CN101259118A

CN101259118A - 2’,4’-二羟基-6’-甲氧基-3’,5’-二甲基查耳酮作为PPARγ激动剂的应用

Info

Publication number: CN101259118A
Application number: CNA2008100261576A
Authority: CN
Inventors: 吴东海; 金晓辉; 魏孝义; 黄志伟
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS; South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS; South China Botanical Garden of CAS
Priority date: 2008-01-31
Filing date: 2008-01-31
Publication date: 2008-09-10
Anticipated expiration: 2028-01-31
Also published as: CN101259118B

Abstract

本发明公开了2’，4’－二羟基－6’－甲氧基－3’，5’－二甲基查耳酮作为过氧化物酶体增长因子活化受体－γ(PPARγ)激动剂的应用。该化合物作为PPARγ的激动剂的应用，为临床预防和治疗2型糖尿病、高脂血症、肥胖症提供一种新的药物。

Description

2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮作为PPARγ激动剂的应用

技术领域

本发明涉及2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮作为过氧化物酶体增长因子活化受体-γ(PPARγ)激动剂的应用。

背景技术

过氧化物酶体增长因子活化受体(peroxisome proliferator-activatedreceptor，PPAR)是一类由配体激活的核转录因子，属于核受体超家族成员。PPARγ是PPAR的一种亚型，主要存在于在脂肪组织中。PPARγ与配体结合而被激活后，能与维甲酸类受体X(retinoid X receptor，RXR)形成异二聚体，作用于靶基因上游的PPAR反应元件(PPAR-responsive element，PPRE)，从而调节目的基因的转录，这些基因直接或间接参与许多病理和生理过程，如能量平衡、细胞分化、糖脂代谢、改善胰岛素抵抗等。因此，以PPARγ为靶点的药物是当前糖尿病药物开发的热点。噻唑烷二酮(TZD)类药物，如罗格列酮和吡格列酮等，是目前以PPARγ为靶点的治疗2型糖尿病的代表药物，但是这些药物在临床应用上会通常带来体重增加、浮肿、增加充血性心力衰竭的机率等不良后果。因此，近年来2型糖尿病的药物研究都集中在寻求具有相似疗效而毒副作用更小的PPARγ配体上，其中，从天然产物来源的化合物中寻求PPARγ配体就是一种很好的途径。

2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮(2’，4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’，5’-dimethylchalcone，DMC)是桃金娘科植物水翁Cleistocalyx operculatus(Roxb.)Merr.et Perry的干燥花蕾提取物的成分之一。分子式为C₁₈H₁₈O₄，其结构通式为：

之前的研究结果表明2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮具有抗肿瘤和抗氧化的活性，能够抑制ATP酶以及阻断血管内皮生长因子受体的信号通路。专利号为200510023242.3的中国专利则公开了2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮作为肿瘤多药耐药性逆转剂的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮的一种新用途，即技术方案为：2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮作为PPARγ激动剂的应用。

特别地，2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮在制备预防和治疗由PPARγ介导引起的2型糖尿病的药物中的应用。

2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮在制备预防和治疗由PPARγ介导引起的肥胖症的药物中的应用。

2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮在制备预防和治疗由PPARγ介导引起的高脂血症的药物中的应用。

经大量试验研究发现，2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮具有PPARγ的配体结合活性，能够促进3T3-L1前脂肪细胞的分化，显著提高3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取能力。该化合物作为PPARγ的激动剂的应用，为临床预防和治疗2型糖尿病、高脂血症、肥胖症提供一种新的药物。

附图说明

图1是通过GAL4嵌合体报告基因试验分析DMC的PPARγ配体结合活性的示意图；

图2是DMC对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响的示意图；

图3是DMC对3T3-L1前脂肪细胞的分化的影响的示意图。

具体实施方式

下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：

DMC由中国科学院华南植物园提供；罗格列酮为葛兰素史克(天津)有限公司产品，DMC和罗格列酮均溶于DMSO中保存；DMSO为AMRESCO公司产品；脂质体(Lipofectamine 2000)、高糖DMEM培养基、OPTI-MEM培养基以及胎牛血清(FBS)均为invitrogen公司产品；双荧光素酶检测试剂盒(Dual-LuciferaseReporter Assay System)为Promega公司产品；胰岛素、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)以及油红O均为Sigma公司产品；³H-2-脱氧葡萄糖购自中国同位素总公司。293T细胞、3T3-L1细胞购自ATCC公司。萤火虫荧光素酶(Firefly-Luc)报告基因质粒pFR-Luc为Stratagene公司产品；海肾荧光素酶(Renilla-Luc)报告基因质粒pRL-TK-Renilla为Promega公司产品；GAL4-PPARγ-LBD质粒由中国科学院广州生物医药与健康研究院黄志伟研究员构建；细胞培养板均为Corning Costar公司产品。

实施例1DMC的PPARγ配体结合活性分析

将对数生长期的293T细胞以每孔1.5×10⁴个接种于96孔培养板，培养过夜，细胞长到80％~90％满时用于转染。用OPTI-MEM培养基分别稀释Lipofectamine2000(体积比是0.5∶100)和质粒DNA，将稀释后的脂质体和质粒DNA以等体积混合，室温放置20min后对细胞进行瞬时共转染，转染的质粒DNA用量分别为：GAL4-PPARγ-LBD每孔25ng，pFR-Luc每孔50ng，pRL-TK-Renilla每孔5ng。转染后孵育4h再加药，实验组加入浓度从1n mol·L^-1到10μmol·L^-1的DMC，正常对照组加入同样体积的DMSO，加药24h之后检测荧光素酶活性，检测方法严格按照Dual-Luciferase Reporter Assay System说明书，分别用荧光照度计读取Firefly-luc与Renilla-luc的荧光值，以Firefly-luc与Renilla-luc的比值作为活性测定结果。

从图1可以看出：经过DMC处理的细胞的PPARγ激活程度显著高于用DMSO处理的正常对照细胞。DMC作用的半数最大效应浓度(EC₅₀)约为5μmol·L^-1，在浓度为10μmol·L^-1时，DMC对于PPARγ的激活达到了最大，为正常对照的12倍。这说明了DMC能以剂量依赖型的方式激活PPARγ。

实施例2DMC对3T3-L1前脂肪细胞的分化的影响

24孔板培养的3T3-L1前脂肪细胞生长至完全融合后2d，换成诱导液(含200nmol·L^-1胰岛素、1μmol·L^-1地塞米松的10％FBS高糖DMEM)培养，同时每孔分别加入终浓度为1μmol·L^-1、5μmol·L^-1和10μmol·L^-1的DMC，加DMSO的孔作为正常对照，诱导3d后，换成含200nmol·L^-1胰岛素的10％FBS高糖DMEM。2d后结束孵育，进行油红O染色：吸去全部培养基，将细胞用PBS洗涤一次，用10％甲醛将细胞固定24h，弃去固定液，用60％异丙醇洗涤一次，等细胞充分干燥后加入油红O溶液，室温下染色30min，弃去染色剂，用dH₂O洗涤细胞4次，干燥后用100％异丙醇萃取，萃取后的染液转移到新的24孔板，用酶标仪读取A_500nm值。A_500nm值代表了细胞中的甘油三酯含量，反映了3T3-L1前脂肪细胞的分化程度。

从图2可以看出：DMC处理组的A_500nm值明显高于正常对照组，且随着DMC浓度的提升，A_500nm值也随之提高。表明了DMC能促进3T3-L1前脂肪细胞的分化，且作用方式呈量效关系。

实施例3DMC对3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取的影响

将24孔培养板中诱导后8d的3T3-L1脂肪细胞分别用5μmol·L^-1的DMC和5μmol·L^-1的罗格列酮处理48h，DMSO处理的细胞作为正常对照组。在进行葡萄糖摄取试验之前，将细胞换成含0.1％FBS的DMEM培养基饥饿培养2h，吸去培养基，PBS洗涤细胞3次，换成含2％BSA的KRH缓冲液(20mM HEPES，pH 7.4；136m mol·L^-1 NaCl；4.7m mol·L^-1 KCl；1.25m mol·L^-1 MgSO₄；1.25m mol·L^-1CaCl₂)37℃孵育30min，加入终浓度为200nmol·L^-1的胰岛素继续37℃孵育30min，随后每孔加人20μl含1.6μCi[³H]-2-脱氧葡萄糖的2-脱氧葡萄糖混和液，37℃孵育10min后迅速吸去孵育液，冰冷PBS洗涤细胞3次，室温下等细胞充分干燥后用闪烁液吹打裂解细胞，将裂解液转移到5ml闪烁管中，用液体闪烁分析仪读取CPM值。

从图3可以看出：经过5μmol·L^-1的DMC处理的3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取量达到了正常对照组的353％，而5μmol·L^-1的罗格列酮处理的细胞的葡萄糖摄取量为正常对照组的208％，这说明了DMC能显著促进胰岛素刺激下的3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取，并且作用效果超过了同等浓度的罗格列酮。

Claims

1.2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮作为PPARγ激动剂的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述应用为2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮用于制备预防和治疗由PPARγ介导引起的2型糖尿病的药物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述应用为2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮用于制备预防和治疗由PPARγ介导引起的肥胖症的药物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述应用为2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮用于制备预防和治疗由PPARγ介导引起的高脂血症的药物。