CN101274961A - 重组人甲状旁腺素相关蛋白 - Google Patents
重组人甲状旁腺素相关蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101274961A CN101274961A CNA2007100866983A CN200710086698A CN101274961A CN 101274961 A CN101274961 A CN 101274961A CN A2007100866983 A CNA2007100866983 A CN A2007100866983A CN 200710086698 A CN200710086698 A CN 200710086698A CN 101274961 A CN101274961 A CN 101274961A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pthrp1
- parathyroid hormone
- protein
- hormone related
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
本发明提供一种人甲状旁腺素相关蛋白及其应用。具体地，本发明提供一种人甲状旁腺素相关蛋白1－86、其编码基因、及其应用，同时还提供人甲状旁腺相关蛋白1－141的应用。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质工程领域。具体地，本发明涉及重组人甲状旁腺素相关蛋白及其应用。
背景技术
恶性肿瘤患者常出现恶性肿瘤高钙血症综合征(HHM)[1，2]，表现出与甲状旁腺功能亢进相似的临床症状和血液生化改变，但患者血清中甲状旁腺激素(PTH)水平却未明显增高。研究人员于是推测一种生理功能类似于PTH的物质是引起高钙血症的原因。1983年，研究人员证实这种物质不是PTH，而是由肿瘤细胞分泌的另一种与钙磷代谢有关蛋白质[3]。1987年，研究人员克隆了这种物质的cDNA，将这种蛋白命名为甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)[4，5]。随着研究的进一步深入，在多种不同的正常机体组织中均检测到了PTHrP的存在[6，7]，证实其在大多数组织器官都有所表达，提示其在正常细胞生长分化中的重要性[8]。PTHrP基因被敲除的小鼠在胚胎期发生死亡，不能正常发育[9，10]，从另一个侧面证实了PTHrP对于机体的生长发育是至关重要的。
PTH是由甲状旁腺分泌到血液，被运送至靶细胞发挥其生理作用，即人们所熟知的内分泌(endocrine)方式。而PTHrP却不是这样，它的释放方式主要为自分泌(autocrine)、旁分泌(paracrine)和胞内分泌(intracrine)[6，7，11]。
PTHrP被认为是PTH家族的第二个激素[7]。PTHrP与PTH氨基酸序列的N端序列有很大的相似性——PTHrP与PTH在N端前13个氨基酸中有8个(第2、3、4、6、7、9、12、13)是完全一样的[12]，最初研究人员推断他们在生理功能上具有相似性。经研究证实，PTHrP N端片断与PTH作用于共同的受体——PTH1型受体(PTH1R)[7]，在调节钙磷代谢中具有相似的作用。然而，随着对其研究的深入，研究人员发现二者无论是在基因结构还是在生理功能上都存在着极大的差异，PTH和PTHrP缺乏或过量分泌所引起出的临床表现也迥然不同[7]。PTHrP的基因结构远比PTH复杂得多，编码人PTH和PTHrP的基因分别位于11号与12号染色体的短臂[13]。PTHrP共包含有3个启动子和9个外显子，而PTH只有3个外显子(见图1.1)。由于转录后mRNA不同的剪接加工方式，翻译后，PTHrP共有3种成熟蛋白形式(PTHrP1-139、PTHrP1-141和PTHrP1-173)[13-15]。此外，不同种属间PTHrP基因也存在明显差异。大鼠和小鼠的PTHrP基因较人更为简单，只有5个外显子，它们编码的PTHrP成熟肽只有PTHrP1-139和PTHrP1-141两种形式[6]。
最初翻译的PTHrP前体要经过复杂的翻译后加工过程，其中包括信号肽(-36--1)的去除及蛋白内切酶的酶切作用。PTHrP被酶切后产生多种不同的多肽片段，形成了具有不同生物学活性的一组多肽。现在已经证实了3个具有生物活性的分泌型片段：N端片段(1-36/37)，中间部分片段(38-94/95/101)，C端片段(107-139/141)[12，16，17]。它们的生物学功能明显不同，而且这些多肽片段很可能各有其不同的受体[12，18]。N端片段与PTH在生物学性质上最为相似，表现出相似的生理活性。它们通过与共同的受体(PTH1R)结合，激活腺苷酸环化酶和/或磷脂酶C，发挥多种多样的生理功能[19-21]。由于蛋白酶作用的位点不同，中间部分的边界不是很确定，中间部分多肽片段88-91和89-106区域还含有核定位序列(NLS)，结构与病毒和哺乳动物的转录因子相似。在它的作用下，PTHrP可以进入核内，发挥对于基因转录的调节作用。虽然进入到细胞核的PTHrP很少，但是，在细胞的增殖分化过程中，这些极少量PTHrP却起到了极其重要的作用。C端片段同样含有NLS，可入核发挥转录调节作用，引起细胞增殖。此外还可通过特异性分布在骨和脑组织的相应受体，发挥其它两个片段所不具有的生物学效应[6，7]。
PTHrP在机体内是广泛分布的，它的作用靶组织与靶器官涉及包括骨骼、肾脏、血管、平滑肌、角质细胞、胎盘、胰岛、中枢神经系统等在内的几乎全身所有组织器官[6，7]。在骨组织，PTHrP与其受体(PTH1R)结合后，促进软骨细胞增殖，抑制其终末分化，抑制软骨细胞凋亡，这样的结果是促进骨骼生长和软骨内成骨。PTHrP对促进胎儿骨骼发育非常重要，不能为PTH所替代。PTHrP还可以促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞活动，刺激骨组织形成[7，9，23]。在肾脏，PTHrP和PTH共同参与钙磷代谢调节，间接影响骨组织代谢；还可以降低肾血流速度及肾小球滤过率，还可以促进肾小管和肾小球细胞的增生，在肾组织损伤的修复过程中起到了一定的作用[6，23-28]；PTHrP在平滑肌细胞(VSMC)和血管内皮细胞也有表达，对平滑肌具有强大的松弛作用，能够降低空腔器官及血管的紧张性，从而调节消化吸收，降低血压，维持血压平衡[29-34]；在胰腺，PTHrP能够推迟β细胞的凋亡，促进β细胞聚集以及胰岛素的分泌[35-37]。此外，在乳腺、胎盘、皮肤、小肠、心脏、垂体、中枢神经等组织器官，PTHrP都能发挥其特定的生理作用[7]。PTHrP的这些生理功能，预示着PTHrP未来在临床上广泛的应用前景，可被用于对于骨质疏松、肾功能衰竭、糖尿病、高血压等多种疾病的治疗。
近年来有关PTHrP的研究日趋增多，也已经对PTHrP有了一定的了解。然而，直到现在，它的许多生理特性、作用机制人们还不是很清楚。由于PTHrP在血清及组织细胞中的表达量极低，单靠纯化蛋白的方法提取样品很难满足科学研究的需要。
基因工程技术是利用酶学的方法，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割、重新连接，拼接成一个新的杂合DNA分子，进而转化宿主细胞，使得目的基因在体外进行大量表达。进一步纯化后，就可以得到大量目的蛋白。对于那些在体内表达量很低的蛋白，很难通过单纯的蛋白提取和纯化的方法获得大量较高纯度的样品，而基因工程技术可以在短时间内获得大量纯品，因而日益受到重视。目前国内外利用基因工程获得PTHrP都限于较短片段，合成PTHrP1-141这样长度的多肽片段还没有报道。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统既有大肠杆菌(E.coli)系统操作方便、经济、能大规模发酵生产等优点，又能对重组蛋白进行正确折叠和翻译后修饰(如：糖基化)，而且分泌型表达使产物易于纯化，它可以在以甲醇为唯一碳源的培基中生长，这是因为该细胞的过氧化酶体中含有甲醇代谢途径的必需酶，如：醇氧化酶1(alcohol oxidasel，AOX1)、是甲醇利用途径中的第一个酶，在甲醇培养的酵母中，该酶可占细胞总蛋白的30％以上。甲醇强诱导AOX1启动子，使其下游的外源基因易于调控，并具有很高的表达。毕赤酵母相对于酿酒酵母而言，重组蛋白的糖基化程度减低，后者表达重组蛋白糖基化程度高，可能产生超敏反应。因而，临床应用来自毕赤酵母的重组蛋白更安全。
动物实验广泛用于检测生物样品的生物活性。对不同片段的甲状旁腺素相关蛋白进行动物实验，可以通过检测一些反映骨重建的生物力学、骨计量学及生化指标，以了解甲状旁腺素相关蛋白在动物体内对成骨作用的影响，确认不同片段的生物活性。
发明内容
本发明的一方面是提供甲状旁腺素相关蛋白PTHrP1-86，其氨基酸序列包含SEQ ID NO：8所示的序列，或包含SEQ ID NO：8所示的序列经一个或多个(优选几个)氨基酸的保守性替代、缺失、添加后所得到的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO：8所示的序列。
本发明的另一方面提供编码本发明的甲状旁腺素相关蛋白PTHrP1-86的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7所示的序列或包含在严格杂交条件下与SEQ ID NO：7所示的序列杂交的序列。在一个优选的实施方案中，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：7所示的序列。
在本发明中，“在严格条件下的杂交”是指核酸能在T.Maniatis等.(编辑)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory(1989)所述的条件或类似条件下进行杂交。例如，它是指在下述条件下的杂交能力：在含有0.5％SDS、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％菲可(Ficoll)400和0.01％变性的鲑鱼精子核酸的6×SSC(1×SSC：0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)中，于50℃将其上固定有核酸的膜与探针孵育12-20小时。孵育后，在37℃，在含有0.5％SDS的2×SSC中洗涤膜，同时将SSC浓度下调至0.1×且温度上调至50℃，直到来自固定的核酸的信号能从背景中区分开，然后检测探针。
在本发明的另一个方面，提供包含编码甲状旁腺素相关蛋白PTHrP1-86的核苷酸序列的载体及宿主细胞。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是毕赤酵母细胞。
在本发明的另一个方面，提供了本发明的人甲状旁腺素相关蛋白(PTHrP1-86或PTHrP1-141)在制备用于治疗骨质疏松的药物中的应用。
在本发明的另一个方面，提供了一种治疗骨质疏松的方法，其包含对患者给药治疗有效量的本发明的人甲状旁腺素相关蛋白(PTHrP1-86或PTHrP1-141)。
在本发明的另一个方面，提供了一种治疗骨质疏松的试剂盒，其包含治疗有效量的本发明的人甲状旁腺素相关蛋白(PTHrP1-86或PTHrP1-141)。
在本文中所用的术语“保守性替代、缺失、添加”意指经上述修饰后的氨基酸或核苷酸序列仍具有与原序列相同的功能。本领域的普通技术人员基于所述序列，完全可以确定经保守性替代、缺失、添加后所得到的具有相同功能的序列。
在本文中所用的术语“治疗有效量”意指医师可以根据患者的病症确定的可有效发挥治疗作用的剂量。
本发明以pGEM-T easy/PTHrP1-141，1-86为模板，PCR扩增得到了PTHrP1-141，1-86成熟肽cDNA，将该片段克隆入pGEM-T easy中，再利用pGEM-T easy多克隆位点中的XhoI和EcoRI位点，将该片段定向连入相同内切酶处理过的pPIC9K连接，实现定向克隆。毕赤酵母的转化方法主要有电穿孔法、原生质法、PEG1000法和氯化锂法。电穿孔法的转化效率最高，每μg质粒DNA可产生103-104个转化子，但需要特殊设备电转化仪。原生质法也可获得较好的转化效率，但需要价格较昂贵的Zymolyase来部分水解细胞壁，实验过程也较为烦琐。PEG1000转化方法简单、经济，每μg质粒DNA可产生102-103个转化子。本研究采用这种方法也取得了较好的转化效果，转化后每个7cm平板平均获得100-200个转化子。
优点及效果
由于PTHrP在人体中的表达量极低，仅靠单纯从组织中提取目的蛋白难以得到预期产量。用本发明方法制备重组人甲状旁腺素相关蛋白1-86，1-141，操作简便，安全可靠。经纯化后，重组多肽PTHrP1-86，1-141可以满足生物活性测定以及动物实验的要求，并可用于骨质疏松的治疗。
大鼠作为实验动物，成本较低，操作简便，结果具有可重复性。该治疗及给药方法操作简便，作用直接，效果明显。
附图说明：
图1.以基因组DNA为模板PCR扩增PTHrP1-141基因，其中1为DNAMarker DL2000：2000，1000，750，500，250，100bp 2为PTHrP1-141的PCR扩增产物。
图2.重组质粒pGEM-T easy/PTHrP1-141酶切鉴定，1.DNA MarkerDL2000：2000，1000，750，500，250，100bp 2.pGEM-T easy 3.pGEM-T easy/PTHrP1-141重组质粒经酶切产物。
图3.以pGEM-T easy/PTHrP1-141为模板PCR扩增PTHrP1-141基因，1.DNA Marker DL2000：2000，1000，750，500，250，100bp 2.PTHrP1-141PCR扩增产物。
图4.以pGEM-T easy/PTHrP1-141为模板PCR扩增PTHrP1-86基因，1.DNA Marker DL2000：2000，1000，750，500，250，100bp 2.PTHrP1-86PCR扩增产物。
图5.pQE-30Xa/PTHrP1-141和pQE-30Xa/PTHrP1-86表达载体的构建。
图6.pQE-30Xa/PTHrP1-141重组质粒酶切鉴定图，其中1为1.DNAMarker DL2000：2000，1000，750，500，250，100bp；2.重组质粒pQE-30Xa/PTHrP1-141经Pvu II酶产物；3.重组质粒pQE-30Xa/PTHrP1-141。
图7.pQE-30Xa/PTHrP1-86重组质粒酶切鉴定图，其中1为1.DNAMarker DL2000：2000，1000，750，500，250，100bp；2.重组质粒pQE-30Xa/PTHrP1-86经Pvu II酶切产物；3.重组质粒pQE-30Xa/PTHrP1-86。
图8pQE-30Xa/PTHrP1-141在E.coli M15[pREP4]中表达产物的SDS-PAGE电泳结果，其中1为M15[pREP4]诱导表达，碎菌沉淀；2为M15[pREP4]诱导表达，碎菌上清；3为空pQE-30Xa质粒转化的M15[pREP4]诱导表达，碎菌沉淀；4为空pQE-30Xa质粒转化的M15[pREP4]诱导表达，碎菌上清；5为pQE-30Xa/PTHrP1-141重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达(0.1mmol/L IPTG)，碎菌沉淀；6为pQE-30Xa/PTHrP1-141重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达(0.1mmol/L IPTG)，碎菌上清；7为pQE-30Xa/PTHrP1-141重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达(2.0mmol/LIPTG)，碎菌沉淀；8为pQE-30Xa/PTHrP1-141重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达(2.0mmol/L IPTG)，碎菌上清；9为蛋白质分子量标志：116.0kD、66.2kD、45.0kD、35.0kD、25.0kD、18.4kD、14.4kD。
图9.pQE-30Xa/PTHrP1-86在E.coli M15[pREP4]中表达产物的SDS-PAGE电泳结果，其中1为M15[pREP4]诱导表达4小时，碎菌上清；2为空pQE-30Xa质粒转化的M15[pREP4]诱导表达4小时，碎菌上清；3为pQE-30Xa/PTHrP1-86重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达4小时(1.0mmol/L IPTG)，碎菌上清；4为pQE-30Xa/PTHrP1-86重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达4小时(2.0mmol/L IPTG)，碎菌上清；5为多肽分子量标志：16.95kD、14.44kD、10.60kD；6为M15[pREP4]诱导表达4小时，碎菌沉淀；7为空pQE-30Xa质粒转化的M15[pREP4]诱导表达4小时，碎菌沉淀；8为pQE-30Xa/PTHrP1-86重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达4小时(1.0mmol/L IPTG)，碎菌沉淀；9为pQE-30Xa/PTHrP1-86重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达4小时(2.0mmol/L IPTG)，碎菌沉淀。
图10.重组蛋白PTHrP1-141的Western Blotting鉴定，其中1为蛋白质分子量标志(氨基黑染色)：66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；2为诱导表达产物显色结果。
图11.重组蛋白PTHrP1-86的Western Blotting鉴定，其中1为多肽分子量标志(氨基黑染色)：16.95kD、14.44kD、10.60kD；2为诱导表达产物显色结果。
图12.重组PTHrP1-141和PTHrP1-86生物活性测定。
图13.酵母表达穿梭质粒pPIC9示意图。
图14.质粒pPIC9K-PTHrP1-86的PCR鉴定.1：以空质粒pPIC9K为模板的PCR产物；2，3，5，6，7：以重组质粒pPIC9K-PTHrp1-86为模板的PCR产物；4：DNA分子量Marker2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
图15.酵母培养基上清经SDS-PAGE电泳后凝胶银染结果。1：pPIC9K转化子诱导表达120小时培养液上清电泳；2：pPIC9K/PTHrP转化子诱导表达12小时培养液上清电泳；3：pPIC9K/PTHrP转化子诱导表达24小时培养液上清电泳；4：pPIC9K/PTHrP转化子诱导表达48小时培养液上清电泳；5：蛋白质分子量标志：97.4KD，66.2KD，43.0KD，31.0KD，20.0KD，14.4KD；6：pPIC9K/PTHrP转化子诱导表达72小时培养液上清电泳；7：pPIC9K/PTHrP转化子诱导表达96小时培养液上清电泳；8：pPIC9K/PTHrP转化子诱导表达108小时培养液上清电泳；9：pPIC9K/PTHrP转化子诱导表达120小时培养液上清电泳。
图16.对大鼠骨密度值的影响，去势组P＜0.05，其余组无差别。
图17.对大鼠血清骨钙素水平的影响，去势组：P＜0.05，PTH1-34高剂量组、PTH1-141高剂量组与PTH1-141低剂量组相比P＜0.05。
图18.对大鼠肱骨的影响，去势组P＜0.05，余组无差别。
图19.对大鼠血清碱性磷酸酶的影响，PTH1-34高剂量组、PTHrP1-141高剂量组高于其余各组。
图20.对大鼠血清钙磷的影响，假手术组P＜0.05，去势组、PTH1-141高剂量组分别和PTH1-141低剂量组相比P＜0.05。
图21.对大鼠股骨最大应力的影响。
图22.对大鼠股骨最大载荷的影响。
图23.对大鼠股骨最大变形能力的影响。
图24.对大鼠股骨伸长率的影响。
图25.对大鼠股骨骨体积的影响。
图26.对大鼠股骨单标记表体积的影响。
图27.对大鼠股骨双标记表体积的影响。
图28.对大鼠股骨单双标记表体积比的影响。
图29.对大鼠股骨类骨质表体积的影响。
图30.对大鼠股骨类骨质宽度的影响。
图31.对大鼠股骨吸收表面积的影响。
图32.对大鼠股骨矿化率的影响。
图33.对大鼠股骨矿化时间的影响。
图34.对大鼠股骨骨重建时间的影响
具体实施方式
下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的，并不应被解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。
大肠杆菌E.coli JM109菌株购自QIAGEN公司，大肠杆菌E.coli M15[pREP4]菌株购自QIAGEN公司；大鼠骨肉瘤细胞系UMR 106为本室保存购自美国ATCC(American Tissue Culture Collection)；；pGEM-T Easy载体购自Promega公司，pQE-30Xa购自QIAGEN公司。
限制性核酸内切酶EcoRI、SalI、StuI、Pvu II，rTaq DNA聚合酶、PyrobestDNA聚合酶，核酸分子量标志物DL2000，dNTP购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶购自Promega公司；多肽分子量标志物购自Sigma公司；中分子量蛋白标志物、RNase购自Fermentas公司。
氨苄青霉素、卡那霉素、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三羟甲基甘氨酸(Tricine)、十二烷基硫酸钠(SDS)购自华美生物工程公司。3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、琼脂糖、甘氨酸、溴化乙锭(EB)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、环磷酸腺苷(cAMP)为美国Sigma公司产品。过硫酸铵(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺及亚甲基双丙烯酰胺购自美国USB公司。HRP标记的兔抗山羊IgG购自北京鼎国生物工程公司。山羊抗人PTHrP(N-19)IgG购自SANTA CRUZ公司。hPTH1-34购自BACHEM公司。其他试剂均为进口或国产分析纯。
酵母提取物(Yeast Extract)、胰蛋白胨(Tryptone)、琼脂(Agar)、DMEM培养基均为GIBCO产品。胎牛血清购自Hyclone。
DNA快速纯化回收试剂盒购自北京鼎国生物科技公司。ProbandTMNi-NTA亲和层析蛋白纯化试剂盒购自Invitrogen公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒为PIERCE公司产品。DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
实施例1.pGEM-T easy/PTHrp1-141重组质粒的构建
(1)PTHrP1-141基因的获得
按照TKM法[38]自全血中提取人基因组DNA。以提取的人基因组DNA为模板，以下列引物通过PCR扩增PTHrP1-141基因：
上游引物：5’---GCGAATTCATGGCTGTGTCTGAACATCAGCTCCTC---3’(SEQ IDNO：1)，其中ATG为起始密码子；斜线表示的碱基为EcoRI酶切位点。
下游引物：5’---GGGTCGACTTAATGCCTCCGTGAATCGAGCTC---3’(SEQ ID NO：2)，其中斜线表示的碱基为SalI酶切位点，TTA为终止密码子TAA的反密码子。
PCR反应体系如下：基因组DNA为1.0μl，10×PCR缓冲液为2.5μl，dNTP(各2.5mmol/L)为1.5μl，上游引物(5μmol/L)为1.0μl，下游引物(5μmol/L)为1.0μl，rTaqDNA聚合酶(1U/μL)为1.0μl，ddH2O为17.0μl。
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性45sec，58℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；最后72℃延伸10min。取2μl PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，以核酸分子量标志物DL 2000为参照，扩增产物分子量大小为423bp(SEQ ID NO：3)，见图1。
(2)构建重组质粒pGEM-T easy/PTHrP1-141
将上述PCR扩增产物经DNA快速纯化回收试剂盒(购自北京鼎国生物科技公司)回收后与pGEM-T easy载体进行连接。然后转化到按照Nishimmra法[39]制备的感受态菌E.coli JM109中。
碱裂解法[39，40]小量提取质粒。经限制性内切酶EcoRI(8-20U/μl)0.5μl，SalI(8-20U/μl)0.5μl酶切鉴定，可见3000bp和450bp左右两条片段，见图2。将重组质粒命名为pGEM-T/PTHrP1-141。
实施例2.pQE-30Xa/PTHrP1-141和pQE-30Xa/PTHrP1-86重组质粒的构建和表达
(1)扩增PTHrP1-141和PTHrP1-86片段：
以上述重组pGEM-T easy/PTHrP1-141质粒为模板，如下通过PCR扩增PTHrP1-141和PTHrP1-86片段：
上游引物(PTHrP1-141和PTHrP1-86共用)：
5’---ATGGCTGTGTCTGAACATCAG---3’(SEQ ID NO：4)
下游引物(PTHrP1-141用)，其中斜线表示的碱基为Sal I酶切位点：
5’--CCGTCGACTTAATGCCTCCGTGAATC--3’(SEQ ID NO：5)
(PTHrP1-86用)：
5’--GTCAATGCGTCGACTTAAGGTGTCTTGAGCGGCTG--3’(SEQ IDNO：6)
PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性45sec，58℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；最后72℃延伸10min。PTHrP1-141片段的大小为423bp(SEQ ID NO：3)，见图3。PTHrP1-86片段的大小为258bp，见图4(SEQ ID NO：7，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示)。
(2)pQE-30Xa/PTHrP1-141和pQE-30Xa/PTHrP1-86重组质粒的构建
将pQE-30Xa载体经Stu I和Sal I双酶切后，分别与部分(1)中得到的PCR扩增产物PTHrP1-141和PTHrP1-86的Sal I单酶切产物连接。质粒pQE-30Xa、PTHrP1-141和PTHrP1-86序列上都有一个限制性核酸内切酶Pvu II的酶切位点。连接产物若为pQE-30Xa/PTHrP1-141重组子，则酶切后会产生3285bp和613bp两个酶切片段；若为pQE-30Xa/PTHrP1-86重组子，则酶切后会产生3285bp和448bp两个酶切片段；若为载体自连，则酶切产生一个3509bp的酶切片段，即线性化的质粒pQE-30Xa。将上述质粒经Pvu II酶切鉴定证实获得上述重组质粒(见图6和7)。对酶切鉴定有阳性结果的重组子进行DNA序列分析，进一步证实为正确的重组子。
(3).PTHrP1-141和PTHrP1-86在E.coli M15[pREP4]中的表达
将重组子pQE-30Xa/PTHrP1-141和pQE-30Xa/PTHrP1-86转化E.coliM15[pREP4]。IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导分别转化重组pQE-30Xa/PTHrP1-141和pQE-30Xa/PTHrP1-86质粒的E.coliM15[pREP4]菌6个小时。
通过SDS-PAGE[39，40]鉴定pQE-30Xa/PTHrP1-141诱导表达产物。以不含有pQE-30Xa质粒的E.coli M15[pREP4]宿主菌和含空白pQE-30Xa质粒的宿主菌为对照，表达的融合蛋白包括担体蛋白(2.2kD)和PTHrP1-141(16.2kD)，故应在约18-19kDa处可见深染蛋白条带。目的条带比预测分子量略大结果。见图8。
通过SDS-PAGE鉴定pQE-30Xa/PTHrP1-86诱导表达产物。以不含有pQE-30Xa质粒的E.coli M15[pREP4]宿主菌和含空白pQE-30Xa质粒的宿主菌为对照，表达的融合蛋白包括担体蛋白(2.2kD)和PTHrP1-86(10.0kD)，故应在约12-13kDa处可见深染蛋白条带。结果见图9。
碎菌上清中融合蛋白质的产量随IPTG终浓度增加而增加，在1.0mmol/L时达到高峰。
半干法将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上，以山羊抗人PTHrP(N-19)多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG抗体为二抗进行Western Blot[43]鉴定。用于Western Blotting检测的PVDF膜经底物显色后有一条约22kD的深染条带，其位置与重组质粒诱导表达产物的特异性条带位置一致，见图10。用于Western Blotting检测的PVDF膜经底物显色后有一条约12kD的深染条带，其位置与重组质粒诱导表达产物的特异性条带位置一致，见图11。
同时，使用Invitrogen公司ProBandTM Purification System试剂盒纯化重组蛋白。
实施例3.重组PTHrP1-141和PTHrP1-86生物活性测定[45，46]
PTH与PTHrP是通过共同的受体发挥生理功能的[19，20]，具有生物活性的PTH或PTHrP与受体结合后可触发一系列由细胞内第二信使cAMP引发的级联反应，因而细胞内cAMP浓度将显著升高。通过测定大鼠成骨肉瘤细胞系UMR106细胞内的cAMP的变化(见下表1)，检测重组PTHrP1-86及PTHrP1-141是否具有生物学活性。测定结果显示，重组PTHrP1-141及PTHrP1-86均能使细胞内cAMP水平呈剂量依赖性升高，前者作用更为明显，但二者作用强度都低于PTH1-34，见图12。具体过程如下。
1.细胞培养与样品处理
复苏大鼠骨肉瘤细胞系UMR 106[47]，传代2-3次后，接种到24孔板。37℃，5％CO2，以DMEM完全培养液培养，当细胞达到80％融合(106以上)时，弃去培养液，以冷PBS淋洗细胞2次，加入无血清DMEM培养液，5％CO2下37℃培养24hr。弃去无血清培养液，以冷PBS溶液淋洗2次。加入含1mmol/L IBMX的上述无血清培养液，作用60min，以抑制磷酸二酯酶的活性。以生理盐水为空白对照，hPTH1-34为阳性对照，三种样品(hPTH1-34、重组PTHrP1-141和PTHrP1-86)终浓度分别为10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L。5％CO2，37℃作用5min。4℃冰浴终止反应，弃去培养液，冷PBS洗2次，加入1mL冷酸乙醇(0.01mol/L HCl、95％乙醇)，-20℃放置24小时，萃取cAMP。反复冻融3次，将细胞刮下，收集细胞悬液。超声破碎细胞(40W，每次3sec，间隔3sec，共20次)。4℃，15000×g离心10分钟，上清置新管中，80℃烘干，以100μL TE复溶，用于cAMP测定。
2.cAMP含量测定
HPLC测定cAMP含量。以峰上面积值与cAMP标准曲线峰下面积值相比，得出待测样品的cAMP值。cAMP标准品购自SIGMA公司，将标准品稀释成不同浓度，建立标准曲线。
3.以细胞裂解液的总蛋白浓度对cAMP含量测定结果进行校正
BCA法测定细胞裂解液的总蛋白浓度，并将测得的细胞内cAMP含量测定结果与之相比，以二者比值作为校正后的cAMP含量测定结果。
表1重组PTHrP1-86及PTHrP1-141对细胞内cAMP水平的刺激作用
| 作用物 | 作用物终浓度(mol/L) | cAMP水平(ng/ml) |
| 空白对照 | - | 23.81 |
| rhPTHrP1-141 | 10-10 | 73.20 |
| rhPTHrP1-141 | 10-9 | 114.39 |
| rhPTHrP1-141 | 10-8 | 156.89 |
| rhPTHrP1-141 | 10-7 | 182.74 |
| rhPTHrP1-141 | 10-6 | 222.15 |
| rhPTHrP1-141 | 10-5 | 495.59 |
| rhPTHrP1-86 | 10-10 | 47.38 |
| rhPTHrP1-86 | 10-9 | 57.45 |
| rhPTHrP1-86 | 10-8 | 154.12 |
| rhPTHrP1-86 | 10-7 | 200.22 |
| rhPTHrP1-86 | 10-6 | 265.87 |
| rhPTHrP1-86 | 10-5 | 315.99 |
| rhPTH1-34 | 10-10 | 61.59 |
| rhPTH1-34 | 10-9 | 144.86 |
| rhPTH1-34 | 10-8 | 283.06 |
| rhPTH1-34 | 10-7 | 495.59 |
| rhPTH1-34 | 10-6 | 729.05 |
| PTH1-34 | 10-5 | 948.15 |
实施例3.pPIC9k/PTHrP1-141和pPIC9k/PTHrP1-86重组质粒的构建和表达
(1).重组质粒pPIC9K/PTHrP1-86的构建
将实施例2中得到的PTHrP1-86片段连入pGEM-T easy(方法同前)后，经过XhoI、EcoRI酶切后回收纯化所需DNA片段，与经过同样酶切处理的表达质粒pPIC9(图13)进行连接。将重组质粒pIC9/PTHrP1-86进行酶切鉴定及序列测定(测序引物为Invitrogen提供的5’AOX1)以确定获得正确的重组子。
(2).重组子的转化
将空质粒pPIC9K和上述重组质粒pIC9/PTHrP1-86经SalI酶切线性化后，利用电转化法转化毕赤酵母菌株GS115(购自Invitrogen公司)。涂布于MD平板(1.34％YNB(酵母氮源，是不含任何碳源的完全人工合成培养基)，4×10-5％生物素，2％葡萄糖，1.5％琼脂)30℃倒置培养两天，将生长出的各个菌落接种于YPD培养基(10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖)，震荡培养后，提取酵母基因组DNA作为模板，利用上述PCR法(同实施例2)筛选重组子。结果可见重组质粒pIC9/PTHrP1-86与空pPIC9转化的酵母菌株有不同大小扩增带，重组质粒扩增出两条带：一条大小为2200bp，是酵母AOX1基因的PCR扩增产物；另一条为771bp，是pPIC9上下游引物相对应之间的片段492bp与插入片段279bp之和。结果见图14。说明重组质粒pIC9/PTHrP1-86已整合到酵母染色体上。
(4).重组酵母菌株的诱导表达：
挑取上述重组的毕赤酵母单菌落(分别是空质粒转化产物，及重组质粒转化产物)接种于100mL BMGY培养液(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，10g/L甘油，13.4g/L YNB，0.4mg/L生物素，0.1mol/L磷酸钾缓冲液)中，30℃振荡培养直到OD600＝4.0。离心收集菌体，弃去BMGY培养液，换上25ml BMMY培养液(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，10g/L甘油，13.4g/L YNB，0.4mg/L生物素，0.1mol/L磷酸钾缓冲液)，30℃继续振荡培养，每过24h加入甲醇0.125ml(终浓度为0.5％V/V)开始诱导表达。5天后停止培养，15000×g离心保留上清，并取适量进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。含PTHrP成熟肽编码序列的重组酵母菌株在10KD处可见一明显的蛋白着色带，而对照酵母菌株(空质粒转化的酵母细胞株)则无该条带，见图15。
(5).发酵(5L)：
5.1种子液的培养：挑取上述鉴定的重组的毕赤酵母单菌落接种于100mLBMGY培养基中，30℃振荡培养至OD600＝3.0(约18hrs)。
5.2发酵：将种子液转移到5L BMGY培养基中，加入7.5％的卡那霉素5ml(终浓度为75μg/ml)，30℃，进行发酵培养。每1hr取样测定培养基OD600的吸光度值，培养至OD600＝2.0(约10hrs)。
5.3诱导表达：2000×g室温离心5min收集菌体，以500ml BMMY培养基悬浮菌体，30℃继续震荡培养，每隔24hr加入甲醇2.5ml(终浓度为0.5％V/V)。共诱导表达144hr，期间于72hr、96hr及120分别留取少量样本。
5.4电泳鉴定：15000×g离心保留上清，取少量如上用于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
实施例4.重组质粒pPIC9K/PTHrP1-141的构建
(1)重组质粒pPIC9K/PTHrP1-141的构建
将上述获得的pGEM-T easy/PTHrP1-141转入大肠杆菌JM109，培养后经碱裂解法提取质粒，经过XhoI、EcoRI酶切后回收纯化所需DNA片段，与经过同样处理的表达质粒pPIC9进行连接。重组质粒进行酶切鉴定。同时进行序列测定，测序引物为Invitrogen提供的5’AOX1。
(2).重组子的转化
pIC9/PTHrP1-141经SalI酶切线性化采用PEG法[39]转化毕赤酵母GS115感受态细胞(同时用空质粒进行转化)，涂布于MD平板(1.34％YNB，4×10-5％生物素，2％葡萄糖，1.5％琼脂)30℃倒置培养两天，将生长出的各个菌落接种于YPD培养基，震荡培养后，提取酵母基因组DNA作为模板，PCR法(同实施例2)筛选重组子。结果可见重组质粒pIC9/PTHrP1-141与空pPIC9转化的酵母菌株由不同大小扩增带，重组质粒扩增出两条带：一条大小为2200bp，是酵母AOX1基因的PCR扩增产物，另一条为936bp，是pPIC9上下游引物之间的片段492bp与插入片段444bp之和。说明重组质粒pIC9/PTHrP1-141已整合到酵母染色体上。
(4).重组酵母菌株的诱导表达：
挑取重组的毕赤酵母单菌落(空质粒转化产物，及重组质粒转化产物)接种于100mL BMGY培养液中，30℃振荡培养直到OD600＝4.0。离心收集菌体，弃去BMGY培养液，换上25ml BMMY培养液，30℃继续振荡培养，每过24h加入甲醇0.125ml(终浓度为0.5％V/V)开始诱导表达。5天后停止培养，15000×g离心保留上清，并取适量进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。含PTHrP1-141成熟肽编码序列的重组酵母菌株在22KD处有一明显的蛋白着色带可见，而对照酵母菌株(空质粒转化的酵母细胞株)则无该条带。
(5).发酵(5L)同实施例3的部分(5)
实施例5.治疗作用鉴定：
1.动物选择和分组
选择：雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠160只，12周龄，体重225-308克，平均262.87士18.68克，购自北京大学医学部实验动物科学部(实验动物质量合格证编号：0034797)，动物级别为二级(清洁级)。试验期间动物自由饮水，进食。饲料为标准颗粒饲料，饮水为自来水，铁笼喂养，自然昼夜光线照明，室内通风良好(相对湿度40-70％，室温保持在18-20℃)。
动物分组：所选动物按体重分组，遵循随机原则分为6组：假手术组、阴性对照组、PTH1-34高剂量组、PTH1-34低剂量组、PTHrP1-86高剂量组、PTHrP1-86低剂量组。每组动物20只，除假手术组外，其余各组均行去势手术。
2..去势动物模型的制备
使用10％水合氯醛，按0.3mL/100g体重经腹腔注射麻醉大鼠。麻醉后，将大鼠按俯卧位固定，备皮消毒后，经背部切口，钝性分离肌肉组织后，打开腹膜腔，确认卵巢后予以结扎、切除。将组织送回体内，庆大霉素冲洗腹腔后缝合伤口，待其自然苏醒。去势手术16周后，测定大鼠腰椎骨密度，确认动物模型造模成功。
3.给药过程
术后20周后，每日经颈背部皮下给药一次，持续给药6周。各组给药如下：假手术组给溶媒(酸化生理盐水)，阴性对照组给溶媒，PTH1-34高剂量组给PTH1-34蛋白购自上海赛金生物医药有限公司。(40nmol/kg体重)，PTH1-34低剂量组给PTH1-34(5nmol/kg体重)，PTHrP1-86高剂量组给重组PTHrP1-86蛋白(40nmol/kg体重)，PTHrP1-86低剂量组给重组PTHrP1-86蛋白(5nmol/kg体重)，PTHrP1-141高剂量组给重组PTHrP1-141蛋白(40nmol/kg体重)，PTHrP1-141低剂量组给重组PTHrP1-141蛋白(5nmol/kg体重)。给药结束前10天和给药结束前3天分别经腹腔注射四环素标记。给药结束后，经股动脉放血处死动物。
4.检测如下指标
按照现有技术[57，58，59]，检测如下指标：
(1)常规生化检查：
(a)对大鼠骨密度值的影响(见图16)去势组P＜0.05，其余组无差别。
(b)对大鼠血清骨钙素水平的影响(见图17)去势组：P＜0.05，PTH1-34高剂量组、PTH1-141高剂量组与PTH1-141低剂量组相比P＜0.05
(c)对大鼠肱骨的影响(见图18)去势组P＜0.05，余组无差别
(d)对大鼠血清碱性磷酸酶的影响(见图19)PTH1-34高剂量组、PTHrP1-141高剂量组高于其余各组
(e)对大鼠血清钙磷的影响(见图20)假手术组P＜0.05，去势组、PTH1-141高剂量组分别和PTH1-141低剂量组相比P＜0.05。
(2)对成骨作用的影响——生物力学试验，骨计量学检测
在WDW-10KN微机控制电子万能试验机做三点弯曲实验，加载点位于股骨干上1/3处，两侧支点标距为20mm，试验机匀速加载，加载速度为2mm/min。检测如下指标：
对大鼠股骨最大应力的影响(见图21)
对大鼠股骨最大载荷的影响(见图22)
对大鼠股骨最大变形能力的影响(见图23)
对大鼠股骨伸长率的影响(见图24)
对大鼠股骨骨体积的影响(见图25)
对大鼠股骨单标记表体积的影响(见图26)
对大鼠股骨双标记表体积的影响(见图27)
对大鼠股骨单双标记表体积比的影响(见图28)
对大鼠股骨类骨质表体积的影响(见图29)
对大鼠股骨类骨质宽度的影响(见图30)
对大鼠股骨吸收表面积的影响(见图31)
对大鼠股骨矿化率的影响(见图32)
对大鼠股骨矿化时间的影响(见图33)
对大鼠股骨骨重建时间的影响(见图34)
综合以上结果可见，去势组各项力学指标显著降低，而PTHrP1-86和PTHrP1-141组的结构力学和材料力学指标显著增高，说明PTHrP1-86和PTHrP1-141可使骨的力学性能提高，抗弯曲强度高，抗变形能力增强，韧性增高，脆性降低。不易发生断裂。证明PTHrP1-86和PTHrP1-141能有效提高骨的抗骨折能力，对治疗和预防骨质疏松有一定疗效。
实验结果证实，PTHrP1-86和PTHrP1-141可使骨转换加快，促进新骨生成，使骨的力学性能提高，抗弯曲强度高，抗变形能力增强，韧性增高，脆性降低，不易发生断裂。证明PTHrP1-86能有效提高骨的抗骨折能力，对治疗和预防骨质疏松有一定疗效。同时证明该动物实验方法该方法行之有效，可以很好地测定PTHrP1-86对骨质疏松的治疗作用。
参考文献
1.Burtis WJ，Brady TG，Orloff JJ，et al.Immunochemical characterization ofcirculating parathyroid hormone-related protein in patients with humoralhypercalcemia of cancer.N Engl J Med.1990；322：1106-112
2.Stewart AF.Hypercalcemia associated with cancer.N Engl J Med.2005；352：373-379
3.Strewler GJ，Williams RD，Nissenson RA.Human renal carcinoma cellsproduce hypercalcemia in the nude mouse and a novel protein recognizedby parathyroid hormone receptors.J Clin Invest.1983；71：769-774
4.Stewart AF，Insogna KL，Goltzman D，et al.Identification of adenylatecyclase-stimulating activity and cytochemical glucose-6-phosphatedehydrogenase-stimulating activity in extracts of tumors from patients withhumoral hypercalcemia of malignancy.Proc Natl Acad Sci USA.1983；80：1454-1458
5.Suva LJ，Winslow GA，Wettenhall RE，et al.A parathyroid hormone-relatedprotein implicated in malignant hypercalcemia：cloning and expression.Science.1987；237：893-896
6.Philbrick WM，Wysolmerski JJ，Galbraith S et al.Defining the roles ofparathyroid hormone-related protein in normal physiology.Physiology.1996；76：127-173
7.Strewler GJ.Mechanisms of Disease：The Physiology of ParathyroidHormone-Related Protein.N Engl J Med.2000；342：177-185
8.Martin TJ，Moseley JM，Williams ED.Parathyroid hormone-related protein：hormone and cytokine.J Endocrinol.1997；154：S23-S37
9.Karaplis AC，Luz A，Glowacki J，et al.Lethal skeletal dysplasia fromtargeted disruption of the parathyroid hormone-related peptide gene.GenesDev.1994；8：277-289
10.Soegiarto DW，Kiachopoulos S，Schipani E，et al.Partial rescue ofPTH/PTHrP receptor knockout mice by targeted expression of the Jansentransgene.Endocrinology.2001；142：5303-5310
11.Jans DA，Thomas RJ，Gillespie MT.Parathyroid hormone-related protein(PTHrP)：a nucleocytoplasmic shuttling protein with distinct paracrine andintracrine roles.Vitam Horm.2003；66：345-384
12.Orloff JJ，Reddy D，de Papp AE，et al.Parathyroid hormone-related proteinas a prohormone：posttranslational processing and receptor interactions.Endocr Rev.1994；15：40-60
13.Marguerite M，Andrew CW，Barbara ED，et al.Identification of a cDNAencoding a parathyroid hormone-like peptide from a human tumorassociated with humoral hypercalcemia of malignancy.Proc Natl Acad SciUSA.1988；85：597-601
14.Yasuda T，Banville D，Hendy GN et al.Characterization of the humanparathyroid hormone-like peptide gene：functional and evolutionary aspects.J Biol Chem.1989；264：7720-7725
15.Clemens TL，Cormier Sarah，Eichinger A，et al.Parathyroidhormone-related protein and its receptors：nuclear functions and roles in therenal and cardiovascular systems，the placental trophoblasts and thepancreatic islets.Br J Pharmacol.2001；134：1113-1136
16.Wu TL，Vasavada RC，Yang K，et al.Structural and physiologiccharacterization of the mid-region secretory species of parathyroidhormone-related protein.J Biol Chem.1996；271：24371-24381
17.Plawner LL，Philbrick WM，Burtis WJ，et al.Cell type-specific secretion ofparathyroid hormone-related protein via the regulated versus theconstitutive secretory pathway.J Biol Chem.1995；270：14078-14084
18.Orloff JJ，Kats Y，Urena P，et al.Further evidence for a novel receptor foramino-terminal parathyroid hormone-related protein on keratinocytes andsquamous carcinoma cell lines.Endocrinology.1995；136：3016-3023
19.Juppner H，Abou-Samra AB，Freeman M，et al.A G protein-linked receptorfor parathyroid hormone and parathyroid hormone-related peptide.Science.1991；254：1024-1026
20.Abou-Samra A，Juppner H，Force T，et al.Expression cloning of a commonreceptor for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related peptidefrom rat osteoblast-like cells：a single receptor stimulates intracellularaccumulation of both camp and inositol trisphosphates and increasesintracellular free calcium.Natl Acad Sci USA.1992；89：2732-2736
21.Mannstadt M，Juppner H，Gardella TJ.Receptors for PTH and PTHrP：theirbiological importance and functional properties.Am J Physiol.1999；277：F665-75
22.
A，Guillén C，Esbrit P.C-terminal parathyroid hormone-relatedprotein(PTHrP)(107-139)stimulates intracellular Ca2+ through a receptordifierent from the type 1 PTH/PTHrP receptor in osteoblastic osteosarcomaUMR 106 cells.Endocrinology.2001；142：2752-2759
23.Kovacs CS，Chafe LL，Fudge NJ，et al.PTH regulates fetal blood calciumand skeletal mineralization independently of PTHrP.Endocrinology.2001；142：4983-4993
24.Massfelder T，Parekh N，Endlich K，etal.Effect of intrarenally infusedparathyroid hormone-related protein on renal blood flow and glomerularfiltration rate in the anaesthetized rat.Br J Pharmacol.1996；118：1995-2000
25.Caverzasio J，Bonjour JP.Characteristics and regulation of Pi transport inosteogenic cells for bone metabolism.Kidney Int.1996；49：975-980
26.Massfelder T，Saussine C，Simeoni U，et al.Evidence for adenylylcyclase-dependent receptors for parathyroid hormone (PTH)-related proteinin rabbit kidney glomeruli.Life Sci.1993；53：875-881
27.Massfelder T，Stewart AF，Endlich N，et al.Parathyroid hormone-relatedprotein detection and ineraction with NO and cyclic AMP in therenovascular system.Kidney Int.1996；50：1591-1603
28.Saussine C，Massfelder T，Parnin F，et al.Renin stimulating properties ofparathyroid hormone-related peptide in the isolated perfused rat kidney.Kidney Int.1993；44：764-773
29.Massfelder T，Dann P，Wu TL et al.Opposing mitogenic and anti-mitogenicactions of parathyroid hormone-related protein in vascular smooth musclecells：a critical role for nuclear targeting.Proc Natl Acad Sci.USA.1997；94：13630-13635
30.Pirola CJ，Wang HM，Kamyar A，et al.Angiotensin II regulates parathyroidhormone-related protein expression in cultured rat aortic smooth musclecells through transcriptional and post-transcriptional mechanisms.J.Biol.Chem.1993；268：1987-1994
31.Steers WD，Broder SR，Persson K，et al.Mechanical stretch increasessecretion of parathyroid hormone-related protein by cultured bladdersmooth muscle cell.J.Urol.1998；160：908-912
32.Maeda S，Sutliff RL，Qian J，et al.Targeted overexpression of parathyroidhormone-related protein (PTHrp)to vascular smooth muscle in transgenicmice lowers blood pressure and alters cascular contractility.Endocrinology.1999；140：1815-1825
33.Massfelder T，Fiaschi-taesch N，Stewart AF，et al.parathyroidhormone-related peptide-a smooth muscle tone and proliferation regulatoryprotein.Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.1998；7：27-32
34.Wolzt M，Schmetterer L，Dorner G，et al.hemodynamic effects ofParathyroid hormone-related peptide(1-34)in human.J Clin EndocrinolMetab.1997；82：2548-2551
35.Gaich G，Orloff JJ，Atillasoy EJ，et al.Amino-terminal Parathyroidhormone-related protein：specific binding and cytosolic calcium responsesin rat insulinoma cell.Endocrinology.1993；132：1402-1409
36.Porter SE，Sorenson RL，Dann P，et al.Progressive pancreatic islethyperplasia in the islet-targeted，Parathyroid hormone-relatedprotein-overexpressing mouse.Endocrinology.1998；139：3743-3751
37.Vasavada RC，Garcia-ocana A，Zawalich WS et al.Targeted expression ofplacental lactogen in the beta cells of transgenic mice results in beta cellproliferation，islet mass augmentation，and hypoglycaemia.J Biol Chem.2000；275：15399-15406
38.Lahiri DK，Schnabei B.DNA isolation by a rapid method from humanblood samples：effect of MgCl2，EDTA，storage time and temperature onDNA yield and quality.Biochem genet.1993；31：321-325
39.卢圣栋主编.现代分子生物实验技术(第二版).中国协和医科大学出版社.1999
40.黄培堂主译.分子克隆实验指南(第三版).科学出版社.2002
41.颜子颖，王海林译.精编分子生物学实验指南.科学出版社.1999
42.郭尧君.蛋白质电泳技术.科学出版社.1999
43.沈关心，周汝麟主编.现代免疫学试验技术(第二版).湖北科学技术出版社.2002.
44.Thorikay M，Kramer S，Reynolds FH，et al.Synthesis of a gene encodingparathyroid hormone-like peptide-(1-141)：purification and biologicalcharacterization of the expressed protein.Endocrinology.1989；124：111-118
45.Hammonds RG，Jr，McKay P，et al.Purification and characterization ofrecombinant human parathyroid hormone-related protein.J Biol Chem.1989；264：14806-14811
46.Smith PK，Krohn RI.Measurement of protein using bicinchoninic acid.Anal Biochem.1985；150：76
47.司徒镇强，吴军正主编.细胞培养.世界图书出版社.1996
48.Rian E，Jemtland R，Olstad OK，et al.Synthesis of humanparathyroid-hormone-related protein(1-141)in Saccharomyces cerevisiae.A correct amino-terminal processing vital for the hormone′s biologicalactivity is obtained by an ubiquitin fusion protein approach.Eur J Biochem.1993；213：641-648
49.Shatzman AR.Expression systems.Curr.Opin.Biotechnol.1995；6：491-493
50.Makrides SC.Strategies for achieving high-level expression of genes inEscherichia coli.Microbiol Rev.1996；60：512-538
51.Gold，L.Expression of heterologous proteins in Escherichia coli.MethodsEnzymol.1990；185：11-14
52.Gu J，Stephenson CG，and ladarola MJ.Recombinant proteins attached to aNi-NTA column：Use in affinity purification of antibodies.Biotechniques.1994；17：257-262
53.Janknecht R，de Martynoff G，Lou J，et al.Rapid and efficient purificationof native histidine-tagged protein expressed by recombinant vaccinia virus.Proc Natl Acad Sci USA.1991；88：8972-8976
54.Thorikay M，Kramer S，Reynolds FH，et al.Synthesis of a gene encodingparathyroid hormone-like protein-(1-141)：purification and biologicalcharacterization of the expressed protein.Endocrinology.1989；124：111-118
55.张文怡.基因工程甲状旁腺素(PTH)高效表达系统的构建及重组PTH对骨质疏松动物模型的治疗作用.天津医科大学博士论文.2001
56.陈凯.甲状旁腺激素相关肽(1-141和1-86)编码序列的克隆与表达.天津医科大学硕士论文.2004
57.陆邦超，王坚，赵明等.胰淀素对糖皮质激素性骨质疏松大鼠骨生物力学性能的影响.BULLETIN OF MEDICAL POSTGRADUATE，2006年19卷10期
58莫梅英，黄连芳，冷扬等.骨组织形态计量学观察低钙和低蛋白饮食对大鼠骨骼的影响.中国临床营养杂志，2002年04期
59王学谦著.骨质疏松与骨关节病分册-检验与临床诊断.2006年6月
SEQUENCE LISTING
<110>天津医科大学
<120>重组人甲状旁腺素相关蛋白及其应用
<130>IP070013
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gcgaattcat ggctgtgtct gaacatcagc tcctc 35
<210>2
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gggtcgactt aatgcctccg tgaatcgagc tc 32
<210>3
<211>423
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gctgtgtctg aacatcagct cctccatgac aaggggaagt ccatccaaga tttacggcga 60
cgattcttcc ttcaccatct gatcgcagaa atccacacag ctgaaatcag agctacctcg 120
gaggtgtccc ctaactccaa gccctctccc aacacaaaga accaccccgt ccgatttggg 180
tctgatgatg agggcagata cctaactcag gaaactaaca aggtggagac gtacaaagag 240
cagccgctca agacacctgg gaagaaaaag aaaggcaagc ccgggaaacg caaggagcag 300
gaaaagaaaa aacggcgaac tcgctctgcc tggttagact ctggagtgac tgggagtggg 360
ctagaagggg accacctgtc tgacacctcc acaacgtcgc tggagctcga ttcacggagg 420
cat 423
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
atggctgtgt ctgaacatca g 21
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ccgtcgactt aatgcctccg tgaatc 26
<210>6
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gtcaatgcgt cgacttaagg tgtcttgagc ggctg 35
<210>7
<211>258
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
gctgtgtctg aacatcagct cctccatgac aaggggaagt ccatccaaga tttacggcga 60
cgattcttcc ttcaccatct gatcgcagaa atccacacag ctgaaatcag agctacctcg 120
gaggtgtccc ctaactccaa gccctctccc aacacaaaga accaccccgt ccgatttggg 180
tctgatgatg agggcagata cctaactcag gaaactaaca aggtggagac gtacaaagag 240
cagccgctca agacacct 258
<210>8
<211>86
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln
1 5 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His
20 25 30
Thr Ala Glu Ile Arg Ala Thr Ser Glu Val Ser Pro Asn Ser Lys Pro
35 40 45
Ser Pro Asn Thr Lys Asn His Pro Val Arg Phe Gly Ser Asp Asp Glu
50 55 60
Gly Arg Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys Val Glu Thr Tyr Lys Glu
65 70 75 80
Gln Pro Leu Lys Thr Pro
85
Claims (11)
1. 一种甲状旁腺素相关蛋白，其氨基酸序列包含SEQ ID NO：8所示的序列，或包含SEQ ID NO：8所示的序列经一个或多个氨基酸的保守性替代、缺失、添加后所得到的氨基酸序列。
2. 权利要求1所述的甲状旁腺素相关蛋白，其氨基酸序列是SEQ IDNO：8所示的序列。
3. 编码权利要求1或2所述甲状旁腺素相关蛋白的核苷酸序列。
4. 权利要求3所述的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7所示的序列，或包含在严格杂交条件下与SEQ ID NO：7所示的序列杂交的序列。
5. 权利要求4所述的核苷酸序列，其是SEQ ID NO：7所示的序列。
6. 载体，其包含权利要求4或5所述的核苷酸序列。
7. 宿主细胞，其包含权利要求6所述的载体。
8. 权利要求7所述的宿主细胞，其是毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)或大肠杆菌(E.coli)。
9. 人甲状旁腺素相关蛋白在制备用于治疗骨质疏松的药物中的应用，其中所述人甲状旁腺素相关蛋白选自权利要求1或2所述的人甲状旁腺素相关蛋白，或具有SEQ ID NO：3所示序列的人甲状旁腺素相关蛋白1-141。
10. 一种治疗骨质疏松输的方法，其包含对患者给药治疗有效量的人甲状旁腺素相关蛋白，其中所述人甲状旁腺素相关蛋白选自权利要求1或2所述的人甲状旁腺素相关蛋白，或具有SEQ ID NO：3所示序列的人甲状旁腺素相关蛋白1-141。
11. 一种治疗骨质疏松的试剂盒，其包含治疗有效量的人甲状旁腺素相关蛋白，其中所述人甲状旁腺素相关蛋白选自权利要求1或2所述的人甲状旁腺素相关蛋白，或具有SEQ ID NO：3所示序列的人甲状旁腺素相关蛋白1-141。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2007100866983A CN101274961A (zh) | 2006-03-30 | 2007-03-30 | 重组人甲状旁腺素相关蛋白 |
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200610013401.6 | 2006-03-30 | ||
| CN200610013404.X | 2006-03-30 | ||
| CN200610013405.4 | 2006-03-30 | ||
| CN200610013403.5 | 2006-03-30 | ||
| CN200610013405 | 2006-03-30 | ||
| CN200610013398.8 | 2006-03-30 | ||
| CN200610013402.0 | 2006-03-30 | ||
| CN200610013628.0 | 2006-05-11 | ||
| CNA2007100866983A CN101274961A (zh) | 2006-03-30 | 2007-03-30 | 重组人甲状旁腺素相关蛋白 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101274961A true CN101274961A (zh) | 2008-10-01 |
Family
ID=39994847
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2007100866983A Pending CN101274961A (zh) | 2006-03-30 | 2007-03-30 | 重组人甲状旁腺素相关蛋白 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101274961A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103893746A (zh) * | 2009-09-09 | 2014-07-02 | 旭化成制药株式会社 | 含有pth的骨质疏松症治疗/预防剂 |
-
2007
- 2007-03-30 CN CNA2007100866983A patent/CN101274961A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103893746A (zh) * | 2009-09-09 | 2014-07-02 | 旭化成制药株式会社 | 含有pth的骨质疏松症治疗/预防剂 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ravindran et al. | Endogenous amino acid flow in the avian ileum: quantification using three techniques | |
| CN110546161B (zh) | 对胰岛素受体具有降低的结合力的胰岛素类似物及其用途 | |
| MX2008015657A (es) | Polipeptidos de factor de crecimiento similares a insulina estabilizados. | |
| CN102292347A (zh) | 胰高血糖素类似物 | |
| CN102282166A (zh) | 胰高血糖素类似物 | |
| CN102292348A (zh) | 胰高血糖素类似物 | |
| CN102282167A (zh) | 胰高血糖素类似物 | |
| KR20020047096A (ko) | 초활성 돼지 성장 호르몬 분비 호르몬 유사체 | |
| CN101466399A (zh) | 稳定的胰岛素样生长因子多肽 | |
| CN104520314A (zh) | 新的具有强效激动效果的gh-rh类似物 | |
| CN111840530A (zh) | 一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗vnqs的制备及其在抗鸡球虫病中的应用方法 | |
| CN113501870B (zh) | 一种乳源多肽及其嵌合肽在用于制备促进脂肪细胞能量代谢药物中的应用 | |
| Poole et al. | Atrial natriuretic factor inhibits the stimulated in-vivo and in-vitro release of vasopressin and oxytocin in the rat | |
| CN104870470B (zh) | 人松驰素类似物、其药物组合物及其在医药上的应用 | |
| CN101274961A (zh) | 重组人甲状旁腺素相关蛋白 | |
| CN101824435A (zh) | 一种罗非鱼神经肽y重组蛋白的表达系统 | |
| CN111529691A (zh) | 甲状旁腺激素(1-34)在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用 | |
| CN101875699B (zh) | 人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN107188953B (zh) | 胰高血糖素样肽-1类似物及其用途 | |
| CN101928348A (zh) | 一种人tshr胞外段融合蛋白及其制备方法 | |
| CN107405363A (zh) | 用于治疗由超免疫反应诱导的炎性疾病的组合物 | |
| CN111840529A (zh) | 一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗vkvq的制备及其在抗鸡球虫病中的应用方法 | |
| CN102816222B (zh) | 鸡柔嫩艾美耳球虫ma2基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用 | |
| CN103463629A (zh) | 一种卵巢早衰非人哺乳动物模型的制备方法及其应用 | |
| CN100535005C (zh) | 长链人胰岛素样生长因子(lr3igf-1)及其制备和应用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20081001 |