CN101274026A - 预防支架介入术后再狭窄的药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种预防冠心病介入治疗术后冠脉再狭窄的药物及其制备方法，属于制药领域，其特征在于：该药物由以下原料按重量比水煎制得：大黄25～35∶芒硝10～20∶甘草10～20∶肉桂10～20∶桃仁10～20∶水蛭20～30∶金银花15～25。本发明解决了以往冠心病介入治疗技术中出现的术后冠脉再狭窄影响疗效的问题和以往防治术后冠脉再狭窄过程中常规西药出现对肝功、肾功损害及大出血等的问题。

Description

预防支架介入术后再狭窄的药物及其制备方法

技术领域：

本发明属于制药领域，特别涉及一种治疗冠心病支架介入术后，易形成冠状动脉再狭窄并发症的药物及其制备方法。

背景技术：

冠心病是危害人类生命的最主要疾病之一。目前心血管领域积极开展了介入治疗，以经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous transluminalcoronary angioplasty，PTCA)为基础的冠心病介入治疗技术(PCI)迅速发展，成为冠心病血管重建治疗的较成熟的手段，成功抢救许多患者生命。介入术后再狭窄(RS)率已经从经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)时代的20％～30％降至目前药物支架时代的5％～8％^[1]，但是术后再狭窄(RS)仍是影响介入治疗中、远期疗效的重要因素。目前常规西药防治过程中出现对肝功、肾功损害及大出血等的严重问题仍未能解决；因此冠心病介入技术(PCI)术后再狭窄(RS)的中医药防治的研究成了人们关注的新热点；目前还未见有中药治疗这种并发症的相关报道。

发明内容：

发明目的：本发明提供一种预防冠心病介入术后再狭窄的药物及其制备方法，其解决了以往冠心病介入技术中出现的术后再狭窄影响疗效的问题和以往防治术后再狭窄过程中常规西药出现对肝功、肾功损害及大出血等的问题。

技术方案：本发明是通过以下技术方案实现的：

一种预防支架介入术后再狭窄的药物，其特征在于：该药物作为治疗冠心病支架介入术后再狭窄的药物，由以下原料按重量比水煎制得：大黄25～35∶芒硝10～20∶甘草10～20∶肉桂10～20∶桃仁10～20∶水蛭20～30∶金银花15～25。

2、一种如上所述的预防冠心病介入术后再狭窄的药物的制备方法，其特征在于：该药物按以下步骤制备而成：

a、先将大黄、芒硝、甘草、肉桂、桃仁、水蛭、金银花按权利要求1的比例用水浸泡0.5-2小时；

b、用武火将水加热至沸腾后再文火煎1-3小时；

c、将步骤b中的药物用纱布过滤后100℃水浴浓缩至制得成品，然后密封冷藏。

上述的步骤b中倒出药汁后重新加水煎煮，共煎3次，将3次的药汁合并。

上述的步骤b中文火加热的温度控制在75-85℃。

优点及效果：

本发明提供一种预防冠心病介入术后再狭窄的药物及其制备方法，其解决了以往冠心病介入技术中出现的术后再狭窄影响疗效的问题和以往防治术后冠脉再狭窄过程中常规西药出现对肝功、肾功损害及大出血等的问题及疗效不够理想的问题；其提供一种中药及其制备方法用来预防冠心病介入技术术后再狭窄；该药物配制合理有效，制备过程简单易行，可以较好地预防冠心病介入技术术后再狭窄。

附图说明：

图1为本发明的药物对兔损伤血管内皮中NO含量影响的照片；

图2为4组兔子血管内皮中STAT3mRNA半定量RT-PCR结果；

图3为印迹分析图。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作近一步说明：

实施例1：

一种预防冠心病介入术后再狭窄的药物，该药物作为治疗冠心病支架介入术后再狭窄的药物，由以下原料按重量比水煎制得：大黄25～35∶芒硝10～20∶甘草10～20∶肉桂10～20∶桃仁10～20∶水蛭20～30∶金银花15～25。

a、先将大黄30g、芒硝15g、甘草15g、肉桂15g、桃仁15g、水蛭25g、金银花20g，用水浸泡0.5小时；

b、用武火将水加热至沸腾后再文火水煎1小时，文火加热的温度控制在75-85℃；

c、纱布过滤后100℃水浴浓缩至100mL制得成品，密封后3～6℃冰箱保存。

药汁中含有治疗作用的有效成分，温度过高影响治疗作用，所以，一定要控制好温度，因此先武火将水烧开后小火应控制在75-85℃，成品后也应低温保藏，待食用时取出。

实施例2：

一种预防冠心病介入术后再狭窄的药物，该药物按下列步骤进行：

a、先将大黄25g、芒硝20g、甘草20g、肉桂20g、桃仁20g、水蛭25g、金银花20g用水浸泡半小时；

b、先用武火将水加热至沸腾后再文火煎2小时，文火加热的温度控制在75-85℃；然后倒出药汁，重新加水继续煎煮，共煎3次，将三次的药汁合并；之所以通过三次煎煮是因为经过反复的煎煮可以更加有效地提取原料中的药物成分。

c、纱布过滤后100℃水浴浓缩至100mL，密封后3～6℃冰箱保存。。

实施例3：

一种预防冠心病介入术后再狭窄的药物，该药物按下列步骤进行：

a、先将大黄35g、芒硝20g、甘草20g、肉桂15g、桃仁15g、水蛭20g、金银花15g用水浸泡半小时；

b、用武火将水加热至沸腾后再文火煎3小时，文火加热的温度控制在75-85℃，然后倒出药汁，重新加110g水继续煎煮，共煎3次，将三次的药汁合并；之所以通过三次煎煮是因为经过反复的煎煮可以更加充分的利用药物的有效成分；

c、纱布过滤后100℃水浴浓缩至100mL，6℃冰箱保存。

为验证本发明的效果，特提供已实现的实验方法及结果如下：

1实验材料

1.1动物及饲料：健康新西兰大耳白兔40只，体重2-2.5kg雌雄不拘。由辽宁中医药大学实验动物中心提供。家兔普通饲料、家兔高脂饲料，其中家兔高脂饲料为基础饲料79％、15％蛋黄粉、猪油5％、胆固醇1％；以上均由辽宁中医药大学动物实验中心加工。

1.2主要试剂和仪器：鼠抗人单克隆抗体COX-2(GT201202)，购自Gene公司。封闭用正常山羊血清工作液，总RNA提取试剂异硫氰酸胍(TriozolReagent)：美国Invitrogen Life technologies公司。反转录酶(AMV)，RNA酶抑制剂，dNTP混合液，Oligo(dT)15，Taq DNA聚合酶，目的基因引物均购自日本TaKaRa公司。考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒：南京建成生物工程公司。碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG，北京中山生物技术有限公司。PCR扩增仪(德国Biometra)，Chemi Imager5500凝胶电泳成像分析系统(美国Alphainnotechchemi Imager)。NO免疫组化一抗购自武汉博士德生物工程有限公司。二抗生物素标记羊抗兔IgG、辣根酶标记链霉卵白素工作液、显色剂3，3-二氨基苯甲胺(DBA)及放射免疫所用试剂均购自中国北京中山生物技术有限公司。恒温水浴箱、Smart View 2001生物电泳图像分析软件等。

2实验方法

2.1实验分组：健康新西兰大耳白兔40只，将动物分模型组、中药组、西药组、空白组，各组均为10只新西兰大耳白兔；将模型组、中药组、西药组高酯饲料喂养4周后行腹主动脉内膜剥脱术造模。术后3组正常饲料喂养，中药组予本发明的预防冠心病介入治疗术后再狭窄的药物13.5ml/kg灌胃4周，西药组予舒降之、阿司匹林混合液13.5ml/kg灌胃4周，模型组、空白组予生理盐水13.5ml/kg灌胃4周，给药量按人和动物间体表面积折算的等效剂量比率表计算。

2.2药物制备：中药：以上实施例中制备好的预防冠心病介入治疗术后冠脉再狭窄的药物；西药：舒降支40mg/片，批号：国药准字J20040032，由杭州默沙东制药有限公司提供。阿司匹林100mg/片，批号：BTA6015，由拜尔药业集团有限公司提供。

2.3动物造模：模型组、中药组、西药组高酯饲料喂养4周造成动脉粥样硬化模型^[2]，然后行腹主动脉内膜剥脱术造模：25％乌拉坦每100g0.4ml腹腔麻醉家兔，于右侧腹股沟部进行脱毛消毒后利多卡因少量局麻，切皮拨肉分离股动脉，两动脉夹分别夹住股动脉进心远心端暴露2厘米左右，剪开动脉周长三分之一口，经导丝导入直径1.5-2.0mm球囊导管(依血管直径大小而定)，至肾动脉下方，盐水充盈球囊，压力为4-6Kpa，缓慢回拉导管至切口处抽空球囊内液体，使压力降至零，重复上述过程三次，达到剥落腹主动脉内皮的目的。撤出导管，结扎股动脉，缝合皮肤，术后3天连续肌注青霉素80万u/只/天，预防感染。

2.4实验取材：术后4周耳缘静脉采血，检测NO。腹主动脉内膜剥脱术后4周处死家兔，切开腹壁暴露腹腔，将肠管翻至一侧，见到腹主动脉与下腔静脉并行于脊柱旁，分离腹主动脉，截取2cm长腹主动脉用生理盐水冲洗后放于10％的中性甲醛溶液中-20℃贮存。

2.5观测指标

2.5.1家兔血清NO含量测定：

血清NO的测定：抽血2ml 1500r/min离心10min，分离血清，-30℃冰箱冻存。采用比色法，在酶标仪570nm测定样品吸光值，以亚硝酸钠为标准品，按标准曲线，可以间接测定NO浓度。

2.5.2损伤血管中NO分布测定：

采用免疫组化的方法将固定好的标本经酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋；5μm连续切片；3％H2O2.室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟×2；抗原修复；5-10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟，倾去血清勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1-2小时；PBS冲洗，5分钟×3次；滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10-30分钟；PBS冲洗，5分钟×3次；滴加适量的辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10-30分钟；PBS冲洗，5分钟×3次；DAB显色3-15分钟；自来水冲洗，复染，脱水，透明，封片。PBS代替一抗作为阴性对照。阳性判断标准：以细胞浆呈棕黄色为阳性。应用经Smart View2001生物电泳图像分析软件(上海复日科技有限公司)进行处理、分析测定NO在内皮和平滑肌细胞中阳性表达，并做统计学处理。

2.6 Trizol法抽提总RNA：参照Trizol说明书采取一步法提取总RNA。取0.1g组织剪碎置于组织匀浆器中，加入Trizol1ml，在冰浴中迅速匀浆15-30秒以充分研碎组织，置于室温中5分钟，后加入0.2ml氯仿摇振15秒，置室温3分钟，以12000rpm4℃离心15分钟，吸取上清液加入0.5ml异丙醇摇匀，室温置2小时，再次离心，条件同上，弃上清，以75％乙醇清洗一次，弃上清，加Nuclease free water 50μl。采用紫外可见光分光光度计测定OD值。

2.7半定量RT-PCR：取实验兔的血管内皮组织200mg。测定mRNA；参照说明。引物COX-2和β-actin内参对照引物由中国医科大实验室提供。

2.7.1 cDNA的合成：参照RT-PCR试剂盒说明书。

2.7.2 PCR反应条件：参照RT-PCR试剂盒说明书。

2.7.3 PCR凝胶电泳：取5μl PCR产物与2μl上样缓冲液混合，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，45min)，电泳结束后，凝胶成像仪成像分析。

2.8 Western Blot印迹分析：参考试剂盒说明。

2.9数据处理  图像分析和统计学处理图像经Smart View2001生物电泳图像分析软件(上海复日科技有限公司)进行处理、分析；采用SPSS10.0软件包对RT-PCR和Western Blot结果进行方差分析和Pearson相关分析，数据以均值±标准差表示；免疫组化结果用列表χ2检验；P＜0.05有统计学意义。

实验结果：

1本发明的预防冠心病介入术后再狭窄的药物对家兔血清NO含量影响：4周后家兔中药组、西药组血浆NO较模型组明显升高(P＜0.05，见图2)，中药组、西药组间无明显差异(P＞0.05)。(见表1)

2本发明的预防冠心病介入术后再狭窄的药物对家兔损伤血管中NO含量影响(免疫组化法)：

免疫组化染色图象分析结果：阳性颗粒主要表达部位在腹主动脉内膜内皮细胞胞浆，动脉中膜及内皮下的平滑肌细胞胞浆有少量表达。NO抗原表达从免疫组化结果看：模型组NO抗原表达明显低于中药组、西药组、空白组(P＜0.05)，中药组、西药组NO抗原表达比模型组显著增强(P＜0.05)，中药组、西药组抗原表达无明显差异(P＞0.05)。模型组内皮不光滑、有增生、不连续，中药组、西药组内皮较连续、增生减低，空白组内皮光滑、未见增生。说明本发明的预防冠心病介入治疗术后冠脉再狭窄的药物能促进NO抗原阳性表达，如图1所示：图1中A代表模型组、B代表中药组、C代表西药组、D代表空白组。

3家兔血管内皮中STAT3的mRNA半定量RT-PCR结果。在不同试验组兔子血管内皮中，均可见到STAT3的mRNA表达。其中，Mark 2中STAT3的mRNA表达上调；Mark 3中STAT3的mRNA表达被抑制；Mark 4中STAT3的mRNA表达被抑制，如图2所示，图2中MarK 1空白组；Mark 2模型组；Mark 3中药组；Mark 4西药组。

4 Western Blot结果量化分析：采用FlourChem V 2.0凝胶成像分析软件(America)分析，记录每条蛋白电泳带的灰度值，进行定量分析。如图3所示，图3中模型组和空白组比较有显著性差异(P＜0.05)；中药组和模型组比较有显著性差异(P＜0.05)；西药组和模型组比较有显著性差异(P＜0.05)；中药组、西药组间无明显差异(P＞0.05)。

表1为家兔血清NO含量变化：

                                                           

                                     NO(μmol/L)

                                                           

模型组(n＝10)                        81.69±9.14^*

中药组(n＝10)                        130.76±9.60^*▲△

西药组(n＝10)                        129.71±9.53^*▲

空白组(n＝10)                        141.67±11.60

                                                           

注：^*为与空白组比P＜0.05，^▲为与模型组比P＜0.05，^△为与西药组比P＞0.05。

讨论结果：

本发明中的大黄对血压的作用为：药用大黄及掌叶大黄浸剂、酊剂及大黄素皆有降低血压作用，D-儿茶精可使兔耳血管收缩、血压轻度上升；对心脏的作用为：大黄素小剂量则兴奋，大剂量则抑制；对于降血脂作用为：大黄的活性物质白藜芦醇能抑制胆固醇吸收；大黄中的儿茶素等能降低毛细血管通透性，增加内皮致密性，限制有害脂质的进入，从而降低血液粘滞度，提高血浆渗透压，这种稀释血液的功能，可以减少脂质的沉积。由于大黄还能增加胆汁分泌，促进胆汁排泄，使胆固醇在肠内被还原成类固醇排出体外的数量增加；另外，大黄内的结合蒽醌类物质能促使肠蠕动而致泻。而芒硝的作用为：泻热通便、软坚润燥、清火消肿；甘草的作用为：和中缓急，润肺，解毒，调和诸药；肉桂：补元阳，暖脾胃，除积冷，通血脉；桃仁：破血行瘀，润燥滑肠；水蛭：破血，逐瘀，通经；金银花：清热、解毒、凉血、通经活络；将以上几味药物有效地结合在一起，其药效相互促进，互相弥补，可更加有效地预防冠心病介入治疗术后冠脉再狭窄，同时大大减小了对人体内各脏器的损伤。

“胸痹”病名最早见于《内经》，《内经》记载：“心痹者脉不通。脉者，血之府也□，□涩则心痛”。《金匮要略》所言：胸痹而痛，所以然者，责其极虚故也。冠心病介入治疗术后冠脉再狭窄属于中医“血瘀证”范畴。其发病理论涉及瘀、痰、虚等多个方面，病机为脏气亏虚为本，痰瘀阻滞为标。治法理论则主要是以活血化瘀、豁痰去浊、兼以扶正等方面。因PCI系为外源性创伤，导致血脉受损，瘀血内停，毒邪壅于局部，与外科的创伤过程类似，并根据病变局部的感染因素和炎症反应，提出冠心病介入治疗术后冠脉再狭窄的中医发病机制不单纯是痰瘀和虚，局部特点应为瘀毒互结，兼以正气亏虚。由于新旧病因的综合作用，再次心脉闭阻的可能增加，这可能是冠脉再狭窄形成的另一主要机制。《血证论》指出：“刀伤乃是气分之血，故宜补气以生血，气达患处乃能生肌，气充肌肤乃能行血。”《景岳全书》亦云：“血有虚而滞者，宜补之活之。”气能生血，亦能行血，故在活血化瘀、豁痰去浊的同时兼以补气之药则效果更佳。而本研究运用伤寒方“桃核承气汤”，即大黄、芒硝、甘草、肉桂、桃仁、水蛭、金银花水煎制得，其为基础的改良方中大黄、芒硝为软坚散结要药防治毒邪壅于局部、防止增生、预防冠脉再狭窄共为君药；桃仁为活血祛瘀之药，水蛭为破血逐瘀之药，金银花为清热解毒之药共为臣药；肉桂补元阳、暖脾胃、除积冷、通血脉为佐药；炙甘草入心经，能补益气血以鼓动血脉，又有调和诸药之功效为使药。该方的组成特点是：活血化瘀，通下瘀毒兼扶正气。

冠脉再狭窄(RS)是一种医源性疾病，通常在冠心病介入术(PCI)后3-6个月发生，单纯球囊扩张后发生率30％-50％^[3]；冠脉金属裸支架置入术后10％-40％的患者可发生支架内再狭窄^[4]；药物洗脱支架如雷帕霉素洗脱支架的再狭窄发生率仍有5-10％^[5]。研究表明，PCI术后再狭窄的机制主要为：血栓形成、炎症反应、血管平滑肌增殖、细胞外基质及胶原纤维过量增生、血管重塑等。上述各环节互相影响，最终导致再狭窄。

STAT3是在1994年作为白细胞介素-6(IL-6)信号传递中的急性期反应因子(acute-phase responsefactor；APRF)被纯化的。STAT3广泛表达于不同类型的细胞和组织中，参与细胞生长、恶性转化、凋亡等生理功能的调控^[6]。Stat3与心肌细胞的发育、调节心肌收缩性及血管生成等方面有密切的关系，活化的Stat3可促进心肌保护因子、凋亡相关基因的表达，在心肌细胞的凋亡和存活中起重要作用。NO是由完整血管内皮细胞内一氧化氮合酶催化L-精氨酸而合成、释放的内皮依赖性舒张因子(EDRF)，具有扩张血管、抑制多种血细胞对内皮的粘附和损伤、抑制血小板活化聚集及抗血管平滑肌细胞增生等作用。

研究表明Stat3可调节心肌组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达，促进血管生成以及心肌细胞与内皮细胞的相互作用，在心肌的代偿性肥大中起到重要作用^[7]。Stat3不仅是血管生成的一种调节因子，还能诱导一氧化氮合酶的合成提高一氧化氮量，以及介导抗凋亡基因bcl2xl、超氧化物歧化酶(SOD)的生成提高应激条件下心肌细胞的存活能力^[8，9]。

目前认为VSMCs(血管平滑肌细胞)的增殖和迁移、血管外膜的重塑以及细胞外基质的生成是经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄的主要机制，同时也是防治的热点和难点^[10]。研究发现，细胞内信号传导通路与VSMCs增殖密切相关，已得到了广泛的关注^[11]。自1993年Bromberg等^[12]。首次将Stat3确认为癌基因以来，Stat3信号通路已成为调控细胞增殖、凋亡新的研究热点，Stat3表达产物为一核转录因子，当细胞外信息分子刺激该通路后，Stat3的酪氨酸基团被磷酸化，通过其SH2功能区相互作用形成同源或异源二聚体，二聚体进入细胞核后识别特异DNA片段并与之结合，作用于Cyclin D1、Bcl2xL等下游靶基因，调节细胞增殖、分化、凋亡^[13，14]。

本实验研究发现：本发明的预防冠心病介入术后再狭窄的药物能有效地升高冠心病介入技术(PCI)术后兔STAT3含量，，诱导一氧化氮合酶的合成提高一氧化氮量，抑制血管内皮增生，促进损伤内膜修复，其可促进冠心病介入治疗技术(PCI)术后兔内皮细胞的STAT3分泌，从而防止损伤内皮增生预防冠心病介入治疗术后冠脉再狭窄，同时并没有出现因为副作用对内脏的损伤；其药物配制合理有效，制备过程简单易行，可以更好地预防冠心病介入技术术后再狭窄，其有效地利用了中药理论，大大减小了实施过程中对人体内各脏器的损伤，较利于很好的推广应用。

Claims (4)

1、一种预防支架介入术后再狭窄的药物，其特征在于：该药物作为治疗冠心病支架介入术后冠状动脉再狭窄的药物，由以下原料按重量比水煎制得：大黄25～35∶芒硝10～20∶甘草10～20∶肉桂10～20∶桃仁10～20∶水蛭20～30∶金银花15～25。

2、一种如权利要求1所述的预防冠心病介入术后再狭窄的药物的制备方法，其特征在于：该药物按以下步骤制备而成：

a、先将大黄、芒硝、甘草、肉桂、桃仁、水蛭、金银花按权利要求1的比例用水浸泡0.5-2小时；

b、用武火将水加热至沸腾后再文火煎1-3小时；

c、将步骤b中的药物用纱布过滤后100℃水浴浓缩至制得成品，然后密封冷藏。

3、根据权利要求2所述的预防冠心病介入术后再狭窄的药物的制备方法，其特征在于：步骤b中倒出药汁后重新加水煎煮，共煎3次，将3次的药汁合并。

4、根据权利要求2所述的预防冠心病介入术后再狭窄的药物的制备方法，其特征在于：步骤b中文火加热的温度控制在75-85℃。

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