CN101243185B - 使用毛细管膜生产重组产物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了在通气条件下生产至少一种重组产物的方法。该方法包括：提供具有第一侧和第二侧并且具有与其第一侧附着的微生物的生物膜的多孔基质，该基质的构造允许营养物溶液从其中通过并且防止微生物细胞从其中通过。该方法进一步包括使营养物溶液在通气条件下以从其第二侧到达其第一侧的方向流过基质和生物膜，速率足够低以便建立通过生物膜的具有浓度差的营养物梯度，并且诱导微生物产生重组产物。

Description

使用毛细管膜生产重组产物

发明领域

本发明涉及重组产物的生产方法。特别地，本发明涉及在需氧条件下生产重组产物的方法，并且涉及用于在需氧条件下生产这类重组产物的设备。

发明背景

重组产物，包括，但不限于由多种微生物表达系统产生的酶、激素、抗体、抗体片段、病毒类颗粒、肽类、DNA和RNA片段。产物还可以包括因重组合成酶表达产生的化学产物。

用于药物和其它工业的重组产物的市场近年来已经增加。商品包括在重组宿主中表达的重组产物和由重组生物合成酶产生的化学品。

这类重组产物的有效生产一般依赖于使用有效的表达宿主和好的生物加工技术。表达宿主包括：许多细菌种类，其中大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)为最突出的；以及真菌；原生动物；植物；昆虫和哺乳动物的细胞。产物中的某些为胞内的，但优选使产物分泌入培养基以易于纯化。大部分表达系统为需氧的，从而需要输入能量以便增加浸没培养生物反应器中的氧传递。大部分生物加工技术着眼于一般通过补料分批培养方式在生物反应器中获得极高的细胞浓度。可以改造生产宿主以便以组成型方式产生感兴趣的重组产物，或一旦足够的生物量存在，则诱导生产宿主表达感兴趣的重组产物。这种诱导一般为在适当时间加入分子或由生产宿主产生的作为代谢物废物或次级代谢物的代谢物。

一旦培养处于稳定期，则诱导重组蛋白产生的策略就是典型的，因为：

1)它允许产生对生产生物体而言有毒的产物。

2)如果反应器中的生物量浓度极高，那么容量生产能力得以改善。

3)用于形成产物的前体一般为初级代谢产物，它们在初级生长期过程中蓄积。

在浸没批量培养中，通常难以以最佳方式定时添加重组蛋白诱导物，以便在培养物达到稳定期时加入诱导物且既不过早，也不过晚。当在最佳实验过程中的不同条件下进行平行多重培养时特别困难。

尽管大部分重组蛋白表达宿主为需氧生物体，但是因氧量传递限制和在生长培养基中提供的营养物的毒性或溶解度束缚而导致高密度培养受限。影响用于重组蛋白生产的生物反应器的容量生产能力的因素包括：低剪切环境；高生物量浓度；延长的生产期；良好的营养物量传递。

一般而言，在高密度培养物中，氧和营养物量的传递受培养物形态学和/或流变学影响。在浸没培养中，丝状生物体，诸如曲霉属(Aspergillus)中的重组产物的表达特别受到形态分化和颗粒形成的影响，并且生产能力通过重组生物体的固定化而得到增强。固定化不仅限制了剪切应力和降低了肉汤粘度，从而改善了供氧和营养物量传递，而且还表现出抑制黑曲霉(Aspergillus niger)中胞外蛋白酶的产生，由此限制了该生物体中重组蛋白的降解(Wang等2005)。在大部分固定化系统中，氧量传递限制始终是生产中的限速步骤。

本文任意处涉及的″微生物″必须解释为意旨涉及细菌、真菌、原生动物中的成员的生物体，并且包括已经改造以便在需氧条件下产生重组产物的植物或哺乳动物细胞。

本文任意处涉及的″稳定期″必须解释为意旨受限生长或基本上平衡生长和死亡的期限，该期限一般在补料分批培养或连续培养微生物中的生长初期后即刻发生。

本文任意处涉及的″重组蛋白″必须解释为与″重组产物″为同义词并且意旨任意的产物或其产物，只要它为与表达宿主同源或异源的生物合成产物，其生产可以在典型分批方法的稳定期开始时或过程中通过某些机制诱导。该产物可以由表达宿主分泌入胞外环境或保留在胞内。重组产物不限于蛋白质。

本文任意处涉及的″营养物溶液″必须解释为意旨包含微生物生长所需的一种或多种营养物并且包括至少一种限制生长的营养物的液体溶液。该营养物溶液还可以携带启动重组产物表达所需的诱导物。

本文任意处涉及的″诱导物″必须解释为意旨在所述营养物溶液或生物合成产物中包括的生物或合成化学品，所述的生物合成产物由固定化表达宿主在生长过程中产生并且用作在调节所述重组产物或蛋白表达的相关启动子控制下调节重组产物或蛋白生产的工具。

本文任意处涉及的″渗透物″必须解释为意旨已经通过基质和生物膜并且可以携带分泌的产物，代谢废物和/或营养物溶液通过生物膜过程中微生物未代谢的营养物的剩余部分的消耗的营养物溶液或产物流。

本文任意处涉及的″通气条件″必须解释为意旨任意的培养条件，其中使包含氧的气体经生物膜表面通过生物反应器，并且该条件给微生物提供生长用的氧。

发明概述

本发明的一个方面提供了在通气条件下生产至少一种重组产物的方法。该方法包括：

提供具有第一侧和第二侧并且具有与其第一侧附着的微生物的生物膜(biofilm of microorganism)的多孔基质，该基质的构造允许营养物溶液通过其中并且防止微生物细胞通过其中；并且

使营养物溶液在通气条件下以从其第二侧到达其第一侧的方向流过基质和生物膜，速率足够低以便建立通过生物膜的具有浓度差的营养物梯度，其中接近基质的营养物浓度相对较高并且足够高以便维持微生物的初级生长，并且其中较为远离基质的营养物浓度相对较低并且足够低以便进入和维持微生物的稳定期，且诱导微生物产生重组产物。

诱导可以以各种方式产生，诸如通过营养物消耗，添加诱导物分子，在营养受限条件下累积初级代谢产物或次级代谢物，自体-诱导等。换句话说，该方法可以使用去阻抑和/或诱导重组基因表达。换句话说，诱导可以通过将诱导物分子添加到营养物溶液或通过累积在营养物限制条件下产生的初级代谢产物或次级代谢物而发生。

诱导可以通过将诱导物分子添加到营养物溶液中而发生，使得从第二侧通过基质和生物膜到达第一侧的营养物溶液的流量中携带所述的诱导物到达微生物，由此诱导微生物产生至少一种重组蛋白或产物。诱导还可以通过在生物膜内累积初级代谢产物或次级代谢物而发生，以便它们由此以在营养物溶液中的方式被携带通过生物膜，从而产生浓度梯度，其中诱导物浓度在接近基质处相对较低并且在较为远离基质处相对较高，并且足够高以便诱导重组产物表达。

诱导物还可以为累积在生物膜内的初级代谢产物或次级代谢物，以便它们由此以在营养物溶液中的方式被携带通过生物膜，从而产生浓度梯度，其中诱导物浓度在接近基质处相对较低并且在较为远离基质处相对较高，并且足够高至诱导微生物表达至少一种重组产物。

如果微生物分泌，那么可以收集来自第一侧的渗透物中的重组产物，或如果由微生物保留在胞内，那么可以从生物膜中收集重组产物。

诱导物可以为任意合适的诱导物，诸如异丙基b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(0.1-1mM)、甲醇(0.5-1.5％)和微生物产生的有机酸，它们与经改造的重组表达系统的特异性启动子发生相互作用。诱导物的浓度可以改变，以便优化可溶性的正确折叠的蛋白质产物的表达。

该方法可以包括使生物膜接触气体。可以将气体吹在生物膜的外表面上，由此带走微生物的孢子和死亡细胞并且去除可能含有分泌产物的消耗的营养物溶液。该气体可以提供用于代谢的氧气。该气体可以为空气。

微生物可以为微生物菌株的基本上纯的培养物或不同微生物的混合培养物。微生物可以选自曲霉属(Aspergillus sp.)、木霉属(Trichoderma sp.)、毛霉属(Mucor sp.)、毕赤氏酵母属(Pichiasp.)、镰孢属(Fusarium sp.)、脉孢霉属(Neurospora sp.)、青霉属(Penicillium sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、Chrysosporium lucknowense、Mortierella alpinis。

生产重组产物的方法可以在微生物生长和产物形成范围内的温度下进行。生产重组产物的方法可以在2-109℃，优选20-40℃，例如30℃的温度下进行。

生产重组产物的方法可以在微生物生长和产物形成范围内的初始pH下进行。生产重组产物的方法可以在1-13，优选4-8，例如7的初始pH下进行。

生产重组产物的方法可以进行一定时间期限，只要生物膜或培养物保持存活并且具有生产能力，且不至于过度致密而妨碍产物流过所述的膜。生产重组产物的方法可以进行2-60天，优选2-30天，例如25天。

重组产物可以由微生物在胞内或胞外产生。如果微生物分泌，那么可以采集来自第一侧的重组产物，或如果由微生物保留在胞内，那么可以从生物膜中收集重组产物。胞内代谢物可以保留在胞质内或分泌至周质空间并且使用细胞裂解或细胞渗透操作步骤，诸如渗透压休克提取。

营养物溶液可以以足以维持和固定微生物，同时维持通过生物膜的营养物梯度的速率通过生物膜和基质。流速可以根据营养物溶液的营养物含量或培养的微生物类型的不同而不同。流速可以在0.001-10个体积营养物溶液/反应器体积/小时。

生物膜厚度可以依赖于营养物溶液的营养物含量和培养的微生物类型。生物膜可以具有0.1-10mm的厚度并且应受到限制，以便将经加湿的气体于生物膜之间的最佳氧的生物量传递维持在对生物膜或培养物而言合适的范围内，从而保持存活和生产能力。

本发明的第二个方面提供了在通气条件下生产重组产物的设备，该设备包括：

至少一种具有第一侧和第二侧的多孔基质；和

用于在通气条件下将营养物溶液进料以便使之接触微生物的进料装置，在应用中，所述的微生物在基质第一侧上附着并且形成生物膜，所述的进料装置是可操作的以使营养物溶液以从其第二侧到其第一侧的方向流过基质和生物膜，其速率足够低以便建立通过生物膜的营养物梯度，其中接近基质处营养物的浓度相对较高和足够高以便支持微生物的初级生长，并且其中较为远离基质处营养物浓度相对较低并且足够低以便进入和维持微生物的稳定期，其中诱导微生物产生重组产物。诱导还可以通过在生物膜内累积初级代谢产物或次级代谢物来发生，以便它们由此以在营养物溶液中的方式被携带通过生物膜，从而产生浓度梯度，其中诱导物浓度在接近基质处相对较低并且在较为远离基质处相对较高，并且足够高至诱导生物体表达至少一种重组产物。

进料装置可以包括机械源中的至少一种，所述机械源诸如泵和气动源，诸如加压气体。所述的气动源用于使营养物溶液进料以便接触基质的第二侧并且导致营养物溶液流过基质和生物膜而到达第一侧。

所述的设备包括在第一侧上提供的气动源，诸如加压气体，它可以流过和定向于接触生物膜外部。该气体应包括生长和代谢用氧并且还可以用于带走微生物的孢子和死亡细胞并且去除可能包含分泌产物的渗透物。

该设备可以包括用于收集来自生物膜第一侧的气体和可能包含产物的渗透物的产物收集装置。该产物收集装置还可以包括出口，该出口包括返压生成部件(backpressure creating means)，诸如，但不限于机械限制，它可以用于调节第一侧上的气体压力，由此改变在产生施加的返压下到达生物膜的气体氧传递。

所述的基质可以包含多孔膜，该多孔膜具有允许营养物溶液从其中流过的足够大的孔，但这些孔足够小以防止微生物细胞从其中通过或生长。膜的精切构造可以变动很大。在具体的实施方案中，膜可以为中空纤维膜，毛细管膜的形式，或可以具有管形或平片状构造。

所述的设备可以包括用于所述基质的外罩，该外罩在空间上与多孔基质分离。该外罩可以包括营养物溶液入口，气体溶液入口和用于从罩中排出渗透物的出口。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。在本文件中，包括定义中如果出现矛盾之处，那么应放弃本领域技术人员通常理解的术语。优选的方法和设备如下所述，不过，与本文所述类似或等同的方法和设备可以用于实施或测试本发明。将本文提及的所有公开文献，专利申请和其它参考文献完整地引入作为参考。本文披露的方法，设备和实施例仅用于解释目的，但并不指定起限定作用。

附图简述

下文借助于本发明的非限制性实施例，并且参照和如附图中所例示的描述本发明的额外特征。在图中：

图1表示本发明设备的示意性的侧视图；

图2表示多孔基质和生物膜，断面I，II和III的图示的示意性截面平面图，其中从第二侧上提供营养物到第一侧，并且供氧在第一侧上，以便建立通过生物膜的营养物梯度，该梯度在第二侧上最高并且在第一侧上最低，并且建立氧的梯度，它在第一侧上最高并且在第二侧上最低；和

图3表示构成本发明按比例放大的实施方案的多个单纤维膜生物反应器的示意图。

优选实施方案的详细描述

就附图中的图1-2而言，一般将本发明在通气条件下生产重组蛋白的设备命名为附图标记10。该设备为实验室规模的附图中的图1中所示的生物反应器10形式，然而，可以理解生物反应器10中具体实施的原理可以应用于按比例扩大的或商业化实施方案。

生物反应器10包括陶瓷中空纤维毛细管膜12，其中该膜的末端上插入塑料插入物14，16与包含陶瓷插入物的环氧树脂18。玻璃的外罩或反应器外壳20与毛细管膜12同轴排列并且配有在玻璃外罩20上拧紧的末端帽22和23。外罩20包括用于将氧导入在毛细管12与外罩20之间的空间24的气体入口26；用于将接种物导入在连接膜12的外罩20之间的空间24的接种入口25。外罩进一步包括用于从外罩中排出进料溶液并且吹气体的渗透物或气体出口27。

在使用中，生物膜32建立在毛细管膜12的外表面30上。这可以通过下列步骤实现：将所需微生物的孢子或营养型接种物导入第一侧上膜表面30与玻璃外罩20之间的空间24并且经毛细管膜12将接种物从外表面30过滤至第二侧上的膜腔34，从腔34中并且通过出口29排出任意的渗透物。腔34由此与出口29保持流通。接种物由此被固定在膜表面30上。膜12具有在内侧上相对薄的多孔表面层36和从表面层36向外呈放射状的相对厚的指状无外表面层的空隙结构38。一般而言，膜12具有约2mm的外径。

在操作过程中，将微生物的合适的营养物溶液通过培养基入口28导入外罩。使营养物溶液以从第二侧或膜腔34到第一侧或其外表面30的方向流过膜12。从膜腔34或第二侧通过培养基出口29排出气体，该出口在操作过程中关闭以有利于营养物从腔内侧通过毛细管膜壁36和38渗透至膜表面30与玻璃外罩20之间的空间24。

在图3中，例示了多个生物反应器10。将加压气体供给表示为附图标记40，它通过两个调节阀42与两个0.22m过滤器44连接。配置加湿容器46并且通过压力表48测定压力。显示启动容器50和培养基供应容器52与生物反应器10连接。渗透物收集容器54与通气过滤器56和流量调节器58连接。

就图3而言，与渗透物收集容器54连接的管线被钳60以机械方式密闭，此后将微生物直接导入膜表面与各生物反应器10的玻璃外罩之间的空间，使得膜表面与玻璃外罩之间的空间充满了接种物。接种物在从压缩机40通过管线B提供的压力下被固定在膜表面上。加压气体的压力由压力调节阀42控制并且使用压力表48监测。T-形片64使压力均匀分布在多分支生物反应器10之间。通过使气体通过0.22μm过滤器44对来自管线B的加压气体灭菌且然后通过使气体经加湿容器66中的无菌蒸馏水发泡加湿润，此后进入生物反应器10，以防止微生物干燥并且改善气流与生物膜之间的氧传递速率。将接种过滤物从将内侧收集入启动容器50。一旦完成，就开放与渗透物收集容器54连接的管线并且使用流量调节器58在渗透物受体容器54的气体出口设定来自管线B的气体压力和气流速率。

在操作过程中，在从压缩器40通过管线A提供的压力下从培养基供应容器52中提供营养物溶液。加压气体的压力由压力调节阀42控制并且使用压力表48监测。T-形片64使压力均匀分布在多分支生物反应器10之间。通过使气体通过0.22μm过滤器44对来自管线A的加压气体灭菌。以气动方式将营养物溶液从培养基供应容器52进料入毛细管膜腔，从该腔中将空气排入启动容器50。在操作过程中，用钳60以机械方式密封与启动容器50连接的管线。根据管线B中加压气体的供应与管线A中加压气体的供应之间的压差确定营养物溶液从第二侧上膜腔供应至第一侧上膜表面上固定的生物膜上的速率。可以间隔从渗透物收集容器中取出渗透物。

生产重组蛋白的基础在于通过对控制外源基因表达的启动子元件起作用阻抑或诱导基因表达的分子对基因表达的调节。除较好的已知诱导物，诸如IPTG和甲醇外，诸如碳或氮这类营养物也可以用于下调(阻抑)或上调(诱导)重组产物表达。通过营养物饥饿，可以使启动子元件脱阻抑或诱导启动子元件，由此启动基因表达和重组蛋白生产。这一结果使用膜固定的生物膜生物反应器10，通过经生物膜32产生放射状营养物浓度梯度实现。作为结果，膜/生物膜界面上的营养物浓度高，而生物膜32暴露的外表面上的营养物浓度低。在附图的图2中，为了例示目的，图中描绘了营养物浓度水平C(y轴)与距膜表面的距离(x轴)之间的关系，而将从高到低的营养物浓度区分别命名为附图标记I-III。在I区中，营养物浓度足够高以便支持微生物的初级生长，在II区中，营养物浓度足够低以便导致压迫微生物的营养物饥饿，由此诱导和维持微生物的稳定期，而在III区中，营养物浓度耗尽，导致细胞死亡和裂解。

由于许多重组产物的毒性和生产能力增加所需的高细胞密度，所以改造了大部分表达系统以便在稳定期生长过程中通过自体诱导或在稳定期生长过程中添加诱导物产生重组产物。自体诱导由如下原因导致；

1)本文所述的营养物梯度；或

2)在营养物溶液灌注生物膜时代谢废物的浓度随之增加，这还可以在其中累积诱导产物形成的代谢废物的培养物中诱导产物形成；

3)这还可以导致次级代谢物产生，这种次级代谢物诱导重组产物产生。可以理解在建立营养物梯度后，还可以通过作为有机酸累积的结果的pH改变诱导了产物形成。

在本发明中，可以维持最佳条件，同时限制产物宿主接触毒性产物。当操作时，生物反应器能够延长生产重组蛋白并且在生物量得以保留时能够回收相对高纯度的生物量游离产物，并且蛋白水解酶对重组产物的降解和衰变通过连续取出产物得以减少。

在营养条件或宿主生物体自身产生的代谢产物自动调节表达的重组宿主中，可以将重组蛋白生产维持在II区，例如在甘油醛-6-磷酸脱氢酶(gpd)启动子控制下在黑曲霉中产生木聚糖酶(Rose和van ZyI，2002)。

在表达受合成或生物合成化学品调节的重组宿主中，可以在没有抑制剂存在下的整个生物膜中诱导重组蛋白产生，或可以将重组蛋白生产维持在II区，其中这类抑制剂可以由微生物代谢，例如，由甲醇在限碳条件下诱导在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中的AOX启动子控制下重组生产。在这种表达系统中，白蛋白为分泌的产物且β-半乳糖苷酶为胞内产物。

可以理解调节重组蛋白生产是宿主和表达系统特异性的，并且在固定化生物膜内进行重组蛋白生产的方式可以不同，而仍然可以并入本文所述的营养物，代谢物和/或诱导物梯度的主要特征。

还可以理解生物反应器和流体流动方式的确切配置可以显著改变，而仍然可以并入上文定义的主要特征。

可以采用专利US5945002和EP9606333.4(引入本文作为参考)中所述的次级代谢物生产方法并且将它们用于生产本发明的重组产物。

实施例1

黑曲霉表达系统

黑曲霉通常用作使用各种表达载体的真菌表达系统。在本实施例中，将经改造以便在来自黑曲霉的甘油醛-6-磷酸(gpd)启动子的转录控制下以组成型方式表达黑氏木霉(Trichoderma reesei)β-1，4-木聚糖酶基因(xyn2)的黑曲霉(Rose和van Zyle，2002)以稳定的高产率转化体用来说明使用本文所述的设备连续生产重组木聚糖酶。

菌株和培养条件

包含整合入其真菌基因组的黑氏木霉的木聚糖酶II(xyn2)基因的重组菌株黑曲霉D15获自Prof.W.H.van Zyl，Dept.ofMicrobiology，University of Stellenbosch，South Africa(Rose和van Zyl，2002)。

在20％(v/v)糖蜜(mollasses)，1x确定成分培养基(Punt和vanden Hondel，1992)，2x确定成分培养基(Punt和van den Hondel，1992)或基本培养基(Record等2002)中培养产生木聚糖酶的曲霉属。

生物反应器设定

单纤维膜生物反应器的构造如图3中所示。操作4个生物反应器模块的4个储存库(bank)，每个储存库处于不同的营养条件中。对生物反应器进行高压灭菌并且按照标准操作步骤(SOP)对需氧操作进行设定。在开始实验前将无菌生长培养基以无菌方式配入各培养基供应容器。

接种

给所有生物反应器接种1ml通过将来自单一琼脂平板的孢子重新悬浮于20ml无菌蒸馏水中产生的孢子混悬液。以无菌方式将接种物直接注入毛细管外空间(ECS)，即各生物反应器的膜表面与外罩之间。按照SOP，通过逆流完成接种物在毛细管膜外表面上的固定。

操作

按照SOP在需氧条件下操作生物反应器。使用压力调节阀从压缩器中提供0.22μm过滤的加湿气体形式的氧并且使用压力表监测。在各生物反应器的气体出口处使用Hoffman钳以便调节气流和产生反压力。使用压力表监测ECS，即第一侧上的膜表面与玻璃外罩之间的空间内的气体压力并且维持在60kPa，且使用转子流量计将通过生物反应器的气流设定在1体积空气/分钟/反应器体积。

使用0.22μm过滤的加压气体，应用压力调节阀将生长培养基提供至各生物反应器的单独的培养基供应容器并且使用压力表监测。使生长培养基从腔或毛细管膜的第二侧进料至生物膜，通过膜壁到达第一侧或毛细管膜外表面。通过下列步骤相应地手动调节从第二侧到第一侧的培养基流速：维持正压差设定从腔或第二侧通过膜表面到达生物反应器的外膜表面或第一侧，由此控制营养物进料(流量)至生物膜的速率。增加的生物膜生长对流量产生了更大的阻力且由此应调整压力以便维持恒流。在最佳流量条件下，基本上维持生物膜厚度和流量平衡，从而有利于微生物分化和连续重组蛋白产生所需的营养物梯度。

在渗透物收集容器中收集渗透物并且每日取样用于进一步分析。每日监测渗透物累积速率和pH。将样品储存在-20℃下用于进一步分析。

生物膜显现

使用不同的生长培养基对黑曲霉D15转化体观察生物膜厚度、分化和生产能力。

生物膜生长在基本培养基中快速显现(Record等2002)，在早至第3天表现出均匀黑色着色的重度孢子形成生长。

在1x和2x确定成分培养基(Punt和van den Hondel，1992)上生长是类似的，其中在使用2x生长培养基时生物膜的厚度稍大。在确定成分培养基中生长得较为缓慢并且并不表现出相同的深色着色或孢子形成。生物膜着色为色斑霜状至浅和深棕色，从第10天开始变暗色并且从第15天开始孢子形成。在糖蜜中难以生长，仅表现出弥散的生物膜生长，截止到第14天出现深色着色和孢子形成。

就表1而言，在25天后收集生物反应器并且对每个生物反应器计算干细胞重。使用2x确定成分培养基厚度明显较高的生物量。在25天期限内生物反应器产生的木聚糖酶的量与生物量产量著相关(r²＝0.92)。

表1：使用不同生长培养基培养的生物反应器(n＝2)中产生的平均生物量

生产能力

使用Megazyme氏偶氮-木聚糖(birchwood)木聚糖酶活性测定法对酶活性进行定量。在55℃下和pH6.0的磷酸钠缓冲液中进行操作。所用的pH和孵育温度如上述对黑曲霉D15中产生的重组xyn2优化所述(Rose和van Zyl，1992)。因生物反应器之间培养基组成的差异而导致对每一样品制备单独的对照品(空白)。将1个单位的酶活性定义为每分钟从阿拉伯木聚糖(arabinozylan)中释放1μmole D-木糖还原糖当量所需的酶的量。

就表2而言，确定成分的生长培养基表现出较高的木聚糖酶产率，其中2x确定成分培养基比1x确定成分培养基在生物反应器容量生产能力上倍增。这一结果与使用更浓生长培养基(如上所述)时产生的生物量的量增加相关。使用基本培养基培养的生物反应器表现出稍低于使用1x确定成分培养基培养的那些生物反应器的生产能力，而20％糖蜜难以支持生长和生物反应器中的木聚糖酶生产。

表2：使用生物反应器的木聚糖酶产量

参考文献：

1.Wang，L.，Ridgway，D.，Gu，T.and Moo-Young M.(2005)Bioprocessing strategies to improve heterologous proteinproduction in filamentous fungal fermentations.Biotech.Advances 23，pp.115-129

2.Rose，S.H和van Zyl W.H.(2002)Constitutive expressionof the Trichoderma reesei beta-1，4-xylanase gene(xyn2)and thebeta-1，4-endoglucanase gene(egl)in Aspergillus niger inmolasses and defined glucose media.Appl.Microbiol.Biotechnol.58，pp.115-129。

已经描述了本发明的许多实施方案。尽管如此，但是可以理解可以在不脱离本发明实质和范围的情况下进行各种变形。

Claims (11)

1.在通气条件下生产至少一种重组产物的方法，该方法包括：

提供具有第一侧和第二侧并且具有与其第一侧附着的微生物的生物膜的多孔基质，该基质的构造允许营养物溶液通过其中并且防止微生物细胞通过其中；并且

使营养物溶液在通气条件下以从其第二侧到达其第一侧的方向流过基质和生物膜，其中营养物溶液从第二侧到第一侧的流速为0.001-10个体积营养物溶液/生物反应器体积/小时，以便建立通过生物膜的具有浓度差的营养物梯度，其中基质上的营养物浓度高以便支持微生物的初级生长，并且其中生物膜的外表面上的营养物浓度低以便使微生物进入和维持微生物的稳定期，且诱导微生物以产生重组产物。

2.权利要求1的方法，其中所述的微生物选自曲霉属(Aspergillus sp.)、木霉属(Trichoderma sp.)、毛霉属(Mucorsp.)、毕赤氏酵母属(Pichia sp.)、镰孢属(Fusarium sp.)、脉孢霉属(Neurospora sp.)、青霉属(Penicillium sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、Chrysosporium lucknowense、Mortierellaalpinis。

3.权利要求1的方法，其中该方法在2-109℃的温度下进行。

4.权利要求1的方法，其中该方法在1-13的初始pH下进行。

5.权利要求1的方法，其中该方法进行2-60天。

6.权利要求1的方法，其中所述的生物膜具有0.1-10mm的厚度。

7.权利要求1的方法，该方法包括将诱导物分子加入到营养物溶液中，使得从第二侧通过基质和生物膜到第一侧的营养物溶液流携带所述诱导物分子至微生物，由此诱导微生物产生至少一种重组产物。

8.权利要求7的方法，其中所述的诱导物选自0.1-1mM的异丙基b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、0.5-1.5％的甲醇和微生物产生的有机酸中的至少一种。

9.权利要求1的方法，其中所述的重组产物由微生物在胞内产生。

10.权利要求1的方法，其中所述的重组产物由微生物在胞外产生。

11.权利要求1的方法，包括使所述的生物膜接触气体。

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