TWI380824B - 包含促紅血球形成分子之藥物及套組及其用途 - Google Patents

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Description

包含促紅血球形成分子之藥物及套組及其用途
本發明係關於一種使用新穎促紅血球形成劑(NEA)治療腦及脊髓之神經退化性疾病之方法。
諸如人類紅血球生成素(EPO)之市售蛋白治療劑之生物可用性受其短的血漿半衰期及對蛋白酶降解之感受性限制。此等缺點阻礙其達到最大臨床效能。經由化學修飾EPO及其類似物已發展新穎促紅血球形成劑。此等新穎藥劑在患有腎病之患者體內及在經歷化學療法之AIDS及癌症患者體內產生允許最佳貧血處理之有效及延長的促紅血球形成活性。
本發明係關於一種藉由對需要治療之患者投予治療有效量之新穎促紅血球形成劑(NEA)來治療腦及脊髓的神經退化性疾病之方法，該新穎促紅血球形成劑為經化學修飾之人類紅血球生成素或化學修飾之人類紅血球生成素類似物，其包含具有特定分子量及鏈路結構的藉由共價鍵併入之聚(乙二醇)基團。
特定言之，本發明中所用之NEA為經化學修飾之促紅血球形成分子，其較佳具有至少一個游離胺基且包含選自由人類紅血球生成素及其類似物組成之群的紅血球生成素部分，人類紅血球生成素類似物具有藉由添加1至6個糖基化位點或重排至少一個糖基化位點而修飾之人類紅血球生成素序列；該紅血球生成素部分與式－CO－(CH2 )x －(OCH2 CH2 )m －OR之"n"個聚(乙二醇)基團共價連接，其中各聚(乙二醇)基團之－CO(意即羰基)與該等胺基之一形成醯胺鍵；其中R為低碳烷基；x為2或3；m為約450至約900；n為1至3；且選擇n及m以使得所得NEA之分子量減去未經修飾之紅血球生成素部分的分子量等於約20千道爾頓至約100千道爾頓。該等NEA(例如)描述於在必要程度上以引用方式併入本文中之美國專利第6,583,272號中。
可用於本發明之NEA在生物化學方面及功能上均與EPO不同。同時，活體內及活體外資料表明與EPO相比，此等NEA顯示實質上較低的與EPO受體結合之結合親和力且解離更快。與人類紅血球生成素(hEPO)相比，此等NEA顯示不同的、有利之臨床性質，其包括活體內增加之循環半衰期及血漿滯留時間、減少之清除率及增加之臨床活性。
關於本發明NEA之不同性質之上述觀測結果中的一些可藉由新穎之作用模式來解釋。自紅血球生成素受體("EPO－R")快速解離連同延長之血清半衰期可經由與受體的多重相互作用導致增加及持續之促紅血球形成作用。因為空間排列的原因，此等多重相互作用可足以誘發EPO－R之信號級聯但並未足夠緊密以導致使得受體/分子複合物內在化且降解之強結合。在統計學上，僅一定百分比之分子可達到該緊密結合。總之，此作用模式將導致一個分子將在降解之前活化一個以上受體之結果。
重要地，此等NEA之有利性質允許降低之投藥頻率及血色素之更穩定控制，在患有腎病之患者及經歷化學療法的患有AIDS或癌症之患者體內容許最佳之貧血處理。期望此等優點導致改良之治療結果以及改良之患者生活品質。
天然存在之人類紅血球生成素(hEPO)在身體之不同組織(例如腎、腦等)中產生且為其中刺激紅血球產生之體液血漿因子(Carnot,P及Deflandre,C(1906)C.R.Acad.Sci.143：432；Erslev,AJ(1953)Blood 8：349；Reissmann,KR(1950)Blood 5：372；Jacobson,LO、Goldwasser,E、Freid,W及Plzak,LF(1957)Nature 179：6331－4)。天然存在之EPO刺激骨髓中定型紅血球系祖細胞之分裂及分化且藉由與紅血球系前驅體上之受體結合而發揮其生物活性(Krantz,BS(1991)Blood 77：419)。
除了使用EPO治療貧血之外，最近亦假定此分子提供神經及心肌保護作用。參見綜述文章W.Jelkmann及K.Wagner,Ann.Hematol 83：673－686(2004)。
本發明提供藉由在血流中引入本發明NEA來治療腦及脊髓的神經退化性疾病之NEA用途。本發明以下述發現為基礎：本發明之NEA儘管具有相對大尺寸亦能夠跨越血液腦障壁以用作腦及脊髓中所發現之神經元的神經保護劑。與使用EPO之療法相比，亦期望此等NEA在如上文所述之其他設定中顯示的不同、優越之臨床性質在用於治療神經退化性疾病時提供實質性的治療優點。
紅血球生成素在生物合成上已使用重組DNA技術製造(Egrie,JC、Strickland,TW、Lane,J等人(1986)Immunobiol.72：213－224)且為中國倉鼠卵巢組織細胞(CHO細胞)中所插入且表現之經選殖人類EPO基因的產物。在SEQ ID NO：1中說明hEPO之主要、充分加工形式的一級結構。在Cys7 －Cys1 6 1 與Cys2 9 －Cys3 3 之間存在兩個雙硫橋。無糖部分之EPO多肽鏈之分子量為18,236 Da。在完整EPO分子中，在蛋白之糖基化位點使蛋白糖基化之碳水化合物基團占約40%之分子量(Sasaki,H、Bothner,B、Dell,A及Fukuda,M(1987)J.Biol.Chem.262：12059)。
術語"紅血球生成素"或"EPO"指糖基化蛋白，其具有(SEQ ID NO：1)或(SEQ ID NO：2)中所述之胺基酸序列或其實質上同源之胺基酸序列，其生物性質可與骨髓中刺激紅血球產生及刺激定型紅血球系祖細胞分裂及分化有關。此外，"紅血球生成素"指顯示此項技術狀況中已知之生物性質或結合親和力中之至少一者之糖基化蛋白。因此，僅包含顯示神經保護作用之分子。如本文所用，此等術語包括如(例如)藉由定點突變誘發有意修飾或經由突變意外修飾之該等蛋白。此等術語亦包括具有1至6個額外糖基化位點之類似物、在糖蛋白之羧基末端具有至少一個額外胺基酸之類似物(其中該額外胺基酸包括至少一個糖基化位點)及具有包括至少一個糖基化位點重排的胺基酸序列之類似物。此等術語包括天然產生及重組產生之人類紅血球生成素。
EPO與特異性跨膜受體(EPO－R)結合。功能性人類EPO－R為細胞因子I類受體總科之成員且以兩條具有484個胺基酸之相同糖蛋白鏈之均二聚體形式存在。每一鏈包含細胞外域、疏水跨膜序列及與蛋白酪胺酸激酶JAK2關連之細胞質域。未經修飾之EPO與受體次單元結合，藉此兩個結合位點之解離常數大不相同。EPO與受體之結合導致構形變化及導致兩個JAK分子之自體磷酸化(其導致複合信號級聯)的兩個EPO－R次單元之較緊密連接。已顯示在刺激30－60 min之後EPO誘發之信號發送路徑幾乎返回基底水準。藉由引起EPO/EPO－R複合物的內在化及降解之造血細胞磷酸酶(HCP)之作用終止EPO之作用。
近來已顯示與最初所認為的情況相比，EPO為更具多效性之存活生長因子。咸信EPO具有神經營養及神經保護(Cerami A等人，(2002)Nephrol.Dial.Transplant.17：8－12；Chong,ZZ等人，(2003)Curr.Drug Targets Cardiovasc.Haematol.Disord.3：141－154；Jumbe,NL(2002)Oncology 16：91－107；Marti,HH等人，(2000)News Physiol.Sci.15：225－229)、血管(Masuda,S等人，(1999)Int.J.Hematol.70：1－6；Smith,KJ等人，(2003)Cardiovasc.Res.59：538－548)及心臟保護功能(Smith,KJ等人，(2003)Cardiovasc.Res.59：538－548；Parsa,CJ等人，(2003)J.Clin.Invest.112：999－1007)。已顯示EPO－R存在於齧齒動物及哺乳動物大腦之不同區域中(Digicaylioglu,M等人，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：3717－3720；Li,Y等人，(1996)Pediatr.Res.40：376－380；Marti,HH等人(1996)Eur.J.Neurosci.8：666－676)。EPO結合位點主要位於小鼠之海馬體、內囊、皮質及中腦中(Digicaylioglu,M等人，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：3717－3720)。此外，已知EPO刺激神經元幹細胞及祖細胞之增殖及分化(Shingo,T等人，(2001)J.Neurosci.21：9733－9743；Studer,L等人，(2000)J.Neurosci.20：7377－7383)。
EPO之神經保護作用可追溯至藉由在缺氧原生海馬趾神經元細胞培養物中維持粒線體膜勢能而在EPO之神經保護作用中具有主要重要性之PI－3K/Akt路徑。線粒體膜勢能之不穩定導致釋放細胞色素C，其活化促進DNA斷裂之卡斯蛋白酶(caspase)8、1及3。
EPO在腦中之活體內神經保護作用首先由Sasaki小組在1998年(Sadamoto,Y等人，(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.253：26－32；Sakanak,M等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：4635－4640)藉由對蒙古沙鼠(Mongolian gerbil)執行活體內神經保護作用而提供。顯示出EPO融合至側腦室中會防止局部缺血誘發之學習障礙且挽救海馬趾CAl神經元以免死亡。關於大鼠之類似實驗顯示減少局部缺血誘發之定位航行障礙、皮質梗塞及丘腦退化(Sadamoto,Y等人(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.253：26－32)。此外，當藉由將可溶EPO－R融合至腦室中而局部阻塞EPO信號發送時，小鼠中已知之乏氧性預處理的保護作用顯著減小(Prass,K等人，(2003)Stroke 34：1981－1986)。
由於血－腦障壁，初期假定全身投予之EPO將不進入大腦(Junk,AK等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99：10659－10664；Juul,SE等人(1999)Pediatr.Res.46：543－547)。血腦障壁(BBB)將大腦以及腦脊髓液(CSF，體液)與血液分開且調節血液與大腦之間的物質交換。如本文所用之術語"BBB"包含血腦障壁以及血液－CSF障壁。其主要包含腦毛細管、脈絡膜叢立方上皮及蛛網膜。所有BBB位點之特徵為存在毗鄰細胞間的緊密連接、不存在內皮孔及具有少量胞飲小泡。此外，與來自身體其他部位之毛細管相比，腦毛細管含有數目密度數倍增加之內皮粒線體。構成BBB之細胞有效地充當連續細胞層，主要允許僅藉由細胞間途徑交換溶質。因此，脂質可溶溶質易於穿透BBB，而電解質、脂質不可溶非電解質及蛋白自血液進入大腦比其進入非神經組織更慢。此障壁功能幫助保護大腦不受有害物質傷害。
關於溶質分子跨膜移動存在四種基本機制。(1)簡單擴散，(2)促進擴散，(3)經由水性通道簡單擴散及(4)經由蛋白載劑活性輸送。由於緊密連接，旁細胞擴散不會以任何大程度出現於BBB處。在細胞間擴散之狀況下，一般規則為物質的親油性愈高，在大腦中的擴散愈多。葡萄糖、醇及其他小分子僅藉由擴散進入大腦。大多數蛋白通常需要使用活性輸送。
血腦障壁可藉由某些解決方式"打開"，諸如動脈內注射高張甘露糖醇。認為甘露糖醇藉由使內皮細胞收縮而經由滲透打開血腦障壁。
CSF位於腦室、髓管及蛛網膜下空間內。CSF之首要來源為側腦室、第三及第四腦室之脈絡膜從且體積在腦重量的10－20%之間變化。對於人類而言，在轉換5 h(對於大鼠而言，1 h)情況下人類體內CSF體積為140－150 ml。CSF在由其製造所產生之流體靜力學壓力的影響下在腦室及蛛網膜下空間內運動。CSF緩衝大腦，調節大腦細胞外液，允許神經活性物質分佈且為收集大腦所產生的廢物之接收點。
Jumbe(Jumbe NL(2002)Oncology 16：91－107)已顯示靜脈內投予重組人類EPO(500 U/kg)之大鼠的腦脊髓液與血清濃度比率為約1×10－ 3 。類似結果對於以25 μg/kg投予達貝泊汀(darbepoetin)α亦適用。藉由非腔室分析所計算之濃度－時間曲線下平均面積(AUC0 － 8 )在腦脊髓液中對於重組人類EPO(rhEPO)為340 mU h/ml且對於達貝泊汀α為3.6 ng h/ml，與在血清中分別為370,000 mU h/ml及4500 ng h/ml相對。
關於中風實驗，已顯示對測試動物全身投予高劑量的rhEPO會減小中腦動脈閉塞後24 h梗塞體積(Siren,AL等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci USA 98：4044－4049)，降低死亡率(Buemi,M等人，(2000)Eur.J.Pharmacol.392：31－34)，預防神經元損傷(Alafaci,C等人，(2000)Eur.J.Pharmacol.406：219－225)，增加大腦血液流量(Grasso,G(2001)J.Neurosurg.Sci.45：7－14)且減少神經缺損(Grasso,G等人，(2002)J.Neurosurg.96：565－570)。此外，EPO防止運動神經元細胞凋亡及神經障礙(Cerami,A等人，(2002)Nephrol.Dial.Transplant 17：8－12)，改良運動功能之恢復(Gorio,A等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：9450－9455)且減少乏氧大腦中之發炎反應(Villa,P等人，(2003)J.Exp.Med.l98：971－975)。
此外，在多發性硬化(MS)中使用紅血球生成素當前亦在考慮中。MS係作為大腦及脊髓之中樞神經系統(CNS)之發炎疾病。在罹患MS之人群中，稱為斑塊或病變之損傷斑出現在CNS白質之表面上隨機區域中。在病變位點，稱為髓鞘之神經絕緣物質很可能在自體免疫炎症期間失去。在稱為脫髓鞘之過程中，髓鞘自軸突脫離。在CNS中，寡樹突神經膠質細胞的某些部分形成髓鞘。迄今不明白什麼導致MS。已提議不同理論，例如自體免疫、病原體介導、遺傳組份、子宮內生物化學事件、血腦障壁損傷、飲食及維生素缺乏、過敏反應及其他理論。此外，經討論炎症亦損傷軸突膜。迄今為止不存在可用於MS之有療效的治療。然而，大量藥物可用於有徵兆地治療該疾病。舉例而言，可投予皮質類固醇、大量免疫抑制藥物及β干擾素。
Diem等人(Brain(2005),128：375－85)描述與應用EPO組合之類固醇治療以靶向發炎以及神經退化性態樣。因此，甲潑尼龍(methylprednisolone)及紅血球生成素在MS模型中成功地用作組合療法。
Ehrenreich等人(Ehrenreich,H等人，(2002)Mol.Med.8：495－505)關於中風患者所進行之人類實驗已顯示與中風後1個月的顯著神經恢復及臨床結果有關，經rhEPO治療之患者體內梗塞大小具有強烈減小趨勢。患者在中風後第一天每日一次經靜脈內接受rhEPO(3.3×104 U)。患者腦脊髓液中之平均EPO濃度增加至17 U/l(正常值為約1 U/l)。灌注後3 h，患者之血清含量大致為5,000 U/l(正常血清含量為約15 U/l)。此外，EPO亦可成功地用於減少急性中風的涵蓋區域之再灌注損傷。
已知EPO及EPR－R在人類及齧齒動物大腦組織中表現(Sirn AL等人，(2001)Acta Neuropathologica 101：271－276)，具有低氧可誘發性(Jelkmann,W(1994)Clin.Investig.72：3－10)且具有經證實之顯著神經保護潛力(Bernaudin,M等人，(1999)J.Cereb.Blood Flow Metab.19：643－651；Genc,S等人，(2001)Neurosci.Lett.298：139－141)。在成年人類大腦中，據報導在神經元及星形膠質細胞中僅微弱表現EPO及其受體(Sirn AL等人，(2001)Acta Neuropathologica 101：271－276)。無論如何，在缺血及/或低氧人類大腦中在血管組織及發炎細胞中可見EPO，在血管以及梗塞及梗塞周邊區內之神經元及星形膠質細胞處理中可見EPO－R。在時間較長之缺血梗塞中，反應性神經膠質中之EPO及EPO－R最濃。靶細胞中EPO－R刺激之淨作用為增殖、抑制細胞凋亡及在紅血球母細胞之狀況下為分化。
已假定BBB有效地排斥諸如EPO之大糖基化分子。雖然在傳統觀點中認為BBB為大分子不可滲透的，但研究顯示一些大分子可跨越毛細管內皮特定輸送至大腦中以影響大腦功能。此情況經由與存在於內皮細胞之內腔表面上的受體結合而發生。此起始內飲作用，接著跨越BBB移位。因為EPO－R在腦毛細管處表現，所以假定經由BBB之EPO輸送經由受體介導之輸送而起作用。
特別地，組織保護所需之EPO血清濃度高於紅血球生成所需之EPO血清濃度。此情形之一原因為與紅血球系祖細胞相比，用於組織保護之受體顯示較低親和力(約1000倍)(Masuda,S等人，(1993)J.Biol.Chem.268：11208－11216)。另一原因可為存在BBB。臨床前資料顯示抗組織損傷之保護所需之最小EPO治療含量似乎約為每公斤體重300－500 mlU。EPO單位定義為在大鼠中誘發相同促紅血球形成反應之EPO量，如15 μmol CoCl2 (氯化鈷)。簡言之，因此已知EPO對大腦及脊髓之神經元具有神經保護作用。然而，EPO用於該療法之潛在用途受需要達到該效果之實質高治療含量的需要限制。具有改良半衰期且跨越BBB之新穎紅血球生成刺激因子(ESA)將為較佳的，尤其若該ESA可以血流中相對低起始濃度投予以避免消極副作用。
藉由使用本發明之NEA解決所屬技術領域中之問題，該NEA包含具有如所附申請專利範圍中所描述之特定分子量及鍵聯結構之藉由共價鍵併入的聚(乙二醇)基團。詳言之，此NEA係用於製造藉由在血流中引入藥物來治療腦及脊髓之神經退化性疾病之藥物。在一較佳實施例中，該NEA為經化學修飾之促紅血球形成分子，其具有至少一個游離胺基且包含選自由人類紅血球生成素及其類似物組成之群的紅血球生成素部分，該人類紅血球生成素類似物具有藉由添加1至6個糖基化位點或重排至少一個糖基化位點而修飾之人類紅血球生成素序列；該紅血球生成素部分與式－CO－(CH2 )x －(OCH2 CH2 )m －OR之"n"個聚(乙二醇)基團共價連接，其中各聚(乙二醇)基團之－CO(意即羰基)與該等胺基之一形成醯胺鍵；其中R為低碳烷基；x為2或3；m為約450至約900；n為1至3；且選擇n及m之選擇可使所得NEA之分子量減去未經修飾之紅血球生成素糖蛋白的分子量為約20千道爾頓至約100千道爾頓。
較佳地，NEA為下式：P－[NHCO－(CH2 )x －(OCH2 CH2 )m －OR]n (I)其中x、m、n及R如請求項1中所定義，且P為無n個與聚(乙二醇)基團形成醯胺鍵的胺基之紅血球生成素部分的殘基。在上文所描述之形式內，R最佳為甲基，m為約650至約750且n為1。
最佳地，用於本發明方法中之NEA具有下式：[CH3 O(CH2 CH2 O)m CH2 CH2 CH2 CO－NH]n －P其中m為650至750，n為1且P為紅血球生成素部分之殘基。
較佳地，紅血球生成素部分為人類紅血球生成素糖蛋白，其可藉由內源基因活化而表現，且其具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
或者，紅血球生成素部分具有藉由添加1至6個糖基化位點而修飾之人類紅血球生成素序列。
在另一較佳實施態樣中，可藉由本發明方法治療之腦及脊髓之神經退化性疾病係關於選自中風、TBI(創傷性腦損傷)或脊髓損傷之急性事件。此外，該腦及脊髓之神經退化性疾病可關於慢性治療，其包含中風、精神分裂症、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、亨丁頓氏病(Huntington's disease)、癡呆、FXTAS(脆弱X關聯性震顫/共濟失調症候群)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、海綿狀腦病、多發性硬化及與細菌或病毒感染關聯之神經退化。
在本發明之方法中，NEA係以足以治療或改善神經退化性疾病之量("治療有效量")投藥。可藉由EPO療法所用之習知方法對患者投予NEA。NEA之確切量取決於所治療病症之確切類型、所治療患者之病況以及組合物中的其他成份。以μg表示之量僅與各自之紅血球生成素(其為蛋白)部分相關。較佳地，對患者每週一次投予每公斤體重約0.1至約100 μg、較佳為每公斤體重約1至約10 μg之本發明ESA。
若必要，則可更頻繁地投予NEA。然而，視所治療之疾病及投藥種類而定，根據本發明所用之NEA亦可每隔兩週、每隔三週或每月一次或甚至以更長時間間隔投藥。含有共軛物之醫藥組合物可以藉由各種方式對罹患特徵為神經元死亡的神經退化性疾病之人類患者有效投藥之濃度來調配。共軛物之平均治療有效量可變化且尤其應以有資格醫師之推薦及處方為基礎。
根據本發明之NEA之比活性可藉由此項技術中已知之各種檢定來確定。本發明之經純化NEA之生物活性使得(例如)藉由注射對人類患者投予NEA會導致保護腦及脊髓之神經元。
本發明之醫藥製劑包括適合注射之醫藥組合物，其用醫藥學上可接受之載劑或媒劑調配。該等醫藥組合物之製備在此項技術中為已知的。參見(例如)US 2002/0037841 A1(對應於WO 01/87329)，該美國公開案以引用的方式併入本文中。用於調配本發明產物之醫藥學上可接受之載劑包括人類血清白蛋白、人類血漿蛋白及其類似物。
此外，在添加有或並未添加任何穩定劑或填充材料之狀況下可需要使用組合物之噴霧乾燥製劑。
可在pH 7下在含有張力劑(例如132 mM氯化鈉)之10 mM磷酸鈉/鉀緩衝液中調配本發明中所用之ESA。醫藥組合物可視情況含有防腐劑。醫藥組合物可含有不同量之紅血球生成素蛋白，例如10－1000 μg/ml，較佳為50 μg或400 μg。
較佳地，藉由注射、皮膚貼片、皮下沈積或吸入在血流中引入NEA。
較佳地，在急性神經退化之狀況下以約25 μg至約500 μg/天之劑量歷時長達兩週或在慢性治療神經退化性疾病之狀況下藉由用藥約25 μg至約1,000 μg/週而對個體投予NEA。視用藥類型及疾病類型而定，在後一種狀況下投藥亦可延長至每月或甚至在更長時間範圍內用藥一次。在一較佳實施例中，在急性狀況下將以約165 μg/天歷時長達一週應用NEA，或在慢性狀況下以約200 μg/週應用NEA。
此外，本發明係關於套組，其包含根據前述用途可用之NEA及改良血腦障壁滲透性之物質且改良血腦障壁滲透性之物質為甘露糖醇。
人類紅血球生成素及如上文所定義之類似蛋白可藉由內源基因活化來表現。較佳之人類紅血球生成素糖蛋白為SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2之彼等紅血球生成素糖蛋白，最佳為SEQ ID NO：1之彼等紅血球生成素糖蛋白。
此外，P可選自由人類紅血球生成素及其具有1至6個額外糖基化位點之類似物的殘基組成之群。如下文中詳細陳述，EPO之製備及純化在此項技術中為熟知的。EPO意謂天然或重組蛋白，較佳為人類蛋白，如自任何習知來源(諸如組織、蛋白合成、天然或重組細胞之細胞培養物)所獲得者。包含具有EPO活性之任何蛋白，諸如突變蛋白或另外經修飾之蛋白。"任何活性"在此態樣中亦包括與僅存在於神經元細胞上之EPO受體特異性結合。因此，包括不顯示促紅血球形成活性之根據本發明之NEA衍生物。重組EPO可經由藉由DNA技術或藉由內源基因活化在CHO－、BHK－或HeLa細胞株中表現來製備。蛋白(包括EPO)藉由內源基因活化而表現在此項技術中為熟知的且揭示於(例如)美國專利第5,733,761、5,641,670及5,733,746號及國際專利申請案第WO 93/09222、WO 94/12650、WO 95/31560、WO 90/11354、WO 91/06667及WO 91/09955號中，其各自內容以引用的方式併入本文中。用於製備紅血球生成素糖蛋白產物之較佳EPO種類為人類EPO種類。更佳地，EPO種類為具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所述之胺基酸序列、更佳地SEQ ID NO：1之胺基酸序列的人類EPO。
此外，P可為具有1至6個額外糖基化位點之糖蛋白類似物之殘基。用一或多個寡醣基團糖基化蛋白在沿多肽主鏈之特定位置處發生且極大地影響蛋白之物理性質，諸如蛋白穩定性、分泌、亞細胞位置及生物活性。糖基化通常為兩種類型。連接O之寡醣與絲胺酸或蘇胺酸殘基相連且連接N之寡醣與天冬醯胺酸殘基相連。在連接N及連接O之寡醣上發現的一種寡醣類型為N－乙醯基神經胺酸(唾液酸)，其為含有9個或9個以上碳原子之胺基糖家族。唾液酸通常為連接N及連接O之寡糖上的末端殘基，且因為其具有負電荷，使糖蛋白具有酸性性質。具有165個胺基酸之人類紅血球生成素含有三個連接N及一個連接O之寡醣鏈，其構成糖蛋白總分子量之約40%。連接N之糖基化在位於位置24、38及83之天冬醯胺酸殘基處發生且連接O之糖基化在位於位置126之絲胺酸殘基處發生。寡糖鏈經末端唾液酸殘基修飾。自糖基化紅血球生成素酶促移除所有唾液酸殘基會導致損失活體內活性而非活體外活性，因為紅血球生成素之唾液化藉由肝結合蛋白防止其結合及隨後清除。
本發明NEA之化學合成中所用之糖蛋白包括在人類紅血球生成素之胺基酸序列中具有導致唾液酸連接位點數目增加之一或多個變化的人類紅血球生成素類似物。此等糖蛋白類似物可由具有胺基酸殘基添加、缺失或取代之定點突變誘發而產生，其增加或改變可用於糖基化之位點。唾液酸含量大於人類紅血球生成素中所發現之唾液酸含量的糖蛋白類似物係藉由添加不干擾生物活性所需的二級或三級構形之糖基化位點而產生。本發明NEA之化學合成中所用之糖蛋白亦包括在糖基化位點具有增加之碳水化合物連接程度的類似物，其通常包含與連接N或連接O之位點緊接的一或多個胺基酸之取代。本發明NEA之化學合成中所用之糖蛋白亦包括具有一或多個自紅血球生成素之羧基末端延伸的胺基酸且提供至少一個額外碳水化合物位點之類似物。本發明NEA之化學合成中所用之糖蛋白亦包括具有包括至少一個糖基化位點重排之胺基酸序列的類似物。該糖基化位點重排包括人類紅血球生成素中缺失一或多個糖基化位點及添加一或多個非天然存在之糖基化位點。在1995年3月1日出版的Elliot之歐洲專利申請案640 619中更詳細揭示具有額外糖基化位點之紅血球生成素類似物。
此外，本發明NEA之化學合成中所用之糖蛋白包含包括至少一個額外糖基化位點之胺基酸序列，諸如(但不限於)包含藉由選自下列各物之修飾而修飾的人類紅血球生成素序列：Asn3 0 Thr3 2 ；Asn5 1 Thr5 3 ；Asn5 7 Thr5 9 ；Asn6 9 ；Asn6 9 Thr7 1 ；Ser6 8 Asn6 9 Thr7 1 ；Val8 7 Asn8 8 Thr9 0 ；Ser8 7 Asn8 8 Thr9 0 ；Ser8 7 Asn8 8 Gly8 9 Thr9 0 ；Ser8 7 Asn8 8 Thr9 0 Thr9 2 ；Ser8 7 Asn8 8 Thr9 0 Ala1 6 2 ；Asn6 9 Thr7 1 Ser8 7 Asn8 8 Thr9 0 ；Asn3 0 Thr3 2 Val8 7 Asn8 8 Thr9 0 ；Asn8 9 Ile9 0 Thr9 1 ；Ser8 7 Asn8 9 Ile9 0 Thr9 1 ；Asn1 3 6 Thr1 3 8 ；Asn1 3 8 Thr1 4 0 ；Thr1 2 5 ；及Pro1 2 4 Thr1 2 5 。
本文中用於胺基酸序列修飾之符號意謂將上標數字所指之相應未經修飾蛋白的位置(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之hEPO)變成直接位於各自上標數字之前的胺基酸。
糖蛋白亦可為在糖蛋白之羧基末端具有至少一個額外胺基酸的類似物，其中該額外胺基酸包括至少一個糖基化位點，意即如上文所定義之共軛物亦指其中糖蛋白具有包含人類紅血球生成素序列及位於人類紅血球生成素序列之羧基末端的第二序列之序列的化合物，其中該第二序列含有至少一個糖基化位點。額外胺基酸可包含得自人類絨膜促性腺激素之羧基末端的肽片段。較佳地，糖蛋白為選自由下列物質組成之群之類似物：(a)具有自羧基末端延伸之胺基酸序列(Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro IIe Leu Pro Gln(SEQ ID NO：3))的人類紅血球生成素；(b)在(a)中進一步包含Ser8 7 Asn8 8 Thr9 0 EPO之類似物；及(c)在(a)中進一步包含Asn3 0 Thr3 2 Val8 7 Asn8 8 Thr9 0 EPO之類似物。
糖蛋白亦可為具有包括至少一個糖基化位點重排之胺基酸序列的類似物。重排可包含人類紅血球生產素中缺失任何連接N之碳水化合物位點及在人類紅血球生成素之胺基酸序列位置88處添加連接N之碳水化合物位點。較佳地，糖蛋白為選自由Gln2 4 Ser8 7 Asn8 8 Thr9 0 EPO、Gln3 8 Ser8 7 Asn8 8 Thr9 0 EPO及Gln8 3 Ser8 7 Asn8 8 Thr9 0 EPO組成之群之類似物。
如本文所用，"低碳烷基"意謂具有一至六個碳原子之直鏈或支鏈烷基。低碳烷基之實例包括甲基、乙基及異丙基。根據本發明，R為任何低碳烷基。其中R為甲基之共軛物為較佳的。
符號"m"表示聚(環氧乙烷)基團中氧化伸乙基殘基(OCH2 CH2 )之數目。單一PEG次單位之氧化伸乙基具有約44道爾頓之分子量。因此，共軛物之分子量(排除EPO之分子量)取決於數字"m"。在本發明之共軛物中，"m"為約450至約900(對應於約20 kDa至約40 kDa之分子量)，較佳為約650至約750(對應於約30 kDa之分子量)。選擇數字m以使得所得本發明之共軛物具有可比得上未經修飾之EPO的生理活性，該活性可表示與未經修飾EPO之相應活性相同、高於其或為其部分。"約"特定數目之分子量意謂其在如藉由習知分析技術所確定之數量的合理範圍內。選擇數字"m"以使得與紅血球生成素糖蛋白共價連接之各聚(乙二醇)基團之分子量為約20 kDa至約40kDa，且較佳為約30 kDa。
在本發明之共軛物中，數字"n"為經由醯胺鍵與紅血球生成素蛋白之游離胺基(包括離胺酸胺基酸之ε－胺基及/或胺基－末端胺基)共價結合之聚乙二醇基團的數目。本發明之共軛物可具有每個EPO分子一、二或三個PEG基團。"n"為介於1至3之間的整數，較佳地"n"為1或2，且更佳地"n"為1。
式I之化合物可自已知之聚合物材料藉由使式II之化合物與紅血球生成素糖蛋白縮合來製備： 其中R及m如上文所描述。其中x為3之式II化合物為聚(乙二醇)之α－低碳烷氧基、丁酸琥珀醯亞胺酯(低碳烷氧基－PEG－SBA)。其中x為2之式II化合物為聚(乙二醇)之α－低碳烷氧基、丙酸琥珀醯亞胺酯(低碳烷氧基－PEG－SPA)。可利用使經活化之酯與胺反應之任何習知方法以形成醯胺。在上述反應中，例示性琥珀醯亞胺酯為引起醯胺形成之離去基團。在1997年9月30日頒發之美國專利第5,672,662號(Harris等人)中，揭示諸如式II化合物之琥珀醯亞胺酯用於製造與蛋白共軛之共軛物的用途。
人類EPO含有九個游離胺基，胺基-末端胺基加上8個離胺酸殘基之ε-胺基。當聚乙二醇化試劑與式II之SBA化合物組合時，發現在pH 7.5、蛋白：PEG比率1：3及20-25℃之反應溫度下製造單聚乙二醇化物質、二聚乙二醇化物質及痕量三聚乙二醇化物質之混合物。當聚乙二醇化試劑為式II之SPA化合物時，除了蛋白：PEG比率為1：2之外，在類似條件下主要製造單聚乙二醇化物質。聚乙二醇化EPO可作為混合物或作為經陽離子交換層析分離之不同聚乙二醇化物質來投藥。藉由操縱反應條件(例如試劑之比率、pH值、溫度、蛋白濃度、反應時間等)，不同聚乙二醇化物質的相對量可變化。
本發明提供包含如上文所述之共軛物之組合物的用途。如US 6,583,272之實例5所示，可製備含有至少90%之單-PEG共軛物(意即其中n為1)之組合物。紅血球生成素糖蛋白之單-PEG共軛物通常為合乎需要的，因為其傾向於比二-PEG共軛物具有更高之活性。單-PEG共軛物之百分比以及單及二-PEG物質之比率可藉由將較寬之溶離份集中在溶離峰周圍以降低組合物中單-PEG之百分比或將較窄之溶離份集中在溶離峰周圍以增加組合物中單-PEG之百分比來控制。約90%之單-PEG共軛物為產率與活性之良好平衡。有時，可希望得到其中(例如)至少92%或至少96%之共軛物為單－PEG物質(n等於1)之組合物。在本發明之一實施例中，其中n為1之共軛物的百分比為90%至96%。
下列情形違反直覺，即如本發明中所介紹之經化學修飾之促紅血球形成蛋白將能夠藉由簡單擴散通過BBB，因為本發明之NEA為高度親水的且具有大分子量。此情形因為Partridge等人(Pharmaceutical Research，第15卷，第4期，1998)已顯示用小PEG分子(2000道爾頓分子量)聚乙二醇化會減少腦被動吸收諸如得自腦之神經營養因子之肽。然而，下文中吾人實例明確地證實CSF中存在NEA。此等發現與下述情形一致且吾等因此假定：包含併入分子結構中的聚(乙二醇)部分之本發明NEA藉由促進或活性輸送過程而通過BBB。
罹患中風之患者必須儘快用本發明之NEA治療。關於慢性神經病，NEA將由於其在血流中改良之滯留時間(意即較長之半衰期)而週期性地投藥。因為NEA具有長滯留時間且顯示對EPO受體減小之親和力，所以血紅素含量可控制在相當窄的範圍中。因為藉由投予NEA來減小通常發現的關於EPO之血紅素含量之波峰及波谷，所以消極副作用有所減少，如增加的血栓形成風險及不需要之血液增稠。
下文藉由說明性實例進一步描述本發明。此等實例描述本發明之各種實施例，但不意欲限制本申請案。
 實例 實例1：用mPEG－SBA使EPO聚乙二醇化
例如，在US 6,583,272實例1中描述人類EPO之醱酵及純化。
如藉由分析方法所確定，根據US 6,583,272中實例1之血清分離程序所純化之EPO(EPOsf)為均勻的且顯示由8種同功異型物組成之典型同功異型物模式。如藉由正常紅血球血性(normocythaemic)小鼠檢定所確定，其具有190,000 IU/mg之生物比活性。所用之聚乙二醇化試劑為甲氧基－PEG－SBA，其為式II之化合物，其中R為甲基；x為3且m為650至750(平均約680，對應於約30 kDa之平均分子量)。
聚乙二醇化反應 向100毫克EPOsf(9.71 ml 10.3 mg/ml EPOsf儲備液，5.48 μmol)中添加含有506 mg 30 kDa甲氧基－PEG－SBA(16.5 μmol)(獲自Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,Alabama)之10 ml 0.1 M磷酸鉀緩衝液(pH 7.5)且在室溫(20－23℃)下混合2 h。最終蛋白濃度為5 mg/ml且蛋白：PEG試劑比率為1：3。兩小時後，藉由用冰乙酸將pH值調節至4.5來終止反應且將其儲存於－20℃下直至準備純化。
純化1.共軛混合物 ：將約28 ml SP－SEPHAROSE FF(磺酸基－丙基陽離子交換樹脂)填充至一AMICON玻璃管柱(2.2×7.5 cm)中且用20 mM乙酸鹽緩衝液(pH 4.5)在150 ml/h之流動速率下使其平衡。用平衡緩衝液將含有30 mg蛋白之6毫升反應混合物稀釋5倍且將其施加至管柱上。用緩衝液洗去未吸附之材料且用平衡緩衝液中之0.175 M NaCl自管柱中溶離經吸附之PEG共軛混合物。用750 mM NaCl溶離仍留在管柱上之未經修飾EPOsf。使管柱在起始緩衝液中再平衡。藉由SDS－PAGE分析樣品且確定其聚乙二醇化程度。發現0.175 M NaCl溶離液含有單聚乙二醇化物質以及二聚乙二醇化物質以及痕量三聚乙二醇化物質，而750 mM NaCl溶離液含有未經修飾之EPOsf。
2.二－PEG及單－PEG－EPOsf ：用緩衝液將先前步驟中自管柱中溶離之經純化共軛混合物稀釋4倍，且再次將其施加至管柱上且如所述經洗滌。分別用0.1 M NaCl及0.175 M NaCl自管柱中單獨溶離二－PEG－EPOsf及單－PEG－EPOsf。亦用750 mM NaCl進行溶離以溶離任何保持未經修飾之EPOsf。
或者，用乙酸鹽緩衝液將反應混合物稀釋5倍且將其施加至SP－瓊脂糖管柱(每毫升凝膠約0.5 mg蛋白)上。洗滌管柱且如先前部分中所述溶離經吸附之單－PEG－EPOsf、二－PEG－EPOsf及未經修飾之EPOsf。
結果 藉由使具有30 kDa數量平均分子量之直鏈PEG分子化學共軛來合成PEG－EPOsf。PEG－EPOsf得自EPOsf之第一胺基與30 kDa PEG－丁酸之琥珀醯亞胺酯衍生物之間產生醯胺鍵之反應。
結果概述於表1中。如藉由SDS－PAGE分析所確定，經純化之共軛混合物包含單及二－PEG－EPOsf且不含未經修飾之EPOsf。共軛混合物占23.4 mg或起始材料之78%。單及二－PEG－EPOsf之陽離子交換層析分離顯示共軛混合物中單－PEG－EPOsf與二－PEG－EPOsf比率幾乎為1：1。在反應完成後，個別組份之單：二：未經修飾比率為40：38：20(%)。總產率幾乎為定量的。
實例2：用mPEG－SPA使EPO聚乙二醇化
使實例2中所用之EPOsf的不同等分試樣與30 kDa甲氧基－PEG－SPA(Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,Alabama)反應。在蛋白：試劑比率1：2下進行反應且純化技術與實例2相同。主要產生單聚乙二醇化物質。
在US 6,583,272實例4中描述所述EPO共軛物之活體內活性。
實例3：活體內檢定
在購自Charles River RCC,Fllinsdorf,Switzerland之雄性Wistar大鼠中進行活體內實驗。將EPO及EPO共軛物(根據實例1所產生)均以每公斤體重25 μg之單一劑量經靜脈內投予至大鼠之尾部靜脈中。在所指出之時間點(注射後2及6小時)，採集腦脊髓液(CSF)樣本，接著收集血漿(舌下或末端)。藉由將收集針(0.7×19 mm)插入至小腦延髓池(後顱窩池)中獲得CSF。藉由毛細管力用矽管(ID 0.5 mm)排出CSF。使用此技術，可能自大鼠中獲得約0.1 ml CSF。
化合物： EPO，濃度：1.84 mg/ml投藥體積：每公斤體重2 ml組合物：水性緩衝液EPO共軛物，濃度：6.2 mg/ml投藥體積：每公斤體重2 ml組合物：水性緩衝液
已藉由酶聯免疫吸附檢定(ELISA)來確定所收集樣品中之化合物濃度。
結果 圖1－3顯示根據本發明之NEA能夠穿過血腦障壁。在2至6小時時期內，體液中共軛物濃度增加。
圖1描述在注射後2及6小時大鼠血清中EPO及本發明之NEA的濃度。
圖2描述在注射後2及6小時大鼠體液中EPO及本發明之NEA的濃度。
圖3描述在注射後2及6小時大鼠體液中以及血清中EPO及本發明之NEA的濃度。
<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司<120> 治療神經退化性疾病<130> 23251 <140> 095135363 <141> 2006－09－25 <150> 05108946.4 <151> 2005－09－28 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> 智人<400> 1 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> 智人<400> 2 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> 智人<400> 3

Claims (18)

  1. 一種促紅血球形成分子之用途，其係用於製造治療腦及脊髓的神經退化性疾病之藥物，該治療係藉由在需要該治療之患者的血流中投予有效量之該藥物，其中該促紅血球形成分子包含具有至少一個游離胺基之紅血球生成素部分，其係選自由人類紅血球生成素及其類似物組成之群，該等人類紅血球生成素類似物具有藉由添加1至6個糖基化位點或重排至少一個糖基化位點而修飾之人類紅血球生成素的序列；該紅血球生成素部分與下式之"n"個聚(乙二醇)基團共價連接：-CO-(CH2 )x -(OCH2 CH2 )m -OR其中各聚(乙二醇)基團之-CO與該等胺基之一形成醯胺鍵；其中R為低碳烷基；x為2或3；m為450至900；n為1至3；且n及m之選擇可使該促紅血球形成分子之分子量減去該紅血球生成素部分之分子量為20千道爾頓至100千道爾頓。
  2. 如請求項1之促紅血球形成分子之用途，該促紅血球形成分子具有下式：P-[NHCO-(CH2 )x -(OCH2 CH2 )m -OR]n (I)其中x、m、n及R如請求項1中所定義，且P為無n個與聚 (乙二醇)基團形成醯胺連接之胺基之紅血球生成素部分的殘基。
  3. 如請求項1或2之促紅血球形成分子之用途，其中R為甲基。
  4. 如請求項1或2之促紅血球形成分子之用途，其中m為650至750。
  5. 如請求項1或2之促紅血球形成分子之用途，其中n為1。
  6. 如請求項1或2之促紅血球形成分子之用途，其中R為甲基；m為650至750；且n為1。
  7. 如請求項1或2之促紅血球形成分子之用途，該促紅血球形成分子具有下式：[CH3 O(CH2 CH2 O)m CH2 CH2 CH2 CO-NH]n -P其中m為650至750，n為1且P如請求項2中所定義。
  8. 如請求項1或2之促紅血球形成分子之用途，其中該紅血球生成素部分為人類紅血球生成素。
  9. 如請求項1或2之促紅血球形成分子之用途，其中該紅血球生成素部分具有SEQ ID NO：1之序列。
  10. 如請求項1或2之促紅血球形成分子之用途，其中該紅血球生成素部分具有藉由添加1至6個糖基化位點而修飾之人類紅血球生成素的序列。
  11. 如請求項1或2之促紅血球形成分子之用途，其中該等腦及脊髓之神經退化性疾病係與選自中風、創傷性腦損傷或脊髓損傷之急性事件有關。
  12. 如請求項1或2之促紅血球形成分子之用途，其中該等腦 神經退化性疾病係與慢性治療有關，且係選自精神分裂症、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、亨丁頓氏病(Huntington's disease)、癡呆症、脆弱X關聯性震顫/共濟失調症候群、帕金森氏病(Parkinson's disease)、海綿狀腦病、多發性硬化症及與細菌或病毒感染關聯之神經退化。
  13. 如請求項1或2之促紅血球形成分子之用途，其中該促紅血球形成分子在血流中之投藥係藉由注射、皮膚貼片、皮下沈積或吸入來完成。
  14. 如請求項1或2之促紅血球形成分子之用途，其中以該紅血球生成素部分之量測量，投予之量在急性狀況下為每天25 μg至500 μg投予最多約兩週，或在慢性治療下為每週25 μg至1,000 μg。
  15. 如請求項14之促紅血球形成分子之用途，其在急性狀況下使用165 μg/天投予最多一週，或在慢性治療下使用200 μg/週。
  16. 一種用於治療腦及脊髓的神經退化性疾病之套組，其包含如請求項1至15中任一項之促紅血球形成分子。
  17. 如請求項16之套組，其包含促紅血球形成分子及改良血腦障壁之滲透性之物質。
  18. 一種包含促紅血球形成分子之藥物，其係藉由在需要治療之患者的血流中投予有效量之該藥物來治療腦及脊髓的神經退化性疾病，其中該促紅血球形成分子包含具有至少一個游離胺基之紅血球生成素部分，其係選自由人 類紅血球生成素及其類似物組成之群，該等人類紅血球生成素類似物具有藉由添加1至6個糖基化位點或重排至少一個糖基化位點而修飾之人類紅血球生成素的序列；該紅血球生成素部分與下式之"n"個聚(乙二醇)基團共價連接：-CO-(CH2 )x -(OCH2 CH2 )m -OR其中各聚(乙二醇)基團之-CO與該等胺基之一形成醯胺鍵；其中R為低碳烷基；x為2或3；m為450至900；n為1至3；且n及m之選擇可使所得促紅血球形成分子之分子量減去該紅血球生成素部分之分子量為20千道爾頓至100千道爾頓。
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