CN101257948A - 嘧啶并二氮䓬衍生物及吲哚并蝶啶化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及嘧啶并苯并二氮䓬和吲哚并蝶啶类化合物，还涉及含有两个或多个上述化合物的库及相关制备方法。此外，本发明还涉及嘧啶并苯并二氮䓬衍生物和吲哚并蝶啶类化合物的活性筛选方法。
Description
本申请权利要求2005年2月18日提交的美国临时专利申请系列号60/654,606的利益，该临时专利申请已作为参考全部合并入本申请中。
1.技术领域
本发明涉及嘧啶并苯并二氮
衍生物以及吲哚并蝶啶类化合物，本发明还涉及含有两个或多个所述化合物的库以及所述化合物的制备方法。本发明还涉及可用于治疗或预防癌症等疾病的生物活性嘧啶并苯并二氮
以及吲哚并蝶啶类化合物的筛选方法。
2.技术背景
杂环化合物由于具有多种多样的生物活性而经常被认为是药物化学中的特定结构，已有许多文献报道含有苯并二氮基团的杂环分子骨架具有重要的生物活性。(Evans等，J.Med.Chem.1988，31，2235-2246；Evans等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2001，11，1297-1300；Wyatt等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2001，11，1301-1305；Stevens等，J.Am.Chem.Soc.1996，118，10650-10651)
苯并二氮衍生物可能是药物发明中研究最多的一类化合物，这些化合物显示了多种生物活性，特别是在中枢神经系统的活性方面。例如，氯氮平、奥氮平、喹硫平用于治疗阿尔茨海默氏病((Campiani等，J.Med.Chem.2002，45，344；Campiani等，J.Med.Chem.2004，47，143；Mouithys-Mickalad等，J.Med.Chem.2001，44，769)；氯硝西泮、地西泮、劳拉西泮、硝西泮和奥沙西泮用作抗焦虑药物；咪达唑仑作为苯巴比妥类似物用于麻醉。此外，它们还可作为胆囊收缩素受体(CCK)A和B的拮抗剂、催产素拮抗剂以及抑制蛋白-DNA的相互作用(Horton等，Chem.Rev.2003，103，893；Abrous等，Org.Lett.2001，3，1089；Evans等，J.Med.Chem.1988，31，2235；Evans等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2001，11，1297；Wyatt等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2001，11，1301；Stevens等，J.Am.Chem.Soc.1996，118，10650；Morita等，Tetrahedron Lett.1970，11，861；Kobayashi，Chem.Lett.1974，967；Kobayashi，Bull.Chem.Soc.Jpn.1975，48，302；Hunziker等，Helv.Chim.Acta 1964，47，1163；Eyrolles等，J.Med.Chem.1994，37，1508；Frederick and William(Bristol-Myers)Eur.Pat.Appl.DE19742418285 19740416，1974；Chem.Abstr.1975，82，73045；Chebanov等，J.Heterocycl.Chem，2003，40，25)。
目前，三环二氮
衍生物已知具有抗炎、抗心绞痛、抗分泌(胃酸)、抗M胆碱受体、抗心律失常、抗抑郁、镇痛、镇静、抗焦虑、抗惊厥、抗肿瘤、抗有丝分裂、抗高血压、抗过敏、平喘、抗菌、抗糖尿病、抗阻胺、强心以及解痉等作用。除此之外，还有报道表明这类化合物可以用于治疗肠易综合症、遗尿、肾衰、神经痛、败血症以及用作GABA A/苯二氮
受体复合物相关药物、微管抑制剂、内皮素拮抗剂、M2(muscarinic)受体拮抗剂、加压素V1、V2拮抗剂和脂氧酶抑制剂等。
关于三环苯并硫氮杂
类化合物(benzothiazepines)，仅有几个对其合成进行的研究。Brodrock等报道了利用2-苯胺基二芳基硫醚的Bischler-Napieralski型关环反应制备二苯基硫氮
的方法(Brodrick等，J.Chem.Soc.1954，3857)。随后，Hunziker将这种合成方法应用于其它二苯基硫氮
衍生物(Hunziker等，Helv.Chim.Acta.1964，47，1163)。1957年，Jarrett和Loudon开发出利用邻氨基苯硫酚与具有反应活性的邻氯苯基醛或酮缩合制备该类化合物的方法(J.Chem.Soc.1957，3818)。这种合成策略是随后的几个报道的关键(Galt等，J.Chem.Soc.1958，1588；Galtand Loudon，J.Chem.Soc.1959，885)，J-P.Le Roux在叠氮化合物的重排中观察到二苯基硫氮
的生成(Le Roux等Tetrahedron Lett.1976，3141)。Safonova等人描述了由5-氨基-6-巯基-嘧啶与含有羰基的对氯硝基苯衍生物反应制备嘧啶并苯并硫氮杂的方法(Safonova等，Chem.Heterocycl.Compd.(Engl.Transl.)2001，37，245)。
嘧啶及嘧啶并环化合物是另一类被广泛研究的化合物，这是由于它们具有目标药理活性，并且其结构与天然存在的核苷具有相似性。例如，一些吡咯并嘧啶类化合物被报道具有抗肿瘤活性(Wang等，J.Med.Chem.2004，47，1329)；一些氨基吡啶并嘧啶类化合物是非核苷类腺苷激酶抑制剂(Perner等，J.Med.Chem.2003，46，5249)；某些呋喃并嘧啶是人类细胞巨化病毒(HCMV)有效的选择性抑制剂(McGuigan等，J.Med.Chem.2004，47，1847)；5-位取代的呋喃并[2，3-d]嘧啶对肿瘤细胞的生长表现出有效的抑制活性。
与此相应地，新型嘧啶或嘧啶并环化合物合成方法的开发对有机化学和药物化学家们来说就显得尤为有意义。例如，近年来报道了嘌呤、吡咯并嘧啶(Gangjee等，Med.Chem.2004，47，3689；Dang and Gomez-Galeno，J.Org.Chem.2002，67，8703-8705)、吡唑并嘧啶(Bhuyan等，J.Org.Chem.1990，55，568-571；Selleri等，J.Med.Chem.2003，46，310-313)、嘧啶并嘧啶(Thskur等，Synlett.2001，1299-1302)、咪唑并嘧啶(Gudmundsson andJohns，Org.Lett.2003，5，1369)、呋喃并嘧啶(Gangjee等，J.Med.Chem.2004，47，6893-6901)等的有效合成方法。
嘧啶并蝶啶(pyrimidine-fused pteridines)是与苯并二氮
相关的一类化合物，这类化合物已被报道显示了多样的生物活性，是多个上市药物的基本结构骨架。例如，抗叶酸药物甲氨蝶呤(MTX)被用于抗肿瘤，氨苯蝶啶用于利尿。喋啶类化合物的生物活性还被报道表现在其它生物靶点上，比如烷基转移酶、腺苷激酶、非典型分枝杆菌FtsZ、黄嘌呤氧化酶、神经细胞一氧化氮合酶等(Nelson等，J.Med.Chem.2004，47，3887；Gomtsyan等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2004，14，4165；Reynolds等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2004，14，3161；Oettl等，Biochim.Biophys.Acta 1999，1430，387；
等，J.Med.Chem.1999，42，4108).
目前急需的是寻找合成不同类型的苯并二氮
衍生物及相关化合物，筛选可用于治疗或预防如癌症等疾病的新的生物活性化合物。
3.发明概述
本发明涉及嘧啶并苯并二氮
和嘧啶并蝶啶类化合物，以及该类化合物的库。这些基于特定结构的化合物，对用于在库中广泛的药物靶点上筛选以获得新的先导化合物是重要的，它们还可作为药物发现中的基本结构。作为具体的实例，本发明中的化合物经过纯化。
在一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
X代表O、S或NR；
Y1、Y2、Y3、Y4代表H、烷基、芳基或杂原子；和
R、R1、R2代表烷基、芳基或杂环。
在某些实施方案中，Y1、Y2、Y3和Y4代表取代的烷基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
在某些实施方案中，R、R1、R2代表取代的烷基、取代的芳基或取代的杂环。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
X代表O、S、或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3和Y4代表H、烷基、芳基或杂原子；和
R、R1、R2、R4、R5和R6代表烷基、芳基或杂环。
在某些实施方案中，Nu代表卤素。
在某些实施方案中，Y1、Y2、Y3和Y4代表取代的烷基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
在某些实施方案中，R、R1、R2、R4、R5和R6代表取代的烷基、取代的芳基或取代的杂环。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
X代表O、S或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3和Y4代表H、烷基、芳基或杂原子；
R、R1、R2、R3、R4、R5和R6代表烷基、芳基或杂环。
在某些实施方案中，Nu代表卤素。
在某些实施方案中，Y1、Y2、Y3和Y4代表取代的烷基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
在某些实施方案中，R、R1、R2、R4、R5和R6代表取代的烷基、取代的芳基或取代的杂环。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
X代表O、S、或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3和Y4代表H、烷基、芳基、或杂原子；和
R、R1、R2、R4、R5和R6代表烷基、芳基或杂环。
在某些实施方案中，Nu代表卤素。
在某些实施方案中，Y1、Y2、Y3和Y4代表取代的烷基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
在某些实施方案中，R、R1、R2、R4、R5和R6代表取代的烷基、取代的芳基或取代的杂环。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
X代表O、S或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3、和Y4代表H、烷基、芳基、或杂原子；
R、R1、R2、R3、R4、R5、和R6代表取代的烷基、取代的芳基或取代的杂环。
在某些实施方案中，Nu代表卤素。
在某些实施方案中，Y1、Y2、Y3和Y4代表取代的烷基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
在某些实施方案中，R、R1、R2、R4、R5和R6代表取代的烷基、取代的芳基或取代的杂环。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
R7代表H、CH3、或F；和
R8代表4′-F-C6H4、4′-CH3-C6H4、或4′-NO2-C6H4。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物
其中：
NHR9R10为正丁胺或吡咯烷。
在优选实施方案中，所述化合物是4-氯-11-甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-6，11-二甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-11-甲基-6-(4-氟苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-(4-甲基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-(4-硝基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-6，8，11-三甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-(4-氟苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-(4-甲基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-(4-硝基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-11-甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-6，11-二甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4-氟苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4-甲基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4-硝基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-羟基-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-丁胺基-8-氟-11-甲基-6-(4-甲基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；或4-(吡咯-1-基)-8-氟-11-甲基-6-(4-甲基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
本发明还提供了制备三环4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
及其衍生物的方法。在一实施方案中，该方法包括将6-氯-4，5-二氨基嘧啶与酸或酸衍生物反应生成4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
。在其它实施方案中，该方法还包括所述4-氯-嘧啶[4，5-b][1，4]苯并二氮
的进一步亲核取代反应。在其它实施方案中，本方法还包括4位取代的嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
在氢化反应条件下的氢化以及与金属有机试剂的反应。此外，在其它实施方案中，本发明包括酰胺生成、烷基化及磺酰胺生成。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
R1代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环或卤素；
R2代表烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、或取代的杂环。
在优选实施方案中，所述化合物是4-氯-11-甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-(4-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-(4-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-(4-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8，11-二甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-(4-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-(4-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-(4-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-9，11-二甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-9，11-二甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-9，11-二甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-9，11-二甲基-6-(4-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-9，11-二甲基-6-(4-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-9，11-二甲基-6-(4-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
或4-氯-8氟-11-甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
本发明也提供了三环的嘧啶并5，6-二氢苯并二氮
的合成方法。在一实施方案中，该方法包括将6-氯-4，5-二氨基嘧啶与醛进行反应来合成4-氯-二氢嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
。另外，在其它实施方案中，该方法还包括4-氯基的亲核取代。
在一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环、卤素或者烷氧基；并且
R3代表烷基、取代的烷基、芳基、杂环、取代的杂环、杂芳基、取代的芳基。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
R2代表氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或者取代的杂环、或者卤素。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
R2代表氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环、或者卤素；
R4、R5代表氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环、或者R4和R5共同形成环烷基。
在优选的实施方案中，所述化合物为4-(苯硫基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(苯硫基)-6-(吡啶-3-基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-对甲苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(苯硫基)-6-(邻硝基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-(邻硝基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-(对硝基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(苯硫基)-6-(间硝基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-苄基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲苯基硫基)-6-苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲基苯硫基)-6-(吡啶-3-基)-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲基苯硫基)-6-(对甲苯基)-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲基苯硫基)-6-(对氟苯基)-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲基苯硫基)-6-丙基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲基苯硫基)-6-苄基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(对氯苯硫基)-6-苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(对氯苯硫基)-6-(对甲苯基)-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(对氯苯硫基)-6-(吡啶-3-基)-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对氯苯硫基)-6-苄基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲氧基苯硫基)-6-苯基-8-甲氧基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲氧基苯硫基)-6-苄基-8-甲氧基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯亚磺酰)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(对甲苯基亚磺酰)-6-苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对氯苯亚磺酰)-6-苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-正丁胺基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(吡咯烷-1-基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-正丁胺基-6-苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；或者4-正丁胺基-6-苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
本发明还提供了合成三环嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
的方法。在一个实施方案中，该方法包括将5-氨基4，6-二苯硫基嘧啶与酸或者酸的衍生物反应以制备嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
。在其它实施方案中，该方法还包括氧化嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
中的苯硫基制备相应的砜或者亚砜。在其它的实施方案中，该方法还包括胺的亲核取代。
在一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
X代表Cl、R3R4N、R3O、R3S或芳基；
R1、R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、或R1与R2一起形成环烷基；
R3、R4代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
在优选的实施方案中，所述化合物是8-氯-6-乙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-(邻甲氧基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-(对硝基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-(对氟苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-苯乙烯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-丙烯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6，6-二甲基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-甲基-6-乙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-甲基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-环己烯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-甲基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-甲基-6-(对甲氧基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-甲基-6-(对硝基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-乙基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-乙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂-二苯并[c，d，h]甘菊环-6-羧酸；9-氯-7-乙基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂-苯并[4，5]环庚三烯[1，2，3-de]萘；9-氯-7-丙基(pyproyl)-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂-苯并[4，5]环庚三烯[1，2，3-de]萘；9-氯-7-苯基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂-苯并[4，5]环庚三烯[1，2，3-de]萘；9-氯-7-(对甲基苯基)-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂-苯并[4，5]环庚三烯[1，2，3-de]萘；9-氯-7-(对硝基苯基)-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂-苯并[4，5]环庚三烯[1，2，3-de]萘；9-氯-7-苯乙烯基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂-苯并[4，5]环庚三烯[1，2，3-de]萘；9-氯-7，7-二甲基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂-苯并[4，5]环庚三烯[1，2，3-de]萘；N-正丁基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环-8-胺；N-苯基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环-8-胺；8-(吗啉-1-基)-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-(吡咯啉-1-基)-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-丁氧基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-丁氧基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苄硫基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苄硫基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苯硫基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苯硫基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苯基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苯基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环。
本发明还提供了四环嘧啶并苯并二氮
的制备方法。在一实施方案中，该方法包括将吲哚-1-基嘧啶或四氢喹啉-1-基嘧啶与脂肪醛、芳香醛或酮反应生成四环嘧啶并苯并二氮
。在另一实施方案中，该方法还包括所述化合物的进一步的亲核取代。
在一实施方案中，本发明提供具有如下结构的化合物：
其中：
R1、R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环，或R1与R2一起形成环烷基；
R3代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
X代表Cl或NHR；
R代表烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基。
在优选的实施方案中，所述化合物是4-氯-6-乙基-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；6-丁基-4-氯-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-苯基-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(4-甲基苯基)-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(4-硝基苯基)-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(3，4-二氯苯基)-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(邻甲氧基苯基)-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(邻氯苯基)-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(邻硝基苯基)-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(间硝基苯基)-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-乙基-6-甲基-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-甲基-6-丙基-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-亚环己基-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-甲基-6-苯基-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-甲基-6-(对甲基苯基)-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-甲基-6-(对硝基苯基)-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-7-乙氧羰基-6-苯基-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-7-乙氧羰基-6-(对甲基苯基)-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-7-乙氧羰基-6-(对氟苯基)-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-7-乙氧羰基-6-丙基-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-亚环己基-7-乙氧羰基-5，6-二氢吲哚[2，1-h]蝶啶；N-丁基-6-亚环己基-吲哚并[2，1-h]蝶啶-4-胺；和N-丁基-6-(对甲基苯基)-吲哚并[2，1-h]蝶啶-4-胺。
本发明还提供了吲哚并嘧啶的制备方法。在一实施方案中，该方法包括将5-氨基-4-氯-6-(1-吲哚基)嘧啶与醛或酮反应生成5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶。在另一实施方案中，该方法还包括亲核取代反应。
本发明还提供了由多种本发明的化合物所组成的库。在具体实施方案中，所述多种为2种或更多、3种或更多、4种或更多、5种或更多、10种或更多、15种或更多、20种或更多、50种或更多。此外，在一个具体的实施方案中，所述库中的每个化合物都被纯化。
在具体实施方案中，本发明提供了其中的化合物为式I的化合物的库。在具体实施方案中，本发明提供了其中的化合物为式II的化合物的库。在具体实施方案中，本发明提供了其中的化合物为式III的化合物的库。在具体实施方案中，本发明提供了其中的化合物为式IV的化合物的库。在具体实施方案中，本发明提供了其中的化合物为式V的化合物的库。在具体实施方案中，本发明提供了其中的化合物为式VI的化合物的库。在具体实施方案中，本发明提供了其中的化合物为式VII的化合物的库。在具体实施方案中，本发明提供了其中的化合物为式VIII的化合物的库。在具体实施方案中，本发明提供了其中的化合物为式IX的化合物的库。在具体实施方案中，本发明提供了其中的化合物为式X的化合物的库。在具体实施方案中，本发明提供了其中的化合物为式XI的化合物的库。在具体实施方案中，本发明提供了其中的化合物为式XII的化合物的库。在具体实施方案中，本发明提供了其中的化合物为式XIII的化合物的库。在前面的实施方案中，所述库可以是本发明的任何库。
本发明的库的筛选方法如下所述。任何一个库化合物都可以根据需要的药物活性筛选。在优选的实施方案中，被筛选的化合物库只包括特定类型的化合物，例如，用相同的反应制备的化合物。本发明的库的筛选方法可以应用于整个化合物库，库中的亚组，或者库中的一个单独的化合物。
在一实施方案中，本发明提供了筛选库以获得具有治疗活性的候选药物的方法，该方法包括：
(a)在本发明的库的一个或多个化合物存在的情况下进行生物学试验；和
(b)通过上述生物学试验检测确定活性，
其中，相对于缺少所述化合物情况下的活性调节了所述活性表明所述一个或多个化合物的治疗活性。在一具体实施方案中，该方法进一步包括用最初测试的化合物的亚组重复进行试验以鉴定活性得到调节的化合物。
在一个实施方案中，将所述库在激酶试验中测试。在这种实施方案中，将库存在下的激酶活性与不存在该库的激酶活性进行了比较。在一具体实施方案中，药学上期望的活性升高或者激酶活性得到抑制。在优选实施方案中，本发明还提供了筛选库以获得候选激酶抑制剂的方法，包括：
(a)在适于激酶活性的条件下将所述库中的一个或多个化合物与激酶和激酶底物接触；
(b)确定非磷酸化底物与磷酸化底物的第一比例值，从而得出激酶活性的第一测量值；和
(c)将第一比例值与激酶活性的第二测量值比较，该第二测量值由在不存在所述化合物的情况下获得的非磷酸化底物与磷酸化底物的第二比例值确定，
其中激酶活性的抑制表明存在获选的激酶抑制剂。在优选的实施方案中，所述激酶是FLT3、KIT、PDGFR-B、RET、SRC、FLT1(VEGFR1)、FLT4(VEGFR3)、KDR(VEGFR2)或者RAF-1。
在另一个实施方案中，测试所述化合物对癌细胞的细胞毒性，例如，用一方法进行测试，该方法包括将本发明的一种或多种化合物与癌细胞接触，和测定在缺少所述化合物情况下癌细胞的死亡是否增加。
4.附图说明
图1表示合成嘧啶并二氮衍生物的通用反应方案I。
图2表示利用Pictet-Spengler型环化反应合成嘧啶并5，6-二氢苯并二氮
的通用反应方案II。
图3表示合成嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
的通用反应方案III。
图4表示合成四环嘧啶并苯并二氮
的通用反应方案IV。
图5表示合成吲哚并蝶啶的通用反应方案V。
5.发明的详细描述
本发明涉及嘧啶并苯并二氮
、嘧啶并蝶啶和多种所述化合物的库。本发明还提供了制备嘧啶并苯并二氮
衍生物和嘧啶并蝶啶类化合物的方法。本发明所包括的各种化合物将在下文作详细说明。
5.1嘧啶并二氮及其衍生物
5.1.1代表性化合物
在一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
X代表O、S、或NR；
Y1、Y2、Y3、和Y4代表氢、烷基、芳基或杂原子；
R、R1、R2代表烷基、芳基或杂原子。
在某些实施方案中，Y1、Y2、Y3、和Y4代表取代的烷基，取代的芳基，杂环或取代的杂环。
在某些实施方案中，R、R1、R2代表取代的烷基、取代的芳基或取代的杂环。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
X代表O、S、或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3、和Y4代表H、烷基、芳基或杂原子；
R、R1、R2、R4、R5、和R6代表烷基、芳基或杂环。
在某些实施方案中，Y1、Y2、Y3、和Y4代表取代的烷基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
在某些实施方案中，R、R1、R2、R4、R5、和R6代表取代的烷基、取代的芳基或取代的杂环。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
X代表O、S或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3和Y4代表H、烷基，芳基或杂原子；
R、R1、R2、R3、R4、R5、和R6代表烷基、芳基或杂环；
在某些实施方案中，Nu代表卤素；
在某些实施方案中，Y1、Y2、Y3、和Y4代表取代的烷基、取代的芳基、杂环或取代的杂环；
在某些实施方案中，R、R1、R2、R3、R4、R5、和R6代表取代的烷基、取代的芳基或取代的杂环。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
X代表O、S、或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3、和Y4代表氢、烷基、芳基或杂原子；
R、R1、R2、R4、R5、和R6代表烷基、芳基或杂环。
在某些实施方案中、Nu代表卤素。
在某些实施方案中、Y1、Y2、Y3、和Y4代表取代的烷基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
在某些实施方案中、R、R1、R2、R4、R5、和R6代表取代的烷基、取代的芳基或取代的杂环。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
X代表O、S、或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3、和Y4代表氢、烷基、芳基或杂原子；
R、R1、R2、R3、R4、R5、和R6代表烷基、芳基或杂环。
在某些实施方案中、Nu代表卤素。
在某些实施方案中、Y1、Y2、Y3、和Y4代表取代的烷基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
在某些实施方案中、R、R1、R2、R3、R4、R5、和R6代表取代的烷基、取代的芳基或取代的杂环。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
R7代表氢、甲基或氟；
R8代表4′-F-C6H4、4′-CH3-C6H4、或4′-NO2-C6H4。
在另一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
NHR9R10为正丁胺或吡咯烷。
在优选实施方案中，所述化合物是：
4-氯-11-甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-6，11-二甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-11-甲基-6-(4-氟-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-11-甲基-6-(4-甲基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-11-甲基-6-(4-硝基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8，11-二甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-6，8，11-三甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8，11-二甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8，11-二甲基-6-(4-氟-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8，11-二甲基-6-(4-甲基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8，11-二甲基-6-(4-硝基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8-氟-11-甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8-氟-6，11-二甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8-氟-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4-氟-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4-甲基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4-硝基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-羟基-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-(丁胺基)-8-氟-11-甲基-6-(4-甲基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
或
4-(吡咯烷基)-8-氟-11-甲基-6-(4-甲基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
5.1.2合成方法
在一实施方案中，本发明中的化合物是根据方案I来合成的，见图1。嘧啶并苯并二氮
类似物2-6中的任一个均可作为骨架用于进一步合成其它化合物。见Yang等，2005，Org.Lett.，7，1541-1543，在此全部引入作为参考。
从化合物1到化合物2的反应包括环化。合成4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
的关键步骤是5-氨基-4-(N-取代)苯胺-6氯嘧啶与羧酸或羧酸衍生物通过分子内的付-克反应来构建4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
核。通常将酸或路易斯酸用作催化剂。例如，与POCl3组合或随后用POCl3处理，PPA可用于该目的(Norman等，J.Med.Chem.2000，43，4288；Caron和Vazquez，Org.Chem.2003，68，4104)。
随后的亲核取代反应可以在目标分子上增加多个多样化位点。4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
有四个多样化位点，例如，4-位的氯可以通过与亲核试剂(例如胺、醇和苯酚)发生取代反应或与硼酸发生Suzuki-Miyaura偶联反应而转化为其它基团。(Chorvat等，J.Med.Chem.1999，42，833；Gundersen等，J.Med.Chem.2002，45，1383；Oh等，Arch.Pharm.Pharm.Med.Chem.2001，334，345；Havelkova等，Synlett 1999，1145)。从化合物2到化合物3的反应包括亲核取代。反应b)的反应条件一般包括亲核取代反应所用的条件，例如，以碱为催化剂用胺类取代氯基团。
化合物3可以通过氢化反应或与有机金属试剂反应转化为化合物4或5。氢化反应的条件包括H2/Pd-C。有机金属试剂包括R3MgCl或LiR3，其中R3是烷基、芳基或杂环。
化合物4和5可以通过酰胺形成(与酸)、烷基化(与亲电试剂)或磺胺形成(与磺酰氯)反应转化成化合物6。
5.2三环嘧啶并5，6-二氢苯并二氮
5.2.1代表性化合物
在一实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
R1代表氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环或卤素。
R2代表烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
在优选实施方案中，所述化合物是：
4-氯-11-甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-11-甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-11-甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-11-甲基-6-(4-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-11-甲基-6-(4-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-11-甲基-6-(4-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8，11-二甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8，11-二甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8，11-二甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8，11-二甲基-6-(4-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8，11-二甲基-6-(4-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8，11-二甲基-6-(4-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-9，11-二甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-9，11-二甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-9，11-二甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-9，11-二甲基-6-(4-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-9，11-二甲基-6-(4-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-9，11-二甲基-6-(4-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；或
4-氯-8-氟-11-甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
5.2.2合成
通过用醛进行类Friedel环化反应来代替用羧酸进行的付-克反应从而得到了三环嘧啶并5，6-二氢苯并二氮
。详见Che等，Tetrahedron，2006，62，2563-2568，该文献在此全文引为参考。该反应是基于5-氨基-6-氯-4-(N-甲基-苯胺基)嘧啶与醛形成亚胺，然后在苯环上发生分子内的亲电取代反应的一锅煮反应。起始原料嘧啶衍生物是通过可购买得到的5-硝基-4，6-二氯嘧啶与N-甲基苯胺进行两步反应获得。(Norman等，J.Med.Chem.2000，43，4288；Caron和Vazquez，Org.Chem.2003，68，4104)。所得产物可通过对其氯原子进行亲核取代而进一步转化。
5.3三环嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
5.3.1.代表性化合物
在一个实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
R2代表氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环、卤素、杂原子或者烷氧基；和
R3代表烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环。
在另外一个实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
R2代表氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或者取代的杂环。
在另一个实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
R2代表氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或者取代的杂环；
R4、R5代表氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或者取代的杂环、或者R4和R5共同形成环烷基。
在优选实施方案中，所述化合物是：
4-(苯硫基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(苯硫基)-6-(吡啶-3-基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(苯硫基)-6-(对甲基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(苯硫基)-6-(邻硝基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(苯硫基)-6-(邻硝基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(苯硫基)-6-(对硝基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(苯硫基)-6-(间氟苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(苯硫基)-6-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(苯硫基)-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(苯硫基)-6-苄基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(对甲基苯硫基)-6-苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(对甲基苯硫基)-6-(吡啶-3-基)-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(对甲基苯硫基)-6-(对甲基苯基)-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(对甲基苯硫基)-6-(对氟苯基)-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(对甲基苯硫基)-6-丙基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(对甲基苯硫基)-6-苄基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(对氯苯硫基)-6-苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(对氯苯硫基)-6-(对甲基苯基)-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(对氯苯硫基)-6-(吡啶-3-基)-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(对氯苯硫基)-6-苄基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(对甲氧基苯硫基)-6-苯基-8-甲氧基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(对甲氧基苯硫基)-6-苄基-8-甲氧基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(苯亚磺酰)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(对甲基苯亚磺酰)-6-苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(对氯苯亚磺酰)-6-苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-正丁胺基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(吡咯烷-1-基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-正丁胺基-6-苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；或
4-正丁胺基-6-苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
5.3.2合成
三环嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
是通过方案III所示的方法制备的。见Fu等，2005，J.Org.Chem.，70，10810-10816，在此全文引入作为参考。一般来说，这些化合物是由5-氨基-4，6二芳硫基嘧啶和羧酸通过Bischler-Napieralski型反应制备的。方案3中的前体化合物6的制备是在碱的存在下通过可购买得到的5-氨基-4，6二氯嘧啶1与苯硫酚或其类似物发生反应，制备出5-氨基-4，6-二苯硫基嘧啶6或者其类似物。在有些情况下要进行另外的化学修饰，如o-甲基化。期望的环化产物2是通过采用合适的羧酸在PPA/POCl3中进行Bischler-Napieralski型反应制备得到的。5-氨基-4，6二苯硫基嘧啶6的类似物能够与各种羧酸或者其类似物发生反应得到结构多样性的环化产物2。化合物2中的苯硫基可以被氧化得到多种亚砜的类似物8。亚砜基团的亲核取代反应能够产生更多的多样性，就如化合物3所示的那样。
5.4四环嘧啶并苯并二氮
5.4.1代表性化合物
在一个实施方案中，本发明提供了如下结构的化合物：
其中：
X代表Cl、R3R4N、R3O、R3S或芳基；
R1、R2代表H，烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、或R1与R2一起形成环烷基；
R3、R4代表H，烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
在优选实施方案中，所述化合物是：
8-氯-6-乙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-(邻甲氧基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-(对硝基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-(对氟苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-苯乙烯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-丙烯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6，6-二甲基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-乙基-6-甲基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-甲基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-亚环己基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-甲基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-甲基-6-(对甲氧基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-甲基-6-(对硝基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-乙基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-氯-6-乙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环-6-羧酸；
9-氯-7-乙基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯[1，2，3-de]萘；
9-氯-7-丙基(pyproyl)-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯[1，2，3-de]萘；
9-氯-7-苯基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯[1，2，3-de]萘；
9-氯-7-(对甲基苯基)-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯[1，2，3-de]萘；
9-氯-7-(对硝基苯基)-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯[1，2，3-de]萘；
9-氯-7-苯乙烯基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯[1，2，3-de]萘；
9-氯-7，7-二甲基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯[1，2，3-de]萘；
N-正丁基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环-8-胺；
N-苯基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环-8-胺；
8-(吗啉-1-基)-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-(吗啉-1-基)-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-丁氧基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-丁氧基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-苄硫基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-苄硫基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-苯硫基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-苯硫基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-苯基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；
8-苯基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环。
5.4.2合成
四环嘧啶并苯并二氮
是与嘧啶、吲哚啉或四氢喹啉等杂环相稠合的苯并二氮。见Zheng等发表的“Design and Synthesis of a TetracyclicPyrimidine-fused Benzodiazepeine Library”，J.Comb.Chem.2006，8，381-387。该合成策略是基于亚胺离子的亲电环化反应，其中该亚胺离子由相应的氨基嘧啶与羰基化合物形成。与开环的苯胺类似物相比，环状吲哚啉或四氢喹啉的存在能显著增加环化的反应活性。产物中的氯基团可以被亲核试剂如硼酸、胺、醇或硫醇等取代，或通过过渡金属催化的偶联反应转化为其它基团。
在反应方案IV中，从嘧啶1起始的合成策略包括使吲哚部分的吲哚环饱和，从而导致在苯环发生环化，生成四环嘧啶并苯并二氮
2的骨架。与多种醛包括脂肪醛和芳香醛以及脂肪酮都能够发生亲电环化反应。预期所述环化反应是通过与Pictet-Spengler异喹啉合成类似的途径进行的(Cox等，Chem Rev 1995，95，1797)。
同样的策略可以应用于四氢喹啉或类似体系中，得到具有至少8个多样化位点的库(方案IV中的化合物3-6)。化合物2中的氯基团提供优异的机会引入额外的多样化位点并与各种亲核试剂或偶联试剂发生良好反应。在浓盐酸溶液的酸性条件(针对正BuNH2、苯胺和吗啉；Taddei等，EurJ Org Chem 2005，939)或在三乙胺存在下(针对吡咯烷)，代表性的亲核试剂包括胺类而得到氨基取代的产物。其它具有杂原子的亲核试剂如醇、硫醇等已知能够与6-氯嘌呤反应，例如正丁醇、苄硫醇、硫酚等在碱性条件下生成相应的正丁氧基、苄硫烷基或苯硫烷基取代的嘧啶并苯并二氮(Lavecchia等，Tetrahedron Lett 2005，46，5851)。引入碳取代基代替氯进一步扩大了所述库的范围。在一实施方案中，在非优化的Suzuki-Miyaura交叉偶联条件下(Nyerges等，Tetrahedron 2005，61，8199；Havelkova等，Synlett 1999，7，1145)，化合物能够与苯硼酸反应生成芳基取代的产物。
5.5吲哚并蝶啶类的杂环骨架
5.5.1代表性化合物
在一个实施方案中，本发明提供如下结构式化合物：
其中：
R1、R2代表代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环，或R1与R2一起组成环烷基；
R3代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或取代的杂环；
X代表Cl或NHR；
R代表烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基。
在优选实施方案中，所述化合物是：
4-氯-6-乙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
6-丁基-4-氯-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-6-苯基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-6-(4-甲基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-6-(4-硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-6-(3，4-二氯苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-6-(邻甲氧基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-6-(邻氯苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-6-(邻硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-6-(间硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-6-乙基-6-甲基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-6-甲基-6-丙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-6-亚环己基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-6-甲基-6-苯基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-6-甲基-6-(对甲基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-6-甲基-6-(对硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-7-乙氧羰基-6-苯基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-7-乙氧羰基-6-(对甲基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-7-乙氧羰基-6-(对氟苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-7-乙氧羰基-6-丙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
4-氯-7-乙氧羰基-6-亚环己基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；
N-丁基-6-亚环己基-吲哚并[2，1-h]蝶啶-4-胺；或
N-丁基-6-对甲苯基-吲哚并[2，1-h]蝶啶-4-胺。
5.5.2合成
通过扩展上述合成嘧啶并苯并二氮
的环化反应，设计出了新型吲哚并蝶啶杂环分子骨架的合成方法。见Zheng等发表的J.Comb.Chem.，2005，7，813-815，5-氨基-4氯-6-(1-吲哚基)嘧啶2与各种醛和酮反应可以得到吲哚并蝶啶类化合物。
关键的吲哚取代的嘧啶，即化合物2经两步反应合成。参照文献的方法(Tanji等，Chem.Pharm.Bull.1992，40，227)，将可购买得到的4，6-二氯-5-氨基嘧啶与吲哚啉反应生成嘧啶1，然后将吲哚啉部分氧化为对应的吲哚(Yamagucm等，Bull.Chem.Soc.Jpn.1989，62，4066)得到关键中间体氨基嘧啶，即化合物2。
设计其它合成步骤，从而使5-氨基-6-(1-吲哚啉基)嘧啶1在苯环上与醛或酮发生亲电环化，而5-氨基-6-(1-吲哚基)嘧啶2在富电子的吡咯环上环化。
化合物3的吲哚部分存在5个额外的多样化位点，通过进一步反应可以得到结构多样的化合物，而4位的氯也提供了另一多样化位点。
5.6定义
“酸衍生物”是指含有甲酰基(HCO-)或酰基(RCO-)的分子、离子或官能团，该甲酰基(HCO-)或酰基(RCO-)与另一原子或官能团相连，因此形成大量的含羰基的分子、离子或官能团，如醛、酮、酰卤、酰胺、酯、酸酐和硫代羧酸中的一种。
“烷基”是指只含碳和氢的环状、支链或直链的化学基团，如甲基、苯基、金刚烷基等。典型的烷基包含1-12个碳原子，优选1-10个，更优选1-8个碳原子。在一些实施方案中，烷基至少部分不饱和，如烯基或炔基。
“取代的烷基”是指被一个或多个取代基取代的烷基，这些取代基如卤素、烷氧基、酰氧基、氨基、硝基、羟基、巯基、羧基、羧基衍生物、苄氧基、杂环、取代的杂环、芳基、取代的芳基、芳杂环、取代的芳杂环或其它取代基。
“芳基”是指单价的不饱和芳香碳环，其具有单个环(例如苯)或多元稠合环(例如萘或蒽)。
“取代的芳基”是指被氨基、羟基、低级烷基、烷氧基、氯、卤素、巯基和其它取代基取代的芳环。
“杂原子”是指碳之外的其它原子。典型的杂原子是氧、氮或氟。
“杂环”是指任选取代的含有1-4个杂原子的五至八元环，该杂原子如氧、硫和/或氮，在氮的情况下单独存在或与氧、硫环原子连接。这些五至八元杂环可以是饱和的、部分饱和的或完全不饱和的(例如杂芳基)。优选的杂环包括吡啶、吗啉、哌啶、哌嗪、2-氨基咪唑、四氢呋喃、吡咯、四氢噻吩基、己亚甲基亚胺(hexylmethyleneimino)和庚亚甲基亚胺(heptylmethyleneimino)等。
“取代的杂环”是指被例如一个或多个、优选一个或两个取代基(相同或不同)取代的杂环。该取代基可以是卤素、羟基、保护的羟基、氰基、硝基、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12取代的烷氧基、C1-C12酰基、C1-C12酰氧基、羧基、保护的羧基、羧甲基、保护的羧甲基、羟甲基、保护的羟甲基、氨基、保护的氨基、(单取代的)氨基、保护的单取代的氨基、(双取代的)甲酰胺、保护的甲酰胺、N-(C1-C12烷基)甲酰胺、保护的N-(C1-C12烷基)甲酰胺、N，N-二(C1-C12烷基)甲酰胺、三氟甲基、N-(C1-C12烷基)磺酰胺基、N-苯磺酰胺基、杂环或取代的杂环。
“亲核试剂”是指富电子的分子、离子、分子片段或官能团，通常含有一个或多个杂原子，如S、O或N，其可以用于，例如在取代反应中置换离去基团。典型的亲核试剂包括胺、醇、酚和硫酚类。
本发明的库可以含有多种(不同的)本发明的化合物。在一具体实施方案中，多种为两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种本发明的化合物。在另一本发明的实施方案中，多种为十种或更多种本发明的化合物。在又一本发明的实施方案中，多种为十五种或更多种、二十种或更多种、二十五种或更多种、五十种或更多种上述化合物。如果需要，多种为100,000或更多种，甚至1,000,000或更多种。
5.7药物组合物
本发明涉及的化合物可以用于药物组合物中作为抗炎性、抗心绞痛、抗分泌(胃酸)、抗毒蕈碱(muscarinic)、抗心律失常、抗抑郁、止痛、抗精神病性、抗焦虑、抗惊厥、抗肿瘤、抗有丝分裂、抗高血压、抗变应性、抗哮喘、抗生素性、抗糖尿病、抗组胺、抗心力衰竭(cadiotonic)、和解痉试剂，用作GABA A/苯并二氮
受体复合物相关药物、微管抑制剂、内皮缩血管肽拮抗剂、毒蕈碱(M2)拮抗剂、后叶加压素V1拮抗剂、后叶加压素V2拮抗剂、脂肪氧合酶抑制剂，和用于治疗感染性休克、肠易激综合征、尿失禁、肾衰竭和神经痛。
为了制备含本发明化合物的药物组合物，采用惰性的、药学上可接受的载体。这种药学上可接受的载体可以是固体或者液体。固体形式的制剂包括粉末、药片、可分散的小颗粒、胶囊、扁囊剂和栓剂。
固体载体可以是一种或者多种物质，其可以用作稀释液、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浊剂、粘结剂、或者是药片崩解剂；它也可以是可封装物质。
在粉剂中，所述载体通常是与具有精细分散的活性成分混合的精细分散的固体。在片剂中，活性成份与具有所需粘性的载体以合适的比例混合并压成一定的形状和大小。
为了制备栓剂形式的药物组合物，首先融化低熔点的腊状物如脂肪酸甘油脂和可可油的混合物，活性成份通过例如搅拌等方式分散其中。该均匀的熔融混合物被倒入一个常规大小的模子中，使其冷却和固化。
粉剂和片剂优选含优质量分数为5％到70％的活性成份。合适的载体包括例如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、乳糖、糖、胶质、糊精、淀粉、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点的腊、可可油等。
所述药物组合物包括活性物质与作为载体提供胶囊的封装材料一起形成的制剂，其中活性成份(有载体或者没有载体)被载体包围，因此与之连接。相似地，还包括扁囊剂。片剂、粉剂、扁囊剂、和胶囊都可以用作适于口服的固体剂型。
液体药物组合物包括：例如适于口服或者肠胃外给药的溶液，或者悬浊液，以及适合口服的乳状液。活性成份的无菌水溶液或在溶剂中的无菌溶液都是适合肠胃外给药的液态组合物，该溶剂包含水、乙醇、或丙二醇的。
无菌溶液可以如下制备：将活性成份溶于所要的溶剂体系中，然后将得到的溶液通过薄膜滤器进行灭菌，或者在无菌条件下将所述的无菌化合物溶解在之前已消毒的溶液中。
口服给药的水溶液可以通过将所述活性化合物溶解在水中，并根据需要加入合适的调味剂、染色剂、稳定剂和增稠剂制备得到。口服的水性悬浊液可以通过将精细分散的活性成份与粘性物质，如天然的或者人工合成的胶、树酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠，和其它的药物制剂领域公知的悬浮剂，分散在水中而制备得到。
优选地，所述药物组合物是单位剂形。在这种形式中，该组合物被分成含有适量活性嘧啶并苯并二氮
化合物的单位剂量。该单位剂形可以是被包装的制剂，即该包装含有分散量的制剂，例如包装的片剂、胶囊以及装在小瓶或者安瓿中的粉剂。这种单位剂形也可以是胶囊、扁囊剂、或者片剂本身，或者是任何数量的这些包装形式中的一种。
作为治疗本文所述的疾病或者紊乱的药物组合物，本发明的化合物通常是这样的药物组合物形式，其对于一个体重约为70千克的成人，以每天0.7到7000毫克的剂量水平给予患者，优选每天给予1到500毫克，这样的药物剂量可以转换为0.01到100毫克/每千克体重每天。然而，所采用的具体剂量可以根据患者的需求，所治疗的疾病的严重程度以及所采用的化合物的活性而改变。对于具体情况确定最佳剂量是本领域公知的。
5.8试验
近年来，开发出了多种方法来对化合物库进行筛选以鉴定具有所述特性的化合物。典型地，如果一个化合物当与靶酶或者受体结合时的解离常数为10-6或者更小时，那么这一化合物就被认为与该酶或受体具有特异性作用。分离对受体或者酶表现出所需亲合力的库化合物种类的方法在本领域是公知的。
例如，酶溶液可以在适于酶配体结合的条件下与特定库的化合物的溶液相混合。见Bush等发表的Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1993，37，851-858，和Daub等发表的Biochemistry 1989，27，3701-3708。库化合物与酶的特异性结合可以通过本领域公知的大量酶抑制试验中的任一种来测试。通过将所述溶液应用到Sephadex G-25凝胶过滤柱，与酶结合的化合物可以容易地与游离在溶液中的化合物分开。游离的酶和酶配体复合物会快速的通过柱子，而游离的库化合物在它们通过柱子的过程中会延迟。然后将酶配体复合物和游离的酶的混合物用强的变性剂处理，例如胍的盐酸盐或者脲类，以将配体从所述配体中释放出来。然后将所得的溶液将注入到高效液相色谱柱中(例如，Vydac C-4反相柱，用含0％-80％乙腈的水和乙腈梯度洗脱)。二极管阵列检测可以降组合库化合物与酶区分开。然后收集化合物的峰进行质谱鉴定。
适于检测本发明的化合物的其它检测方法在本领域是公知的。可以检测所述化合物在体外对抗癌细胞或者细胞株的细胞毒性，例如，通过如下方法检测：将本发明的一种或多种化合物与癌细胞接触，和确定癌细胞的死亡与不存在该化合物的情况相比较是否增加。
在一优选实施方案中，对所述化合物进行激酶试验，这将在下文进行详细说明。
对激酶抑制剂体外评价的一般程序
激酶试验采用Invitrogen Corporation公司(501 Charmany Drive，Madison，Wisconsin，53719)的SelectScreenTM Kinase Profiling Service进行。进行下文的一般性方案以检测化合物对大量酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸激酶的抑制活性。可以预期本发明的化合物将首次被应用于对抗以下激酶的测试中：FLT3、KIT、PDGFR-B、RET、SRC、FLT1(VEGFR1)、FLT4(VEGFR3)、KDR(VEGFR2)和RAF-1。针对这些激酶以及其它激酶的具体说明将在该一般方案后在下文进行详细描述(由InvitrogenPublication″Screening Protocol and Assay Conditions″提供，接受日期：12/15/05)：
试验理论.Z′-LYTETM生物化学试验应用了荧光标记的酶耦联技术，并基于磷酸化和非磷酸化的肽对蛋白酶水解裂解的灵敏度的差异。在肽底物的两端分别用两个荧光团标记，由此形成了一个荧光共振能量转移(FRET)对。在初级反应中，激酶把三磷酸腺苷(ATP)的γ位的磷酸基转移到了人工合成的FRET肽上单个酪氨酸、丝氨酸或者苏氨酸残基上。在次级反应中，位点特异性的蛋白水解酶识别并且裂解非磷酸化的FRET肽。通过显色剂(Development Reagent)显示，FRET肽的磷酸化抑制裂解。裂解破坏了FRET肽上的荧光团给体(例如，香豆素)和荧光团受体(例如，荧光素)之间的FRET，因而未裂解的磷酸化FRET肽保持了FRET。在给体荧光团在400nm激发后，通过计算给体荧光团和受体荧光团的发射强度的比率(发射比率)的计算比率方法可以用于测定反应的进度，如下面的等式所示：
发射比率＝香豆素发射强度(445nm)/荧光素发射强度(520nm)
这种测定反应进度的计算比率的方法的一个重要好处在于消除了在FRET肽浓度和信号强度方面孔与孔之间的误差。因此，该试验在磷酸百分率低的情况下得到很高的Z′因子值(＞0.7)。裂解和未裂解的FRET肽产生荧光信号，因此产生发射比率。FRET-肽的磷酸化的程度可以通过发射比率来计算。如果FRET肽被磷酸化(例如，没有激酶抑制)，则发射比率就会比较低，如果FRET肽没有被磷酸化(例如，激酶抑制)，则发射比率就会比较高。
试验条件.所有测试抑制剂化合物开始时在100％DMSO中稀释到100×浓度。然后，将该100×浓度在激酶缓冲溶液(50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA)中稀释到4×工作浓度。最后，将所述测试抑制剂化合物置于1％DMSO的孔中。
肽/激酶的混合物.所有的肽/激酶的混合物都将用适当的激酶缓冲液(见激酶特异性试验条件的详细描述)稀释到2×工作浓度。
ATP溶液.所有的ATP的溶液都用合适的激酶缓冲液(50mMHEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA)稀释到4×工作浓度。
显影剂溶剂.显影剂用显色缓冲液稀释(见激酶特异性试验条件-直接和级联的详细说明)。
试验方案
1.将2.5μL4×测试化合物溶液加到条形码标记的、低体积NBS，384孔板(标记目录#3676)中。
2.将5μL2×肽/激酶混合物加到所述板中。
3.将2.5μL4×ATP溶液加入到所述板中。
4.在振荡机上振荡检测板30秒钟。
5.在室温下温育检测板60分钟。
6.将5μL显影剂溶液加入到所述板中。
7.在振荡机上振荡检测板30秒钟。
8.在室温下温育检测板60分钟。
9.在荧光板分析仪上对检测板读数并分析数据。
试验对照.下面的对照用于每一个单独的激酶，并且置于激酶同样的检测板中：
0％磷酸化对照(100％抑制对照).用0％磷酸化对照(100％抑制对照)确定最大发射比率，该0％磷酸化对照不含ATP，因此没有任何激酶活性。这一对照在显影反应中将产生100％肽裂解。
100％磷酸化对照.100％磷酸化对照设计来计算出磷酸化的百分率，该100％磷酸化对照含有人工合成的激酶的与底物肽具有同样序列的磷酸化肽。这一对照在显影反应中产生很低的肽裂解。所述0％磷酸化对照和该100％磷酸化对照可以使我们计算出每一特定反应孔中的磷酸化百分率。对照孔将不含有任何激酶抑制剂。
0％抑制对照.用0％抑制对照确定最小发射比率，该0％抑制对照含有活性激酶。这一对照在激酶反应中产生10 50％的磷酸化肽，在显影反应中产生60 80％肽裂解。
已知抑制剂.对每一单独的激酶，在与所述激酶同样的板上作已知抑制剂对照的标准曲线(10点滴定)，以确保激酶在之前测定的期望IC50范围内被抑制，并确保R2和Hillslope值在合适的范围内。
为每一浓度的待检测化合物准备的如下对照：
显影反应干扰.显影反应干扰是通过将不含ATP的所述测试化合物对照孔与0％磷酸化对照(不含所述测试化合物)相比较而得到的。
测试化合物荧光干扰.所述测试化合物荧光干扰是通过将不含有激酶/肽混合物的所述测试化合物对照孔(0％肽对照)与0％抑制对照相比较而得到的。
试验数据分析
FI代表荧光强度
C100％代表100％磷酸化对照的平均香豆素发射信号
C0％代表0％磷酸化对照的平均香豆素发射信号
F100％代表100％磷酸化对照的平均荧光素发射信号
F0％代表0％磷酸化对照的平均荧光素发射信号
DRI代表显影反应干扰
TCFI代表测试化合物荧光干扰
图表制作软件
SelectScreenTM Kinase Profiling Service利用从IDBS得到的XL fit。剂量响应曲线由205号模型(曲线剂量-响应模型)作图。如果曲线的底部不符合-20％到20％之间的抑制，则它将被设定为0％抑制。如果剂量响应曲线的顶部不符合70％到130％之间的抑制，则它将被设定为100％抑制。
激酶特异性试验的详细描述
ABL1
在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X ABL1/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.4-2.8ng ABL1和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL 1∶64稀释的显影剂A。
ABL1 E255K
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X ABL1 E255K/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.8-5.2ng ABL1 E255K和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL1∶64稀释的显影剂A。
ABL1 G250E
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X ABL1 G250E/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.8-7.9ng ABL1 G250E和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
ABL1 T315I
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X ABL1 T315I/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.4-8.2ng ABL1 T315I和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
ABL1 Y253F
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X ABL1 Y253F/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.7-5.2ng ABL1 Y253F和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
ABL2(Arg)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X ABL2(Arg)/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.4-5.3ng ABL2(Arg)和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
ACVR1B(ALK4)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MnCl2，1mMEGTA，2mM DTT，0.02％NaN3中制备2X ACVR1B(ALK4)/Ser/Thr 16肽混合物。10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，5mM MgCl2，5mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT，0.01％NaN3中的10.0-62.2ng ACVR1B(ALK4)和2μM Ser/Thr 16肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶8稀释的显影剂B。
ADRBK1(GRK2)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X ADRBK1(GRK2)/Ser/Thr 16肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的11.0-121.2ng ADRBK1(GRK2)和2μM Ser/Thr 16肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶8稀释的显影剂B。
ADRBK2(GRK3)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X ADRBK2(GRK3)/Ser/Thr 16肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的9.9-89.0ng ADRBK2(GRK3)和2μM Ser/Thr 16肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶8稀释的显影剂B。
AKT1(PKBα)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X AKT1(PKBα)/Ser/Thr 06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.5-8.6ng AKT1(PKBα)和2μM Ser/Thr 06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
AKT2(PKBβ)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X AKT2(PKBβ)/Ser/Thr 06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的1.0-40.0ng AKT2(PKBβ)和2μM Ser/Thr 06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
AKT3(PKBγ)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X AKT3(PKBγ)/Ser/Thr 06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.4-8.3ng AKT3(PKBγ)和2μM Ser/Thr 06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
ALK
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X ALK/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的20.3-243.5ng ALK和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
AURKB(Aurora B)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X AURKB(Aurora B)/Ser/Thr 01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的11.1-155.4ng AURKB(Aurora B)和2μM Ser/Thr 01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
BLK
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X BLK/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.5-4.5ng BLK和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B溶液。
BMX
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X BMX/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的2.8 85.0ng BMX和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
BTK
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X BTK/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.0-15.0ng BTK和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
CAMK1D(CaMKIδ)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，20μg/ml Calmodulin，0.02％NaN3中制备2X CAMK1D(CaMKIδ)/Ser/Thr10肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，10μg/mlCalmodulin，0.01％NaN3中的2.1-40.0ng CAMK1D(CaMKIδ)和2μMSer/Thr 10肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
CAMK2A(CaMKIIα)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMCaCl2，20μg/ml Calmodulin，0.02％NaN3中制备2X CAMK2A(CaMKIIα)/Ser/Thr 04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，10μg/ml Calmodulin，0.01％NaN3中的0.3-4.8ng CAMK2A(CaMKIIα)和2μM Ser/Thr 04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
CAMK2B(CaMKIIβ)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，20μg/ml Calmodulin，0.02％NaN3中制备2X CAMK2B(CaMKIIβ)/Ser/Thr10肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，10μg/mlCalmodulin，0.01％NaN3中的0.8-7.0ng CAMK2B(CaMKII β)和2μMSer/Thr 10肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
CAMK2D(CaMKIIδ)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，20μg/ml Calmodulin，0.02％NaN3中制备2X CAMK2D(CaMKIIδ)/Ser/Thr04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，10μg/mlCalmodulin，0.01％NaN3中的0.1-0.8ng CAMK2D(CaMKIIδ)和2μMSer/Thr 04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
CAMK4(CaMKIV)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，20μg/ml Calmodulin，0.02％NaN3中制备2X CAMK4(CaMKIV)/Ser/Thr10肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，10μg/mlCalmodulin，0.01％NaN3中的7.5-67.3ng CAMK4(CaMKIV)和2μMSer/Thr 10肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
CDK1/cyclin B
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CDK1/cyclin B/Ser/Thr 12肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.3-3.5ng CDK1/cyclin B和2μM Ser/Thr 12肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶4096稀释的显影剂A。
CDK2/cyclin A
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CDK2/cyclin A/Ser/Thr 12肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的2.3-30.5ng CDK2/cyclin A和2μM Ser/Thr 12肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶4096稀释的显影剂A。
CDK5/p35
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CDK5/p35/Ser/Thr12肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.2-1.0ng CDK5/p35和2μM Ser/Thr 12肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶4096稀释的显影剂A。
CHEK1(CHK1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CHEK1(CHK1)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的4.0-115.2ng CHEK1(CHK1)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
CHEK2(CHK2)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CHEK2(CHK2)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的6.0-400.0ng CHEK2(CHK2)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
CLK1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CLK1/Ser/Thr 09肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的16.0-140.0ng CLK1和2μM Ser/Thr 09肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A溶液。
CLK2
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CLK2/Ser/Thr06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.8-21.6ng CLK2和2μM Ser/Thr 06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A溶液。
CSF1R(FMS)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CSF1R(FMS)/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.2-67.3ng CSF1R(FMS)和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B溶液。
CSK
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CSK/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的2.0-26.0ng CSK和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
CSNK1A1(CK1α1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA，2mM DTT中制备2X CSNK1A1(CK1α1)/Ser/Thr 11肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的16.7-107.0ng CSNK1A1(CK1α1)和2μM Ser/Thr11肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶16稀释的显影剂B。
CSNK1D(CK1δ)
在50mM Tris pH8.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA，0.02％NaN3中制备2X CSNK1D(CK1δ)/Ser/Thr 11肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM Tris/HEPES，pH8.0，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA，0.01％NaN3中的17.2-138.2ng CSNK1D(CK1δ)和2μM Ser/Thr 11肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶16稀释的显影剂B。
CSNK1E(CK1ε)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CSNK1E(CK1ε)/Ser/Thr11肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的6.0-40.0ng CSNK1E(CK1ε)和2μM Ser/Thr 11肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶16稀释的显影剂B。
CSNK1G1(CK1γ1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CSNK1G1(CK1γ1)/Ser/Thr 05肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的3.7-19.5ng CSNK1G1(CK1γ1)和2μM Ser/Thr 05肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
CSNK1G2(CK1γ2)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CSNK1G2(CK1γ2)/Ser/Thr 05肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的2.0-16.5ng CSNK1G2(CK1γ2)和2μM Ser/Thr 05肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B溶液。
CSNK1G3(CK1γ3)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CSNK1G3(CK1γ3)/Ser/Thr 05肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的4.3-31.7ng CSNK1G3(CK1γ3)和2μM Ser/Thr 05肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B溶液。
CSNK2A1(CK2α1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CSNK2A1(CK2α1)/Ser/Thr 11肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.4-22.5ng CSNK2A1(CK2α1)和2μM Ser/Thr 11肽制备得到的。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶16稀释的显影剂B。
CSNK2A2(CK2α2)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X CSNK2A2(CK2α2)/Ser/Thr11肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.9-26.3ng CSNK2A2(CK2α2)和2μM Ser/Thr 11肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶16稀释的显影剂B。
DAPK3(ZIPK)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X DAPK3(ZIPK)/Ser/Thr13肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的11.6-80.0ng DAPK3(ZIPK)和2μM Ser/Thr 13肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶512稀释的显影剂A。
DYRK3
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2XDYRK3/Ser/Thr09肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.4-10.9ng DYRK3和2μM Ser/Thr 09肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
DYRK4
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X DYRK4/Ser/Thr 09肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的13.6-103.6ng DYRK4和2μM Ser/Thr 09肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
EGFR(ErbB1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X EGFR(ErbB1)/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的1.3-7.9ng EGFR(ErbB1)和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
EGFR L858R(ErbB1 L858R)
在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X EGFR L858R(ErbB1 L858R)/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mMDTT中的0.6-4.5ng EGFR L858R(ErbB1 L858R)和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
EGFR L861Q(ErbB1 L861Q)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X EGFR L861Q(ErbB1 L861Q)/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mMDTT中的1.2-8.4ng EGFR L861Q(ErbB1 L861Q)和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
EPHA1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X EPHA1/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的5.5-60.7ng EPHA1和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
EPHA2
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X EPHA2/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.2-26.2ng EPHA2和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
EPHA3
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X EPHA3/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的2.3-145.5ng EPHA3和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B溶液。
EPHA4
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X EPHA4/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的5.8-23.0ng EPHA4和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
EPHA5
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X EPHA5/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.5-38.1ng EPHA5和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B溶液。
EPHA8
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X EPHA8/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的3.2-49.1ng EPHA8和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
EPHB1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X EPHB1/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的2.4-63.1ng EPHB1和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
EPHB2
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X EPHB2/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.7-18.0ng EPHB2和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
EPHB3
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X EPHB3/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的2.0-43.8ng EPHB3和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
EPHB4
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X EPHB4/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.3-18.0ng EPHB4和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
ERBB2(HER2)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MnCl2，1mMEGTA，2mM DTT，0.02％NaN3中制备2X ERBB2(HER2)/酪氨酸06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，5mM MgCl2，5mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT，0.01％NaN3中的4.1-34.1ng ERBB2(HER2)和2μM酪氨酸06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
ERBB4(HER4)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X ERBB4(HER4)/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的2.0-23.0ng ERBB4(HER4)和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
FER
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X FER/酪氨酸05肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.6-21.7ng FER和2μM酪氨酸05肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
FES(FPS)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X FES(FPS)/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.7-5.2ng FES(FPS)和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
FGFR1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X FGFR1/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的0.4-3.7ngFGFR1和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
FGFR2
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2XFGFR2/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的0.3-2.9ngFGFR2和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
FGFR3
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X FGFR3/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的1.4-20.0ngFGFR3和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
FGFR4
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X FGFR4/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的2.4-105.0ngFGFR4和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
FGR
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X FGR/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.8-6.0ng FGR和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
FLT1(VEGFR1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X FLT1(VEGFR1)/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的5.0-25.0ng FLT1(VEGFR1)和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
FLT3
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X FLT3/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.6-76.0ng FLT3和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
FLT3 D835Y
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X FLT3 D835Y/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.1-1.3ng FLT3 D835Y和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
FLT4(VEGFR3)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X FLT4(VEGFR3)/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的1.9-16.0ng FLT4(VEGFR3)和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
FRK(PTK5)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X FRK(PTK5)/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.1-51.9ng FRK(PTK5)和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
FYN
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X FYN/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的5.0-34.0ng FYN和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
GRK4
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X GRK4/Ser/Thr 16肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.3-9.6ng GRK4和2μM Ser/Thr 16肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶8稀释的显影剂B。
GRK5
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X GRK5/Ser/Thr16肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的12.1-97.5ngGRK5和2μM Ser/Thr 16肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶8稀释的显影剂B。
GRK6
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X GRK6/Ser/Thr 16肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的9.1-82.9ng GRK6和2μM Ser/Thr 16肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶8稀释的显影剂B。
GRK7
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X GRK7/Ser/Thr 16肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的3.8-28.5ng GRK7和2μM Ser/Thr 16肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶8稀释的显影剂B。
GSK3A(GSK3α)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X GSK3A(GSK3α)/Ser/Thr 09肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.1-0.4ng GSK3A(GSK3α)和2μM Ser/Thr 09肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
GSK3B(GSK3β)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中2X GSK3B(GSK3β)/Ser/Thr 09肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.4-2.5ng GSK3B(GSK3β)和2μM Ser/Thr 09肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
HCK
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X HCK/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.3-3.5ng HCK和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
IGF1R
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X IGF1R/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的3.8-98.8ng IGF1R和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
IKBKB(IKKβ)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X IKBKB(IKKβ)/Ser/Thr 05肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的1.2-10.6ng IKBKB(IKKβ)和2μM Ser/Thr 05肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
INSR
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X INSR/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的2.3-50.0ngINSR和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
INSRR(IRR)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X INSRR(IRR)/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的2.2-14.7ng INSRR(IRR)和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
IRAK4
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X IRAK4/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的3.8-400.0ng IRAK4和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
ITK
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X ITK/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的3.8-80.0ng ITK和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
JAK2
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X JAK2/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的0.5-4.0ng JAK2和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
JAK3
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X JAK3/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的6.7-49.1ngJAK3和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
KDR(VEGFR2)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X KDR(VEGFR2)/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.6-14.4ng KDR(VEGFR2)和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
KIT
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MnCl2，1mMEGTA，2mM DTT，0.02％NaN3中制备2X KIT/酪氨酸06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，5mM MgCl2，5mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT，0.01％NaN3中的3.7-27.7ng KIT和2μM酪氨酸06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
KIT T670I
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MnCl2，1mMEGTA，2mM DTT，0.02％NaN3中制备2X KIT T670I/酪氨酸06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，5mM MgCl2，5mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT，0.01％NaN3中的4.8-127.0ng KIT T670I和2μM酪氨酸06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
LCK
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X LCK/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的2.0-26.5ng LCK和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
LYN A
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X LYN A/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.1-12.0ng LYN A和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
LYN B
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X LYN B/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.9-18.5ng LYN B和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
MAP3K9(MLK1)
在50mM HEPES，pH6.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA，0.02％NaN3中制备2X MAP3K9(MLK1)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.0，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA，0.01％NaN3中的12.0-55.6ng MAP3K9(MLK1)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
MAP4K2(GCK)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAP4K2(GCK)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.4-8.4ng MAP4K2(GCK)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
MAP4K4(HGK)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAP4K4(HGK)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.5-5.0ng MAP4K4(HGK)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
MAP4K5(KHS1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAP4K5(KHS1)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.3-4.0ng MAP4K5(KHS1)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
MAPK1(ERK2)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAPK1(ERK2)/Ser/Thr 03肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的2.1-31.4ng MAPK1(ERK2)和2μM Ser/Thr 03肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
MAPK11(p38β)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAPK11(p38β)/Ser/Thr15肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的12.0-76.0ng MAPK11(p38β)和2μM Ser/Thr 15肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂B。
MAPK12(p38γ)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAPK12(p38γ)/Ser/Thr 03肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.5-4.8ng MAPK12(p38γ)和2μM Ser/Thr 03肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
MAPK13(p38δ)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAPK13(p38δ)/Ser/Thr 03肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的3.5-39.6ng MAPK13(p38δ)和2μM Ser/Thr 03肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
MAPK3(ERK1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAPK3(ERK1)/Ser/Thr 03肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的2.5-31.5ng MAPK3(ERK1)和2μM Ser/Thr 03肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
MAPKAPK2
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAPKAPK2/Ser/Thr 04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.1-0.3ng MAPKAPK2和2μM Ser/Thr 04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
MAPKAPK3
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAPKAPK3/Ser/Thr 04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.8-15.8ng MAPKAPK3和2μM Ser/Thr 04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
MAPKAPK5(PRAK)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAPKAPK5(PRAK)/Ser/Thr 04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的2.1-18.0ng MAPKAPK5(PRAK)和2μM Ser/Thr 04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
MATK(HYL)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MATK(HYL)/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的2.9-76.8ng MATK(HYL)和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
MERTK(cMER)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X MERTK(cMER)/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的0.7-7.8ng MERTK(cMER)和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
MET(cMet)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MET(cMet)/酪氨酸06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.3-10.0ng MET(cMet)和2μM酪氨酸06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
MET M1250T
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MET M1250T/酪氨酸06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的3.0-30.0ng MET M1250T和2μM酪氨酸06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
MINK1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MINK1/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.2-35.0ng MINK1和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
MST1R(RON)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MST1R(RON)/酪氨酸06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.1-1.2ng MST1R(RON)和2μM酪氨酸06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
MST4
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MST4/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的10.5-89.8ng MST4和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
MUSK
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X MUSK/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的16.4-89.5ngMUSK和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
MYLK2(skMLCK)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，20μg/ml Calmodulin，0.02％NaN3中制备2X MYLK2(skMLCK)/Ser/Thr13肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，10μg/mlCalmodulin，0.01％NaN3中的7.1-51.4ng MYLK2(skMLCK)和2μMSer/Thr 13肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶512稀释的显影剂A。
NEK1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X NEK1/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.9-69.1ng NEK1和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
NEK2
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X NEK2/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.4-4.0ng NEK2和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
NTRK1(TRKA)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X NTRK1(TRKA)/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的4.8-77.4ng NTRK1(TRKA)和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
NTRK2(TRKB)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X NTRK2(TRKB)/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的0.2-2.0ng NTRK2(TRKB)和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
NTRK3(TRKC)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X NTRK3(TRKC)/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的3.3-110.6ng NTRK3(TRKC)和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
PAK3
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PAK3/Ser/Thr14肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的3.8-68.0ng PAK3和2μM Ser/Thr14肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶256稀释的显影剂A。
PAK4
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PAK4/Ser/Thr14肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.1-0.5ng PAK4和2μM Ser/Thr14肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶256稀释的显影剂A。
PAK6
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PAK6/Ser/Thr14肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的2.0-12.6ng PAK6和2μM Ser/Thr14肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶256稀释的显影剂A。
PASK
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PASK/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的10.5-59.8ng PASK和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PDGFRA(PDGFRα)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X PDGFRA(PDGFRα)/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的4.0-132.8ng PDGFRA(PDGFRα)和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
PDGFRA D842V
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X PDGFRA D842V/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的4.4-39.6ng PDGFRA D842V和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
PDGFRA T674I
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X PDGFRA T674I/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的14.6-58.4ng PDGFRA T674I和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
PDGFRB(PDGFRβ)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X PDGFRB(PDGFRβ)/酪氨酸04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的4.8-33.0ng PDGFRB(PDGFRβ)和2μM酪氨酸04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32稀释的显影剂B。
PHKG1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，20μg/ml Calmodulin，0.02％NaN3中制备2X PHKG1/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，10μg/ml Calmodulin，0.01％NaN3中的6.3-117.8ng PHKG1和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PHKG2
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，0.02％NaN3中制备2X PHKG2/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，0.01％NaN3中的5.2-26.0ng PHKG2和2μMSer/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PIM1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PIM1/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.8-39.4ng PIM1和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PIM2
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PIM2/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的2.5-25.0ng PIM2和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PKN1(PRK1)
在50mM Tris pH8.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA，0.02％NaN3中制备2X PKN1(PRK1)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM Tris/HEPES，pH 8.0，0.01％BRIJ-35，10mMMgCl2，1mM EGTA，0.01％NaN3中的2.9-29.8ng PKN1(PRK1)和2μMSer/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PLK1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PLK1/Ser/Thr16肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的2.8-25.3ng PLK1和2μM Ser/Thr16肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶8稀释的显影剂B。
PLK2
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PLK2/Ser/Thr16肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的13.0-186.2ng PLK2和2μM Ser/Thr16肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶8稀释的显影剂B。
PLK3
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PLK3/Ser/Thr16肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.8-4.5ng PLK3和2μM Ser/Thr 16肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶8稀释的显影剂B。
PRKACA(PKA)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PRKACA(PKA)/Ser/Thr 01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.0-0.1ng PRKACA(PKA)和2μM Ser/Thr 01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
PRKCA(PKCα)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，2X Novel Lipid Mix，0.02％NaN3中制备2X PRKCA(PKCα)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，1X Novel Lipid Mix，0.01％NaN3中的0.0-0.3ng PRKCA(PKCα)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PRKCB1(PKCβI)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，2X Novel Lipid Mix，0.02％NaN3中制备2X PRKCB1(PKCβI)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，1X Novel LipidMix，0.01％NaN3中的0.0-0.3ng PRKCB1(PKCβI)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PRKCB2(PKCβII)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，2X Novel Lipid Mix，0.02％NaN3中制备2X PRKCB2(PKC βII)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，1X Novel LipidMix，0.01％NaN3中的0.0-0.6ng PRKCB2(PKCβII)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PRKCD(PKCδ)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，2X Novel Lipid Mix，0.02％NaN3中制备2X PRKCD(PKCδ)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，1X Novel Lipid Mix，0.01％NaN3中的0.1-1.3ng PRKCD(PKCδ)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PRKCE(PKCε)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，2X Novel Lipid Mix，0.02％NaN3中制备2X PRKCE(PKCε)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，1X Novel Lipid Mix，0.01％NaN3中的0.1-0.7ng PRKCE(PKCε)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PRKCG(PKCγ)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，2X Novel Lipid Mix，0.02％NaN3中制备2X PRKCG(PKCγ)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，1X Novel Lipid Mix，0.01％NaN3中的0.0-0.4ng PRKCG(PKCγ)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PRKCH(PKCη)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，2X Novel Lipid Mix，0.02％NaN3中制备2X PRKCH(PKCη)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，1X Novel Lipid Mix，0.01％NaN3中的0.1-1.1ng PRKCH(PKCη)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PRKCI(PKCι)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，2X Novel Lipid Mix，0.02％NaN3中制备2X PRKCI(PKCι)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，1X Novel Lipid Mix，0.01％NaN3中的0.8-5.0ng PRKCI(PKCι)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PRKCN(PKD3)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PRKCN(PKD3)/Ser/Thr 10肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.3-5.8ng PRKCN(PKD3)和2μM Ser/Thr 10肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
PRKCQ(PKCθ)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，2X Novel Lipid Mix，0.02％NaN3中制备2X PRKCQ(PKCθ)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，1X Novel Lipid Mix，0.01％NaN3中的0.0-0.4ng PRKCQ(PKCθ)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PRKCZ(PKCζ)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mM CaCl2，2X Novel Lipid Mix，0.02％NaN3中制备2X PRKCZ(PKCζ)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，500μM EGTA，2mM CaCl2，1X Novel Lipid Mix，0.01％NaN3中的0.9-8.0ng PRKCZ(PKCζ)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
PRKD1(PKCμ)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PRKD1(PKCμ)/Ser/Thr10肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.1-1.7ng PRKD1(PKCμ)和2μM Ser/Thr10肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
PRKD2(PKD2)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PRKD2(PKD2)/Ser/Thr 10肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.2-2.4ng PRKD2(PKD2)和2μM Ser/Thr10肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
PRKG1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA，20μM cGMP中制备2XPRKG1/Ser/Thr 14肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mMMgCl2，1mM EGTA，10μM cGMP中的0.1-0.8ng PRKG1和2μM Ser/Thr14肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶256稀释的显影剂A。
PRKG2(PKG2)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA，20μM cGMP中制备2X PRKG2(PKG2)/Ser/Thr 14肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA，10μM cGMP中的0.1-2.0ng PRKG2(PKG2)和2μM Ser/Thr 14肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶256稀释的显影剂A。
PRKX
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PRKX/Ser/Thr 14肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.3-2.8ng PRKX和2μM Ser/Thr14肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶256稀释的显影剂A。
PTK2(FAK)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PTK2(FAK)/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的2.7-40.1ng PTK2(FAK)和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
PTK6(Brk)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X PTK6(Brk)/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的17.5-400.0ng PTK6(Brk)和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
RET
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X RET/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.5-4.6ng RET和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
ROCK1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X ROCK1/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.8-12.3ng ROCK1和2μM Ser/Thr07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
ROCK2
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X ROCK2/Ser/Thr13肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.9-6.1ng ROCK2和2μM Ser/Thr 13肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶512稀释的显影剂A。
ROS1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X ROS1/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的3.6-23.9ng ROS1和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
RPS6KA1(RSK1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X RPS6KA1(RSK1)/Ser/Thr 06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.8-7.1ng RPS6KA1(RSK1)和2μM Ser/Thr 06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
RPS6KA2(RSK3)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X RPS6KA2(RSK3)/Ser/Thr 06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的2.3-15.6ng RPS6KA2(RSK3)和2μM Ser/Thr 06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
RPS6KA3(RSK2)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X RPS6KA3(RSK2)/Ser/Thr 06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.3-2.7ng RPS6KA3(RSK2)和2μM Ser/Thr 06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
RPS6KA4(MSK2)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X RPS6KA4(MSK2)/Ser/Thr 01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的12.4-126.1ng RPS6KA4(MSK2)和2μM Ser/Thr 01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
RPS6KA5(MSK1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X RPS6KA5(MSK1)/Ser/Thr 01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.0-11.0ng RPS6KA5(MSK1)和2μM Ser/Thr 01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
RPS6KB1(p70S6K)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X RPS6KB1(p70S6K)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的6.3-51.3ng RPS6KB1(p70S6K)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
SGK(SGK1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X SGK(SGK1)/Ser/Thr 06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.1-1.0ng SGK(SGK1)和2μM Ser/Thr 06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
SGK2
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X SGK2/Ser/Thr 06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.2-3.0ng SGK2和2μM Ser/Thr 06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
SGKL(SGK3)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X SGKL(SGK3)/Ser/Thr 06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.1-1.8ng SGKL(SGK3)和2μM Ser/Thr06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
SRC
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X SRC/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的3.4-36.0ng SRC和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
SRC N1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X SRC N1/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.9-15.5ng SRC N1和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
SRC N2
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X SRC N2/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.8-31.5ng SRC N2和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
SRMS(Srm)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X SRMS(Srm)/酪氨酸01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的13.3-67.7ng SRMS(Srm)和2μM酪氨酸01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
SRPK2
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X SRPK2/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的10.6-123.1ng SRPK2和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
STK22B(TSSK2)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X STK22B(TSSK2)/Ser/Thr 04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的5.6-37.5ng STK22B(TSSK2)和2μM Ser/Thr 04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
STK22D(TSSK1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X STK22D(TSSK1)/Ser/Thr 04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的1.5-11.4ng STK22D(TSSK1)和2μM Ser/Thr 04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
STK24(MST3)
在50mM Tris pH8.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA，0.02％NaN3中制备2X STK24(MST3)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM Tris/HEPES，pH8.0，0.01％BRIJ-35，10mMMgCl2，1mM EGTA，0.01％NaN3中的14.7-84.0ng STK24(MST3)和2μMSer/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
STK25(YSK1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X STK25(YSK1)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的3.1-56.8ng STK25(YSK1)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
STK3(MST2)
在50mM HEPES，pH6.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA，0.02％NaN3中制备2X STK3(MST2)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.0，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA，0.01％NaN3中的5.7-150.0ng STK3(MST2)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
STK4(MST1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X STK4(MST1)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的8.0-200.0ng STK4(MST1)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
STK6(Aurora A)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X STK6(Aurora A)/Ser/Thr 01肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的0.9-6.2ng STK6(Aurora A)和2μM Ser/Thr 01肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
SYK
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X SYK/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.4-6.4ng SYK和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
TAOK2(TAO1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X TAOK2(TAO1)/Ser/Thr 07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的10.8-70.4ng TAOK2(TAO1)和2μM Ser/Thr 07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶32768稀释的显影剂A。
TBK1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X TBK1/Ser/Thr 05肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.6-9.2ng TBK1和2μM Ser/Thr 05肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶128稀释的显影剂B。
TEK(Tie2)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，4mMMnCl2，1mM EGTA，2mM DTT中制备2X TEK(Tie2)/酪氨酸05肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，2mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT中的0.5-5.8ng TEK(Tie2)和2μM酪氨酸05肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
TYRO3(RSE)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X酪氨酸O3(RSE)/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA中的2.8-40.8ng酪氨酸O3(RSE)和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
YES1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X YES1/酪氨酸02肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.5-18.0ng YES1和2μM酪氨酸02肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶64稀释的显影剂A。
ZAP70
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MnCl2，1mMEGTA，2mM DTT，0.02％NaN3中制备2X ZAP70/酪氨酸07肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，5mM MgCl2，5mM MnCl2，1mM EGTA，1mM DTT，0.01％NaN3中的20.0-113.0ng ZAP70和2μM酪氨酸07肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶16稀释的显影剂B。
激酶特异性试验的详细描述(级联形式(Cascade Format))
BRAF
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X BRAF/失活的MAP2K1(MEK1)/失活MAPK1(ERK2)/Ser/Thr03肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.03-0.13ng BRAF，10ng失活的MAP2K1(MEK1)，100ng失活的MAPK1(ERK2)和2μMSer/Thr 03肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
BRAF V599E
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X BRAF V599E/失活的MAP2K1(MEK1)/失活的MAPK1(ERK2)/Ser/Thr 03肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mMHEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.004-0.014ng BRAF V599E，10ng失活的MAP2K1(MEK1)，100ng失活的MAPK1(ERK2)和2μM Ser/Thr03肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
MAP2K1(MEK1)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAP2K1(MEK1)/失活的MAPK1(ERK2)/Ser/Thr 03肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH 7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.00-4.00ng MAP2K1(MEK1)，105ng失活的MAPK1(ERK2)和2μM Ser/Thr 03肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
MAP2K2(MEK2)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAP2K2(MEK2)/失活的MAPK1(ERK2)/Ser/Thr 03肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的1.00-4.00ng MAP2K2(MEK2)，105ng失活的MAPK1(ERK2)和2μM Ser/Thr 03肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
MAP2K6(MKK6)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAP2K6(MKK6)/失活的MAPK12(p38γ)/Ser/Thr 03肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的9.80-39.00ng MAP2K6(MKK6)，100ng失活的MAPK1K(p38γ)和2μM Ser/Thr 03肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
MAP3K8(COT)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAP3K8(COT)/失活的MAP2K1(MEK1)/失活的MAPK1(ERK2)/Ser/Thr 03肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mMHEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.5-2.0ng MAP3K8(COT)，10ng失活的MAP2K1(MEK1)，100ng失活的MAPK1(ERK2)和2μM Ser/Thr 03肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
MAPK14(p38α)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X MAPK14(p38α)/失活的MAPKAPK2/Ser/Thr 04肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.005-0.020ng MAPK14(p38α)，5ng失活的MAPKAPK2和2μM Ser/Thr 04肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
PDK1
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X PDK1/失活的AKT2(PKBβ)/Ser/Thr 06肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mMMgCl2，1mM EGTA中的3.20-12.60ng PDK1，150ng失活的AKT2(PKBβ)和2μM Ser/Thr 06肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶2048稀释的显影剂A。
RAF1(cRAF)
在50mM HEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中制备2X RAF1(cRAF)/失活的MAP2K1(MEK1)/失活的MAPK1(ERK2)/Ser/Thr 03肽混合物。最终的10μL激酶反应物包含溶在50mMHEPES，pH7.5，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA中的0.002-0.008ng RAF1(cRAF)，10ng失活的MAP2K1(MEK1)，100ng失活的MAPK1(ERK2)和2μM Ser/Thr 03肽。在激酶反应物培养1小时后，加入5μL的1∶1024稀释的显影剂A。
6.实施例
6.1三环4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
在此描述本发明的例子的通用合成程序，其中所期望的产物是4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
，因此以方案1中的化合物2具有R1代表H，X代表N-CH3，Y3代表R，Y1代表H，Y2代表H和Y3代表H，见图1。在该例子中，反应a)可以如下进行：将4，6-二氯-5-硝基嘧啶和三乙胺的THF溶液加入到合适胺(如N-甲基苯胺)的THF溶液中。室温搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩，用水稀释，用EtOAc萃取。有机相用盐酸、盐水冲洗，在无水硫酸镁上干燥，并真空浓缩，得固体粗产品。在一些例子中需再经过重结晶纯化而得到纯化的产物6-氯-5-硝基嘧啶-4-胺产物(方案I的化合物1，X代表NR，Y3代表R，Y1、Y2和Y4代表H)。将6-氯-5硝基嘧啶-4-胺溶解在乙醇与水的混和物中，加入还原铁粉和氯化铵，将混合物搅拌回流5小时后，冷却至室温，用硅藻土垫过滤。将滤液在真空下浓缩。残留物用乙酸乙酯萃取，有机萃取物用饱和碳酸氢钠溶液、水、盐水冲洗，在无水硫酸镁上干燥。然后过滤和真空浓缩，得到粗产品，其经过快速柱层析分离提纯得到相应的6-氯-N4-嘧啶-4，5-二胺(化合物1，方案I)。
4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮(化合物2，反应式I)的制备根据如下的通用程序进行：采用两种环化条件合成三环4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
。将6-氯-N4-嘧啶-4，5-二氨、适当的酸或酸衍生物和pPA溶解于三氯氧磷中，然后在回流的二甲苯中搅拌0.5-12小时。将反应混合物真空浓缩，用水稀释，用乙酸乙酯萃取。水层用5N氢氧化钠溶液处理以将pH调至10，并用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，用饱和碳酸氢、盐水冲洗，在无水硫酸镁上干燥，真空浓缩并经快速柱层析分离提纯。
R1＝H，R2＝CH3；
2.1，R3＝H，81％；3.1，R3＝H，80％
2.2，R3＝CH3，84％；3.2，R3＝CH3，80％
2.3，R3＝F；3.3，R3＝F，77％(两步反应)
方法i)4.19，R3＝H，X＝O，61％
方法ii)4.3，R3＝H，X＝Cl，74％
a)p-R3-Ph-NH-R2，Et3N/THF，室温；b)Fe/NH4Cl，C2H5OH/H2O，回流7h；c)苯甲酸，方法i)pPA/二甲苯，方法ii)pPA/三氯氧磷。
当将嘧啶3.1和苯甲酸在回流的二甲苯中用pPA处理5小时后，得到化合物4-羟基-11-甲基-6-苯基-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.19)，产率为61％。化合物4.19用三氯氧磷处理可以容易地转化为4-氯-11-甲基-6-苯基-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.3)。用pPA/三氯氧磷可以在一锅程序(one-pot procedure)中实现上述两步转化，4.3的产率为74％。
其它通过上述方法合成的化合物的例子见表1。在pPA/三氯氧磷条件下，6-氯-4，5-二氨基嘧啶3与各种酸或酸衍生物反应得到目标化合物4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
环系。
表1.三环4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
的合成
为产生额外的库多样性，用胺对4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
上的4-氯原子进行亲核取代。
在回流的正BuOH/Et3N中用伯胺或仲胺对4-位的氯原子进行亲核取代反应，以较好的产率得到4-位取代的化合物5.1，5.2。
5.1，R5R6NH＝正Bu-NH2，84％；5.2，R5R6NH＝吡咯烷，89％
商业上可获得的试剂使用前没有纯化，熔点未经校正。质谱和HPLC(ELSD)数据使用1100型LC/MS系统(安捷伦技术公司)和Alltech ELSD2000，参数为YMC ODS-A，5-μm，120-
，4.6×50mm(Waters，Inc.)测定，并记录所期望产品的延迟时间(Rt)。1H NMR数据用300-MHz Varian质谱仪测定，以TMS作内标，CDCl3为溶剂。峰的多样型表示如下：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；m，多重峰；dd，双重双峰；br，宽峰。耦合常数(J值)如果标记有则以赫兹为单位。环化的起始原料根据文献的方法合成(Tanji等，Chem.Pharm.Bull.1992，40，227)。
6.1.1制备6-氯-5-硝基嘧啶-4-胺的通用合成程序和具体表征数据
向4，6-二氯-5-硝基嘧啶(8.00g，41.5mmol)和三乙胺(6.9mL，49.2mmol)的无水THF溶液(40mL)中缓慢加入适当胺(41.5mmol)的四氢呋喃溶液(40mL)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将该反应混合物真空浓缩，用水稀释，用EtOAc萃取。有机相用1N稀盐酸、盐水冲洗，在无水硫酸镁上干燥，并真空浓缩，从而得到固体粗产品。用甲醇重结晶纯化得纯化的目标产物2.1和2.2(产物2.3未经重结晶纯化直接用于下一步步骤)。
(6-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-甲基苯胺(2.1).黄色固体，产率81％，熔点：133.8-135.5℃。ES-MS：265((M+1)+)。1H NMRδ8.52(s，1H)，7.37-7.39(m，3H)，7.15-7.18(m，2H)，3.58(s，3H)。
(6-氯-5-硝基嘧啶-4-基)-甲基-对甲苯胺(2.2).黄色固体，产率84％，熔点：133.3-134.3℃。ES-MS：279((M+1)+)。1H NMRδ8.49(s，1H)，7.16-7.19(d，J＝9.0Hz，2H)，7.03-7.06(d，J＝9.0Hz，2H)，3.55(s，3H)，2.38(s，3H)。
(6-氯-5-硝基嘧啶-4-基)-(4-氟苯基)-甲基苯胺(2.3).棕色固体，ES-MS：283((M+1)+)。
6.1.2制备6-氯-N4-嘧啶-4，5-二氨的一般合成方法和具体表征数据
将化合物2(33.0mmol)溶解于乙醇(118.0mL)和水(33.0mL)的混合物中，加入铁粉(5.54g，98.9mmol)和氯化铵(1.06g，19.8mmol)。将所述混合物搅拌回流5小时，冷却至室温，并通过硅藻土垫过滤。将滤液真空浓缩。残余物用乙酸乙酯萃取，有机萃取物用饱和碳酸氢钠、水、盐水冲洗，在无水硫酸镁上干燥。然后过滤并真空浓缩得到粗产品，其通过快速柱层析纯化(先用9％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱剂，再20％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱)得到化合物3.1、3.2和3.3。
6-氯-N4-甲基-N4-苯基嘧啶-4，5-二胺(3.1).白色固体，产率80％，熔点：81.0-82.6℃。ES-MS：235((M+1)+)。1H NMRδ8.22(s，1H)，7.35-7.40(t，J＝7.5Hz，2H)，7.17-7.22(t，J＝7.5Hz，1H)，7.05-7.08(d，J＝9.0Hz，2H)，3.51(s，3H)。
6-氯-N4-甲基-N4-对甲苯基嘧啶-4，5-二胺(3.2).白色固体，产率80％，熔点：114.9-116.1℃。ES-MS：249((M+1)+)。1H NMRδ8.19(s，1H)，7.16-7.19(d，J＝9.0Hz，2H)，6.97-7.00(d，J＝9.0Hz，2H)，4.82(br，2H)，3.47(s，3H)，2.35(s，3H)。
6-氯-N4-对氟苯基-N4-甲基嘧啶-4，5-二胺(3.3).黄色固体，产率：77％(两步反应)，熔点：106-108℃。ES-MS：253((M+1)+)。1H NMRδ8.21(s，1H)，7.05-7.08(m，4H)，3.47(s，3H)。
6.1.3制备4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
的通用合成程序和具体表征数据
将6-氯-N4-嘧啶-4，5-二胺(1.3mmol)、适当的酸或酸衍生物(1.9mmol)和pPA(0.63g，1.9mmol)溶解于三氯氧磷(6.0mL)中，并搅拌回流0.5-12小时。将反应混合物真空浓缩，用水(15mL)稀释，用乙酸乙酯萃取(3×10mL)。将水层用5N氢氧化钠溶液处理使pH为10，并用乙酸乙酯萃取(2×10mL)，合并的EtOAc相用饱和碳酸氢钠、盐水冲洗，在无水硫酸镁上干燥，真空浓缩并经快速柱层析分离提纯(对于化合物4.6，4.12，4.18用20％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱；其余化合物先用2.5％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱，再用9％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱)。
4-氯-11-甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.1).黄色固体，产率：60％，熔点：125.3-126.9℃。ES-MS：287((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.66分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.35(s，1H)，7.38-7.44(t，J＝9.0Hz，1H)，7.32-7.35(d，J＝9.0Hz，1H)，7.08-7.14(t，J＝9.0Hz，1H)，6.98-7.01(d，J＝9.0Hz，1H)，3.28(s，3H)，2.84-2.89(t，J＝7.5Hz，2H)，1.70-1.83(m，2H)，1.02-1.07(t，J＝7.5Hz，3H)。13C NMR(300Hz，CDCl3)δ177.5，162.9，156.0，153.3，153.0，132.1，131.0，130.4，128.3，124.2，119.3，42.2，35.9，20.4，13.7。
4-氯-6，11-二甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.2).黄色固体，产率：52％，熔点：121.1-122.6℃。ES-MS：259((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.10min)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.36(s，1H)，7.40-7.45(t，J＝7.8Hz，1H)，7.34-7.36(d，J＝6.9Hz，1H)，7.10-7.15(t，J＝7.5Hz，1H)，6.98-7.00(d，J＝8.1Hz，1H)，3.30(s，3H)，2.64(s，3H)。
4-氯-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.3).黄色固体，产率：74％，熔点：127.1-128.9℃。ES-MS：321((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.89分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.39(s，1H)，7.80-7.83(d，J＝9.0Hz，2H)，7.42-7.55(m，4H)，7.09-7.14(t，J＝7.5Hz，3H)，3.35(s，3H)。13C NMR(300Hz，CDCl3)δ173.0，162.8，156.7，154.0，153.9，139.6，133.0，132.0，131.6，130.2，129.1，128.5，124.1，120.1，36.2。
4-氯-11-甲基-6-(4′-氟-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.4).橙色固体，产率：79％，熔点：196.1-197.1℃。ES-MS：339((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.76分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.40(s，1H)，7.81-7.86(m，2H)，7.48-7.52(m，1H)，7.10-7.19(m，5H)，3.35(s，3H)。
4-氯-11-甲基-6-(4′-甲基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.5).橙色固体，产率：90％，熔点：200.9-201.8℃。ES-MS：335((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.93分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.38(s，1H)，7.70-7.73(d，J＝8.1Hz，2H)，7.46-7.52(m，1H)，7.23-7.26(d，J＝8.4Hz，2H)，7.06-7.15(m，3H)，3.34(s，3H)，2.43(s，3H)。13C NMR(300Hz，CDCl3)δ173.0，162.9，156.4，153.6，142.2，136.7，133.0，132.1，131.4，130.4，130.2，129.4，129.2，129.1，124.0，120.0，36.2，21.8。
4-氯-11-甲基-6-(4′-硝基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4f).橙色固体，产率：38％，熔点：213.4-214.6℃。ES-MS：366((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.83分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.44(s，1H)，8.29-8.31(d，J＝8.4Hz，2H)，7.99-8.02(d，J＝8.4Hz，2H)，7.52-7.57(t，J＝7.5Hz，1H)，7.12-7.14(m，2H)，7.01-7.04(m，1H)，3.37(s，3H)。
4-氯-8，11-二甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.7).黄色固体，产率：65％，熔点：114.8-116.4℃。ES-MS：301((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.88分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.33(s，1H)，7.19-7.23(d，J＝6.0Hz，1H)，7.12(s，1H)，6.87-6.90(d，J＝9.0Hz，1H)，3.26(s，3H)，2.83-2.88(t，J＝7.5Hz，2H)，2.31(s，3H)，1.70-1.83(m，2H)，1.02-1.07(t，J＝7.5Hz，3H)。13C NMR(300Hz，CDCl3)δ177.5，163.1，155.8，153.2，150.4，134.0，132.7，130.9，130.2，128.6，119.1，42.1，35.8，20.6，20.4，13.7。
4-氯-6，8，11-三甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.8).黄色固体，产率：57％，熔点：117.9-119.6℃。ES-MS：273((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.35分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.34(s，1H)，7.20-7.23(m，1H)，7.14(s，1H)，6.86-6.89(d，J＝8.1Hz，1H)，3.27(s，3H)，2.63(s，3H)，2.31(s，3H)。
4-氯-8，11-二甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.9).橙色固体，产率：85％，熔点：170.4-171.5℃。ES-MS：335((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝4.08分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.37(s，1H)，7.82-7.85(m，2H)，7.43-7.53(m，3H)，7.28(s，1H)，6.98-7.00(d，J＝8.4Hz，1H)，6.92(s，1H)，3.32(s，3H)，2.25(s，3H)。
4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-氟苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.10).黄色固体，产率：88％，熔点：166.0-167.6℃。ES-MS：353((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.92分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.38(s，1H)，7.82-7.87(m，2H)，7.27-7.32(m，1H)，7.12-7.18(m，2H)，6.98-7.00(d，J＝8.4Hz，1H)，6.90(s，1H)，3.31(s，3H)，2.25(s，3H)。
4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-甲基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.11).黄色固体，产率：97％，熔点：231.0-232.1℃。ES-MS：349((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝4.08分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.36(s，1H)，7.71-7.74(d，J＝8.1Hz，2H)，7.24-7.30(m，3H)，6.97-7.00(d，J＝8.4Hz，1H)，6.93(s，1H)，3.32(s，3H)，2.44(s，3H)，2.24(s，3H)。13C NMR(300Hz，CDCl3)δ172.9，163.0，156.3，153.5，151.3，142.0，136.7，133.7，133.5，132.2，130.4，130.2，129.3，129.2，128.9，119.8，36.1，21.7，20.7。
4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-硝基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.12).橙色固体，产率：49％，熔点：229.6-230.8℃。ES-MS：380((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝4.00分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.42(s，1H)，8.29-8.32(d，J＝8.7Hz，2H)，7.99-8.02(d，J＝8.7Hz，2H)，7.33-7.35(d，J＝7.2Hz，1H)，7.00-7.03(d，J＝8.4Hz，1H)，6.80(s，1H)，3.34(s，3H)，2.26(s，3H)。
4-氯-8-氟-11-甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.13).黄色固体，产率：50％，熔点：119.4-120.5℃。ES-MS：305((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.49分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.37(s，1H)，7.11-7.15(m，1H)，7.02-7.06(m，1H)，6.94-6.98(m，1H)，3.26(s，3H)，2.82-2.86(t，J＝7.2Hz，2H)，1.72-1.84(m，2H)，1.03-1.08(t，J＝7.2Hz，3H)。
4-氯-8-氟-6，11-二甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.14).黄色固体，产率：45％，熔点：140.5-141.5℃。ES-MS：277((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.18分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.37(s，1H)，7.10-7.15(m，1H)，7.03-7.07(m，1H)，6.93-6.98(m，1H)，3.27(s，3H)，2.63(s，3H)。
4-氯-8-氟-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.15).橙色固体，产率：88％，熔点：207.7-208.7℃。ES-MS：339((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.90分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.40(s，1H)，7.82-7.84(d，J＝8.1Hz，2H)，7.44-7.57(m，3H)，7.18-7.26(m，1H)，7.04-7.09(m，1H)，6.83-6.86(m，1H)，3.20(s，3H)。
4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4′-氟苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.16).黄色固体，产率：81％，熔点：204.9-205.7℃。ES-MS：357((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.91分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.40(s，1H)，7.83-7.88(m，2H)，7.05-7.22(m，4H)，6.82-6.85(m，1H)，3.32(s，3H)。
4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4′-甲基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.17).黄色固体，产率：90％，熔点：190.8-191.9℃。ES-MS：353((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝4.12分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.40(s，1H)，7.71-7.74(d，J＝8.1Hz，2H)，7.17-7.28(m，3H)，7.03-7.08(m，1H)，6.84-6.87(m，1H)，3.31(s，3H)，2.44(s，3H)。
4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4′-硝基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.18).橙色固体，产率：37％，熔点：226.7-229.0℃。ES-MS：384((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.82分钟)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ8.45(s，1H)，8.31-8.34(d，J＝8.7Hz，2H)，8.00-8.03(d，J＝8.4Hz，2H)，7.24(s，1H)，7.08-7.12(m，1H)，6.73-6.76(m，1H)，3.34(s，3H)。
4-羟基-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.19).橙色油状物，产率：61％。ES-MS：303((M+1)+)。1H NMR(300Hz，CDCl3)δ7.92(s，1H)，7.82-7.84(d，J＝6.6Hz，2H)，7.37-7.46(m，5H)，7.04-7.07(m，2H)，3.29(s，3H)。
6.1.4制备4-氨基-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
的通用合成程序和具体表征数据
将4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4′-甲基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(4.17)(0.14mmol)，适当的胺(0.28mmol)和三乙胺(0.04mL，0.28mmol)溶于正丁醇(2.0mL)中，回流搅拌5小时。将反应混合物真空浓缩，用乙酸乙酯(15mL)溶解，用水(2×15mL)、盐水冲洗，在无水硫酸镁上干燥，真空浓缩并经快速柱层析分离提纯(对于化合物5.1用10/1的二氯甲烷/乙酸乙酯；对于化合物5.2用5/1的二氯甲烷/乙酸乙酯)。
4-(正丁胺基)-8-氟-11-甲基-6-(4-甲基-苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮(5.1).橙色油状物，产率：84％。ES-MS：390((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝3.80分钟)。
4-(吡咯烷-1-基)-8-氟-11-甲基-6-(4-甲基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(5.2).橙色油状物，产率：89％。ES-MS：388((M+1)+)，HPLC(ELSD)：100％(Rt＝2.58分钟)。
6.2三环嘧啶并5，6-二氢苯并二氮
根据方案II合成各种化合物(见图2)，并见表2。
表2：4-氯-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
的合成
起始化合物1按照对上述合成三环4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮的方法加以改变的相似方法来制备。三氯氧磷(phosphoryl oxychloride)新蒸馏得到。所有其它可购买的试剂使用前未经纯化处理，熔点未经校正。质谱和HPLC(ELSD)数据使用1100型LC/MS系统(安捷伦技术公司)和Alltech ELSD 2000测定，使用4.6×50mm柱(CenturySIL C-18 AQ+，5μ)，线性梯度为30-90％(v/v)乙腈-含0.035％三氟乙酸的水，进行8分钟，流速为3.5ml/分钟。分析性TLC采用涂布有0.25mm厚的硅胶60F254的2.5×5cm板进行。采用硅胶G(200-300目)进行柱层析。全部1H NMR谱(300MHz)报告如下：化学位移的单位为ppm，位于内标TMS的前场，以CDCl3或DMSO-d6为溶剂。峰的多样型表示如下：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；m，多重峰，整合和耦合常数(Hz)。全部13C NMR谱(75MHz)采用全氢去偶(Proton complete decoupling)测定，以ppm报告。
将5-氨基-6-氯-4-N-甲基-苯胺基-嘧啶(1)(0.85mmol)，适当的醛或醛的衍生物(1.275mmol)和TFA(0.8mL)溶于乙腈中(10.0mL)，搅拌回流16-48小时。将反应混合物真空浓缩，用乙酸乙酯(15mL)稀释，用饱和碳酸氢钠(3×15mL)冲洗。水层用乙酸乙酯(3×10mL)萃取，合并的乙酸乙酯层用盐水冲洗，在无水硫酸钠上干燥，真空浓缩并经快速柱层析分离提纯(对于化合物3.6，3.12，3.18用1/10的乙酸乙酯/石油醚洗脱；对于其余化合物用1/30的乙酸乙酯/石油醚洗脱剂)。
4-氯-11-甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.1).黄色油状物，产率：65％，ES-MS：289.2[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.01(s，1H)，7.29-7.34(m，1H)，7.03-7.17(m，3H)，4.54-4.59(m，1H)，4.48(d，J＝4.2Hz，1H)，3.49(s，3H)，1.97-2.07(m，2H)，1.39-1.54(m，2H)，1.02(t，J＝7.5Hz，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：150.9，145.8，145.6，142.5，135.5，128.4，128.1，126.0，123.8，122.3，57.3，40.0，35.1，20.1，13.9。C15H17ClN4元素分析的理论值为：C，62.39；H，5.93；N，19.40。实际值为：C，62.37；H，5.69；N，19.40。
4-氯-11-甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.2).黄色油状物，产率：47％，ES-MS：275.1[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.01(s，1H)，7.29-7.34(m，1H)，7.03-7.16(m，3H)，4.52(d，J＝3.9Hz，1H)，4.41-4.48(m，1H)，3.49(s，3H)，1.98-2.14(m，2H)，1.05(t，J＝7.2Hz，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：151.0，145.9，145.6，142.6，135.4，128.5，128.1，126.1，123.9，122.4，59.4，40.1，26.1，11.5。
4-氯-11-甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮(3.3).黄色油状物，产率：65％，ES-MS：323.1[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.99(s，1H)，7.31-7.40(m，4H)，7.24-7.27(m，2H)，7.16(d，J＝7.8Hz，1H)，7.06(td，J＝7.5Hz，0.9Hz，1H)，6.95(dd，J＝7.5Hz，1H)，5.82(d，J＝4.2Hz，1H)，4.97(d，J＝3.9Hz，1H)，3.26(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：151.3，146.4，146.0，143.0，140.1，135.7，129.0，128.8，128.0，127.8，127.7，126.3，124.0，122.8，60.8，39.7。Anal。Calcd for C18H15ClN4：C，66.98；H，4.68；N，17.36。Found C，67.02；H，4.95；N，17.07。
4-氯-11-甲基-6-(4-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.4).黄色油状物，产率：44％，ES-MS：337.1[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.99(s，1H)，7.32-7.38(m，1H)，7.14-7.20(m，5H)，7.04(td，J＝7.2Hz，1.2Hz，2H)，6.92(dd，J＝7.5Hz，1.5Hz，1H)，5.84(d，J＝3.9Hz，1H)，4.91(d，J＝3.3Hz，1H)，3.32(s，3H)，2.36(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：151.3，146.4，146.0，142.9，137.5，136.9，135.9，129.4，128.9，128.2，127.6，126.4，123.9，122.7，60.5，39.9，21.1。
4-氯-11-甲基-6-(4-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.5).黄色油状物，产率：88％，ES-MS：341.1[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.00(s，1H)，7.35-7.40(m，1H)，7.16-7.23(m，3H)，6.97-7.10(m，4H)，5.74(d，J＝3.0Hz，1H)，4.96(d，J＝3.3Hz，1H)，3.26(s，3H)。13CNMR(75MHz，CDCl3)δ：162.0(d，J＝245.0Hz，1C)，151.2，146.5，145.8，143.1，136.1，136.1，135.4，129.2，127.9(d，J＝5.7Hz，2C)，127.7，124.1，122.8，115.5(d，J＝21.8Hz，2C)，60.3，39.7。
4-氯-11-甲基-6-(4-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.6).橙色固体，产率：97％，ES-MS：368.1[(M+1)+]。熔点：174.5-175.8℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.16(d，J＝8.7Hz，2H)，8.00(s，1H)，7.41-7.46(m，1H)，7.35(d，J＝8.4Hz，2H)，7.20-7.16(m，3H)，5.60(d，J＝5.7Hz，1H)，5.19(d，J＝5.7Hz，1H)，3.11(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：151.1，148.3，147.2，146.8，145.7，143.5，134.5，129.8，128.4，126.8，126.6，124.5，123.8，123.1，60.8，39.1。Anal。Calcd for C18H14ClN5O2：C，58.78；H，3.84；N，19.04。Found C，58.86；H，3.74；N，18.93。
4-氯-8，11-二甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.7).黄色油状物，产率：72％，ES-MS：303.1[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.00(s，1H)，7.12(d，J＝8.4Hz，1H)，7.04(d，J＝8.4Hz，1H)，6.94(d，J＝1.8Hz，1H)，4.45-4.54(m，2H)，3.47(s，3H)，2.32(s，3H)，1.96-2.04(m，2H)，1.36-1.53(m，2H)，1.00(t，J＝7.2Hz，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：151.1，145.9，143.0，142.5，135.2，133.5，128.9，128.0，126.7，122.2，57.5，40.0，35.2，20.7，20.2，13.9。
4-氯-8，11-二甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.8).黄色油状物，产率：57％，ES-MS：289.1[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.00(s，1H)，7.11(d，J＝8.1Hz，1H)，7.04(d，J＝8.1Hz，1H)，6.93(s，1H)，4.49(s，1H)，4.37-4.41(m，1H)，3.47(s，3H)，2.32(s，3H)，1.98-2.12(m，2H)，1.05(t，J＝7.2Hz，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：151.0，145.8，142.8，142.4，134.9，133.4，128.8，127.8，126.7，122.1，59.4，39.9，26.0，20.6，11.4。
4-氯-8，11-二甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.9).黄色油状物，产率：72％，ES-MS：337.1[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.97(s，1H)，7.27-7.39(m，3H)，7.23-7.26(m，2H)，7.16(dd，J＝8.7Hz，1.5Hz，1H)，7.05(d，J＝8.7Hz，1H)，6.79(d，J＝1.5Hz，1H)，5.73(d，J＝3.9Hz，1H)，4.98(d，J＝3.9Hz，1H)，3.23(s，3H)，2.29(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：151.5，146.5，143.3，142.9，140.2，135.3，133.8，129.5，128.6，128.5，127.8，127.6，126.3，122.7，60.9，39.7，20.8。
4-氯-8，11-二甲基-6-(4-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.10).黄色油状物，产率：46％，ES-MS：351.1[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.97(s，1H)，7.12-7.19(m，4H)，7.06(d，J＝8.1Hz，2H)，6.75(s，1H)，5.76(d，J＝3.6Hz，1H)，4.91(d，J＝3.6Hz，1H)，3.28(s，3H)，2.36(s，3H)，2.28(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：151.5，146.4，143.3，142.9，137.3，137.0，135.5，133.7，129.4，129.3，128.2，127.9，126.3，122.6，60.6，39.8，21.1，20.8。
4-氯-8，11-二甲基-6-(4-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.11).黄色固体，产率：75％，ES-MS：355.1[(M+1)+]。熔点：153.7-155.6℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.98(s，1H)，7.16-7.22(m，3H)，7.00-7.07(m，3H)，6.81(d，J＝1.5Hz，1H)，5.66(d，J＝4.8Hz，1H)，4.96(d，J＝4.8Hz，1H)，3.22(s，3H)，2.31(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：162.0(d，J＝245.0Hz，1C)，151.4，146.6，143.2，143.1，136.1，135.0，133.9，129.6，128.5，127.8(d，J＝8.0Hz，2C)，127.4，122.8，115.5(d，J＝21.8Hz，2C)，60.4，39.6，20.7。C19H16ClFN4的计算值：C，64.32；H，4.55；N，15.79。实测值C，64.14；H，4.49；N，15.52。
4-氯-8，11-二甲基-6-(4-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.12).橙色固体，产率：97％，ES-MS：382.1[(M+1)+]。熔点：225.6-227.3℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.16(d，J＝8.7Hz，2H)，7.98(s，1H)，7.34(d，J＝8.1Hz，2H)，7.23(d，J＝8.1Hz，1H)，7.06(d，J＝8.1Hz，1H)，7.00(s，1H)，，5.53(d，J＝5.7Hz，1H)，5.18(d，J＝6.0Hz，1H)，3.07(s，3H)，2.37(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：151.3，148.4，147.1，146.8，143.4，142.9，134.4，134.2，130.2，129.0，126.6，123.7，123.0，60.8，39.0，20.7。
4-氯-9，11-二甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.13).黄色油状物，产率：81％，ES-MS：303.1[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.00(s，1H)，7.01(d，J＝7.8Hz，1H)，6.96(s，1H)，6.88(dd，J＝7.8Hz，1.2Hz，1H)，4.51-4.56(m，1H)，4.45-4.46(m，1H)，3.48(s，3H)，2.34(s，3H)，1.94-2.06(m，2H)，1.33-1.55(m，2H)，0.99(t，J＝7.2Hz，3H)。13CNMR(75MHz，CDCl3)δ：151.0，145.8，145.5，142.5，138.2，132.6，128.2，125.9，124.5，122.9，57.0，40.0，35.2，21.2，20.1，13.9。
4-氯-9，11-二甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.14).黄色油状物，产率：74％，ES-MS：289.1[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.00(s，1H)，7.01(d，J＝7.5Hz，1H)，6.96(s，1H)，6.88(d，J＝7.5Hz，1H)，4.49-4.50(m，1H)，4.38-4.45(m，1H)，3.48(s，3H)，2.34(s，3H)，1.98-2.14(m，2H)，1.05(t，J＝7.5Hz，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：151.0，145.8，145.4，142.5，138.2，132.4，128.1，126.1，124.5，122.9，59.1，40.0，26.2，21.2，11.5。C15H17ClN4的计算值：C，62.39；H，5.93；N，19.40。实测值：C，62.56；H，6.12；N，19.22。
4-氯-9，11-二甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.15).黄色油状物，产率：71％，ES-MS：337.1[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.98(s，1H)，7.30-7.38(m，3H)，7.24-7.27(m，2H)，6.98(s，1H)，6.86(d，J＝7.8Hz，1H)，6.82(d，J＝7.8Hz，1H)，5.78(d，J＝3.9Hz，1H)，4.95(d，J＝3.9Hz，1H)，3.27(s，3H)，2.35(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：151.3，146.3，145.8，142.9，140.4，139.0，132.8，128.7，128.1，127.7，127.6，126.3，124.7，123.4，60.5，39.7，21.2。
4-氯-9，11-二甲基-6-(4-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.16).黄色油状物，产率：45％，ES-MS：351.1[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.98(s，1H)，7.11-7.16(m，4H)，6.98(s，1H)，6.85(d，J＝8.4Hz，1H)，6.79(d，J＝8.4Hz，1H)，5.80(d，J＝3.3Hz，1H)，4.89(d，J＝3.3Hz，1H)，3.30(s，3H)，2.36(s，3H)，2.35(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：151.3，146.3，145.8，142.9，138.8，137.4，137.1，133.0，129.4，128.2，127.6，126.4，124.6，123.3，60.2，39.9，21.2，21.1。
4-氯-9，11-二甲基-6-(4-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.17).黄色油状物，产率：91％，ES-MS：355.1[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.99(s，1H)，7.19-7.23(m，2H)，7.98-7.06(m，3H)，6.87(s，2H)，5.70(d，J＝4.2Hz，1H)，4.94(d，J＝4.2Hz，1H)，3.25(s，3H)，2.36(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：162.0(d，J＝245.0Hz，1C)，151.3，146.4，145.6，143.1，139.1，136.3，132.4，127.9，127.8(d，J＝3.4Hz，2C)，127.7，124.7，123.5，115.5(d，J＝21.8Hz，2C)，60.0，39.6，21.2。
4-氯-9，11-二甲基-6-(4-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.18).橙色固体，产率：99％，ES-MS：382.1[(M+1)+]，熔点：82.4-88.7℃(无清晰的熔点)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.16(d，J＝8.4Hz，2H)，7.99(s，1H)，7.34(d，J＝8.4Hz，2H)，7.07(d，J＝7.2Hz，1H)，6.98(s，1H)，6.96(d，J＝7.5Hz，1H)，5.56(d，J＝5.4Hz，1H)，5.17(d，J＝5.4Hz，1H)，3.09(s，3H)，2.38(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：151.2，148.6，147.1，146.7，145.5，143.4，139.9，131.6，128.2，126.9，126.1，125.1，123.7，123.6，60.5，39.0，21.3。
将4-氯-8-氟-11-甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
(3.19)、5-氨基-6-氯-4-N-甲基-苯胺基-嘧啶(1.4)(200mg，0.85mmol)、苯甲醛(1.275mmol)和三氟乙酸(0.8mL)溶于乙腈中(10.0mL)，搅拌回流6天。将反应混合物真空浓缩，并用乙酸乙酯(15mL)稀释，用饱和碳酸氢钠(3×15mL)冲洗，用乙酸乙酯(3×10mL)萃取水层。将合并的EtOAc层用盐水冲洗，在无水硫酸钠上干燥，真空浓缩并经快速柱层析分离提纯(用1/30的乙酸乙酯/石油醚洗脱)，得黄色油状物3.19(55mg，19％)，ES-MS：341.1[(M+1)+]。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.01(s，1H)，7.36-7.43(m，3H)，7.28-7.33(m，2H)，7.11-7.16(m，1H)，7.02(td，J＝8.7Hz，3.0Hz，1H)，6.60-6.63(dd，J＝8.7Hz，3.0Hz，1H)，5.87(d，J＝3.3Hz，1H)，4.87(d，J＝3.0Hz，1H)，3.28(s，3H)。
6.3三环嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
三环嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂是按照方案III(图3)所示合成的。研究了5-氨基-4，6-二苯硫基嘧啶和苯甲酸在PPA/POCl3中进行环化反应的多种条件。虽然在低于POCl3的回流温度时没有得到环化产物，在POCl3的回流温度下回流30小时得到环合产物4，产率为95％。在上述条件下，对5-氨基-4，6-二苯硫基嘧啶的几种类似物与多种羧酸或者其衍生物的反应进行了研究，其结果如表3所示。
表3.5-氨基-4，6-二(苯硫基)嘧啶的环化
通过设计引入4-苯硫基从而提供另外的多样性位点。苯硫基化合物2可以被氧化成相应的亚砜或者砜。虽然在化合物2中有两个硫原子，但是认为嘧啶并苯并硫氮杂环上的硫原子与4-苯硫基相比更不容易被氧化。因此，用m-CPBA处理化合物2容易地得到预期的亚砜8，亚砜8是通过将1.2当量的m-CPBA的CH2Cl2溶液在0℃下滴加获得的(表4)。升高温度或者增加氧化剂的用量会导致过度氧化的副产物增加。
表4.选择性氧化
化合物8中的亚砜基团可以被亲核试剂容易地取代。为了测试其多功能性，在干燥的CH3CN中、室温下、15分钟内获得高产率的预期胺取代产物(表5)。
表5.用胺进行取代反应
所有的反应都在氮气氛下进行。三氯氧磷(phosphoryl oxychloride)是新鲜蒸馏的。乙腈用无水碳酸钾干燥。二氯甲烷用无水氯化钙干燥。所有其它的商品试剂都没有经过进一步纯化直接使用。熔点未经校正。质谱和HPLC(ELSD)数据用1100LC/MS系统(安捷伦技术有限公司)测量，采用4.6×50毫米柱(CenturySIL C-18 AQ+，5μ)，线性剃度为30-90％(v/v)的乙腈-0.035％三氟乙酸水溶液，3.5毫升/分钟的流速，进行8分钟。分析性TLC采用2.5×5厘米板铺以0.25毫米厚度的硅胶60F254进行。柱层析柱采用硅胶G(200-300目)进行。所有的1H NMR(300兆)按照如下的规则进行报告：化学位移(δ)的单位为ppm，位于内标TMS的前场，并且溶剂为CDCl3或DMSO-d6。多重性标记如下：多重性[br＝宽峰，s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，积分和耦合常数(赫兹)]。所有的核磁碳谱13CNMR(75兆)的测试都是在完全的质子去耦条件下进行并且以ppm为单位。用Flash EA 1112进行燃烧元素分析。
6.3.15-氨基-4，6-二(苯硫基)嘧啶化合物的制备和表征详述
5-氨基-4，6-二氯嘧啶(0.652g，4.00mmol)和苯硫酚(0.97g，0.9mL，8.80mmol)被加入到三乙胺(1.62g，2.24mL，16.00mmol)的正丁醇(20mL)溶液中。得到的反应混合物搅拌并且回流过夜，然后真空浓缩。二氯甲烷(150mL)加入到残余物中。有机相用盐水(60mL)洗涤两次，无水硫酸钠干燥，并且在真空下浓缩得到固体粗产物。通过石油醚/乙酸乙酯(10∶1，体积/体积)为溶剂进行重结晶纯化得到目标产物5-氨基-4，6-二(苯硫基)嘧啶6.1(1.182g，95％)黄色固体。熔点：80-82℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.24(s，1H)，7.52-7.47(m，4H)，7.42-7.37(m，6H)；13C NMR(CDCl3)δ：149.6，148.5，136.3，133.8，129.4，129.0，128.9；ES-MS：312.1[M+H+].
5-氨基-4，6-二(对甲苯基硫基)嘧啶95％；白色片状固体，熔点：185-186℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.22(s，1H)，7.40(d，J＝8.1Hz，4H)，7.21(d，J＝8.1Hz，4H)，4.17(s，2H)，2.37(s，6H)；13C NMR(CDCl3)δ：150.1，148.7，139.2，135.6，134.2，130.2，125.1，21.3；ES-MS：340.1[M+H+]。
5-氨基-4，6-二(对氯苯硫基)嘧啶96％；白色片状固体，熔点：205-206℃；1H NMR(DMSO-d6)δ：7.98(s，1H)，7.51(s，8H)，5.52(s，2H)；13C NMR(DMSO-d6)δ：153.1，151.5，141.2，141.0，139.1，134.5，133.0；ES-MS：380.0[M+H+]。
5-氨基-4，6二(对羟基)苯硫基嘧啶98％；白色片状固体，熔点：226-228℃；1H NMR(DMSO-d6)δ：9.86(s，2H)，7.90(s，1H)，7.30(d，J＝8.7Hz，4H)，6.82(d，J＝8.4Hz，4H)，5.17(s，2H)；13C NMR(DMSO-d6)δ：164.1，154.9，151.9，142.4，139.8，121.8，121.7；ES-MS：344.0[M+H+]。
5-氨基-4，6-二(对甲氧基苯硫基)嘧啶是用碘甲烷对化合物6.4进行甲基化制备得到的。试验操作如下。向无水碳酸钾(0.415g，3.00mmol)在丙酮(5mL)的溶液中加入4，6-二(对羟基)苯硫基-5-氨基嘧啶(0.343g，1.00mmol)和碘甲烷(0.596g，4.20mmol)并且反应混合物回流搅拌过夜。冷却到室温后，真空去除溶剂。加入EtOAc(20mL)，并且用水(10mL)洗涤两遍，无水硫酸钠干燥。蒸发掉溶剂后，得到的粗产物通过在EtOAc中重结晶纯化得到目标化合物0.334g(90％)白色片状固体。
5-氨基-4，6-二(对甲氧基)苯硫基嘧啶90％；白色片状固体，熔点：189-191℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.20(s，1H)，7.46(d，J＝9.0Hz，4H)，6.94(d，J＝8.7Hz，4H)，4.13(s，2H)，3.83(s，6H)；13C NMR(CDCl3)δ：160.5，150.6，148.7，136.3，134.7，118.7，115.0，55.3；ES-MS：372.1[M+H+]。
6.3.2合成4-(苯硫基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
的一般性方法
5-氨基-4，6-二(苯硫基)嘧啶(0.156g，0.50mmol)，苯甲酸(0.092g，0.75mmol)和多聚磷酸(0.253g，0.75mmol)溶解在三氯氧磷(5mL)中，并且回流搅拌30小时。反应混合物在真空下浓缩，用乙酸乙酯(15mL)稀释，慢慢加入水(15mL)。水相用5N的氢氧化钠水溶液调PH值到10后再用乙酸乙酯(15mL)萃取两次。合并的有机相用饱和碳酸钠水溶液、盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，真空下浓缩并且以石油醚/乙酸乙酯(15∶1，v/v)为洗脱剂进行快速层析纯化得到目标产物2.1 0.189克(95％)黄色固体。
4-(苯硫基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.1)95％；黄色固体，熔点：171-173℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.45(s，1H)，7.94-7.91(m，2H)，7.65-7.31(m，12H)；13C NMR(CDCl3)δ：171.2，166.7，154.5，153.0，139.7，137.9，137.5，137.3，135.8，134.0，132.6，131.9，131.4，130.5，129.8，129.6，128.7，128.6，128.5；ES-MS：398.1[M+H+]。C23H15N3S2计算值：C，69.49；H，3.80；N，10.57。实测值：C，69.48；H，3.72；N，10.62。
4-(苯硫基)-6-(吡啶-3-基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.2)93％；黄色固体，熔点：241-243℃；1H NMR(CDCl3)δ：9.05(br s，1H)，8.78(br s，1H)，8.48(s，1H)，8.34(dt，J＝8.4，1.8Hz，1H)，7.67(dd，J＝7.2，0.9Hz，1H)，7.61-7.56(m，3H)，7.49-7.41(m，5H)，7.34(dd，J＝6.6，1.5Hz，1H)；13C NMR(CDCl3)δ：168.9，166.9，154.9，153.1，152.4，151.5，137.6，137.3，136.4，135.8，135.4，134.4，133.1，131.0，129.9，129.6，129.0，128.2，123.6；ES-MS：399.1[M+H+]。
4-(苯硫基)-6-(吡啶-3-基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂(2.2)93％；黄色固体，熔点：241-243℃；1H NMR(CDCl3)δ：9.05(br s，1H)，8.78(br s，1H)，8.48(s，1H)，8.34(dt，J＝8.4，1.8Hz，1H)，7.67(dd，J＝7.2，0.9Hz，1H)，7.61-7.56(m，3H)，7.49-7.41(m，5H)，7.34(dd，J＝6.6，1.5Hz，1H)；13C NMR(CDCl3)δ：168.9，166.9，154.9，153.1，152.4，151.5，137.6，137.3，136.4，135.8，135.4，134.4，133.1，131.0，129.9，129.6，129.0，128.2，123.6；ES-MS：399.1[M+H+]。
4-(苯硫基)-6-(对甲基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.3)97％；黄色固体，熔点：164-167℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.44(s，1H)，7.82(d，J＝8.1Hz，2H)，7.65-7.25(m，11H)，2.45(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：170.8，166.4，154.0，152.7，142.3，137.8，137.2，137.1，136.7，135.5，133.7，132.3，131.2，130.2，129.5，129.3，129.2，128.3，21.6；ES-MS：412.1[M+H+]。
4-(苯硫基)-6-(邻硝基苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.4)70％；黄色固体，熔点：190-192℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.49(s，1H)，8.07(dd，J＝8.1，1.2Hz，1H)，7.97(dd，J＝7.8，1.2Hz，1H)，7.81(td，J＝7.8，1.2Hz，1H)，7.68(td，J＝8.1，1.5Hz，1H)，7.62-7.54(m，3H)，7.52(dd，J＝7.5，1.5Hz，1H)，7.49-7.43(m，3H)，7.29(td，J＝8.1，1.4Hz，1H)，7.09(dd，J＝7.5，1.2Hz，1H)；13C NMR(CDCl3)δ：170.1，167.6，155.5，153.7，149.1，137.6，137.5，137.1，136.7，135.9，134.0，133.7，133.4，132.7，131.3，129.9，129.6，129.5，129.0，128.1，125.0；ES-MS：443.1[M+H+]。
4-(苯硫基)-6-(对氟苯基)嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂(2.7)52％；黄色固体，熔点：197-198℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.46(s，1H)，7.97-7.92(m，2H)，7.65(dd，J＝8.0，1.4Hz，1H)，7.61-7.57(m，2H)，7.54(dd，J＝7.5，1.5Hz，1H)，7.48-7.43(m，3H)，7.40(dd，J＝7.2，1.2Hz，1H)，7.33(dd，J＝7.7，1.7Hz，1H)，7.22-7.14(m，2H)；13C NMR(CDCl3)δ：169.8，166.9，165.1(J＝235.8Hz)，154.5，152.9，137.5，137.0，135.8，135.5，134.2，132.8，132.7(J＝9.2Hz)，131.2，129.9，129.6，129.5，128.7，128.3，115.8(J＝20.6Hz)；ES-MS：416.1[M+H+]。
4-(苯硫基)-6-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.8)45％；黄色油状物；1H NMR(CDCl3)δ：8.42(s，1H)，7.55-7.52(m，4H)，7.46-7.42(m，5H)，2.77(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：173.5，165.9，153.9，153.2，138.9，137.5，136.2，135.5，133.5，132.0，129.5，129.3，129.0，128.2，29.1；ES-MS：336.0[M+H+]。
4-(苯硫基)-6-正丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.9)47％；黄色固体，熔点：166-168℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.41(s，1H)，7.55-7.46(m，4H)，7.45-7.39(m，4H)，3.01(t，J＝7.5Hz，2H)，1.90-1.78(m，2H)，1.10(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：176.8，165.9，153.8，153.2，138.5，137.6，136.7，135.5，133.5，131.7，129.5，129.2，129.0，128.3，128.1，43.7，20.4，13.9；ES-MS：364.1[M+H+]。
4-(苯硫基)-6-苄基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂(2.10)65％；黄色固体，熔点：149-151℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.42(s，1H)，7.57-7.52(m，3H)，7.48-7.36(m，8H)，7.35-7.20(m，3H)，4.38(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ：175.1，166.2，154.4，153.7，138.3，137.7，137.3，136.4，135.8，133.8，132.1，129.8，129.6，129.5，129.2，128.9，128.5，128.3，127.2，48.6；ES-MS：412.1[M+H+]。
4-(对甲基苯硫基)-6-苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.11)97％；黄色固体，熔点：210-211℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.44(s，1H)，7.96-7.93(m，2H)，7.55-7.45(m，6H)，7.33(dd，J＝7.8，1.7Hz，1H)，7.25(d，J＝7.8Hz，2H)，7.13(d，J＝1.5Hz，1H)，2.40(s，3H)，2.32(s，3H)；13CNMR(CDCl3)δ：170.9，166.6，154.1，152.9，139.7，139.5，138.6，137.6，136.8，135.4，133.9，133.5，133.2，131.5，131.4，130.1，128.4，124.6，21.4，21.0；ES-MS：426.1[M+H+]。
4-(对甲基苯硫基)-6-(吡啶-3-基)-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.12)97％；黄色固体，熔点：266-267℃；1H NMR(CDCl3)δ：9.04(d，J＝1.8Hz，1H)，8.78(dd，J＝4.8，1.5Hz，1H)，8.47(s，1H)，8.38(dt，J＝8.1，1.8Hz，1H)，7.55-7.36(m，5H)，7.26(d，J＝8.1Hz，2H)，7.12(d，J＝1.8Hz，1H)，2.41(s，3H)，2.34(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：168.9，167.1，154.9，153.3，152.3，151.6，140.2，139.4，137.7，137.3，136.2，135.7，135.5，134.3，134.2，134.0，131.4，130.5，124.5，123.7，21.7，21.4；ES-MS：427.1[M+H+]。
4-(对甲基苯硫基)-6-(对甲基苯基)-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.13)96％；黄色固体，熔点：194-196℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.43(s，1H)，7.83(d，J＝8.1Hz，2H)，7.50(d，J＝8.1Hz，1H)，7.46(d，J＝8.1Hz，2H)，7.34-7.24(m，5H)，7.13(d，J＝1.5Hz，1H)，2.45(s，3H)，2.40(s，3H)，2.31(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：170.7，166.5，153.9，152.8，142.1，139.7，138.6，137.7，136.8，136.7，135.4，133.8，133.5，133.1，131.5，130.1，129.1，124.6，21.5，21.4，21.0；ES-MS：440.3[M+H+]。
4-(对甲基苯硫基)-6-(对氟苯基)-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂(2.14)80％；黄色固体，熔点：152-153℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.45(s，1H)，7.98-7.93(m，2H)，7.51(d，J＝7.8Hz，1H)，7.45(d，J＝8.1Hz，2H)，7.34(dd，J＝8.1，1.8Hz，1H)，7.25(d，J＝8.1Hz，2H)，7.21-7.15(m，2H)，7.11(d，J＝1.5Hz，1H)，2.40(s，3H)，2.33(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：169.8，166.9，165.2(J＝251.9Hz)，154.5，153.1，140.1，139.1，137.8，136.8，136.0，135.9，135.7，134.2，134.0，133.7，132.6(J＝8.6Hz)，131.6，130.5，124.7，115.8(J＝21.8Hz)，21.7，21.4；ES-MS：444.1[M+H+]。
4-(对甲基苯硫基)-6-正丙基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.15)67％；黄色固体，熔点：164-166℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.40(s，1H)，7.43-7.39(m，3H)，7.30-7.22(m，4H)，3.01(t，J＝7.2Hz，2H)，2.39(s，3H)，2.38(s，3H)，1.90-1.78(m，2H)，1.10(t，J＝7.8Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：176.7，166.1，153.7，153.3，139.6，139.1，138.3，137.5，135.4，133.3，133.2，132.4，130.0，128.4，124.6，43.5，21.3，21.1，20.4，13.8；ES-MS：392.1[M+H+]。C22H21N3S2计算值：C，67.48；H，5.41；N，10.73。实测值：C，69.39；H，5.43；N，10.66。
4-(对甲基苯硫基)-6-苄基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.16).60％；黄色固体，熔点：179-181℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.40(s，1H)，7.42(d，J＝8.1Hz，4H)，7.35-7.18(m，8H)，4.37(s，2H)，2.39(s，3H)，2.34(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：174.7，166.2，154.0，153.6，139.7，139.1，137.8，137.4，136.2，135.4，133.7，133.3，132.6，130.1，129.4，128.5，128.4，126.8，124.5，48.1，21.4，21.2；ES-MS：440.1[M+H+]。
4-(对氯苯硫基)-6-苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.17).98％；黄色固体，熔点：203-205℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.46(s，1H)，7.94-7.90(m，2H)，7.61-7.49(m，7H)，7.44-7.40(m，2H)，7.31(d，J＝2.4Hz，1H)；13C NMR(CDCl3)δ：169.9，166.3，154.6，152.7，139.0，138.3，137.8，137.1，136.3，125.7，135.3，135.2，132.7，132.3，131.0，130.3，129.9，128.9，126.7；ES-MS：466.0[M+H+]。
4-(对氯苯硫基)-6-(对甲基苯基)-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.18).95％；黄色固体，熔点：192-193℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.44(s，1H)，7.81(d，J＝8.1Hz，2H)，7.58-7.47(m，4H)，7.43-7.39(m，2H)，7.33-7.30(m，3H)，2.46(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：169.4，165.9，154.1，152.4，138.1，137.6，137.0，136.8，136.0，135.3，134.9，134.8，132.3，130.7，130.1，129.6，129.5，129.4，126.6，21.6；ES-MS：480.1[M+H+]。
4-(对氯苯硫基)-6-(吡啶-3-基)-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂(2.19).12％；黄色固体，熔点：264-266℃；1H NMR(CDCl3)δ：9.07(s，1H)，8.82(d，J＝3.6Hz，1H)，8.49(s，1H)，8.32(dt，J＝8.1，1.8Hz，1H)，7.61(d，J＝8.4Hz，1H)，7.56(d，J＝2.1Hz，1H)，7.54-7.48(m，3H)，7.45-7.41(m，2H)，7.31(d，J＝2.1Hz，1H)；13C NMR(CDCl3)δ：167.3，166.2，154.7，152.5，152.4，151.0，137.1，136.9，136.7，136.1，135.5，135.2，135.1，134.4，132.9，130.2，129.6，126.1，123.5；ES-MS：467.0[M+H+]。
4-(对氯苯硫基)-6-苄基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂(2.20)30％；黄色固体，熔点：177-179℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.42(s，1H)，7.51-7.25(m，12H)，4.35(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ：173.9，166.0，154.5，153.4，139.3，137.1，136.8，136.3，135.8，135.5，135.0，132.2，129.8，129.6，129.0，128.6，128.2，127.5，126.7，48.4；ES-MS：480.0[M+H+]。
4-(对甲氧基苯硫基)-6-苯基-8-甲氧基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.21).80％；黄色固体，熔点：206-209℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.45(s，1H)，7.99-7.96(m，2H)，7.58-7.48(m，6H)，7.06(dd，J＝8.4，3.0Hz，1H)，7.00-6.95(m，2H)，6.83(d，J＝2.7Hz，1H)，3.85(s，3H)，3.74(s，3H)；13CNMR(CDCl3)δ：170.6，167.2，161.0，159.8，154.4，153.4，139.5，138.2，137.9，137.4，135.2，131.9，130.4，128.7，128.3，118.8，118.4，116.5，115.3，55.9，55.6；ES-MS：458.1[M+H+]。
4-(对甲氧基苯硫基)-6-苄基-8-甲氧基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(2.22).30％；黄色固体，熔点：175-177℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.42(s，1H)，7.47-7.43(m，4H)，7.37-7.24(m，4H)，7.00-6.97(m，2H)，6.96-6.94(m，1H)，6.91(dd，J＝8.9，2.9Hz，1H)，4.36(s，2H)，3.84(s，3H)，3.74(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：174.4，166.7，161.0，160.1，154.3，154.2，139.3，137.6，137.4，136.5，134.9，129.6，128.9，128.0，127.3，118.8，117.6，115.2，113.8，55.8，55.6，48.5；ES-MS：472.1[M+H+]。
6.3.3合成4-(苯亚磺酰)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
8.1的通用程序
将4-(苯硫基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
2.1(0.397g，1.00毫摩尔)溶解在二氯甲烷(10毫升)中，并冰水浴冷却到0-5℃。将间氯过氧苯甲酸(0.206克，1.20毫摩尔)的二氯甲烷(15毫升)溶液在30分钟内逐滴加入。搅拌3小时后，反应混合物用饱和亚硫酸氢钠、饱和碳酸钠、盐水处理，在无水硫酸钠上干燥，真空浓缩并且用石油醚/乙酸乙酯(5∶1，体积/体积)为洗脱剂进行柱层析纯化，得到期望的产物8.1 0.318克(77％)黄色固体。
4-(苯硫基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(8.1)77％；黄色固体，熔点：200-202℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.96(s，1H)，7.92(br d，J＝6.9Hz，2H)，7.69(br s，1H)，7.66-7.47(m，7H)，7.33(br s，3H)，7.06(br s，1H)；13CNMR(CDCl3)δ：166.0，157.8，154.7，142.9，136.4，136.2，133.9，132.6，132.4，131.6，130.3，129.3，128.7，128.6，125.4；ES-MS：414.0[M+H+]。
6.3.4合成4-(正丁氨基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
3.1的通用程序
将4-(苯亚磺酰)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
8.1(0.413克，1.00毫摩尔)溶解在干燥的乙腈(10毫升)中。在室温下加入正丁胺(0.219克，0.30毫升，3.00毫摩尔)。搅拌15分钟后，将反应混合物真空浓缩，以石油醚/乙酸乙酯(8∶1，体积/体积)为洗脱剂进行快速柱层析纯化得到期望的产物3.10.324克(77％)黄色固体。
4-正丁胺基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(3.1)90％；黄色油状物；1H NMR(CDCl3)δ：8.30(s，1H)，7.80-7.77(m，2H)，7.63(dd，J＝7.8，0.9Hz，1H)，7.55-7.44(m，4H)，7.34(td，J＝7.2，0.9Hz，1H)，7.24(dd，J＝7.8，1.4Hz，1H)，5.81(t，J＝5.4Hz，1H)，3.54(q，J＝6.7Hz，2H)，1.74-1.64(m，J＝7.4Hz，2H)，1.53-1.41(m，J＝7.5Hz，2H)，0.99(t，J＝7.4Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：170.9，158.1，155.7，150.1，139.7，138.2，137.4，133.8，132.3，131.5，130.8，129.8，128.7，128.2，127.2，41.3，31.9，20.4，14.1；ES-MS：361.1[M+H+]。C21H20N4S分析值：C，69.97；H，5.59；N，15.54。实测值：C，70.00；H，5.76；N，15.30。
4-(吡咯烷-1-基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(3.2)90％；黄色固体，熔点：231-232℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.17(s，1H)，7.81-7.77(m，2H)，7.63(dd，J＝7.8，1.5Hz，1H)，7.51-7.34(m，5H)，7.29(dd，J＝7.8，1.7Hz，1H)，3.88(br s，2H)，3.63(br s，2H)，2.00(br s，2H)，1.85(br s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ：168.0，156.5，153.8，153.7，139.0，138.8，138.2，133.5，131.6，131.3，129.3，129.1，128.7，128.3，127.7，50.0，29.9；ES-MS：359.1[M+H+]。C21H18N4S分析值：C，70.36；H，5.06；N，15.63。实测值：C，70.36；H，5.15；N，15.82。
4-正丁胺基-6-苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(3.3)88％；黄色固体，熔点：173-175℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.28(s，1H)，7.81-7.77(m，2H)，7.56-7.44(m，4H)，7.30(dd，J＝7.8，1.5Hz，1H)，7.03(d，J＝1.5Hz，1H)，5.76(t，J＝5.6Hz，1H)，3.53(q，J＝6.7Hz，2H)，2.29(s，3H)，1.73-1.64(m，2H)，1.53-1.41(m，2H)，0.99(t，J＝7.4Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：170.6，157.7，155.4，150.4，139.5，138.1，137.0，134.7，133.2，132.9，131.1，130.8，129.5，128.4，126.9，40.9，31.6，21.0，20.1，13.8；ES-MS：375.2[M+H+]。
4-正丁胺基-6-苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
(3.4)90％；黄色固体，熔点：155-157℃；1H NMR(CDCl3)δ：8.30(s，1H)，7.79-7.76(m，2H)，7.57-7.45(m，5H)，7.22(d，J＝2.1Hz，1H)，5.75(t，J＝5.6Hz，1H)，3.55(q，J＝6.7Hz，2H)，1.74-1.64(m，2H)，1.53-1.41(m，2H)，0.99(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：169.3，158.0，156.1，150.0，139.0，138.6，136.6，134.9，134.6，132.3，131.7，130.3，129.6，128.9，127.0，41.2，31.9，20.4，14.1；ES-MS：395.1[M+H+]。
6.4四环嘧啶并苯并二氮
6.4.1通用合成方法和详细表征
四环嘧啶并苯并二氮
按照方案IV(FIG.4)合成。用各种醛和酮研究了关环反应中的适用范围，结果列在表6中。
表6.四环嘧啶并苯并二氮
的制备
表7.四环嘧啶并苯并二氮
的制备
为说明可能的库的多样性，获得了具有另外化学修饰的四环嘧啶并苯并二氮
的其它变体。化合物2(n＝1，2)上的氯原子代表引入其它多样性位点良好机会。我们选择两个化合物(2.2和2.3)作为代表性实例来考查它们对各种亲核试剂和偶联试剂的反应活性。化合物2.2或2.3与胺类在浓盐酸的酸性条件下(对n-BuNH2、苯胺和吗啉)或在Et3N的存在下(对吡咯烷)很容易发生反应以中等或高产率得到预期的氨取代产物(条目1-4，表8)。其它具有杂原子的亲核试剂如醇、硫醇等已知能够与6-氯嘌呤发生取代反应，因此它们反应以n-BuOH、BnSH和PhSH为例。化合物2.2或2.3与正丁醇、苄硫醇和苯硫酚在碱性条件下顺利地反应，高产率地生成相应的正丁氧基、苄硫基或苯硫基取代的嘧啶并苯并二氮
(条目5-10，表8)。引入碳取代基代替氯原子进一步扩大了现有库的范围，在非优化的Suzuki-Miyaura交叉偶联反应条件下(Nyerges等，Tetrahedron.2005，61，8199；Havelková等，Synlett.1999，7，1145)，化合物2.2或2.3与苯基硼酸反应生成芳基取代的产物(条目11-12，表8)，产率良好。
表8.向化合物2中引入最终多样化位点
乙腈用氢化钙处理，在氮气氛下回流3小时后蒸馏；所有其它可购买的试剂使用前未经纯化处理；熔点未经校正。MS和HPLC(ELSD)数据用1100型液质联机(1100LC/MS，安捷伦技术公司)测量。1H和13C NMR数据用300-MHz Varian质谱仪测定，四甲基硅烷(TMS)作内标，以CDCl3或DMSO-d6为溶剂。多重性表示如下：s单峰；d双峰；t三重峰；m多重峰；dd双重双峰；br宽峰。耦合常数(J值)大小以赫兹为单位。
6.4.2前体的合成及性质
苯并二氮
的吲哚衍生物前体参照下述吲哚稠合蝶啶的合成方法制备。
苯并二氮的喹啉衍生物前体按下述方法制备。
1-(6-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-1，2，3，4-四氢喹啉
冰浴下，向4，6-二氯-5-硝基-嘧啶(3.00g，15.5mmol)溶于的无水四氢呋喃(40mL)溶液中滴加1，2，3，4-四氢喹啉10(2.07g，15.5mmol)和三乙胺(3.3mL，23.3mmol)的无水四氢呋喃溶液(20mL)。升至室温后，反应混合物搅拌过夜，然后真空浓缩。残渣溶于CH2Cl2(50mL)，依次用1N盐酸(30mL×3)、盐水(30mL×3)洗涤，无水硫酸镁干燥。真空浓缩后粗品经硅胶柱快速层析纯化(石油醚/乙酸乙酯10∶1)，得目标产物3.46g(77％)，棕黄色固体。mp 130-131℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.06(s，1H)，7.21(d，J＝7.5Hz，1H)，7.14(td，J＝7.2Hz，1.5Hz，1H)，7.07(td，J＝8.1Hz，1.8Hz，1H)，6.91(dd，J＝7.5Hz，0.9Hz，1H)，4.02(t，J＝6.6Hz，2H)，2.79(t，J＝6.6Hz，2H)，2.13-2.04(m，2H)；13C NMR(CDCl3)：δ157.1，154.4，153.2，137.5，132.6，128.8，126.4，126.2，119.3，47.2，26.3，23.8；ES-MS：291.0[M+H]+。
4-氯-6-(3，4-二氯-2H-喹啉-1-基)-嘧啶-5-胺。
将1-(6-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-1，2，3，4-四氢喹啉(3.14g，10.8mmol)溶于40mL乙醇和10mL水的混合物中。加入铁粉(1.82g，32.5mmol)和NH4Cl(0.34g，6.26mmol)，然后搅拌回流1小时，用硅藻土垫过滤。滤液真空浓缩。残渣用EtOAc萃取，有机层再依次用饱和NaHCO3和盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。真空浓缩获得粗品，该粗品在乙醇中重结晶，得到2.23g的1b(83％)，白色固体，mp 115-116℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.26(s，1H)，7.16(d，J＝7.2Hz，1H)，7.07(td，J＝8.1Hz，1.5Hz，1H)，6.94(td，J＝7.5Hz，1.2Hz，1H)，6.39(d，J＝7.8Hz，1H)，3.85(t，J＝6.0Hz，2H)，3.82(s，br，2H)，2.89(t，J＝6.6Hz，2H)，2.13-2.05(m，2H)；13C NMR(CDCl3)：δ150.4，146.9，144.1，138.7，129.5，129.3，127.7，126.3，122.0，117.1，47.5，26.9，23.5；ES-MS：261.0[M+H]+。
6.4.3合成四环苯并二氮
的通用方法
向吲哚啉-1-基氨基嘧啶1a或四氢喹啉基氨基嘧啶(0.5mmol)与醛(0.6mmol)或酮(0.6mmol)在3mL乙腈溶液中，加入3滴TFA。将混合物搅拌回流直至起始材料消失。冷却至室温，真空下去除溶剂得到粗产物。经重结晶或硅胶柱快速层析纯化后得到目标产物。
6.4.4具体合成过程及表征详述
化合物2.1(8-氯-6-乙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：92％，mp 140-142℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.14(s，1H)，7.12-7.10(m，1H)，6.91-6.84(m，2H)，4.88(d，J＝5.4Hz，1H)，4.50-4.41(m，1H)，4.32-4.13(m，2H)，3.22-3.11(m，2H)，1.63-1.53(m，2H)，0.95(t，J＝7.2Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ152.0，149.5，146.3，140.6，133.7，127.7，126.5，125.0，124.3，121.8，62.3，51.1，30.3，26.8，11.3；ES-MS：287.1[M+H+]。
化合物2.2(8-氯-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：90％，mp151-152℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.15(s，1H)，7.11(dd，J＝6.6Hz，0.9Hz，1H)，6.90-6.83(m，2H)，4.84(s，br，1H)，4.50-4.41(m，1H)，4.32-4.22(m，2H)，3.27-3.06(m，2H)，1.63-1.23(m，4H)，0.89(t，J＝6.9Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ152.1，149.5，146.3，140.7，133.7，127.8，126.4，125.1，124.3，121.8，60.3，51.1，39.4，26.9，19.7，13.9；ES-MS：301.1[M+H+]。
化合物2.3(8-氯-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：92％，mp142-144℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.10(s，1H)，7.31-7.21(m，3H)，7.17(dd，J＝7.2Hz，1.2Hz，1H)，7.11-7.08(m，2H)，6.85(t，J＝7.8Hz，1H)，6.74(d，J＝7.5Hz，1H)，5.47(s，1H)，5.11(s，br，1H)，4.43-4.32(m，2H)，3.22(t，J＝8.7Hz，2H)；13C NMR(CDCl3)：δ152.2，149.7，146.9，141.4，141.2，133.3，128.8，127.9，127.4，127.3，125.6，125.4，124.5，121.5，63.7，50.9，26.7；ES-MS：335.1[M+H+]。
化合物2.4(8-氯-6-(邻甲氧基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：97％，mp 201-203℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.01(s，1H)，7.20-7.12(m，2H)，6.92-6.84(m，3H)，6.62(t，J＝7.5Hz，1H)，6.38(dd，J＝7.2Hz，1.5Hz，1H)，5.89(d，J＝3.6Hz，1H)，5.63(s，br，1H)，4.46-4.31(m，2H)，3.96(s，3H)，3.28-3.20(m，2H)；13C NMR(CDCl3)：δ156.8，152.3，149.7，147.2，142.6，133.4，129.5，129.4，127.9，127.6，126.0，124.7，124.5，122.0，120.3，110.4，59.0，55.4，51.2，27.0；ES-MS：365.2[M+H+]。
化合物2.5(8-氯-6-(对硝基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：96％，mp195-196℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.11(d，J＝8.7Hz，2H)，8.10(s，1H)，7.25-7.22(m，3H)，6.91(t，J＝7.5Hz，1H)，6.81(d，J＝7.8Hz，1H)，5.62(d，J＝2.7Hz，1H)，5.22(s，br，1H)，4.48-4.27(m，2H)，3.28-3.21(m，2H)；13C NMR(CDCl3)；δ152.2，150.2，148.5，147.4，147.3，141.3，133.7，128.3，127.2，125.1，124.4，124.0，123.7，121.9，62.9，50.9，26.6；ES-MS：380.0[M+H+]。
化合物2.6(8-氯-6-(对氟苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：90％，mp147-148℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.12(s，1H)，7.19(d，J＝7.2Hz，1H)，7.08-7.04(m，2H)，6.99-6.94(m，2H)，6.87(t，J＝7.2Hz，1H)，6.75(d，J＝7.5Hz，1H)，5.47(s，1H)，5.12(s，br，1H)，4.46-4.28(m，2H)，3.23(t，J＝8.1Hz，2H)；ES-MS：353.1[M+H+]。
化合物2.7(8-氯-6-苯乙烯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：81％，mp162-163℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.16(s，1H)，7.25-7.21(m，5H)，7.16(d，J＝7.2Hz，1H)，6.99(d，J＝7.5Hz，1H)，6.90(t，J＝7.5Hz，1H)，6.33-6.18(m，2H)，5.06(t，J＝4.8Hz，1H)，4.96(d，J＝4.2Hz，1H)，4.43-4.30(m，2H)，3.22-3.16(m，2H)；13C NMR(CDCl3)：δ152.0，149.8，147.1，140.8，135.9，133.5，133.1，129.6，128.5，128.0，126.8，126.6，125.3，125.0，124.5，121.7，61.8，50.9，26.7；ES-MS：361.1[M+H+]。
化合物2.8(8-氯-6-丙烯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：83％，mp132-135℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.18(s，1H)，7.13(dd，J＝7.2Hz，1.2Hz，1H)，6.93(dd，J＝7.8Hz，1.2Hz，1H)，6.88(t，J＝6.9Hz，1H)，5.56-5.37(m，2H)，4.83(d，J＝6.3Hz，1H)，4.62(s，br，1H)，4.44-4.25(m，2H)，3.21-3.14(m，2H)，1.62(dd，J＝6.0Hz，1.5Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ151.9，149.4，146.4，140.5，133.2，131.2，129.5，126.4，125.5，124.1，123.9，121.5，61.5，50.7，26.5，17.6；ES-MS：299.1[M+H+]。
化合物2.9(8-氯-6，6-二甲基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：95％，mp117-118℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.18(s，1H)，7.13-7.10(m，2H)，6.89(t，J＝7.2Hz，1H)，4.36(t，J＝8.7Hz，2H)，3.17(t，J＝8.7Hz，2H)，1.57(s，6H)；13C NMR(CDCl3)：δ152.3，149.7，146.7，140.3，133.5，131.7，125.0，124.0，123.1，121.5，56.8，50.7，30.4，26.6；ES-MS：287.1[M+H+]。
化合物2.10(8-氯-6-乙基-6-甲基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：92％，86-88℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.16(s，1H)，7.11(d，J＝7.2Hz，1H)，7.04(d，J＝7.8Hz，1H)，6.88(t，J＝7.5Hz，1H)，4.48-4.22(m，3H)，3.19-3.12(m，2H)，1.85-1.75(m，1H)，1.67-1.55(m，1H)，1.60(s，3H)，0.86(t，J＝7.8Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ152.0，149.4，146.1，140.4，133.6，130.7，124.9，124.0，123.9，121.3，59.8，50.7，34.5，27.1，26.6，8.1；ES-MS：301.1[M+H+]。
化合物2.11(8-氯-6-甲基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：84％，mp 99-101℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.17(s，1H)，7.11(dd，J＝7.2Hz，1.2Hz，1H)，7.04(d，J＝8.1Hz，1H)，6.88(t，J＝7.5Hz，1H)，4.48-4.23(m，3H)，3.20-3.09(m，2H)，1.78-1.48(m，2H)，1.61(s，3H)，1.41-1.18(m，2H)，0.82(t，J＝7.2Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ152.1，149.5，146.2，140.4，133.7，130.8，124.9，124.0，123.9，121.3，59.7，50.7，44.4，27.7，26.6，17.0，14.2；ES-MS：315.1[M+H+]。
化合物2.12(8-氯-6-环亚己基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：92％，mp 182-183℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.12(s，1H)，7.10(t，J＝8.1Hz，2H)，6.88(d，J＝7.8Hz，1H)，4.59(s，br，1H)，4.34(td，J＝8.4Hz，1.8Hz，2H)，3.12(t，J＝9.0Hz，2H)，2.00-1.76(m，5H)，1.69-1.49(m，4H)，1.33-1.25(m，1H)；13C NMR(CDCl3)：δ152.3，149.1，145.5，140.9，133.6，133.3，124.5，124.0，121.9，121.7，58.2，50.7，34.9，26.6，25.1，20.8；ES-MS：327.1[M+H+]。
化合物2.13(8-氯-6-甲基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：87％，mp 188-189℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.06(s，1H)，7.30-7.20(m，3H)，7.17-7.14(m，3H)，6.88-6.80(m，2H)，4.76(s，br，1H)，4.45-4.36(m，1H)，4.23-4.14(m，1H)，3.21-3.14(m，1H)，1.90(s，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ152.0，149.6，146.5，145.8，141.1，133.4，130.8，128.6，127.6，126.5，125.9，125.5，124.3，121.3，63.6，50.7，30.6，26.7；ES-MS：349.1[M+H+]。
化合物2.14(8-氯-6-甲基-6-(对甲氧基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：62％，mp 168-169℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.07(s，1H)，7.14(d，J＝6.6Hz，1H)，7.07(d，J＝9.0Hz，2H)，6.86-6.77(m，4H)，4.71(s，1H)，4.41-4.34(m，1H)，4.25-4.15(m，1H)，3.76(s，3H)，3.16(t，J＝8.7Hz，2H)，1.86(s，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ158.8，152.1，149.6，146.3，141.0，138.0，133.4，131.1，127.8，125.9，125.5，124.2，121.2，113.8，63.1，55.1，50.7，30.5，26.7；ES-MS：379.1[M+H+]。
化合物2.15(8-氯-6-甲基-6-(对硝基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：82％，mp 182-183℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.10(d，J＝8.7Hz，2H)，8.05(s，1H)，7.28-7.21(m，3H)，6.95-6.89(m，2H)，4.80(s，1H)，4.48-4.39(m，1H)，4.18-4.07(m，1H)，3.23-3.14(m，1H)，1.98(s，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ153.2，151.7，149.9，147.1，146.5，141.1，133.9，129.1，127.5，125.3，125.0，124.8，123.8，121.7，63.5，50.7，30.9，26.6；ES-MS：394.2[M+H+]。
化合物2.16(8-氯-6-乙基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：57％，mp 145-147℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.06(s，1H)，7.31-7.21(m，3H)，7.16-7.14(m，3H)，6.83(t，J＝7.5Hz，1H)，6.72(d，J＝8.1Hz，1H)，4.86(s，br，1H)，4.37-4.17(m，2H)，3.15(t，J＝8.7Hz，2H)，2.32-2.12(m，2H)，1.02(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ151.4，149.1，145.7，144.5，141.2，133.7，129.3，128.5，127.5，127.1，126.6，125.5，124.2，120.9，66.9，50.7，34.3，26.5，8.5；ES-MS：363.2[M+H+]。
化合物2.17(8-氯-6-乙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环-6-羧酸)：59％，mp 273℃(dec)。1H NMR(DMSO-d6)：δ8.14(s，1H)，7.24-7.21(m，2H)，6.91(t，J＝7.2Hz，1H)，5.03(s，1H)，4.38-4.29(m，1H)，4.21-4.11(m，1H)，3.21-3.09(m，2H)，1.88(s，3H)；ES-MS：317.2[M+H+]。
化合物2.18(9-氯-7-乙基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘)：97％，无色浆状物。1H NMR(CDCl3)：δ7.97(s，1H)，7.09(dd，J＝6.9Hz，1.2Hz，1H)，7.01-6.94(m，2H)，4.50(s，br，1H)，4.46-4.39(m，1H)，4.15-4.09(m，1H)，3.85-3.77(m，1H)，2.89(t，J＝6.9Hz，2H)，2.13-1.99(m，4H)，1.05(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ150.4，145.8，142.6，141.9，135.3，133.0，131.4，129.5，128.3，123.5，59.2，46.1，26.7，26.2，21.4，11.5；ES-MS：301.1[M+H+]。
化合物2.19(9-氯-7-丙基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘)：95％，mp108-110℃。1H NMR(CDCl3)：δ7.97(s，1H)，7.09(dd，J＝6.9Hz，2.1Hz，1H)，7.01-6.94(m，2H)，4.55(t，J＝8.1Hz，1H)，4.12-4.06(m，1H)，3.88-3.80(m，1H)，2.89(t，J＝7.5Hz，2H)，2.13-1.95(m，4H)，1.52-1.35(m，2H)，0.99(t，J＝7.2Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ150.5，145.8，142.5，141.9，135.4，131.4，129.5，128.4，123.5，123.4；ES-MS：315.1[M+H+]。
化合物2.20(9-氯-7-苯基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘)：96％，mp 140-142℃。1H NMR(CDCl3)：δ7.96(s，1H)，7.39-7.26(m，5H)，7.13(d，J＝7.2Hz，1H)，6.97(t，J＝7.2Hz，1H)，6.76(d，J＝7.5Hz，1H)，5.81(s，1H)，3.90-3.82(m，1H)，3.66-3.59(m，1H)，2.89(t，J＝7.2Hz，2H)，2.11-2.02(m，2H)；13C NMR(CDCl3)：δ150.7，146.3，142.9，142.2，140.3，135.3，133.1，131.8，130.0，128.7，128.3，127.6，126.3，125.3，123.5，60.6，45.8，26.5，21.4；ES-MS：349.2[M+H+]。
化合物2.21(9-氯-7-(对甲基苯基)-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘)：91％，无色浆状物。1H NMR(CDCl3)：δ7.95(s，1H)，7.15(m，5H)，7.11(dd，J＝7.8Hz，1.2Hz，1H)，6.94(t，J＝7.8Hz，1H)，6.72(d，J＝7.2Hz，1H)，5.80(s，1H)，3.80-3.74(m，2H)，2.88(t，J＝7.5Hz，2H)，2.35(s，3H)，2.08-2.04(m，2H)；13C NMR(CDCl3)：δ150.7，146.3，142.9，142.3，137.3，137.2，135.5，131.7，129.9，129.3，128.4，126.4，125.2，123.5，60.3，45.8，26.5，21.4，21.0；ES-MS：363.2[M+H+]。
化合物2.22(9-氯-7-(对硝基苯基)-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘)：85％，mp 245-247℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.16(d，J＝8.7Hz，2H)，7.96(s，1H)，7.34(d，J＝8.7Hz，2H)，7.20(d，J＝7.2Hz，1H)，7.07(t，J＝7.2Hz，1H)，7.00(d，J＝6.3Hz，1H)，5.56(d，J＝5.7Hz，1H)，5.19(d，J＝5.7Hz，1H)，4.26-4.19(m，1H)，2.90-2.79(m，3H)，2.13-1.92(m，2H)；13C NMR(CDCl3)：δ150.5，148.6，147.1，146.6，143.5，141.9，134.1，132.3，130.7，127.0，126.6，125.8，123.9，123.7，60.7，45.5，26.3，21.0；ES-MS：394.1[M+H+]。
化合物2.23(9-氯-7-苯乙烯基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘)：40％，mp 114-116℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.00(s，1H)，7.40-7.23(m，5H)，7.13(dd，J＝7.2Hz，1.2Hz，1H)，7.05(d，J＝7.2Hz，1H)，7.00(t，J＝7.2Hz，1H)，6.63(d，J＝2.7Hz，2H)，5.34(t，J＝2.7Hz，1H)，4.13-4.05(m，1H)，3.88-3.80(m，1H)，2.91(t，J＝6.9Hz，2H)，2.15-2.05(m，2H)；13C NMR(CDCl3)：δ150.6，146.2，136.2，134.8，132.4，131.6，129.9，128.6，128.1，128.0，127.9，126.5，124.1，123.7，59.3，46.1，26.6，21.4；ES-MS：375.1[M+H+]。
化合物2.24(9-氯-7，7-二甲基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘)：37％，mp 130-132℃。1H NMR(CDCl3)：δ7.98(s，1H)，7.14(d，J＝7.8Hz，1H)，7.10(d，J＝7.5Hz，1H)，6.97(t，J＝7.5Hz，1H)，4.31(s，br，1H)，3.99-3.96(m，2H)，2.90(t，J＝7.2Hz，2H)，2.18-2.10(m，2H)，1.79(s，6H)；13C NMR(CDCl3)：δ149.7，145.9，141.6，138.1，132.0，129.8，127.4，123.3，121.1，55.6，46.1，29.4，26.7，21.6；ES-MS：301.1[M+H+]。
6.4.5用n-BuNH2、苯胺和吗啉置换化合物2.2或2.3的氯基的通用方法，化合物3a、3b和3c的制备
向化合物2.2或2.3(0.3mmol)和过量胺(3.0mmol)的正丁醇溶液中(3.0mL)，加入2-3滴浓盐酸。反应混和物在氮气氛下搅拌回流直至结束(TLC监测)。所得混合物冷却至室温后，真空浓缩至干，残余物用硅胶柱快速层析纯化得到目标产物。
化合物3a(N-正丁基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环-8-胺)：74％，棕色固体，mp 105-107℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.09(s，1H)，7.20-7.15(m，3H)，7.12(t，J＝4.2Hz，1H)，7.08-7.05(m，2H)，7.76(d，J＝4.2Hz，2H)，5.85(t，J＝2.4Hz，1H)，5.51(s，1H)，4.35-4.29(m，2H)，3.30-3.13(m，4H)，1.48-1.40(m，2H)，1.37-1.23(m，2H)，0.93(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ161.4，157.2，154.7，154.6，142.4，141.2，133.1，128.5，128.2，128.0，127.4，127.3，124.0，120.3，65.1，49.6，40.4，32.0，27.1，20.0，13.8。
化合物3b(N-苯基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环-8-胺)：60％，浅黄色固体，mp 149-151℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.40(s，1H)，8.32(s，1H)，7.68(dd，J＝7.5Hz，2H)，7.35(t，J＝7.5Hz，2H)，7.09(d，J＝7.5Hz，1H)，7.03(t，J＝7.5Hz，1H)，6.89(d，J＝6.9Hz，1H)，6.82(t，J＝7.5Hz，1H)，4.42-4.33(m，1H)，4.30-4.27(m，2H)，3.17-3.12(m，2H)，2.69(s，br，1H)，1.62-1.56(m，2H)，1.45-1.38(m，2H)，0.88(t，J＝6.9Hz，3H)。
化合物3c(8-(吗啉-1-基)-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：90％，白色固体，mp 158-162℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.22(s，1H)，7.35-7.25(m，3H)，7.17(d，J＝7.2Hz，2H)，7.11(d，J＝7.2Hz，1H)，6.74(t，J＝7.5Hz，1H)，6.58(d，J＝7.5Hz，1H)，5.28(s，1H)，4.93(s，br，1H)，4.46-4.30(m，2H)，3.75-3.65(m，4H)，3.19(t，J＝8.7Hz，2H)，3.00-2.93(m，2H)，2.87-2.80(m，2H)；13C NMR(CDCl3)：δ157.2，151.7，150.0，149.9，141.8，132.9，128.8，127.8，127.5，127.1，125.8，124.1，121.2，120.5，66.8，64.1，64.0，50.3，49.6，26.8。
化合物3d(8-(吡咯烷-1-基)-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：向化合物2.2(90mg，0.3mmol)和吡咯烷(213mg，3.0mmol)的n-BuOH溶液中(3.0mL)，加入Et3N(1mL)。反应混合物在氮气氛下回流、搅拌3天。冷却至室温后，真空去除溶剂，残余物用硅胶快速层析纯化(petroleum/EtOAc 5∶1，v/v)，得到目标产物93.5mg，为浅黄色固体。产率93％，mp 116-118℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.21(s，1H)，7.06(dd，J＝7.5Hz，1.5Hz，1H)，6.85(d，J＝7.5Hz，1H)，6.78(t，J＝7.5Hz，1H)，4.43-4.22(m，2H)，4.17(t，J＝6.9Hz，1H)，3.81-3.73(m，2H)，3.64-3.53(m，2H)，3.19-3.08(m，2H)，1.99-1.84(m，4H)，1.41-1.19(m，4H)，0.86(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ155.8，150.8，150.7，141.5，133.1，129.7，125.9，123.5，120.0，112.0，60.5，50.6，50.3，37.6，26.8，25.3，19.3，14.0。
6.4.6用n-BuOH或PhCH2SH置换化合物2.2或2.3的氯基的通用方法，化合物4a、4b、5a、5b的制备
向化合物2.2或2.3(0.3mmol)的四氢呋喃溶液(2mL)中加入n-BuOH(222mg，0.27mL，3mmol)或PhCH2SH(74.4mg，0.07mL，0.6mmol)，然后再加入氢化钠(48mg，1.2mmol)。在搅拌下加热混合物至70℃，通过TLC监测反应直至结束。向反应物中加入冷水淬灭反应，然后用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤后，无水硫酸镁干燥。真空浓缩，粗残渣用硅胶快速层析纯化得到目标产物。
化合物4a(8-丁氧基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：94％，黄色浆状物。1H NMR(CDCl3)：δ8.10(s，1H)，7.05(d，J＝7.5Hz，1H)，6.86(d，J＝7.5Hz，1H)，6.77(t，J＝7.5Hz，1H)，4.63(s，1H)，4.45-4.38(m，3H)，4.37-4.13(m，2H)，3.21-3.05(m，2H)，1.82-1.73(m，2H)，1.57-1.43(m，6H)，1.39-1.22(m，2H)，0.96(t，J＝7.5Hz，3H)，0.88(t，J＝7.2Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ158.9，150.3，148.4，148.3，141.2，132.9，127.4，126.3，123.5，120.1，113.1，66.4，60.1，50.0，39.3，31.1，26.7，19.3，19.1，13.7，13.6。
化合物4b(8-丁氧基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：94％，黄色固体，89-91℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.03(s，1H)，7.26-7.19(m，3H)，7.13-7.06(m，3H)，6.79-6.71(m，2H)，5.40(s，1H)，4.88(s，br，1H)，4.38-4.31(m，2H)，4.29-4.23(m，2H)，3.19(t，J＝8.1Hz，2H)，1.70-1.65(m，2H)，1.42-1.34(m，2H)，0.93(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ159.1，150.9，149.0，148.9，142.5，142.1，132.7，128.4，127.6，127.4，127.3，124.9，124.0，120.1，114.2，66.4，64.1，50.1，30.9，26.8，19.0，13.7。
化合物5a(8-苄硫基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：94％，黄色浆状物。1H NMR(CDCl3)：δ8.33(s，1H)，7.38-7.34(m，2H)，7.31-7.19(m，3H)，7.04(dt，J＝6.6Hz，0.9Hz，1H)，6.84-6.76(m，2H)，4.54(d，J＝13.2Hz，1H)，4.44(d，J＝13.5Hz，1H)，4.43-4.37(m，1H)，430-4.10(m，3H)，3.19-3.07(m，2H)，1.52-1.15(m，4H)，0.80(t，J＝7.2Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ153.1，150.7，150.0，149.9，140.8，137.7，133.1，128.9，128.4，127.9，127.1，126.0，124.8，123.7，120.7，60.1，50.3，38.7，35.4，26.6，19.6，13.7。
化合物5b(8-苄硫基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：96％，黄色固体，mp 113-115℃。1H NMR(CDCl3)：δ8.27(s，1H)，7.30-7.19(m，8H)，7.14-7.07(m，3H)，6.78(t，J＝7.5Hz，1H)，6.67(d，J＝7.2Hz，1H)，5.36(s，1H)，4.51(s，br，1H)，4.41-4.31(m，4H)，3.20(t，J＝9.0Hz，2H)；13C NMR(CDCl3)：δ154.2，151.2，150.6，150.4，141.9，141.5，137.6，133.0，128.9，128.5，127.7，127.3，127.2，125.9，125.7，124.2，120.9，109.7，64.0，50.4，35.3，26.8。
6.4.7用苯硫酚置换化合物2.2或2.3的氯基的通用方法，化合物5c和5d的制备
向化合物2.2或2.3(0.3mmol)和苯硫酚(330mg，3.0mmol)的n-BuOH溶液(3.0mL)中加入三乙胺(1mL)。反应混合物在氮气氛下搅拌、回流直至反应结束。冷却至室温后，真空蒸除溶剂，残渣用硅胶快速层析纯化(petroleum/EtOAc 5∶1，v/v)，得到目标产物。
化合物5c(8-苯硫基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：95％，黄色浆状物。1H NMR(CDCl3)：δ8.27(s，1H)，7.43-7.38(m，2H)，7.36-7.28(m，3H)，7.09(d，J＝7.2Hz，1H)，6.88-6.81(m，2H)，5.03(s，br，1H)，4.49-4.41(m，1H)，4.33-4.22(m，2H)，3.23-3.07(m，2H)，1.61-1.51(m，2H)，1.49-1.26(m，2H)，0.87(t，J＝6.9Hz，3H)。
化合物5d(8-苯硫基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：94％，黄色浆状物。1H NMR(CDCl3)：δ8.22(s，1H)，7.26-7.05(m，11H)，6.80(t，J＝7.5Hz，1H)，6.71(d，J＝7.5Hz，1H)，5.41(s，1H)，5.31(s，br，1H)，4.41-4.28(m，2H)，3.19(t，J＝8.1Hz，2H)。
6.4.8用PhB(OH)2置换化合物2.2和2.3的氯基的通用方法，化合物6a和6b的制备
在氮气氛下，将化合物3.2或3.3(0.33mmol)与苯基硼酸(61mg，0.5mmol)溶于DME(4mL)中。加入碳酸钾(138mg，1.0mmol)的4mL水溶液，然后再加入醋酸钯(II)(0.9mg，0.004mmol)和三苯基膦(4.2mg，0.016mmol)。反应混和物搅拌、回流6小时。冷却后，用硅藻土垫过滤，固体用乙酸乙酯洗涤。分离有机相，水相用乙酸乙酯萃取(5mL×3)。合并有机萃取液，依次用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。真空浓缩，用硅胶快速层析春花得到目标产物。
化合物6a(8-苯基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：53％，黄色浆状物。1H NMR(CDCl3)：δ8.46(s，1H)，7.55-7.42(m，5H)，7.09(t，J＝4.5Hz，1H)，6.80(d，J＝4.2Hz，2H)，4.81(d，J＝5.4Hz，1H)，4.54-4.45(m，1H)，4.38-4.28(m，1H)，4.05-3.99(m，1H)，3.24-3.12(m，2H)，1.46(q，J＝7.8Hz，2H)，1.12-0.86(m，2H)，0.74(t，J＝7.2Hz，3H)；13C NMR(CDCl3)：δ152.0，151.6，150.0，149.9，141.0，136.7，133.3，128.9，128.5，127.3，125.9，125.8，123.9，120.9，59.8，50.8，38.2，26.6，19.2，13.5。
化合物6b(8-苯基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环)：53％，黄色浆状物。1H NMR(CDCl3)：δ8.43(s，1H)，7.39-7.35(m，3H)，7.27-7.19(m，5H)，7.14(d，J＝7.2Hz，1H)，6.97-6.94(m，2H)，6.78(t，J＝7.5Hz，1H)，6.65(d，J＝7.8Hz，1H)，5.29(d，J＝3.9Hz，1H)，4.78(d，J＝3.9Hz，1H)，4.45(t，J＝8.7Hz，2H)，3.24(t，J＝8.7Hz，2H)；13C NMR(CDCl3)：δ153.4，153.1，151.0，150.9，141.7，141.4，136.5，133.1，128.8，128.5，127.8，127.2，126.6，125.7，124.2，121.0，64.6，50.8，26.8。
6.5吲哚稠合蝶啶类化合物构成的杂环分子构架
6.5.1合成通用方法和表征详述
吲哚稠合蝶啶的合成路线参照方案V(图5)。用各种醛和酮对该反应的范围进行了研究，实验结果列在表9中。
表9.5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶的合成
化合物3中的吲哚部分为进一步衍生化的提供了另外的多样性位点。为了阐明这种多样性，用1-(6-氯-5-硝基嘧啶-4-基)吲哚-3-羧酸乙酯制备了3-乙氧羰基吲哚基嘧啶(化合物7，表10)，并进行了一系列的环化反应(表10)。
表10.7-乙氧羰基取代的4-氯-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶的合成
通过设计在第4位加入了氯原子提供了引入其它取代基的变化位点。为此，我们选择合成两个化合物来说明4-位氯原子对亲核试剂的反应活性。
6.5.24-氯-6-(2，3-二氢-吲哚-1-基)-嘧啶-5-胺1的制备和表征
将5-氨基-4，6-二氯-嘧啶(16.3g，0.1mmol)加入70mL乙醇、250mL水、4mL浓盐酸和吲哚啉(11.9g，0.1mmol)的溶液中，然后搅拌回流9.5小时，冷却至室温过夜。过滤出无色结晶，用乙醇洗涤得到目标产物1(16g)，使用时不需进一步纯化。从滤液中回收3g未反应的起始材料5。化合物1：79％，mp 135-137℃。ES-MS：247.1[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.21(s，1H)，7.25(d，J＝7.2，1H)，7.14(t，J＝7.5H，1H)，6.91(t，J＝7.5，1H)，6.57(t，J＝7.5，1H)，4.16(t，J＝8.1，2H)，3.96(s，br.，2H)，3.15(t，J＝8.1，2H)。13C NMR(CDCl3)δ：149.6，146.8，144.3，143.9，132.6，129.0，127.1，125.4，121.5，112.5，52.8，28.7。
6.5.34-氯-6-(吲哚-1-基)-嘧啶-5-胺2的制备和表征
将反应方案V中的化合物1(6.73g，27.4mmol)和2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ，7.45g，32.8mmol)的混合物在150mL苯中回流搅拌2小时。混合物然后冷却至室温，过滤，固体用苯洗涤。合并后的滤液依次用饱和碳酸氢钠、盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。真空浓缩、用乙醇重结晶后得到目标产物4.52g。母液浓缩后经柱层析纯化又得一部分2(0.41g)，总收率74％。mp 149-151℃。ES-MS：245.1[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.39(s，1H)，7.69(dd，J＝6.9，1.2，1H)，7.52(d，J＝3.3，1H)，7.46(dd，J＝7.2，1.2，1H)，7.30(td，J＝6.9，1.5，1H)，7.24(td，J＝7.2，1.2，1H)，6.78(dd，J＝3.6，0.9，1H)，4.27(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ：146.6，144.1，140.3，134.6，131.5，129.5，126.1，123.3，121.7，121.4，112.2，106.5。
6.5.4环化反应制备化合物3的通用方法及表征
向4-氯-6-吲哚-1-基-嘧啶-5-基胺(0.5mmol)与醛(0.6mmol)或酮(0.6mmol)在3mL干燥的乙腈的溶液中，加入3滴TFA。氮气氛下搅拌回流溶液，TLC监测直至起始材料2消失。冷却至室温后，真空蒸除溶剂，粗产物通过重结晶或快速柱层析纯化。
化合物3.1(4-氯-6-乙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：93％，mp139-140℃，ES-MS：285.1[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.80(d，J＝8.1，1H)，8.32(s，1H)，7.57(d，J＝7.5，1H)，7.35(td，J＝7.2，1.5，1H)，7.26(td，J＝7.2，1.2，1H)，6.46(s，1H)，4.72(t，J＝5.7，1H)，4.50(s，br，1H)，2.02-1.86(m，2H)，1.09(t，J＝7.2，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：146.6，144.9，141.2，134.6，130.0，125.4，123.9，123.0，120.5，116.1，103.0，51.8，29.3，9.4。
化合物3.2(6-丁基-4-氯-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：94％，mp 83-85℃。ES-MS：299.1[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.80(d，J＝8.4，1H)，8.32(s，1H)，7.57(d，J＝6.9，1H)，7.37-7.32(m，1H)，7.29-7.23(m，1H)，6.46(s，1H)，4.76(t，J＝6.0，1H)，4.50(s，br，1H)，1.94-1.84(m，2H)，1.59-1.47(m，2H)，1.01(t，J＝7.5，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：146.6，144.9，141.3，134.9，134.6，130.0，125.3，123.9，123.0，120.5，116.0，102.9，50.4，38.4，18.5，13.8。
化合物3.3(4-氯-6-苯基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：91％，mp176-177℃。ES-MS：333.1[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.81(d，J＝8.4，1H)，8.36(s，1H)，7.51-7.42(m，6H)，7.35(t，J＝7.5，1H)，7.22(t，J＝7.5，1H)，6.03(s，1H)，5.74(s，1H)，4.70(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ：147.0，145.1，141.5，139.3，135.3，134.8，129.8，129.0，128.9，127.8，125.8，124.2，123.1，120.7，116.0，105.2，55.3。
化合物3.4(4-氯-6-(4′-甲基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：96％，mp 155-157℃。ES-MS：347.1[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.82(d，J代表7.8，1H)，8.37(s，1H)，7.47(d，J＝7.5，1H)，7.40-7.33(m，3H)，7.27-7.23(m，3H)，6.05(s，1H)，5.74(s，1H)，4.67(s，1H)，2.41(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：147.0，145.2，141.5，139.0，136.3，135.6，134.9，130.0，129.7，127.8，125.9，124.2，123.1，120.7，116.0，105.2，55.1，21.2。
化合物3.5(4-氯-6-(4′-硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：83％，mp 202-204℃。ES-MS：378.1[M+H+]；1H NMR(DMSO-d6)δ：8.73(d，J＝8.4，1H)，8.33(s，1H)，8.24(d，J＝8.7，2H)，7.68(d，J＝8.7，1H)，7.61(d，J＝7.8，1H)，7.37-7.31(m，2H)，7.24(t，J＝7.2，1H)，6.52(d，J＝0.6，1H)，6.25(s，1H)。
化合物3.6(4-氯-6-(3′，4′-二氯苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：82％，mp 225-227℃。ES-MS：401.0[M+1+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.82(d，J＝8.7，1H)，8.41(s，1H)，7.63(d，J＝2.1，1H)，7.52(t，J＝8.1，2H)，7.41-7.34(m，2H)，7.26(t，J＝7.5，2H)，6.07(s，1H)，5.75(s，1H)，4.68(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ：147.8，145.4，142.3，139.7，135.2，134.4，133.7，133.6，131.4，130.2，129.9，127.5，125.6，124.9，123.6，121.1，116.4，105.9，54.8。
化合物3.7(4-氯-6-(邻甲氧基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：93％，mp 148-150℃。ES-MS：363.1[M+1+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.85(d，J＝8.1，1H)，8.32(s，1H)，7.57(d，J＝7.5，1H)，7.38(td，J＝7.2，1.5，1H)，7.32-7.25(m，2H)，6.96(d，J＝8.1，1H)，6.88-6.79(m，2H)，6.41(s，1H)，6.27(s，1H)，5.22(s，br，1H)，3.96(s，3H)；13CNMR(CDCl3)δ：156.7，147.0，142.1，135.0，133.6，130.2，130.0，129.2，127.9，126.0，124.3，123.3，121.2，121.0，116.4，110.9，110.0，105.0，55.8，49.7。
化合物3.8(4-氯-6-(邻氯苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：98％，mp142-144℃。ES-MS：367.0[M+1+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.85(dd，J＝8.4，0.9，1H)，8.37(s，1H)，7.55-7.65(m，2H)，7.41-7.22(m，6H)，6.37(t，J＝1.2，1H)，6.31(s，1H)，4.95(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ：147.1，145.0，141.9，137.7，134.7，132.9，132.8，129.9，129.8，128.8，127.7，125.2，124.3，123.2，120.8，116.1，105.2，51.5。
化合物3.9(4-氯-6-(邻硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：72％，mp 154-156℃。ES-MS：378.1[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.90(dd，J＝8.1，0.9，1H)，8.39(s，1H)，8.07-8.04(m，1H)，7.59-7.25(m，5H)，7.15-7.12(m，1H)，6.49(s，1H)，6.41(d，J＝0.6，1H)，5.44(s，br，1H)。
化合物3.10(4-氯-6-(间硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：87％，mp 214-216℃。ES-MS：378.0[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.83(d，J＝8.4，1H)，8.43(s，1H)，8.42(s，1H)，8.33-8.29(m，1H)，7.86(d，J＝8.1，1H)，7.66(t，J＝8.1，1H)，7.49(d，J＝7.8，1H)，7.39(td，J＝8.4，1.2，1H)，7.26(td，J＝8.4，0.9，1H)，6.03(s，1H)，5.92(s，1H)，4.77(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ：148.6，147.7，142.1，141.5，134.9，134.0，133.8，130.2，129.6，125.2，124.7，124.1，123.4，123.1，120.9，116.1，109.7，105.8，54.8。
化合物3.11(4-氯-6-甲基-6-乙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：93％，mp 135-136℃。ES-MS：299.1[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.82(d，J＝8.1，1H)，8.32(s，1H)，7.59(dd，J＝7.2，2.1，1H)，7.35(td，J＝7.2，1.5，1H)，7.26(td，J＝7.5，1.2，1H)，6.45(s，1H)，4.26(s，br，1H)，1.92-1.76(m，2H)，1.67(s，3H)，0.94(t，J＝7.2，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：146.5，144.9，141.3，139.0，134.6，129.9，125.1，123.9，122.9，120.5，116.1，102.1，55.0，35.7，27.2，8.5。
化合物3.12(4-氯-6-甲基-6-丙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：90％，mp 110-112℃。ES-MS：313.1[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.83(d，J＝8.1，1H)，8.33(s，1H)，7.58(dd，J＝7.2，0.6，1H)，7.35(td，J＝7.5，1.5，1H)，7.26(td，J＝7.8，1.2，1H)，6.45(s，1H)，4.25(s，br，1H)，1.85-1.68(m，2H)，1.70(s，3H)，1.46-1.32(m，2H)，0.88(t，J＝7.2，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：146.5，144.9，141.2，139.2，134.6，129.9，125.1，123.9，123.0，120.5，116.1，102.1，54.8，45.5，27.8，17.5，14.1。
化合物3.13(4-氯-6-环亚己基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：89％，mp153-154℃。ES-MS：325.2[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.79(dd，J＝8.1，1.2，1H)，8.34(s，1H)，7.58(d，J＝7.8，1H)，7.34(td，J＝7.2，1.5，1H)，7.26(td，J＝7.5，1.2，1H)，6.49(s，1H)，4.85(s，1H)，2.01-1.36(m，10H)；13C NMR(CDCl3)δ：146.9，145.5，142.1，141.1，134.6，130.0，124.6，123.9，123.0，120.6，116.0，101.2，53.2，36.5，24.8，21.3。
化合物3.14(4-氯-6-甲基-6-苯基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：64％，mp 149-151℃。ES-MS：347.1[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.78(d，J＝8.1，1H)，8.33(s，1H)，7.58(dd，J＝7.2，0.6，1H)，7.39-7.21(m，7H)，6.55(s，1H)，4.91(s，br，1H)，2.04(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：147.2，145.8，144.1，142.0，138.7，134.8，129.6，128.7，127.8，125.2，124.2，123.1，120.8，115.9，109.6，103.6，57.5，29.4。
化合物3.15(4-氯-6-甲基-6-(对甲基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：70％，mp 134-136℃。ES-MS：361.1[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.78(d，J＝8.1，1H)，8.33(s，1H)，7.61(d，J＝7.5，1H)，7.36(t，J＝7.2，1H)，7.28(t，J＝7.5，1H)，7.20(d，J＝7.2，2H)，7.09(d，J＝7.8，2H)，6.54(s，1H)，4.88(s，br，1H)，2.29(s，3H)，2.02(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：147.2，145.8，142.1，141.2，139.0，137.7，134.8，129.7，129.4，125.2，124.2，123.1，120.8，116.0，103.5，57.4，29.5，20.9。
化合物3.16(4-氯-6-甲基-6-(对硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)47％，mp 201-202℃。ES-MS：392.1[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.79(d，J＝7.5，1H)，8.37(s，1H)，8.14(d，J＝8.4，2H)，7.65(d，J＝7.5，1H)，7.49(d，J＝8.4，2H)，7.40(t，J＝7.2，1H)，7.32(t，J＝7.2，1H)，6.64(s，1H)，4.96(s，br，1H)，2.10(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：151.3，147.9，147.3，145.8，142.5，137.1，134.9，129.4，126.5，124.7，124.4，124.0，123.4，121.0，116.1，104.0，57.5，29.0。
6.5.51-(5-氨基-6-氯-嘧啶-4-基)-1H-吲哚-3-羧酸乙酯的制备及表征
将SnCl2·2H2O(326mg，1.45mmol)加入至1-(6-氯-5-硝基嘧啶-4-基)-吲哚-3-羧酸乙酯(100mg，0.29mmol)的乙醇溶液(5mL)中。混合物搅拌回流2小时。冷却至室温后，溶液用饱和碳酸氢钠处理至PH8，用EtOAc萃取(3×15mL)。合并有机相，用盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，真空浓缩。用硅胶快速层析纯化(petroleum/EtOAc，5∶1，v/v)得到1-(5-氨基-6-氯嘧啶-4-基)-1H-吲哚-3-羧酸乙酯(80mg，88％)。mp 166-168℃。ES-MS：317.1[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.44(t，1H)，8.31-8.20(m，1H)，8.18(s，1H)，7.43-7.26(m，3H)，4.44-4.33(m，4H)，1.43(t，J＝7.2，1H)；13C NMR(CDCl3)δ：164.5，147.5，146.7，142.8，135.3，132.7，132.6，127.1，124.5，123.6，122.4，112.5，112.0，60.4，14.7。
6.5.6吲哚取代的蝶啶的制备及表征
化合物8参照与化合物3类似的方法通过化合物7与醛或酮反应合成：
化合物8.1(4-氯-7-乙氧羰基-6-苯基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：86％，mp 210-213℃。ES-MS：405.3[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.95(d，J＝7.8，1H)，8.39(s，1H)，8.11(d，J＝6.9，1H)，7.45-7.40(m，2H)，7.26-7.16(m，5H)，6.77(d，J＝1.8，1H)，4.99(s，1H)，4.42-4.32(m，2H)，1.40(t，J＝7.2，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：164.5，146.9，144.8，142.9，141.4，140.0，134.7，129.4，128.6，127.9，126.2，125.8，125.4，124.7，122.3，116.6，108.0，60.7，53.3，14.6。
化合物8.2(4-氯-7-乙氧羰基-6-(对甲基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：82％，mp 179-181℃。ES-MS：419.2[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.93(dd，J＝5.4，1.8，1H)，8.38(s，1H)，8.214-8.182(m，1H)，7.46-7.36(m，2H)，7.05-7.01(m，4H)，6.72(d，J＝2.1，1H)，4.95(s，1H)，4.42-4.34(m，2H)，2.26(s，1H)，1.40(t，J＝7.2，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：164.5，146.8，144.8，142.9，140.3，138.6，138.5，134.7，130.0，127.9，126.1，125.9，125.3，124.7，122.2，116.5，107.8，60.7，53.1，21.3，14.6。
化合物8.3(4-氯-7-乙氧羰基-6-(对氟苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：58％，mp 204-206℃。ES-MS：423.1[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.95(dd，J＝5.7，1.5，1H)，8.41(s，1H)，8.214-8.184(m，1H)，7.48-7.38(m，2H)，7.19-7.13(m，2H)，6.98-7.13(m，2H)，6.76(d，J＝2.4，1H)，4.97(d，J＝2.1，1H)，4.44-4.34(m，2H)，2.26(s，1H)，1.42(t，J＝7.2，3H)。
化合物8.4(4-氯-7-乙氧羰基-6-丙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：82％，mp 168-170℃。ES-MS：371.2[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.86(d，J＝6.3，1H)，8.36(s，1H)，8.19(d，J＝7.2，1H)，7.40-7.35(m，2H)，5.58(s，br，1H)，4.71(s，1H)，4.45(q，J＝7.5，2H)，1.76-1.74(m，2H)，1.51-1.42(m，5H)，0.96(t，J＝7.2，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：164.4，146.3，144.5，142.4，134.2，127.5，125.7，124.7，124.2，121.7，116.1，109.7，106.3，60.3，50.0，38.5，18.6，14.4，13.5。
化合物8.5(4-氯-6-环亚己基-7-乙氧羰基-6-丙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶)：53％，mp 187-189℃。ES-MS：397.2[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.93(d，J＝7.2，1H)，8.36(s，1H)，8.02(d，J＝7.2，1.5，1H)，7.43-7.32(m，2H)，5.08(s，1H)，4.49(q，J＝6.9，2H)，2.74-2.65(m，2H)，1.89-1.81(m，6H)，1.59-1.49(m，2H)，1.51(t，J＝6.9，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：165.1，146.3，144.6，144.4，142.0，133.4，128.2，124.8，124.7，123.9，121.3，116.4，108.3，61.0，56.0，33.6，24.1，21.1，14.4。
6.5.7制备氨基取代的蝶啶9的通用方法及表征
将化合物3(0.154mmol)、n-BuNH2(1.232mmol)和Et3N(0.231mmol)混合物在n-BuOH(2.0mL)中搅拌下回流，TLC监测下直至化合物3消失。真空浓缩，用快速层析纯化(petroleum/EtOAc，5∶1，v/v)，得到目标产物9。
化合物9.1(N-丁基-6-环亚己基-吲哚并[2，1-h]蝶啶基-4-胺)：88％，mp 137-138℃；ES-MS：362.3[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：8.77(d，J＝8.4，1H)，8.40(s，1H)，7.56(d，J＝6.6，1H)，7.29(t，J＝6.9，1H)，7.19(t，J＝7.2，1H)，6.36(s，1H)，5.42(s，br，1H)，3.53(q，J＝6.6，2H)，2.16(s，br，1H)，1.84-0.73(m，17H)；13C NMR(CDCl3)δ：153.0，148.4，143.1，134.7，129.7，123.0，121.7，120.2，115.5，109.7，106.9，98.6，52.0，40.7，35.2，32.0，29.6，25.7，21.3，20.1，13.8。
化合物9.2(N-丁基-6-(对甲苯基)-吲哚并[2，1-h]蝶啶基-4-胺)：91％，mp 139-140℃；ES-MS：382.2[M+H+]；1H NMR(CDCl3)δ：9.34(d，J＝8.4，1H)，8.60(s，1H)，7.92(d，J＝7.8，2H)，7.86(d，J＝7.5，1H)，7.55(t，J＝7.5，1H)，7.46(t，J＝6.9，1H)，7.39(d，J＝7.2，2H)，7.28(s，1H)，6.79(s，br，1H)，3.65(q，J＝6.3，2H)，2.49(s，1H)，1.75-1.67(m，2H)，1.52-1.45(m，2H)，0.99(t，J＝6.9，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：158.9，155.9，153.0，144.3，140.3，135.1，132.6，130.3，129.2，129.0，128.5，124.3，123.7，121.4，118.1，113.0，102.9，40.7，31.8，21.5，20.2，13.9。
熟悉本领域的人将会通过常规实验方法认识到或者能够确定本发明所述具体实施方案的等同方案。这些等同方案也被包含在权利有求中。
在本说明书中提到的所有出版物、专利或专利申请通过引用被纳入本说明书中，就如其中的每一个都被具体指出通过引用纳入本说明书中一样。
本发明引用的参考文献不应当被认为是构成本发明的现有技术。
Claims (44)
1.由多种不同化合物构成的库，其中所述化合物选自下组化合物：
其中，
X代表O、S或NR；
Y1、Y2、Y3和Y4代表H，烷基或杂原子；
R、R1、R2代表烷基、芳基或杂环；
其中，
X代表O、S或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3和Y4代表H、烷基或杂原子；
R、R1、R2、R4、R5和R6代表烷基、芳基或杂环；
其中，
X代表O、S或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3和Y4代表H、烷基或杂原子；
R、R1、R2、R4、R5和R6代表烷基、芳基或杂环；
其中，
X代表O、S或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3和Y4代表H、烷基或杂原子；
R、R1、R2、R4、R5和R6代表烷基、芳基或杂环；
其中，
X代表O、S或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3和Y4代表H、烷基或杂原子；
R、R1、R2、R4、R5和R6代表烷基、芳基或杂环；
其中：
R7代表H、CH3或F；
R8代表4′-F-C6H4、4′-CH3-C6H4或4′-NO2-C6H4；和
其中：
NHR9R10为n-Bu-NH2或吡咯烷。
2.根据权利要求1的库，其中所述多种化合物选自下组化合物：4-氯-11-甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-6，11-二甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-11-甲基-6-(4′-氟苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-11-甲基-6-(4′-甲基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-(4′-硝基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-6，8，11-三甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-8，11-二甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-氟苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-甲基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-硝基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-11-甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-6，11-二甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4′-氟苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4′-甲苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4′-硝基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-羟基-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-(丁基胺基)-8-氟-11-甲基-6-(4′-甲基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；和4-(吡咯-1-基)-8-氟-11-甲基6-(4′-甲基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
3.化合物，其选自下组化合物：
其中，
X代表O、S或NR；
Y1、Y2、Y3和Y4代表H、烷基或杂原子；
R、R1、R2代表烷基、芳基或杂环；
其中，
X代表O、S或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3和Y4代表H、烷基或杂原子；
R、R1、R2、R4、R5和R6代表烷基、芳基或杂环；
其中，
X代表O、S或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3和Y4代表H、烷基或杂原子；
R、R1、R2、R4、R5和R6代表烷基、芳基或杂环；
其中，
X代表O、S或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3和Y4代表H、烷基或杂原子；
R、R1、R2、R4、R5和R6代表烷基、芳基或杂环；
其中，
X代表O、S或NR；
Nu代表R4S、R4O或NR5R6；
Y1、Y2、Y3和Y4代表H、烷基或杂原子；
R、R1、R2、R4、R5和R6代表烷基、芳基或杂环；
其中：
R7代表H、CH3或F；
R8代表4′-F-C6H4、4′-CH3-C6H4或4′-NO2-C6H4；
其中：
NHR9R10为n-Bu-NH2或吡咯烷。
4.根据权利要求3的化合物，其选自下组化合物：4-氯-11-甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-6，11-二甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-(4′-氟苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-(4′-甲基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-11-甲基-6-(4′-硝基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-6，8，11-三甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-8，11-二甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-氟苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-甲基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-硝基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-11-甲基-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-8-氟-6，11-二甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4′-氟苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4′-甲基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
4-氯-8-氟-11-甲基-6-(4′-硝基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-羟基-11-甲基-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-(丁基胺基)-8-氟-11-甲基-6-(4′-甲基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；和4-(吡咯烷-1-基)-8-氟-11-甲基-6-(4′-甲基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
5.制备权利要求3的化合物的方法，包括6-氯-4，5-二氨基嘧啶与酸或酸衍生物反应形成4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
6.根据权利要求5的方法，还包括对所述4-氯-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮进行亲核取代反应，生成4-取代的嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
7.根据权利要求6的方法，还包括在氢化反应条件下对所述4-取代的嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮进行氢化，或使4-取代的嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
与有机金属试剂反应。
8.根据权利要求7的方法，还包括在所述4-取代的嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
环仲胺的5位形成酰胺、烷基化或形成磺酰胺。
9.从权利要求1的库中筛选候选激酶抑制剂的方法，包括：
(a)在适合激酶活性的条件下，将权利要求1库中的一个或多个化合物与激酶和激酶底物接触；
(b)确定非磷酸化底物与磷酸化底物的第一比值，得到激酶活性的第一测定值；和
(c)将所述第一比值与激酶活性的第二测定值比较，其中所述激酶活性的第二测定值由不存在所述化合物的情况下所得的非磷酸化底物与磷酸化底物的第二比值确定；
其中，在步骤(b)中激酶活性的抑制表明所述化合物中存在候选的激酶抑制剂。
10.根据权利要求9的方法，其中所述蛋白激酶为FLT3、KIT、PDGFR-B、RET、SRC、FLT1(VEGFR1)、FLT4(VEGFR3)、KDR(VEGFR2)或RAF-1。
11.由多种不同化合物构成的库，其中所述化合物选自下组化合物：
其中：
R1代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环或卤素；
R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
12.根据权利要求11的库，其中所述多种化合物选自下组化合物：4-氯-11-甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-11-甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-(4′-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-(4′-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-(4′-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-9，11-二甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-9，11-二甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-9，11-二甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-9，11-二甲基-6-(4′-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-9，11-二甲基-6-(4′-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-9，11-二甲基-6-(4′-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；和4-氯-8氟-11-甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
13.化合物，其选自下组化合物：
其中：
R1代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环或卤素；
R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
14.根据权利要求13的化合物，其中所述化合物选自下组化合物：4-氯-11-甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-11-甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-11-甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-11-甲基-6-(4′-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-11-甲基-6-(4′-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-11-甲基-6-(4′-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-8，11-二甲基-6-(4′-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-9，11-二甲基-6-丙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-9，11-二甲基-6-乙基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-9，11-二甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-9，11-二甲基-6-(4′-甲基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-9，11-二甲基-6-(4′-氟-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
；4-氯-9，11-二甲基-6-(4′-硝基-苯基)-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮；和4-氯-8氟-11-甲基-6-苯基-5，6-二氢-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
15.制备权利要求13的化合物的方法，包括用6-氯-4，5-二氨基嘧啶与酸或酸衍生物反应形成4-氯-二氢嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
16.根据权利要求15的方法，还包括对上述的4-氯-二氢嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并二氮
进行亲核取代反应。
17.从权利要求11的库中筛选候选激酶抑制剂的方法，包括：
(a)在适合激酶活性的条件下，将权利要求11所述库中的一个或多个化合物与激酶和激酶底物反应；
(b)确定非磷酸化底物与磷酸化底物的第一比值，得到激酶活性的第一测定值；和
(c)将所述第一比值与激酶活性的第二测定值比较，其中所述激酶活性的第二测定值由不存在所述化合物的情况下所得的非磷酸化底物与磷酸化底物的第二比值确定；
其中，步骤(b)中激酶活性被抑制表明所述化合物中存在候选激酶抑制剂。
18.权利要求17的方法，其中所述激酶为FLT3、KIT、PDGFR-B、RET、SRC、FLT1(VEGFR1)、FLT4(VEGFR3)、KDR(VEGFR2)或RAF-1。
19.由多种不同化合物构成的库，其中所述化合物选自下组化合物：
其中：
R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环、卤素或烷氧基；和
R3代表H、烷基、取代的烷基、芳基、杂环、取代的杂环、杂芳基或取代的芳基；
其中：
R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环、烷氧基或卤素；
其中：
R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环或卤素；
R4、R5代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环，或R4和R5一起形成环烷基。
20.根据权利要求19的库，其中两种或多种化合物选自下组：4-(苯硫基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-(吡啶-3-基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-对甲苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(苯硫基)-6-(邻硝基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(苯硫基)-6-(对硝基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-(对硝基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-(间氟苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-苄基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲苯硫基)-6-苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲苯硫基)-6-(吡啶-3-基)-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(对甲苯硫基)-6-对甲苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲苯硫基)-6-(对氟苯基)-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(对甲苯硫基)-6-丙基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂4-(对甲苯硫基)-6-苄基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对氯-苯硫基)-6-苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对氯-苯硫基)-6-对甲苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(对氯-苯硫基)-6-(吡啶-3-基)-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对氯-苯硫基)-6-苄基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲氧基苯硫基)-6-苯基-8-甲氧基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(对甲氧基苯硫基)-6-苄基-8-甲氧基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(苯基亚磺酰基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲苯基亚磺酰基)-6-苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对氯苯基亚磺酰基)-6-苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(正丁胺基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(吡咯烷-1-基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(正丁胺基)-6-苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；和4-(正丁胺基)-6-苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
21.化合物，其选自下组化合物：
其中：
R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环、卤素或烷氧基。
R3代表H、烷基、取代的烷基、芳基、杂环、取代的杂环、杂芳基或取代的芳基；
其中：
R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环、烷氧基或卤素；
其中：
R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环或卤素；
R4、R5代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环，或R4和R5一起形成环烷基。
22.根据权利要求21的库，其中所述化合物选自下组化合物：4-(苯硫基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(苯硫基)-6-(吡啶-3-基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(苯硫基)-6-对甲苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(苯硫基)-6-(邻硝基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-(间硝基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-(对硝基苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-(间氟苯基)-嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(苯硫基)-6-丙基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(苯硫基)-6-苄基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(对甲苯硫基)-6-苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲苯硫基)-6-(吡啶-3-基)-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(对甲苯硫基)-6-对甲苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲苯硫基)-6-(对氟苯基)-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲苯硫基)-6-丙基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲苯硫基)-6-苄基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对氯-苯硫基)-6-苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对氯-苯硫基)-6-对甲苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(对氯-苯硫基)-6-(吡啶-3-基)-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对氯-苯硫基)-6-苄基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(对甲氧基苯硫基)-6-苯基-8-甲氧基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲氧基苯硫基)-6-苄基-8-甲氧基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂；4-(苯基亚磺酰基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对甲苯基亚磺酰基)-6-苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(对氯苯基亚磺酰基)-6-苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(正丁胺基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
4-(吡咯烷-1-基)-6-苯基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；4-(正丁胺基)-6-苯基-8-甲基嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
；和4-(正丁胺基)-6-苯基-8-氯嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
23.制备权利要求21的化合物的方法，包括用5-氨基-4，6-二苯硫基嘧啶与酸或酸衍生物反应形成嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
24.根据权利要求23的方法，还包括对所述嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂
的苯硫基进行氧化得到相应的砜或亚砜。
25.根据权利要求24的方法，还包括用胺对所述嘧啶并[4，5-b][1，4]苯并硫氮杂进行亲核取代反应。
26.从权利要求19的库中筛选候选激酶抑制剂的方法，包括：
(a)在适合激酶活性的条件下，将权利要求19化合物库的一种或多种化合物与激酶和激酶底物接触；
(b)确定非磷酸化底物与磷酸化底物的第一比值，得到激酶活性的第一测定值；和
(c)将所述第一比值与激酶活性的第二测定值比较，其中所述激酶活性的第二测定值由不存在所述化合物的情况下所得的非磷酸化底物与磷酸化底物的第二比值确定；
其中，步骤(b)中激酶活性被抑制表明所述化合物中存在候选激酶抑制剂。
27.权利要求26的方法，其中所述蛋白酶为FLT3、KIT、PDGFR-B、RET、SRC、FLT1(VEGFR1)、FLT4(VEGFR3)、KDR(VEGFR2)或RAF-1。
28.多种不同化合物构成的库，其中所述化合物选自下组化合物：
其中：
X代表Cl、R3R4N、R3O、R3S或芳基；
R1、R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、羧基，或R1与R2一起形成环烷基；
R3、R4代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
29.根据权利要求28的库，其中所述多种化合物选自下组化合物：8-氯-6-乙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-(邻甲氧基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-(对硝基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-(对氟苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-苯乙烯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-烯丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6，6-二甲基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-乙基-6-甲基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-甲基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-环亚己基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-甲基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-甲基-6-(对甲氧基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-甲基-6-(对硝基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-乙基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-乙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环-6-羧酸；9-氯-7-乙基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘；9-氯-7-丙基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘；9-氯-7-苯基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘；9-氯-7-(对甲基苯基)-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘；9-氯-7-(对硝基苯基)-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘；9-氯-7-苯乙烯基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘；9-氯-7，7-二甲基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘；N-正丁基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环-8-胺；N-苯基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环-8-胺；8-(吗啉-1-基)-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-(吡咯烷-1-基)-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-丁氧基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-丁氧基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苄硫基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苄硫基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苯硫基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苯硫基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苯基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；和8-苯基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环。
30.具有下列结构的化合物：
其中：
X代表Cl、R3R4N、R3O、R3S或芳基；
R1、R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、羧基，或R1与R2一起形成环烷基；
R3、R4代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。
31.根据权利要求30的化合物，其中所述化合物选自下组化合物：8-氯-6-乙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-(邻甲氧基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-(对硝基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-(对氟苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-苯乙烯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-丙烯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6，6-二甲基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-乙基-6-甲基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-甲基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-环亚己基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-甲基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-甲基-6-(对甲氧基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-甲基-6-(对硝基苯基)-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-乙基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-氯-6-乙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环-6-羧酸；9-氯-7-乙基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘；9-氯-7-丙基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘；9-氯-7-苯基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘；9-氯-7-(对甲基苯基)-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘；9-氯-7-(对硝基苯基)-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘；9-氯-7-苯乙烯基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘；9-氯-7，7-二甲基-2，3，7，8-四氢-1H-8，10，12，12b-四氮杂苯并[4，5]环庚三烯并[1，2，3-de]萘；N-正丁基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环-8-胺；N-苯基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环-8-胺；8-(吗啉-1-基)-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-(吡咯烷-1-基)-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-丁氧基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-丁氧基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苄硫基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苄硫基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苯硫基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苯硫基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苯基-6-丙基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环；8-苯基-6-苯基-1，2，6，7-四氢-7，9，11，11b-四氮杂二苯并[c，d，h]甘菊环。
32.制备权利要求30的单个化合物的方法，包括将吲哚-1-基嘧啶或四氢喹啉-1-基嘧啶与醛或酮反应生成四环嘧啶并苯并二氮
33.权利要求32的方法，还包括对所述四环嘧啶并苯并二氮进行亲核取代反应。
34.从权利要求28的库中筛选候选激酶抑制剂的方法，包括：
(a)在适合激酶活性的条件下，将权利要求28化合物库的一种或多种化合物与激酶和激酶底物接触；
(b)确定非磷酸化底物与磷酸化底物的第一比值得到激酶活性的第一测定值；和
(c)将第一比值与激酶活性的第二测定值比较，其中所述第二测定值由不存在所述化合物的情况下所得的非磷酸化底物与磷酸化底物的第二比值确定；
其中，激酶活性被抑制表明所述化合物中存在候选激酶抑制剂。
35.权利要求34所述的方法，其中所述蛋白酶为FLT3、KIT、PDGFR-B、RET、SRC、FLT1(VEGFR1)、FLT4(VEGFR3)、KDR(VEGFR2)或RAF-1。
36.由多种不同化合物构成的库，其中所述化合物选自下组化合物：
其中：
R1、R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环，或R1与R2一起形成环烷基；
R3代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或取代的杂环；
X代表Cl或NHR；
R代表烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基。
37.权利要求36化合物库，其中所述多种化合物选自下组化合物：4-氯-6-乙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；6-丁基-4-氯-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-苯基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(4′-甲基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(4′-硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(3′，4′-二氯苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(邻甲氧基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(邻氯苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(邻硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(间硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-乙基-6-甲基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-甲基-6-丙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-环亚己基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-甲基-6-苯基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-甲基-6-(对甲基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-甲基-6-(对硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-7-乙氧羰基-6-苯基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-7-乙氧羰基-6-(对甲基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-7-乙氧羰基-6-(对氟苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-7-乙氧羰基-6-丙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-环亚己基-7-乙氧羰基-6-丙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；N-丁基-6-环亚己基-吲哚并[2，1-h]蝶啶-4-胺；和N-丁基-6-(对甲苯基)-吲哚并[2，1-h]蝶啶-4-胺。
38.具有下列结构的化合物：
其中：
R1、R2代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、取代的杂环，或者R1与R2一起形成环烷基；
R3代表H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环或取代的杂环；
X代表Cl或NHR；和
R代表烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基。
39.权利要求38的化合物，其中所述化合物选自下组化合物：4-氯-6-乙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；6-丁基-4-氯-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-苯基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(4′-甲基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(4′-硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(3′，4′-二氯苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(邻甲氧基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(邻氯苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(邻硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-(间硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-乙基-6-甲基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-甲基-6-丙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-环亚己基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-甲基-6-苯基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-甲基-6-(对甲基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-甲基-6-(对硝基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-7-乙氧羰基-6-苯基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-7-乙氧羰基-6-(对甲基苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-7-乙氧羰基-6-(对氟苯基)-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-7-乙氧羰基-6-丙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；4-氯-6-环亚己基-7-乙氧羰基-6-丙基-5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶；N-丁基-6-环亚己基-吲哚并[2，1-h]蝶啶-4-胺；和N-丁基-6-(对甲苯基)-吲哚并[2，1-h]蝶啶-4-胺。
40.制备权利要求38的化合物的方法，包括使5-氨基-4-氯-6-(1-吲哚基)嘧啶与醛或酮反应生成5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶。
41.权利要求40的制备方法，还包括对所述5，6-二氢吲哚并[2，1-h]蝶啶进行亲核取代反应。
42.从权利要求36的库中筛选候选激酶抑制剂的方法，包括：
(a)在适合激酶活性的条件下，将权利要求36化合物库的一种或多种化合物与激酶和激酶底物作用；
(b)确定非磷酸化底物与磷酸化底物的第一比值，以确定激酶的活性第一测定值；和
(c)将第一比值与激酶活性的第二测定值比较，其中所述激酶的第二测定值由不存在所述化合物的情况下所得的非磷酸化底物与磷酸化底物的第二比值确定；
其中，激酶活性被抑制表明所述化合物中存在候选激酶抑制剂。
43.权利要求42的方法，其中所述蛋白酶为FLT3、KIT、PDGFR-B、RET、SRC、FLT1(VEGFR1)、FLT4(VEGFR3)、KDR(VEGFR2)或RAF-1。
44.筛选具有治疗活性的候选化合物库的方法，包括：
(a)在本发明化合物库中的一种或多种化合物存在下进行生物测定；和
(b)通过上述生物测定的测量确定活性；
其中相对不存在所述化合物情况下的活性改变说明存在一个或多个治疗活性的化合物。
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