CN101260376B - 一种生物除锰除铁功能菌 - Google Patents

Abstract

一种生物除锰除铁功能菌，它涉及一种微生物。它解决了目前生物氧化除锰工程菌群靠自然选择建立，生化能力弱、除锰效果差；水处理除锰生物滤池的建立所需培养、驯化、启动时间长和工程菌群遭到破坏后恢复周期长的问题。生物除锰除铁功能菌MS604属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCC No.2240；菌株MS604为革兰氏阴性好氧菌，为多形态杆菌，长为1～2μm，宽为0.3～0.4μm，细胞两端圆钝；在培养基上形成乳黄色菌落，菌落圆形，不透明，边缘整齐；菌株MS604具有能源贮存颗粒，有芽胞和荚膜，N，N，N’，N’-四甲基对苯二胺染色为阳性。本发明生物除锰除铁功能菌MS604具有去除水中Mn²⁺和Fe²⁺的能力，Mn²⁺去除率高于79％，Fe²⁺去除率高于90％。

Description

一种生物除锰除铁功能菌

技术领域

本发明涉及一种微生物。

背景技术

水体中铁的去除工艺较为成熟，单纯具有除铁功能的工程菌也比较多，但铁和锰是地壳中含量丰富的金属元素，仅将铁去除远远不能满足现有的水处理标准。普通水体中锰离子的浓度为0.1～1mg/L，而厌氧地下水中溶解性的锰离子浓度可高达7～9mg/L。可溶性锰经充氧曝气能够生成不溶性沉淀物(如MnO₂或MnOOH)。

MnO₂是高度不可溶物质(δ-MnO₂的溶解度kso仅为10^-56)，呈深黑色，可导致供饮用的地下水出现明显的色度；因此饮用水中的锰必须去除。我国规定饮用水中锰离子的最高浓度为0.1mg/L，而欧盟已将饮用水中锰离子的最高浓度确定为0.05mg/L。

地下水中可溶性Mn(II)的去除通常伴随着锰离子的氧化、沉淀以及不溶性氧化产物的过滤分离。锰离子发生的非生物氧化反应如下：

$-\frac{d\left[\mathrm{Mn}\left(\mathrm{II}\right)\right]}{\mathrm{dt}}=k_0\left[\mathrm{Mn}\left(\mathrm{II}\right)\right]+k_1\left[\mathrm{Mn}\left(\mathrm{II}\right)\right]\left[\mathrm{Mn}{O}_x\right]$

表明Mn(II)的氧化伴随着MnO_X的自催化反应，这种自催化作用在饮用水锰处理工艺中较为重要。

Mn(II)非生物氧化由氧作电子供体，通常在pH值大于9的条件下完成，低于9的pH条件下氧化反应速度极慢。绝大多数的饮用水pH在6～8之间，这种pH条件下Mn(II)不会发生氧化反应；因此饮用水中的锰不能通过简单的曝气和沉淀法去除。若加入化学药剂(如KMnO₄和ClO₂)虽然除锰效果较为理想，但增加了工艺运行费用、反应残留物和生成的副产物，引起二次污染。

生物氧化除锰具有良好的应用前景，但是目前生物氧化除锰主要利用自然选择建立工程菌群，因此工程菌群生化能力弱、除锰效果差，而且水处理过滤速度慢、不能超过10m/h。现有水处理除锰生物滤池的建立所需培养、驯化和启动时间长；一旦工程菌群遭到破坏(中毒等原因导致工程菌死亡)其恢复周期长，在此期间出水中锰含量剧增、出水质量难以保证，致使该水处理设施不能正常运转，严重的将威胁人民群众的正常生活和生态环境。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前生物氧化除锰工程菌群靠自然选择建立，生化能力弱、除锰效果差，过滤速度慢；水处理除锰生物滤池的建立所需培养、驯化、启动时间长和工程菌群遭到破坏后恢复周期长的问题，而提供的一种生物除锰除铁功能菌。

生物除锰除铁功能菌MS604属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCC No.2240；生物除锰除铁功能菌MS604为革兰氏阴性好氧菌，为多形态杆菌，长为1～2μm，宽为0.3～0.4μm，细胞两端圆钝；在培养基上形成乳黄色菌落，菌落圆形，不透明，边缘整齐；生物除锰除铁功能菌MS604具有能源贮存颗粒，有芽胞和荚膜，N，N，N’，N’-四甲基对苯二胺(N，N，N’，N’-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)染色为阳性。

生物除锰除铁功能菌MS604能在pH值为6～9的环境中生长，具有脂肪酶和硝酸盐还原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脱氨酶和淀粉酶。

生物除锰除铁功能菌MS604细菌体内有类脂颗粒聚β-羟基丁酸(PHB)和异染颗粒聚合磷酸盐(Poly-P)，PHB和Poly-P都属于细菌细胞内的能源贮存颗粒，因此生物除锰除铁功能菌MS604可以更好的适应低温、贫营养生长环境，具有恶劣环境适应能力强的优点。

本发明生物除锰除铁功能菌MS604通过16S rDNA基因序列比对分析与其最相近的种属是鞘氨醇杆菌属的Sphingobacterium sp.CI01(GenbankDQ530064.1)，同源性为97％。

本发明生物除锰除铁功能菌MS604具有去除水中Mn²⁺和Fe²⁺的能力，Mn²⁺去除率高于79％，Fe²⁺去除率率高于90％。本发明生物除锰除铁功能菌MS604的生化能力强、除锰、除铁效果好，可以直接投入使用，不仅缩短了水处理除锰除铁生物滤池的建立时间，也可加快过滤速度，并且缩短了工程菌群遭到破坏后的恢复周期，可以在短暂的3～4小时内恢复水处理设施正常运行，保证了出水的质量。

生物除锰除铁功能菌MS604属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCC No.2240。

附图说明

图1是生物除锰除铁功能菌MS604中异染颗粒染色后观察图，图2是生物除锰除铁功能菌MS604芽胞染色后观察图，图3是生物除锰除铁功能菌MS604中类脂颗粒染色后观察图，图4是生物除锰除铁功能菌MS604荚膜染色后观察图，图5是生物除锰除铁功能菌MS604去除水中Mn²⁺的时间曲线图，图6是生物除锰除铁功能菌MS604去除水中Mn²⁺的pH值关系曲线图，图7是生物除锰除铁功能菌MS604培养时间与菌液浊度关系曲线，图8是生物除锰除铁功能菌MS604去除水中Fe²⁺的时间曲线图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式生物除锰除铁功能菌MS604属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCC No.2240；生物除锰除铁功能菌MS604为革兰氏阴性好氧菌，为多形态杆菌，长为1～2μm，宽为0.3～0.4μm，细胞两端圆钝；在培养基上形成乳黄色菌落，菌落圆形，不透明，边缘整齐；生物除锰除铁功能菌MS604具有能源贮存颗粒，有芽胞和荚膜(如图2和图4所示)，N，N，N′，N′-四甲基对苯二胺(N，N，N′，N′-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)染色为阳性。

生物除锰除铁功能菌MS604能在pH值为6～9的环境中生长，具有脂肪酶和硝酸盐还原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脱氨酶和淀粉酶。

生物除锰除铁功能菌MS604单个或成簇排列，菌落大。

具体实施方式二：本实施方式生物除锰除铁功能菌MS604是从辽宁省沈阳市张士生物除锰水厂的生物除锰滤池曝气池壁取泥中筛选得到的。筛选用1L培养基由0.8g蛋白胨、0.2g酵母浸膏，0.1g MnSO₄.H₂O，0.1g K₂HPO₄，0.2gMgSO₄·7H₂O，0.2g NaNO₃，0.1g CaCl₂，0.1g(NH₄)₂CO₃，0.01g FeSO₄·7H₂O和余量的蒸馏水制成；然后灭菌。

本实施方式采用平板划线与平板涂布法相结合进行分菌，采用TMPD法(Vandenabeele J，D de Beer et al.Manganese oxidation by microbial consortiafrom sand filters.Microb.Ecol.1992，24：91-108.)对分离所得菌种进行初筛。本实施方式采用TMPD法的原理是N，N，N′，N′-四甲基对苯二胺(N，N，N′，N′-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)可与四价锰反应生成蓝色物质Wurster Blue，利用分光光度法通过测Wurster Blue在420nm处的OD值可推知菌落具有Mn²⁺氧化能力的强弱(菌落无颜色变化的为阴性、无生物除锰功能)。

本实施方式生物除锰除铁功能菌MS604 16S rDNA测序工作由生物工程公司完成；其中PCR扩增正向引物BSF8/20：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物BSR1541/20：5’-AAGGAGGTGATCCA GCCGCA-3’。本实施方式生物除锰除铁功能菌MS604 16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本实施方式生物除锰除铁功能菌MS604生理生化分析结果如表1所示。

[0026][0027]表1生物除锰除铁功能菌MS604生理生化实验结果

试验名称	试验结果	结果所说明的问题
			乙酰甲基醇试验	-	没有发酵葡萄糖产生乙酰四基甲醇的能力。
甲基红试验	-	不能在糖代谢过程中分解葡萄糖产生丙酮酸。
			淀粉水解试验	-	不能产生能够水解淀粉的淀粉酶。
产氨试验	-	不能产生脱氨酶
			油脂水解试验	+	能产生脂肪酶，将脂肪分解成甘油和脂肪酸。
硝酸盐还原试验	+	具有硝酸还原盐能力
			氧化酶试验	-	无可以和细胞色素a、b、c构成氧化酶系的氧化酶
产吲哚试验	-	不具有能分解色氨酸使之形成吲哚的色氨酸酶
			明胶液化试验	-	没有分解蛋白质的能力
产硫化氢试验	-	不能分解含硫有机物产生硫化氢
			PH值试验	pH6～9	适于在中性或碱性环境中生长
生长温度试验	0～37℃	较低温度下都可以正常生长
			需氧性的测定	上部生长	属于好氧型的细菌

生理生化实验结果表明生物除锰除铁功能菌MS604是好氧菌，适于在中性或碱性环境中生长；0℃低温条件下仍可生长，典型低温菌种；具有脂肪酶和硝酸盐还原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脱氨酶和淀粉酶；可将水中的脂肪分解成甘油和脂肪酸，没有发酵葡萄糖产生乙酰四基甲醇的能力，不能在糖代谢过程中分解葡萄糖产生丙酮酸。生物除锰除铁功能菌MS604有脂质颗粒聚β-羟基丁酸(PHB)和异染颗粒聚合磷酸盐(Poly-P)，脂质颗粒PHB和异染颗粒Poly-P都属于能源贮存颗粒。生物除锰除铁功能菌MS604中脂质颗粒染色后观察图如图3所示，生物除锰除铁功能菌MS604中异染颗粒染色后观察图如图1所示。

生物除锰除铁功能菌MS604的发酵上清液具有较高的除锰活性，试验表明生物除锰除铁功能菌MS604能够分泌大量的除锰胞外蛋白酶。

接菌培养生物除锰除铁功能菌MS604，液体培养液pH值为7.5，在12℃低温条件下培养48h，然后向培养液中加入高浓度Mn²⁺溶液使培养液中Mn²⁺的浓度为9mg/L，液体培养液中Mn²⁺的浓度随时间的变化曲线如图5所示；12～24hMn²⁺浓度有大幅度消减，由8.47mg/L降至2.98mg/L。24h后消减程度略趋平缓，直到48h后趋于稳定(2.35mg/L)，之后维持在2mg/L左右，到72h时，Mn²⁺去除率达到79.08％。1。实验证明，生物除锰除铁功能菌MS604具有较高的生物除锰性能，且具有较高的胞外酶活性，通过48h的低温培养菌株向胞外分泌大量活性蛋白，活性蛋白与Mn²⁺相结合，使Mn²⁺转化为MnO_X，得以去除。

由图6可知，生物除锰除铁功能菌MS604的最佳活性pH值为8，生物除锰除铁功能菌MS604在pH值为1～4的环境中几乎无法去除Mn²⁺，主要因为较低的pH环境不适合菌株生长，同时对酶活有抑制作用；pH值大于4去除率开始迅猛增长；pH值大于9Mn²⁺去除率虽然略有下降，但仍保持在较高的范围内，虽然生理生化试验表明值pH大于10生物除锰除铁功能菌MS604根本不能生长，但由于Mn²⁺在pH＞9.5的碱性环境下可以被溶解氧迅速氧化成MnO₂而析出，因此pH为10～14时Mn²⁺去除率仍高达75％左右。

考察菌浊度的目的是确定MS604的生长周期，为工程应用提供指导性的参数。由图7可知接种时原始菌浊度(OD值)为0.12，接种后12h内细菌数量迅速增加，OD值高达0.6；之后的36小时内出现明显的波动状态，菌浊度在经过迅速下降-迅速上升-下降的变化后趋于平稳，稳定在OD值0.48左右。这种无规律的变化曲线很难准确测出MS604的生长曲线。在培养过程中发现接种12h后，培养液底部出现细菌聚集现象，这可能是因为MS604胞外存在荚膜和粘液，使较高浓度的细菌在相互接触过程中形成菌胶团。因而测定OD值时，细菌分布不均匀，导致数值的不真实可靠。由此可见，使用常规方法，即通过测菌浊度，确定生长曲线的方法对生物除锰除铁功能菌MS604不适合。

接菌培养生物除锰除铁功能菌MS604，液体培养液pH值为7.5，在12℃低温条件下培养48h，然后向培养液中加入高浓度Fe²⁺溶液使培养液中Fe²⁺的浓度为14mg/L，液体培养液中Mn²⁺的浓度随时间的变化曲线如图8所示，12h内Fe²⁺去除率迅速增高，去除率高达72.69％，Fe²⁺浓度由14mg/L降至6.56mg/L，24h后去除率趋于稳定，Fe²⁺去除率维持在90％左右。

序列表

<110>哈尔滨工业大学

<120>一种生物除锰除铁功能菌

<160>3

<210>1

<211>1522

<212>DNA

<213>生物除锰除铁功能菌MS604(Sphingobacterium sp.)

<220>

<223>生物除锰除铁功能菌MS604 16S rDNA基因序列

<400>1

aaggaggtga tccagccgca ccttccggta cggctacctt gttacgactt agccccaatt    60

atcggtttta ccctaacacg ctccttgcgg tcacatgctt taggtacccc caactttcat    120

ggcttgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcgtcat tgctgatacg    180

cgattactag cgaatccaac ttcatggggt cgagttgcag accccaatcc gaactgtgaa    240

tggcttttag agattagcat catattgcta tgtagctgcc cgctgtacca tccattgtag    300

cacgtgtgta gccccggacg taagggccat gatgacttga cgtcgccccc accttcctca    360

ctgtttgcac aggcagtctg tttagagtcc ccaccattac atgctggcaa ctaaacatag    420

gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa cacctcacgg cacgagctga cgacagccat    480

gcagcaccta gtttcgtgtc ccgaaggacg agaccgtctc tggtctcttc actaactttc    540

aagcccgggt aaggttcctc gcgtatcatc gaattaaacc acatgctcct ccgcttgtgc    600

gggcccccgt caattccttt gagtttcacc cttgcgggcg tactccccag gtggataact    660

taacgctttc gctaagacgc tggctgtcta tcgccaacat cgagttatca tcgtttaggg    720

cgtggactac cagggtatct aatcctgttc gatccccacg ctttcgtgca tcagcgtcaa    780

taccagctta gtgagctgcc ttcgcaatcg gagttctaag acatatctat gcatttcacc    840

gctacttgtc ttattccgcc cacttcaaat ggattcaagc ccatcagtat caaaggcact    900

gcgatggttg agccaccgta tttcacccct gacttaatag gccgcctacg caccctttaa    960

acccaataaa tccggataac gctcggatcc tccgtattac cgcggctgct ggcacggagt    1020

tagccgatcc ttattcttcc agtacattca gctaaataca cgtatttagg tttattcctg    1080

gacaaaagca gtttacaacc catagggcag tcatcctgca cgcggcatgg ctggttcagg    1140

cttccgccca ttgaccaata ttccttactg ctgcctcccg taggagtctg gtccgtgtct    1200

cagtaccagt gtgggggatt ctcctctcag agcccctaga catcgtcgcc ttggtaagcc    1260

gttaccctac caactagcta atgtcacgcg agcccatctc tatcctataa atatttaata    1320

atatcccgat gccggtacat tatattatgc ggtgttaatc tctctttcga gaggctatcc    1380

ccctgataaa ggtaggttgc tcacgcgtta cgcacccgtg cgccactctc atggaaccag    1440

agcaagctct gattccaatc ccgtccgact tgcatgtatt aggcctgccg ctagcgttca    1500

tcctgagcca ggatcaaact ct                                             1522

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据E.coli 16S rRNA基因8～20bp设计PCR扩增正向引物BSF8/20序列。

<400>2

agagtttgat cctggctcag 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据E.coli 16S rRNA基因1520～1541bp设计PCR扩增正向引物BSR 1541/20序列。

<400>3

aaggaggtga tccagccgca 20

Claims (2)

1.一种生物除锰除铁功能菌，其特征在于生物除锰除铁功能菌MS604属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCC No.2240；生物除锰除铁功能菌MS604为革兰氏阴性好氧菌，为多形态杆菌，长为1～2μm，宽为0.3～0.4μm，细胞两端圆钝；在培养基上形成乳黄色菌落，菌落圆形，不透明，边缘整齐；生物除锰除铁功能菌MS604具有能源贮存颗粒，有芽胞和荚膜，N，N，N’，N’-四甲基对苯二胺染色为阳性。

2.根据权利要求1所述的一种生物除锰除铁功能菌，其特征在于生物除锰除铁功能菌MS604能在pH值为6～9的环境中生长，具有脂肪酶和硝酸盐还原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脱氨酶和淀粉酶。

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