Chong，ZZ等人(2003)Curr.DrugTargets Cardiovasc.Haematol.Disord.3：141-154；Jumbe，NL(2002)Oncology 16：91-107；Marti，HH等人(2000)News Physiol.Sci.15：225-229)、血管保护功能(Masuda，S等人(1999)Int.J.Hematol.70：1-6；Smith，KJ等人(2003)Cardiovasc.Res.59：538-548)、和心脏保护功能(Smith，KJ等人(2003)Cardiovasc.Res.59：538-548；Parsa，CJ等人(2003)J.Clin.Invest.112：999-1007)。已经表明，EPO-R出现在啮齿动物和哺乳动物的脑特定区域(Digicaylioglu，M等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：3717-3720；Li，Y等人(1996)Pediatr.Res.40：376-380；Marti，HH等人(1996)Eur.J.Neurosci.8：666-676)。EPO结合位点主要位于小鼠的海马、内囊、皮层和中脑(Digicaylioglu，M等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：3717-3720)。此外，人们已经知道EPO刺激神经元干细胞和祖细胞的增殖与分化(Shingo，T等人(2001)J.Neurosci.21：9733-9743；Studer，L等人(2000)J.Neurosci.20：7377-7383)。
在缺氧的海马神经元原代细胞培养物中，EPO通过保持线粒体膜电势进行神经保护，其中EPO的神经保护效应与PI-3K/Akt途径有重大关系(Chong，ZZ等人(2003)Circulation 106：2973-2979)。线粒体膜电势的不稳定导致细胞色素C的释放，后者激活胱天蛋白酶8、1和3，促进DNA片段化。
EPO在脑中的体内神经保护效应首先被Sasaki领导的小组在1998年于蒙古沙鼠中发现(Sadamoto，Y等人(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.253：26-32；Sakanak，M等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：4635-4640)。向侧心室中注射EPO可防止局部缺血导致的无学习能力，使海马CA1神经元免于死亡。在大鼠中的相似实验减少了局部缺血诱导的无区域导航能力、皮层梗塞和丘脑变性(Sadamoto，Y等人(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.253：26-32)。此外，向脑室中输注可溶的EPO-R后局部阻断了EPO信号途径，已知的EPO对缺氧预处理的保护效应在小鼠中显著降低了(Prass，K等人(2003)Stroke 34：1981-1986)。
早期人们认为，由于血脑屏障的缘故，全身施用的EPO将不能进入脑(Junk，AK等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99：10659-10664；Juul，SE等人(1999)Pediatr.Res.46：543-547)。血脑屏障(BBB)将脑和脑脊髓液(CSF，体液)与血液分隔，并且调节血液和脑之间物质的交换。在这里，术语“BBB”包括血脑屏障和血-CSF屏障，主要包含脑毛细管、脉络丛立方上皮细胞和蛛网膜。所有的BBB位点的特点在于存在临近细胞之间的紧密结合、内皮孔的消失和胞饮微囊的缺乏。此外，脑毛细血管的内皮线粒体的数量密度比体内其他区域的有几倍的增加。构成BBB的细胞有效发挥连续细胞层功能，使溶质的交换主要仅通过跨细胞通路。从而，脂可溶的溶质很容易地穿过BBB，而电解质、脂不溶的非电解质和蛋白则以比它们进入非神经组织更慢的速度从血液进入脑。这种屏障的功能有助于脑抵御有害物质。
溶质分子跨膜有4种基本机制：(1)简单扩散，(2)促进扩散，(3)通过水性通道的简单扩散，(4)通过蛋白载体的主动运输。由于其紧密的连结，细胞旁扩散在BBB并不常见。至于跨细胞的扩散，总的原则是物质的亲脂性越高，越容易扩散入脑。葡萄糖、醇和其他小分子通过扩散进入脑。大部分蛋白通常需要采取主动运输的方式。
血脑屏障可以被某些手段“打开”，例如动脉内注射高渗甘露醇。甘露醇被认为通过收缩内皮细胞的渗透作用打开血脑屏障。
CSF位于脑室、椎管和蛛网膜下隙中。CSF主要来源于侧部脉络膜丛和第三和第四脑室，容量占脑重量的10-20％。人体内5小时(大鼠1小时)周转的CSF容量为140-150ml。CSF在它的产生引起的流体静力学的压力下在脑室和蛛网膜下隙内移动。CSF保护了脑，调节脑细胞外液，允许神经活性物质分布，并且是脑产生的废弃物的汇集处。
Jumbe(Jumbe NL(2002)Oncology 16：91-107)等人发现，静脉内注射重组人EPO(500U/kg)的大鼠中脑脊髓液与血清浓度的比值为大约1×10-3。注射阿法达贝泊汀(25μg/kg)也有类似的效果。通过非房室模型分析浓度时间曲线下的平均面积(AUC0-8)，脑脊髓液中的重组人EPO(rhEPO)为340mU h/ml，阿法达贝泊汀为3.6ng h/ml，而血清中的这两个数字分别为370,000mU h/ml和4500ng h/ml。
而对于中风的实验，向实验动物全身施用高剂量rhEPO，可以减少中脑动脉梗塞24小时后梗塞形成体积(Siren，AL等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci USA 98：4044-4049)，减少死亡率(Buemi，M等人(2000)Eur.J.Pharmacol.392：31-34)，防止神经元损伤(Alafaci，C等人(2000)Eur.J.Pharmacol.406：219-225)，增大大脑血流(Grasso，G(2001)J.Neurosurg.Sci.45：7-14)，减少神经功能缺损(Grasso，G等人(2002)J.Neurosurg.96：565-570)。此外EPO还预防运动神经元的凋亡和神经疾病(Cerami，A等人(2002)Nephrol.Dial.Transplant 17：8-12)，改善运动功能的恢复(Gorio，A等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：9450-9455)，减少缺氧脑中的炎性反应(Villa，P等人(2003)J.Exp.Med.198：971-975)。
此外，正在考虑将红细胞生成素用于多发性硬化(MS)。MS是中枢神经系统(CNS)即脑与脊髓的一种炎性疾病。在患有MS的人群中，称作病斑或者病变的损伤斑出现在CNS的白质中看似随机的区域。在病变的部位，一种叫作髓磷脂的神经绝缘材料可能在自体免疫炎症中消失。髓鞘在一种称为脱髓鞘的过程中从轴突上剥裂。髓鞘在CNS中是由特定部分的少突胶质细胞形成。到目前为止，还不清楚是什么原因导致MS。人们提出了多种不同的理论，例如自体免疫、病原导致、遗传组分、宫内生化事件、血脑屏障的破坏、节食和缺乏维生素、过敏反应及其他。此外，人们还讨论了炎症同样会伤害轴突膜。目前为止对MS还没有可用的治疗方案。但是，许多药物可以用来治疗这种疾病的症状。例如，皮质类固醇、许多免疫抑制药和β干扰素都可以用来治疗。
Diem等人(Brain(2005)，128：375-85)描述了一种类固醇联合施用EPO对目标炎症和神经变性的治疗方案。在MS模型中，甲基强的松龙和红细胞生成素被成功地用于联合治疗。
Ehrenreich等人(Ehrenreich，H等人(2002)Mol.Med.8：495-505)在中风患者中进行的实验表明，在施用rhEPO的患者中梗塞的大小有明显变小的趋势，在中风1个月后有显著的神经学上的恢复和临床效果。病人在中风后的第一天开始每天接受静脉内注射rhEPO(3.3×104U)。患者的脑脊髓液中EPO的平均浓度增加到17U/l(正常值为大约1U/l)。注射后3小时患者的血清水平大约为5,000U/l(正常血清水平为大约15U/l)。此外，EPO还被成功地用来减少急性中风周围区域的再灌注损伤。
已知EPO和EPO-R在人和啮齿动物的脑组织中表达(Sirén AL等人(2001)Acta Neuropathologica 101：271-276)，是缺氧可诱导的(Jelkmann，W(1994)Clin.Investig.72：3-10)，已证实有显著的神经保护作用(Bernaudin，M等人(1999)J.Cereb.Blood Flow Metab.19：643-651；Genc，S等人(2001)Neurosci.Lett.298：139-141)。在成年人脑中，EPO和它的受体在神经元和星形胶质细胞中只有弱表达(Sirén AL等人(2001)ActaNeuropathologica 101：271-276)。总之，局部缺血和/或缺氧后的人脑中EPO出现在血管组织和炎症细胞中，EPO-R出现在梗塞和周边梗塞区的血管、神经元和星形胶质细胞中。在较久的缺血性梗塞中EPO和EPO-R在反应的神经胶质中达到最强。在靶细胞中EPO-R刺激的净效果为增殖、抑制凋亡，对于成红血细胞则是分化。
认为BBB能够有效地排斥大的糖基化分子，例如EPO。尽管在传统观点上，BBB被认为对于大分子是不能透过的，研究表明一些大分子能够特异地穿过毛细血管的内皮运输到脑中，影响脑的功能。这是通过结合内皮细胞腔面上的受体发生的。结合启动了内吞，然后穿过BBB。由于EPO-R在脑毛细血管中表达，人们认为EPO穿过BBB的运输是通过受体介导的运输完成的。
值得注意的是，组织保护所要求的EPO血清浓度比红细胞生成所要求的要高。其中一个原因是用于组织保护的受体比红系祖细胞的亲和力要低(大约1000倍)(Masuda，S等人(1993)J.Biol.Chem.268：11208-11216)。另外一个原因可能是由于BBB的存在。临床前实验表明，防止组织损伤所需的最小治疗量EPO看起来是约300-500mlU/kg体重。一单位的EPO被定义为在大鼠中与15μmol CoCl2(氯化钴)导致同样红细胞生成反应的量的EPO。简单地说，EPO对脑和脊髓中的神经元有神经保护效应。但是，EPO在这种治疗中的潜在应用受到要达到这样的效应所需要的相当高治疗量的限制。一种新的具有更长半寿期并能穿过BBB的红细胞生成刺激因子(ESA)是优选的，尤其是这种ESA可以以相对较低的起始密度向血管中施用，防止不良副反应的发生。
现有技术中的问题通过使用本发明所述的NEA可以得到解决，所述的NEA如后附权利要求书中所述，包含共价连接的特定分子量的聚(乙二醇)基团和接头结构。具体地，这种NEA被用来制备通过导入血液回路而治疗脑和脊髓的神经变性疾病的药物。在优选的实施方案中，所述的NEA为化学修饰的红细胞生成分子，其具有至少一个游离氨基并包含选自人红细胞生成素及其类似物的红细胞生成素部分，所述人红细胞生成素类似物具有通过添加一至六个糖基化位点或重排至少一个糖基化位点而修饰的人红细胞生成素的序列；所述红细胞生成素部分与n个式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚(乙二醇)基团共价连接，其中每一聚(乙二醇)基团的-CO(即羰基)与所述的氨基之一形成酰胺键；其中R为低级烷基；x为2或3，m为约450至约900；n为1至3；且选择n和m，从而使产生的NEA减去未修饰的红细胞生成素部分后的分子量为约20千道尔顿至约100千道尔顿。
优选地，NEA是下式：
P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n          (I)
其中x、m、n和R如权利要求1中所定义，P为红细胞生成素部分的残基，其不包括n个与聚(乙二醇)基团形成酰胺键的氨基。在上式中，R最优选为甲基，m为约650至约750，n为1。
最优选地，本发明方法中所用的NEA具有下式
[CH3O(CH2CH2O)mCH2CH2CH2CO-NH]n-P
其中m为650至750，n为1，P为红细胞生成素部分的残基。
优选地，红细胞生成素部分为人红细胞生成素糖蛋白，其可以被内源性的基因活化表达，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
备选地，红细胞生成素部分具有人红细胞生成素添加1至6个糖基化位点修饰后的序列。
在另一优选的实施方案中，本发明方法可治疗的脑与脊髓的神经变性疾病与选自中风、TBI(创伤性脑损伤)或脊髓损伤的急性疾病相关。此外，脑与脊髓的神经变性疾病可以与长期治疗相关，例如中风、精神分裂症、阿尔兹海默症、亨廷顿症、痴呆、脆性X染色体相关震颤/共济失调综合征、帕金森症、海绵脑病、多发性硬化以及与细菌或病毒感染相关的神经变性。
在当前的方法中，NEA以足以治疗或改善神经变性疾病的量(“治疗有效量”)施用。NEA可以按照EPO治疗中采用的惯常方式施用于患者。NEA确切的量决定于待治疗的疾病的确切种类、待治疗患者的状态和该组合物中其他成分。μg的量只与各自的红细胞生成素(其为蛋白质)部分相关。优选地，患者每周一次每kg体重施用约0.1至约100μg本发明所述的ESA，优选约1至约10μg每kg体重。
如果必要，NEA可以更频繁地施用。但是，根据本发明使用的NEA也可以每两周、每三周、每月或更长的时间间隔施用一次，这决定于所治疗的疾病和施用方法。含有该缀合物的药物组合物被配制至有效浓度，以多种方式施用于患有特征为神经元死亡的神经变性疾病的患者。该缀合物的平均临床有效量可能发生变化，需在有经验的医师的建议下按处方使用。
本发明所述的NEA的比活性可通过本领域已知的多种检测法确定。本发明所述的纯化的NEA的生物学活性是指施用NEA给人类患者后(例如通过注射)对脑和脊髓中神经元的保护。
本发明所述的药物制备物包括与可药用载体或赋形剂制剂的适用于注射的药物组合物。所述药物组合物的制备在现有技术，例如US2002/0037841A1(相应于WO 01/87329)中是已知的，该美国专利全文引入作为参考。用于制剂本发明所述产品的可药用载体包括人血清白蛋白、人血浆蛋白等。
此外，利用喷雾干燥制备组合物可能很适宜，可加入或不加入任何稳定剂或填充剂。
本发明所使用的ESA可在pH为7、含有渗透调节剂例如132mM氯化钠的10mM磷酸钠/钾缓冲液中配制。任选地药物组合物可含有防腐剂。该药物组合物可含有不同量的红细胞生成素蛋白，例如10-1000μg/ml，优选50μg或400μg。
NEA优选通过注射、透皮贴片、皮下储库或吸入的方式导入血液流路。
NEA优选以多达两周的约25μg至约500μg每天的剂量施用于患有急性神经变性的患者，对于患有神经变性疾病的患者的慢性治疗则以每周约25μg至约1,000μg的剂量施用。对于后一种情况，用药可以延长到每个月一次甚至更长的一段时间一次，根据疾病类型和施用方式而定。在一个优选的实施方案中，对于急性疾病NEA施用约165μg/天，最多一周，对于慢性疾病每周约200μg。
此外，本发明涉及一种试剂盒，其包含以上所述用途的有用的NEA和提高血脑屏障通透性的物质，并且所述血脑屏障通透性的物质为甘露醇。
以上所述的人红细胞生成素及其类似物蛋白可以通过内源性的基因活化来表达。优选的人红细胞生成素糖蛋白为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的那些糖蛋白，最优选SEQ ID NO：1的那些糖蛋白。
更进一步地，P可以选自人红细胞生成素及其具有一至六个额外糖基化位点的类似物的残基。如下文详细所述，EPO的制备和纯化为本领域所熟知。EPO指的是天然或重组的蛋白，优选人EPO，来自任何常规来源，如组织、蛋白质合成、或天然或重组细胞的细胞培养物。包括任何具有红细胞生成素活性的蛋白质，如突变蛋白或经修饰的蛋白。此处的“任何活性”也包括与仅位于神经元细胞表面的EPO受体的结合特异性。因此，包括不表现有红细胞生成活性的本发明的NEA衍生物。可通过重组DNA技术或内源性的基因活化途径，经CHO-、BHK-或HeLa细胞系表达制备重组的EPO。通过内源基因活化进行蛋白质包括EPO的表达是本领域所熟知的，并已公开在如美国专利号5,733,761，5,641,670和5,733,746，国际专利公开号WO 93/09222，WO 94/12650，WO 95/31560，WO 90/11354，WO 91/06667和WO 91/09955，其各自内容均在此处引入作为参考。优选的制备红细胞生成素糖蛋白产物的EPO种类为人EPO种类。更为优选的EPO种类为具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的人EPO，更优选氨基酸序列SEQ ID NO：1。
此外，P可以是具有一至六个额外糖基化位点的糖蛋白类似物的残基。用一个或多个寡糖基团对蛋白质进行糖基化发生在多肽主链的特定位置，且极大地影响了蛋白的物理性质，如蛋白的稳定性、分泌、亚细胞定位以及生物学活性。糖基化通常有两种类型，O-连接的寡糖附着于丝氨酸或苏氨酸残基，而N-连接的寡糖则附着于精氨酸残基。在O-连接和N-连接的寡糖中均存在的寡糖之一为N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，它是含有9个或更多碳原子的氨基糖家族。唾液酸常为N-连接及O-连接寡糖的末端残基，且由于它带有负电荷，赋予该糖蛋白酸性特征。人红细胞生成素具有165个氨基酸，含有三条N-连接和一条O-连接的寡糖链，这些寡糖链约占该糖蛋白总分子量的40％。N-连接的糖基化发生于第24位、38位和83位的精氨酸残基，O-连接的糖基化则发生于第126位的丝氨酸残基。这些寡糖链经由末端唾液酸残基修饰。酶去除糖基化红细胞生成素的所有唾液酸残基会导致体内活性而不是体外活性的丧失，因为红细胞生成素的唾液酸化阻止了其被肝结合蛋白的结合及随后的清除。
用于本发明所述的NEA的化学合成中的糖蛋白包括人红细胞生成素的类似物，所述类似物具有一处或多处人红细胞生成素氨基酸序列的改变，从而增加了唾液酸附着位点的数目。这些糖蛋白类似物可通过包括添加、缺失或替换氨基酸的定点诱变形成，所述诱变增加或改变可供糖基化的位点。唾液酸含量水平高于人红细胞生成素的糖蛋白类似物是通过增加不影响生物学活性所需的二级或三级构象的糖基化位点而产生。用于本发明所述的NEA的化学合成中的糖蛋白也包括糖基化位点处糖类附着水平增加的类似物，所述类似物通常涉及紧邻N-连接或O-连接位点的一个或多个氨基酸替换。用于本发明所述的NEA的化学合成中的糖蛋白也包括从红细胞生成素羧基端延伸一个或多个氨基酸并提供至少一个额外的糖基位点的类似物。用于本发明所述的NEA的化学合成中的糖蛋白也包括其氨基酸序列包含至少一个糖基化位点的重排的类似物。此种糖基化位点重排涉及在人红细胞生成素中缺失一个或多个糖基化位点和加入一个或多个非天然存在的糖基化位点。具有额外糖基化位点的红细胞生成素类似物的详细情况公开于Elliot在1995年3月1日发表的欧洲专利申请640619。
此外，用于本发明所述的NEA的化学合成中的糖蛋白包含这样的氨基酸序列，其包括至少一个额外的糖基化位点，例如但不限于包含通过选自下列修饰而修饰的人红细胞生成素序列的红细胞生成素：
Asn30Thr32；
Asn51Thr53，
Asn57Thr59；
Asn69；
Asn69Thr71；
Ser68Asn69Thr71；
Val87Asn88Thr90；
Ser87Asn88Thr90；
Ser87Asn88Gly89Thr90；
Ser87Asn88Thr90Thr92；
Ser87Asn88Thr90Ala162；
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90；
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90；
Asn89Ile90Thr91；
Ser87Asn89Ile90Thr91；
Asn136Thr138；
Asn138Thr140；
Thr125；和
Pro124Thr125。
此处使用的用于氨基酸序列修饰的表示指在未经修饰的相应蛋白质(如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的hEPO)中上标数字所代表的位置处变为各上标数字前紧邻的氨基酸。
所述糖蛋白也可以是在糖蛋白的羧基末端具有至少一个额外氨基酸的类似物，其中该额外氨基酸包括至少一个糖基化位点，就是说，上文定义的缀合物也指化合物，其中糖蛋白具有包含人红细胞生成素序列的序列和人红细胞生成素序列羧基末端的第二序列，其中第二序列含有至少一个糖基化位点。该额外氨基酸可以包含来自人绒毛膜促性腺激素羧基末端的肽片段。优选该糖蛋白为选自如下的类似物：(a)具有自羧基末端延伸的氨基酸序列Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro SerArg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro IIe Leu Pro Gln(SEQ ID NO：3)的人红细胞生成素；(b)进一步包含Ser87 Asn88 Thr90EPO的(a)的类似物；以及(c)进一步包含Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90EPO的(a)的类似物。
所述糖蛋白也可以是其氨基酸序列含有至少一个糖基化位点的重排的类似物。所述重排可以包括：人红细胞生成素中任一N-连接的糖基位点的缺失，以及在人红细胞生成素氨基酸序列中的第88位添加N-连接的糖基位点。优选该糖蛋白为选自Gln24 Ser87 Asn88 Thr90EPO；Gln38 Ser87Asn88 Thr90EPO和Gln83 Ser87 Asn88 Thr90EPO的类似物。
本文中使用的术语“低级烷基”表示具有1至6个碳原子的直链或支链烷基基团。低级烷基基团的实例包括甲基、乙基和异丙基。根据本发明，R可为任意低级烷基。其中R是甲基的缀合物是优选的。
符号“m”表示聚(环氧乙烷)基团中的环氧乙烷残基(OCH2CH2)的数目。环氧乙烷的单个PEG亚单元的分子量为大约44道尔顿。因此，缀合物的分子量(除去EPO的分子量)依赖于数值“m”。在本发明所述的缀合物中，“m”是大约450至大约900(相当于分子量为大约20kDa至大约40kDa)，优选地是大约650至大约750(相当于分子量为大约30kDa)。对数值m的选择使得本发明的所得到的缀合物具有与未修饰的EPO相当的生理活性，其活性可以是与未修饰的EPO的相应活性相同、更大或其一部分的活性。“大约”某个数量的分子量表示该分子量在通过常规分析技术确定的数量的合理范围之内。对数值“m”如此选择，从而与红细胞生成素糖蛋白共价连接的每一个聚(乙二醇)基团的分子量在大约20kDa至大约40kDa之间，优选是大约30kDa。
在本发明的缀合物中，数值“n”是与红细胞生成素蛋白的游离氨基(包括赖氨酸的ε-氨基和/或N端氨基)通过酰胺键共价结合的聚(乙二醇)基团的数目。本发明的缀合物中，每个EPO分子可以具有一个、两个或三个PEG基团。“n”是1至3的整数，优选地“n”是1或2，更优选地“n”是1。
式(I)的化合物可以从已知的聚合材料：
Figure S2006800360941D00141
通过式(II)化合物与红细胞生成素糖蛋白的缩合而制备，其中R和m如上所述。其中x是3的式II化合物是α-低级烷氧基，聚(乙二醇)的丁酸琥珀酰亚胺酯(低级烷氧基-PEG-SBA)。其中x是2的式II化合物是α-低级烷氧基，聚(乙二醇)的丙酸琥珀酰亚胺酯(低级烷氧基-PEG-SPA)。可以使用胺与活化酯反应形成酰胺的任何常规方法。在上述反应中例证性的琥珀酰亚胺酯是导致酰胺形成的离去基团。使用诸如式II化合物的琥珀酰亚胺酯与蛋白质产生缀合物公开于美国专利5,672,662中，公布于1997年9月30日(Harris等人)。
人HPO含有9个游离氨基，即N端氨基加上8个赖氨酸残基的ε-氨基。当聚乙二醇化试剂与式II的SBA化合物化合时，发现在pH7.5，蛋白质：PEG比率为1∶3以及反应温度为20-25℃时，产生了单聚乙二醇化种类、二聚乙二醇化种类和痕量的三聚乙二醇化种类的混合物。当聚乙二醇化试剂是式II的SPA化合物时，在除了蛋白质：PEG比率为1∶2之外的相似条件下，主要产生单聚乙二醇化种类。聚乙二醇化EPO可以以混合物施用，或者以阳离子交换层析分离的不同聚乙二醇化种类施用。通过控制反应条件(例如反应物的比例、pH、温度、蛋白质浓度、反应时间等等)，可以改变不同聚乙二醇化物质种类的相对量。
本发明提供了包含上述缀合物的组合物的用途。该组合物含有至少90％的单-PEG缀合物，就是说，其中n为1，可通过实施例5所示制备。通常，期望是红细胞生成素的单-PEG缀合物，这是由于它们易于具有比二-PEG缀合物更高的活性。单-PEG缀合物的百分比以及单-和二-PEG的种类的比率可以通过在洗脱峰值附近集中更宽的级分从而降低单-PEG的百分比，或通过在洗脱峰值附近集中更窄级分从而增加组合物中单-PEG的百分比来控制。大约90％的单-PEG缀合物是产率和活性的良好平衡。有时，期望的组合物是例如其中至少92％或至少96％的缀合物是单-PEG(n＝1)的组合物。在本发明的一个实施方案中，其中n为1的缀合物的百分比是90％至96％。
本发明所述的化学修饰的红细胞生成蛋白能够通过简单扩散穿过BBB是违反直觉的，因为本发明所述的NEA高度亲水，并且分子量大。这是由于Patridge等人(Pharmaceutical Research，Vol.15，No.4，1998)指出，用小PEG分子(分子量为2000道尔顿)进行PEG化会减少肽如源自脑的神经营养因子向脑的被动摄入。不过，我们下面的实施例清楚地说明，NEA出现在CSF中。这些发现与我们猜想的一致，本发明所述的在其分子结构中整合有聚(乙二醇)部分的NEA能够通过促进或主动运输途径穿过BBB。
患有中风的患者必须尽快用本发明的NEA予以治疗。对于慢性神经系统疾病，由于其在血液流路中的停留时间(即更长的半寿期)延长，NEA可以周期性地施用。由于NEA具有较长的停留时间并显示与EPO受体降低的亲和力，血红蛋白的水平可以被控制在一个相当窄的范围内。因为通常与施用EPO出现的血红蛋白水平的峰值和谷值通过施用NEA而降低，副反应如血栓的风险和人们不期望的血液增稠都减少了。
下面的实施例进一步阐述了本发明。这些实施例描绘了本发明的多种具体方案，但并不对其应用进行限制。
实施例
实施例1：用mPEG-SBA对EPO进行PEG化
人EPO的发酵与纯化例如描述在US6583272的实施例1中。
依照US6583272的实施例1中所述的无血清方法纯化的EPO经分析方法确定是均一的，并显示出由8个同种型组成的典型的同种型。通过正常红细胞(normocythaemic)小鼠检测，该EPO具有190,000IU/mg的生物学比活性。采用的PEG化试剂为甲氧基-PEG-SBA，即R为甲基；x为3；m为650至750(平均约680，相应的平均分子量为大约30kDa)的式II化合物。
PEG化反应
向100mg EPOsf(9.71ml的10.3mg/ml的EPOsf储存液，5.48μmol)中，加入10ml的含有506mg的30kDa甲氧基-PEG-SBA(16.5μmol)(得自Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，Alabama)的0.1M磷酸钾缓冲液，pH为7.5，室温(20-23℃)混合2小时。蛋白质终浓度为5mg/ml，蛋白质与PEG试剂的比值为1∶3。两小时后，加入冰醋酸调节pH至4.5终止反应，保存于-20℃，直至纯化。
纯化
1.缀合混合物：将大约28ml SP-SEPHAROSE FF(磺基-丙基阳离子交换树脂)装入AMICON玻璃柱(2.2×7.5cm)中，用20mM pH4.5的乙酸盐缓冲液以150ml/小时的流速平衡柱子。将含有30mg蛋白质的6ml反应混合物用平衡缓冲液稀释5倍，加样到柱上。未被吸附的材料用缓冲液洗去，被吸附的PEG缀合混合物用含有0.175M NaCl的平衡缓冲液洗脱。仍留在柱子上的未修饰的EPOsf用750mM NaCl洗脱。用起始缓冲液重新平衡柱子。样品经SDS-PAGE分析，测定它们的PEG化程度。发现0.175M NaCl洗脱液中含有单PEG化种类、二PEG化种类和痕量的三PEG化种类，而750mM NaCl洗脱液中含有未修饰的EPOsf。
2.二PEG-EPOsf和单PEG-EPOsf：在前一个步骤中从柱中洗脱出的纯化的缀合混合物用缓冲液稀释4倍，并被重新加样到柱上，如前文所述进行洗涤。分别用0.1M NaCl和0.175M NaCl从柱中洗脱出了二-PEG-EPOsf和单-PEG-EPOsf。并使用750mM NaCl进行洗脱，洗脱出任何未修饰的EPOsf。
或者，将反应混合物用乙酸盐缓冲液稀释5倍并加样到SP-琼脂糖柱(约0.5mg蛋白质/ml凝胶)上。洗涤柱并吸附单-PEG-EPOsf、二-PEG-EPOsf，并且如前文所述进行洗脱未修饰的EPOsf。
结果
通过化学缀合数均分子量为30kDa的线性PEG分子合成出PEG-EPOsf。PEG-EPOsf衍生于EPOsf的伯氨基基团和30kDa PEG-丁酸的琥珀酰亚胺酯衍生物之间的反应，形成一种酰胺键。
结果总结于表1。包含单-和二-PEG-EPOsf的纯化的缀合混合物通过SDS-PAGE分析不含有未修饰的EPOsf。缀合混合物占23.4mg或初始材料的78％。阳离子交换层析分离单-和二-PEG-EPOsf表明，在缀合混合物中单-与二-PEG的比例几乎是1∶1。在反应完成后，各种组分的比率为单∶二∶未修饰＝40∶38∶20(％)。总产率几乎是定量的。
表1.EPOsfPEG化的结果
Figure S2006800360941D00181
实施例2：用mPEG-SPA对EPO进行PEG化
将实施例2中使用的EPOsf的不同等分试样与30kDa甲氧基-PEG-SPA(Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，Alabama)反应。反应是在蛋白质∶试剂比率为1∶2的条件下进行的，纯化按照实施例2的方法进行。主要产生了单-PEG化的产物。
所述的EPO缀合物的体内活性描述在US6583272的实施例4中。
实施例3：体内测试
对来自瑞典Füllinsdorf Charles River RCC的雄性Wistar大鼠进行体内实验。EPO和EPO缀合物(根据实施例1获得)都通过静脉内以25μg/kg体重的单个剂量施用于大鼠的尾静脉。在显示的时间点(注射后2和6个小时)，先收集脑脊髓液(CSF)的样品，然后收集血浆和(舌下或末端)。通过向小脑延髓池插入采样针(0.7×19mm)获取CSF。通过毛细管力用硅管(ID 0.5毫米)排尽CSF。利用这种技术，从一只大鼠可获得约0.1ml CSF。
化合物：
EPO，浓度：1.84mg/ml
施用量：2ml/千克体重
组合物：水性缓冲液
EPO缀合物，浓度：6.2mg/ml
施用量：2ml/千克体重
组合物：水性缓冲液
收集样品中的化合物浓度经酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定。
结果：
表1-3显示本发明所述的NEA能够穿过血脑屏障。在2到6小时的时间期间内缀合物在体液中的浓度增加了。
序列表
<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
<120>神经变性疾病的治疗
<130>23251
<160>3
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>165
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
1               5                   10                  15
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
            20                  25                  30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
        35                  40                  45
Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
    50                  55                  60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp
                85                  90                  95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
            100                 105                 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
        115                 120                 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
    130                 135                 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp
                165
<210>2
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>2
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
1               5                   10                  15
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
            20                  25                  30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
        35                  40                  45
Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
    50                  55                  60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp
                85                  90                  95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
            100                 105                 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
        115                 120                 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
    130                 135                 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>3
<211>28
<212>PRT
<213>人
<400>3
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu  Pro Gln
            20                  25

Claims (16)

1.红细胞生成分子用于制备治疗脑和脊髓的神经变性疾病的药物中的用途，通过向需要此种治疗的患者的血液流路中施与有效量的药物而治疗脑和脊髓的神经变性疾病，其中所述红细胞生成分子包含具有至少一个游离氨基的人红细胞生成素；所述人红细胞生成素与n个式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚(乙二醇)基团共价连接，其中每一聚(乙二醇)基团的-CO与所述的氨基之一形成酰胺键；其中R为低级烷基，所述低级烷基是1至6个碳原子的直链或支链烷基基团；x为2或3，m为450至900；n为1至3；且选择n和m，从而使所产生的红细胞生成分子的分子量减去人红细胞生成素的分子量后为20千道尔顿至100千道尔顿。
2.根据权利要求1的红细胞生成分子的用途，所述红细胞生成分子具有下式：
P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n  (I)
其中x、m、n和R如权利要求1中所定义，且P为人红细胞生成素的残基，其不包括n个与聚(乙二醇)基团形成酰胺键的氨基。
3.根据权利要求1或2的红细胞生成分子的用途，其中R为甲基。
4.根据权利要求1或2的红细胞生成分子的用途，其中m为650至750。
5.根据权利要求1或2的红细胞生成分子的用途，其中n为1。
6.根据权利要求1或2的红细胞生成分子的用途，其中R为甲基；m为650至750；且n为1。
7.根据权利要求1或2的红细胞生成分子的用途，所述红细胞生成分子具有下式：
[CH3O(CH2CH2O)mCH2CH2CH2CO-NH]n-P
其中m为650至750，n为1，且P如权利要求1所定义。
8.根据权利要求1或2的红细胞生成分子的用途，其中人红细胞生成素是序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的糖基化蛋白。
9.根据权利要求1或2的红细胞生成分子的用途，其中人红细胞生成素是通过添加1至6个糖基化位点而被修饰的人红细胞生成素的序列。
10.根据权利要求1或2的红细胞生成分子的用途，其中脑和脊髓的神经变性疾病涉及选自中风、创伤性脑损伤或脊髓损伤的急性疾病。
11.根据权利要求1或2所述的红细胞生成分子的用途，其中脑的神经变性疾病涉及慢性治疗和选自精神分裂症、阿尔兹海默症、亨廷顿症、痴呆、脆性X染色体相关震颤/共济失调综合征、帕金森症、海绵脑病、多发性硬化以及与细菌或病毒感染相关的神经变性。
12.根据权利要求1或2的红细胞生成分子的用途，其中红细胞生成分子以注射、透皮贴片、皮下储库或吸入施用于血液流路。
13.根据权利要求1或2的红细胞生成分子的用途，其中以人红细胞生成素的量测定的施用量为：以多达两周的25μg至500μg每天施用于急性患者，或者对于慢性治疗则以每周25μg至1,000μg施用。
14.根据权利要求13的红细胞生成分子的用途，对于急性患者多达一周以165μg/天施用，或者对于慢性治疗以每周200μg施用。
15.根据权利要求1或2的红细胞生成分子的用途，用于制备治疗脑和脊髓的神经变性疾病的试剂盒。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述试剂盒包含红细胞生成分子和提高血脑屏障通透性的物质。
CN2006800360941A 2005-09-28 2006-09-18 神经变性疾病的治疗 Expired - Fee Related CN101277715B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05108946 2005-09-28
EP05108946.4 2005-09-28
PCT/EP2006/066438 WO2007039436A1 (en) 2005-09-28 2006-09-18 Treatment of neurodegenerative disorders

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101277715A CN101277715A (zh) 2008-10-01
CN101277715B true CN101277715B (zh) 2013-03-27

Family

ID=37622051

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800360941A Expired - Fee Related CN101277715B (zh) 2005-09-28 2006-09-18 神经变性疾病的治疗

Country Status (18)

Country Link
US (2) US20070072795A1 (zh)
EP (1) EP1940447B1 (zh)
JP (1) JP5096345B2 (zh)
KR (1) KR20080038440A (zh)
CN (1) CN101277715B (zh)
AR (1) AR055654A1 (zh)
AU (1) AU2006298826B2 (zh)
BR (1) BRPI0616572A2 (zh)
CA (1) CA2622609A1 (zh)
DK (1) DK1940447T3 (zh)
ES (1) ES2445035T3 (zh)
IL (1) IL189853A (zh)
PL (1) PL1940447T3 (zh)
RU (1) RU2467761C2 (zh)
SI (1) SI1940447T1 (zh)
TW (1) TWI380824B (zh)
WO (1) WO2007039436A1 (zh)
ZA (1) ZA200802270B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR067537A1 (es) * 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Purificacion de polipeptidos pegilados
CL2008002054A1 (es) 2007-07-17 2009-05-29 Hoffmann La Roche Metodo para la regeneracion de una columna de cromatografia de intercambio cationico despues de la elusion de eritropoyetina monopeguilada y metodo para obtener una eritropoyetina monopeguilada, incorporando el metodo de regeneracion de la columna de intercambio cationico.
RU2515914C1 (ru) * 2013-02-12 2014-05-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика" Гибридный белок на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием (варианты), и способ его получения
RU2561050C2 (ru) 2013-08-28 2015-08-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук (ИБК РАН) Применение белка yb-1 и его фрагментов для изготовления лекарственных средств при лечении болезни альцгеймера
AR113091A1 (es) * 2018-09-27 2020-01-22 Univ Nacional Del Litoral Eritropoyetina humana modificada

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000061164A1 (en) * 1999-04-13 2000-10-19 Kenneth S. Warren Laboratories Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin
EP1525889A1 (en) * 2000-05-15 2005-04-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivative

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US644077A (en) * 1898-08-01 1900-02-27 Farbenfabriken Of Elberfeld Company Acetyl salicylic acid.
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5641670A (en) * 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5733761A (en) * 1991-11-05 1998-03-31 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6703381B1 (en) * 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
US6225895B1 (en) * 1999-05-26 2001-05-01 Floyd E. Bigelow, Jr. Towed vehicle monitor system
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
EP1298994A2 (en) * 2000-07-10 2003-04-09 NAITO, Albert T. Method for opening the blood-brain barrier
DE10043457A1 (de) * 2000-09-04 2002-03-28 Hannelore Ehrenreich Verfahren zur Behandlung von Schizophrenie und verwandten Psychosen sowie Verwendung von Erythropoietin oder Erythropoietinderivaten zur Behandlung von Schizophrenien und verwandten Psychosen
WO2002049673A2 (en) * 2000-12-20 2002-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)
US6531121B2 (en) * 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US7767643B2 (en) * 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US20030072737A1 (en) * 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
JP2005534650A (ja) * 2002-06-11 2005-11-17 ザ バーナム インスティテュート エリスロポイエチンおよびインスリン様増殖因子の神経保護的相乗作用
EP1552298A4 (en) * 2002-07-01 2006-11-08 Kenneth S Warren Inst Inc RECOMBINANT TISSUE-PROOFING CYTOKINS AND NUCLEIC ACIDS COORDINATING THEREOF FOR THE PROTECTION, RECOVERY AND IMPROVEMENT OF CELLS, TISSUE AND ORGANS THEREOF
US7459436B2 (en) * 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
US7718363B2 (en) * 2003-04-25 2010-05-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Tissue protective cytokine receptor complex and assays for identifying tissue protective compounds
EA200501828A1 (ru) * 2003-05-19 2006-08-25 Дзе Кеннет С. Уоррен Инститьют, Инк. Тканепротекторные цитокины с увеличенным терапевтическим окном для защиты, восстановления и стимулирования реагирующих клеток, тканей и органов
PL1696947T3 (pl) * 2003-12-19 2014-08-29 Hoffmann La Roche Zastosowanie erytropoetyny w leczeniu zaburzeń dystrybucji żelaza w przewlekłych chorobach zapalnych jelit
CA2623715A1 (en) * 2005-09-28 2007-04-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Indol-3-yl-carbonyl-azaspiro derivatives as vasopressin receptor antagonists

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000061164A1 (en) * 1999-04-13 2000-10-19 Kenneth S. Warren Laboratories Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin
EP1525889A1 (en) * 2000-05-15 2005-04-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivative

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Serhat Erbayraktar et al.Asialoerythropoietin is a nonerythropoietic cytokine with broad neuroprotective activity in vivo.《PNAS》.2003,第100卷(第11期),6741–6746. *

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200802270B (en) 2009-02-25
EP1940447B1 (en) 2013-11-27
ES2445035T3 (es) 2014-02-27
JP2009510008A (ja) 2009-03-12
US20100267632A1 (en) 2010-10-21
RU2008116309A (ru) 2009-11-10
IL189853A0 (en) 2008-11-03
AU2006298826B2 (en) 2010-04-01
CN101277715A (zh) 2008-10-01
IL189853A (en) 2012-06-28
TWI380824B (zh) 2013-01-01
DK1940447T3 (da) 2014-01-20
US20070072795A1 (en) 2007-03-29
KR20080038440A (ko) 2008-05-06
AR055654A1 (es) 2007-08-29
EP1940447A1 (en) 2008-07-09
WO2007039436A1 (en) 2007-04-12
PL1940447T3 (pl) 2014-04-30
JP5096345B2 (ja) 2012-12-12
SI1940447T1 (sl) 2014-03-31
RU2467761C2 (ru) 2012-11-27
AU2006298826A1 (en) 2007-04-12
BRPI0616572A2 (pt) 2009-11-24
TW200727911A (en) 2007-08-01
CA2622609A1 (en) 2007-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100839302B1 (ko) 심장 질환에서 에리스로포이에틴의 신규한 용도
CN101321870B (zh) 在体内具有延长的半衰期和增强的红细胞生成活性的重组人EPO-Fc融合蛋白
Thorne et al. Delivery of neurotrophic factors to the central nervous system: pharmacokinetic considerations
EP1406922B1 (en) Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
CN1901934B (zh) 促红细胞生成素在治疗慢性炎症性肠病中铁分布紊乱中的用途
US20090233844A1 (en) Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
CN101277715B (zh) 神经变性疾病的治疗
Mocini et al. Structure, production and function of erythropoietin: implications for therapeutical use in cardiovascular disease
ES2364651T3 (es) Utilización de la eritropoyetina.
US20190249163A1 (en) Delivery of therapeutic agents by a collagen binding protein
EP2937088B1 (en) Composition having tissue repairing activity and utilization thereof
CN110799522B (zh) 用于治疗、改善或预防脑出血的肽及其用途
CN100431604C (zh) 用于瞬时性治疗的具有短半衰期的c1抑制剂
Lagarto Parra et al. Nasal neuro EPO could be a reliable choice for neuroprotective stroke treatment
Patel et al. Erythropoietin in the intensive care unit: beyond treatment of anemia
US20170106093A1 (en) Delivery of therapeutic agents by a collagen binding protein
US11767344B2 (en) Pharmaceutically acceptable salts of polypeptides and methods of inhibiting the interaction between psd-95 and n-methyl-d-aspartic acid receptor (nmdar)
TWI849231B (zh) 聚乙二醇化介白素-11之組合物及方法
US20030229012A1 (en) Human transferring for the treatment of anemia of chronic disease (ACD) and of functional iron deficiency
KR20210095141A (ko) 지에이엠티 결핍 치료를 위한 아르기닌 결핍 요법
Dar et al. Role of glycosylation in modulating therapeutic efficiency of protein pharmaceuticals
Dhuria Intranasal targeting of neuropeptides to the central nervous system: Evaluation of pharmacokinetics, pharmacodynamics, and a novel vasoconstrictor formulation

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130327

Termination date: 20190918

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee