CN101250573B - 诱导马铃薯晚疫病菌产生致病性分泌蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导马铃薯晚疫病菌产生致病性分泌蛋白的方法。其方法是将马铃薯晚疫病病样置于普通水琼脂培养基进行保湿培养，待叶片上长出灰白色霉层，用接种针挑取少量菌丝接种到普通固体培养基，16～18℃暗培养；形成较大的菌落后，将菌丝块转接到100mL致病性分泌蛋白液体诱导培养基中，于18℃，150rpm振荡培养14～16天后，用双层灭菌滤纸滤去菌丝体，滤液经4000rpm离心10min，上清液加入硫酸铵(697g/L)，10000rpm离心20min，沉淀经透析处理，冻干后获得马铃薯晚疫病菌致病性分泌蛋白提取物，-20℃保存。此方法可以诱导马铃薯晚疫病菌大量产生致病性分泌蛋白，填补了国内外马铃薯晚疫病菌致病机理研究中不能获得致病性分泌蛋白的空白，具有重大意义。

Description

诱导马铃薯晚疫病菌产生致病性分泌蛋白的方法
技术领域
本发明涉及植物保护技术领域，具体地说是一种诱导马铃薯晚疫病菌致病性分泌蛋白的方法。
背景技术
由Phytophthora infestan引起的马铃薯晚疫病是马铃薯生产中最严重的真菌性病害，世界各地的马铃薯产区均有发生，每年可造成数十亿美元的损失，因此受到世界各国马铃薯育种学家、植物病理学家、遗传学家的广泛关注。马铃薯晚疫病菌同时还是经典遗传学和分子遗传学的良好实验材料，该病害系统是真菌-植物互作研究的模式系统，近年来的研究获得了许多与侵染相关的形态分化和致病因子的遗传资源与信息，为马铃薯晚疫病菌基因组学研究打下了良好基础。
通过致病相关基因的功能研究，可深入了解马铃薯晚疫病菌的致病机制、并以此为途径寻找马铃薯中与该病原菌致病基因相对应的抗性基因，研究寄主-病原物互作机制和抗病机制，预测晚疫病菌群体中致病基因分布、多样性栽培条件下致病基因的表达和变化、诱导过敏反应的功能域与致病功能域的关系，预测马铃薯中相应抗病基因的抗性持久性。通过鉴定致病基因控制的致病相关因子，可以寻找杀菌剂的作用靶点，最终为有效控制马铃薯晚疫病提出新的策略。但是多年研究结果表明，目前还没有能够诱导马铃薯晚疫病菌产生致病性分泌蛋白的方法，从而无法确定其致病相关因子，限制了对其致病机理的深入研究。
发明内容
本发明的目的是克服马铃薯晚疫病菌在固体培养条件下无法产生致病性分泌蛋白的不足，提供一种能够诱导马铃薯晚疫病菌产生致病性分泌蛋白的方法。
本发明的诱导马铃薯晚疫病菌产生致病性分泌蛋白的方法是按以下步骤进行：
(1)将马铃薯晚疫病病样置于普通水琼脂培养基，16～18℃黑暗保湿培养2～3天；普通水琼脂培养基由以下部分组成：琼脂粉10g/L、H2O 1L；
(2)待病样叶片上长出灰白色霉层，用接种针挑取少量菌丝接种到普通固体培养基，16～18℃暗培养8～10天，形成较大菌落；普通固体培养基由以下部分组成：黑麦浸出液450ml、番茄汁150ml、琼脂粉10g/L、CaCO3 1.2g/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平10mg/L、制霉菌素10mg/L、H2O 1L；
(3)用手术刀切取5块约0.5cm2长满菌丝的琼脂块，转接到100mL致病性分泌蛋白液体诱导培养基中，18℃，150rpm振荡培养14～16天；致病性分泌蛋白液体诱导培养基由以下部分组成：黑麦浸出液450ml、CaCO3 1.2g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、天门冬酰胺1g/L、VB1 1mg/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平10mg/L、制霉菌素10mg/L、H2O 1L；
(4)用双层灭菌滤纸滤去菌丝体，滤液经4000rpm离心10min，上清液加入100％硫酸铵(697g/L)，10000rpm离心20min，沉淀经透析处理，冻干后获得马铃薯晚疫病菌致病性分泌蛋白提取物，-20℃保存；
(5)将得到的蛋白提取物用100μl除离子水溶解后，在成株期马铃薯叶片上进行接种实验，验证所提取蛋白的致病性。
本发明的有益效果是解决了马铃薯晚疫病菌在人工培养条件下不产生致病性相关蛋白的问题，通过对液体培养基配方调整，加入少量无机盐及氨基酸，从而诱导马铃薯晚疫病菌大量产生致病性分泌蛋白。通过对这些分泌蛋白的分离和提纯，可以深入研究晚疫病菌与马铃薯之间在蛋白质水平上的相互作用，最终揭示二者在基因水平上的相互识别、信号传导等机理，对于马铃薯晚疫病致病机理的研究具有重要意义。
具体实施方式
具体实施方式是将分离得到的马铃薯晚疫病菌在普通固体培养基上培养，然后转入致病性分泌蛋白液体诱导培养基中培养，最后提取马铃薯晚疫病菌分泌蛋白，蛋白提取物在马铃薯叶片上接种，调查坏死斑。
实施例1：
将马铃薯晚疫病病样置于普通水琼脂培养基，16～18℃黑暗保湿培养2～3天；普通水琼脂培养基由以下部分组成：琼脂粉10g/L、H2O 1L；
将分离获得的马铃薯晚疫病菌弱致病性菌株A1接种到由黑麦浸出液450ml、番茄汁150ml、琼脂粉10g/L、CaCO3 1.2g/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平10mg/L、制霉菌素10mg/L、H2O 1L组成的普通固体培养基上，16～18℃暗培养8～10天；形成较大菌落后，用接种针挑取5块约0.5cm2的菌丝块转接到100mL由黑麦浸出液450ml、CaCO3 1.2g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、天门冬酰胺1g/L、VB1 1mg/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平10mg/L、制霉菌素10mg/L、H2O 1L组成的致病性分泌蛋白液体诱导培养基中，18℃，150rpm振荡培养14～16天；用双层灭菌滤纸滤去菌丝体，滤液经4000rpm离心10min，上清液在0℃加入100％硫酸铵(697g/L)，10000rpm离心20min，沉淀经透析处理，透析带截流范围为1KD，冻干后获得马铃薯晚疫病菌致病性分泌蛋白提取物，-20℃保存。
实施例2：
将分离获得的马铃薯晚疫病菌强致病性菌株A2、A3接种到由黑麦浸出液450ml、番茄汁150ml、琼脂粉10g/L、CaCO3 1.2g/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平10mg/L、制霉菌素10mg/L、H2O 1L组成的普通固体培养基上，16～18℃暗培养8～10天；形成较大菌落后，用接种针挑取5块约0.5cm2的菌丝块转接到100mL由黑麦浸出液450ml、CaCO3 1.2g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、天门冬酰胺1g/L、VB1 1mg/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平10mg/L、制霉菌素10mg/L、H2O 1L组成的致病性分泌蛋白液体诱导培养基中，18℃，150rpm振荡培养14～16天。用双层灭菌滤纸滤去菌丝体，滤液经4000rpm离心10min，上清液加入100％硫酸铵(697g/L)，10000rpm离心20min，沉淀经透析处理，透析带截流范围为1KD，冻干后获得马铃薯晚疫病菌致病性分泌蛋白提取物，-20℃保存。
将上述实施例1、实施例2所提取、保存的分泌蛋白接种到广泛种植的抗性标准品种合作88上，接种5天后调查坏死斑大小，结果表明坏死病斑由内至外，依次形成灰白斑、水渍圈和褐斑圈的感病症状，而且菌株致病性越强，诱导蛋白致病性也越强。坏死斑大小见下表：
  马铃薯晚疫病菌株   坏死斑大小(毫米)
  A1   3.24±0.11～3.89±0.19
  A2、A3   5.12±0.25～5.98±0.31
上述结果表明，通过本方法诱导不同致病性的马铃薯晚疫病菌株产生的分泌蛋白，对广泛种植的马铃薯抗性标准品种合作88均有致病作用，这对马铃薯晚疫病致病性分泌蛋白的研究具有重要作用。

Claims (1)

1.诱导马铃薯晚疫病菌产生致病性分泌蛋白的方法，其步骤为：
(1)将马铃薯晚疫病病样置于普通水琼脂培养基，16～18℃黑暗保湿培养2～3天；普通水琼脂培养基由以下部分组成：琼脂粉10g/L、H2O 1L；
(2)叶片上长出灰白色霉层，用接种针挑取少量菌丝接种到普通固体培养基，16～18℃暗培养8～10天，形成较大菌落；普通固体培养基由以下部分组成：黑麦浸出液450ml、番茄汁150ml、琼脂粉10g/L、CaCO3 1.2g/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平10mg/L、制霉菌素10mg/L、H2O 1L；
(3)用接种针挑取5块约0.5cm2的菌丝块转接到100mL致病性分泌蛋白液体诱导培养基中，18℃，150rpm振荡培养14～16天；致病性分泌蛋白液体诱导培养基由以下部分组成：黑麦浸出液450ml、CaCO3 1.2g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、天门冬酰胺1g/L、VB1 1mg/L、阿莫西林100mg/L、五氯硝基苯30mg/L、利福平10mg/L、制霉菌素10mg/L、H2O 1L；
(4)用双层灭菌滤纸滤去菌丝体，滤液经4000rpm离心10min，上清液加入硫酸铵697g/L，10000rpm离心20min，沉淀经透析处理，透析带截流范围为1KD，冻干后获得马铃薯晚疫病菌致病性分泌蛋白提取物，-20℃保存。
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