CN101243043A - Ppar受体和egf受体特异性化合物及其盐以及它们在医药领域中的用途 - Google Patents

Ppar受体和egf受体特异性化合物及其盐以及它们在医药领域中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明特别涉及通式(I)的化合物及其在医药领域中的用途，其中R1和R2(其可以是相同或不同的)选自H、－CnH2n－1、具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，或一起形成具有5或6个原子的芳香族环或脂肪族环，R3选自－CO－CH3、－NHOH、－OH、－OR6，其中R6是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基；R4选自H、具有1至6个碳原子的直链或支链烷基、苯基、苄基、－CF3或－CF2CF3、乙烯基或烯丙基；R5、R7、R8是氢原子；或R3和R4、R4和R5、或R7和R8一起形成环，该环与苯环、具有5或6个原子的芳香族环或脂肪族环稠合，所述5或6个原子含有1至2个独立地选自N、O的杂原子。

Description

PPAR受体和EGF受体特异性化合物及其盐以及它们在医药领域中的用途
                     发明领域
本发明涉及PPAR受体和EGF受体特异性化合物及其盐以及它们在医药领域中的用途。
                     发明目的
本发明的化合物及其盐可以有利地用于预防和治疗表达PPARγ受体(过氧化物酶体增殖物激活受体)及EGF受体(表皮生长因子受体)的肿瘤，例如：食道、胃、胰、结肠、前列腺、乳腺、子宫及附件、肾和肺的肿瘤。此外，本发明的化合物及其盐可以用于治疗慢性炎症性疾病，尤其是慢性肠病，如局限性回肠炎(即Crohn病)和溃疡性直肠结肠炎。
                     发明背景
PPARγ受体是控制许多基因表达的核受体(大约50个转录因子的组)，所述基因对于调节脂质代谢、胰岛素的合成和癌发生和炎症的过程是重要的(Bull AW，Arch Pathol Lab Med 2003；127：1121-1123)(Koeffler HP，Clin Cancer Res 2003；9：1-9)(Youssef J等人，J BiomedBiotec 2004；3：156-166页)。
存在多种天然和合成的激动剂，其结合PPARγ受体并改变其构象，产生激活。The Lancet 2002；360：1410-1418页中描述了天然和合成的配体。
近来的研究已经表明，使用PPARγ受体的配体处理肿瘤细胞引起细胞增殖、细胞分化和凋亡的减少，这提示有可能使用这类化合物作为用于防止癌发生的药物(Osawa E等人，Gastroenterology 2003；124：361-367)。
其他研究已经表明，PPARγ受体的配体(例如，曲格列酮)具有抗炎作用并抑制IBD动物模型中的粘膜炎症反应(Tanaka T等人，Cancer Res 2001；61：2424-2428页)。
此外，最近刚刚公开了证据，5-ASA(5-氨基水杨酸、美沙拉秦)(治疗IBD的金标准)的肠抗炎活性依赖于PPARγ受体的结合及随之发生的激活(Rousseaux C等人，J Exp Med 2005；201：1205-1215页)。
在不同类型的赘生物中非常高程度地表达了活化形式的具有酪氨酸-激酶EGF活性的跨膜受体(Mendelsohn J，Endocr Relat Cancer2001；8：3-9)(Harari PM，Endocr Relat Cancer 2004；11：689-708页)。
受体的过度表达还与癌细胞转移的潜在能力有关。在这一方面，已证明在与胞外基质相互作用的水平上，EGF促进与病变有关的不同细胞类型的迁移和侵袭(Brunton等人，Oncogene 1997；14：283-293页)。
在实验动物上和人中进行的大量研究已经确定了EGF受体的抑制剂在控制肿瘤的增殖和扩散中的功效(Mendelsohn J，Endocr RelatCancer 2001；8：3-9页)(Harari PM，Endocr Relat Cancer 2004；11：689-708页)。
毫无疑问，通过EGF受体激活而触发的细胞内信号促进肿瘤细胞的生长和存活，促进病理状况的发展，而且该信号在测定肿瘤细胞扩散和移生远程器官的能力中是必需的(Mendelsohn J，Endocr RelatCancer 2001；8：3-9)(Kari C等人，Cancer Res 2003；63：1-5页)。
根据上述内容并此外考虑到，从生物学的观点看，慢性炎症过程在癌发生中发挥作用，清楚的是对于新化学实体的创新研究存在现实需求，该新的化学实体通过其既对PPARγ受体又对EGF受体的互补作用，能够产生化学预防、抗增殖和抗转移类型的抗炎和抗肿瘤作用。
                     发明概述
本发明涉及一系列化合物的新的和创造性的医药和治疗用途，在这些化合物的任意一种是未知的情况下，本发明还涉及这些化合物。
本发明提供了新的一类化合物，其通过调变特异性受体如PPARγ受体和EGF受体而适用于预防和治疗癌症和慢性炎症。
因此，本发明特别涉及通式(I)的化合物
Figure S2006800300279D00031
其中
R1和R2，可以是相同或不同的，选自H、-CnH2n-1、具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，或者一起形成具有5或6个原子的芳香族环或脂肪族环；
R3选自-CO-CH、-NHOH、-OH、-OR6，其中R6是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基；
R4选自H、具有1至6个碳原子的直链或支链烷基、苯基、苄基、-CF3或-CF2CF3、乙烯基或烯丙基；R5、R7、R8是氢原子；或者
R3和R4、R4和R5、或R7和R8一起形成环，该环与苯环、具有5或6个原子的芳香族环或脂肪族环稠合，所述5或6个原子含有1至2个独立地选自N、O的杂原子。
本发明还涉及通式(Ia)的特定亚群化合物
Figure S2006800300279D00032
其中
R1和R2，可以是相同或不同的，并选自H、-CO-CH3、-CnH2n-1、具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，或者一起形成具有5或6个原子的芳香族环或脂肪族环；
R3选自-NHOH、-OH、-OR6，其中R6是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基；
R4选自-H、具有1至6个碳原子的直链或支链烷基；
R5、R7、R8是氢原子；或者
R3和R4、R4和R5、或R7和R8一起形成环，该环与苯环、具有5或6个原子的芳香族环或脂肪族环稠合，所述5或6个原子含有1至2个独立地选自N、O的杂原子。
上述的具有1至6个碳原子的式(I)或(IIa)的直链或支链烷基，可以选自-CH3、-C2H5、异丙基、丙基、CnH2n-1。
本发明还涉及如式(I)和(Ia)中列举的化合物，除了不允许其中R3＝-COCH3以外。存在这样的理论可能性：一些乙酰基衍生物如至少当R3＝-COCH3时的那些中的一些可能是无活性的，因为N-乙酰化作用是芳香族胺类的代谢解毒系统。理论可能性起因于观察到5-ASA的无活性代谢产物是N-乙酰基5-ASA。
在本发明式(I)和(Ia)二者的一些实施方案中，R7和R8可以不形成环。因此，R3和R4，或R4和R5可以一起形成环，该环与苯环、具有5或6个原子的芳香族环或脂肪族环稠合，所述5或6个原子含有1至2个独立地选自N、O的杂原子。在一些实施方案中，排除化合物29、36和37。在本发明式(I)和(Ia)二者的一些实施方案中，R7和R8可以不形成环，除了当R4是CH3时。在本发明式(I)和(Ia)二者的一些实施方案中，R4选自H时，R7和R8可以不形成环。在一些实施方案中，本发明涉及由本发明提供的ketolenes。在一些实施方案中，排除化合物29。
在一些实施方案中，排除一个或多个选自化合物5、6、7、8、9、12、16、18、19、24、25、27、30和41的化合物。
在本发明式(I)和(Ia)二者的一些实施方案中，R1和R2可以不形成环。因此R1和R2，可以是相同或不同的，可以选自-H、-CnH2n-1、具有1至6个碳原予的直链或支链烷基。在一些实施方案中，排除化合物41。
在本发明式(I)和(Ia)二者的一些实施方案中，R4可以不是分支的。因此，R4可以选自H、具有1至6个碳原子的直链烷基；R5、R7、R8是氢原子。在这样的实施方案中，排除化合物30和31。在一些实施方案中，当氨基是在苯环的4′位上时，R4可以不是分支。在这样的实施方案中，排除化合物30。在一些实施方案中，直链烷基可能仅有1个碳原子(即，CH3)。
在本发明式(I)和(Ia)二者的一些实施方案中，R1和R2是-H。在一些实施方案中，排除化合物6、9、24、27、38和41。
在本发明式(I)和(Ia)二者的一些实施方案中，R2可以不与R1不同。
在本发明式(I)和(Ia)二者的一些实施方案中，当R3是-OH时，R4选自-H、具有1至6个碳原子的支链烷基，或者R3和R4一起形成环，该环与苯、具有5或6个原子的芳香族或环稠合，所述5或6个原子含有1至2个独立地选自N、O的杂原子。在一些实施方案中，支链烷基可以是-CH(CH3)2。在一些实施方案中，支链烷基可以是在R8位的-CH(CH3)2。在一些实施方案中，R3和R4形成5-元脂肪族环并具有一个O原子。在一些实施方案(如在这段中描述的实施方案)中，排除化合物7、8、18、19、42。
在本发明式(I)和(Ia)二者的一些实施方案中，当R3是-OH且R4是-H时，基团NR1R2不能在4′位(而应当在R5或R8上)。在一些实施方案中，R1和R2是-CH3的情况下尤其如此。在一些实施方案中，排除化合物24。
在本发明式(I)和(Ia)二者的一些实施方案中，R1和R2是相同的。在一些实施方案中，排除化合物9和12。
在本发明式(I)和(Ia)二者的一些实施方案中，当R3是-OH且R4是-H时，基团-NR1R2不能在R5位(而应当是在R8位)。在一些实施方案中，R1和R2是-H时可能是这种情况。在一些实施方案中，排除化合物6。
在本发明式(I)和(Ia)二者的一些实施方案中，R3是-NHOH时，R4是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基(或者，如果式(I)苯基、苄基、-CF3或-CF2CF3、乙烯基或烯丙基)，R3和R4一起形成环，该环与苯环、具有5或6个原子的芳香族环或脂肪族环稠合，所述5或6个原子含有1至2个独立地选自N、O的杂原子。在一些实施方案中，排除化合物7。
在本发明式(I)和(Ia)二者的一些实施方案中，R3是-NHOH，且R4是具有2个碳原子的直链或支链烷基时，基团-NR1R2不可以在4′位而可以在R8位。在一些实施方案中，排除化合物25。
在本发明式(I)和(Ia)二者的一些实施方案中，当R3是-NHOH并且R4是-H时，基团-NR1R2不可以在R8位，且必须是在4′位。在一些实施方案中，排除化合物5。
根据一个实施方案，根据下式(II)，式(I)和(Ia)化合物的R3和R4可以形成环
其中R1、R2、R5、R7和R8是如上定义的。
根据另一个实施方案，根据下式(III)，式(I)和(Ia)化合物的R4和R5可以形成环
Figure S2006800300279D00062
其中R1、R2、R3、R7和R8是如上定义的。
根据进一步的实施方案，根据下式(IV)或(V)，式(I)和(Ia)化合物的R7和R8可以形成环
Figure S2006800300279D00071
其中R1、R2、R3、R4和R5是如上定义的。
特别地，本发明式(I)和(Ia)的化合物可以选自：
4-氨基-N-羟基-2-甲氧基苯甲酰胺(化合物13)
5-氨基-N-羟基-2-甲氧基苯甲酰胺(化合物14)
5-氨基-2，3-二氢苯并呋喃-7-甲酸(化合物17)
5-氨基-2-乙氧基-N-羟基苯甲酰胺(化合物26)
6-氨基-2，2-二甲基-4H-苯并[1，3]二_英-4-酮(化合物28)
1，2，3，4-四氢-6-羟基喹啉-5-甲酸(化合物29)
5-氨基-2-异丙氧基苯甲酸(化合物31)
6-甲氧基喹啉-5-甲酸(化合物36)
6-甲氧基-1，2，3，4-四氢喹啉-5-甲酸(化合物37)
5-二异丙基氨基水杨酸(化合物38)
4-二异丙基氨基水杨酸(化合物42)。
本发明还提供了其中R1和R2选自-H和-CH(CH3)2的化合物。R1和R2二者可以是相同的。在一些实施方案中，R1和R2可以是-CH(CH3)2。
一个实施例包含以下结构(化合物38)：
Figure S2006800300279D00072
在本发明的其他实施方案中，R1和R2均是-H。
本发明还提供了其中R3选自-NHOH和-OH的化合物。在一些实施方案中，R3可以是-NHOH。一个实施包括了以下结构(化合物13)：
进一步的实施例包含以下结构(化合物14)：
Figure S2006800300279D00082
进一步的实施例包含以下结构(化合物26)：
Figure S2006800300279D00083
在本发明的一些实施方案中，R3可以是-OH。
适合的实施例包含以下结构(化合物17)：
进一步的实施例包含以下结构(化合物31)：
Figure S2006800300279D00085
在本发明的一些实施方案中，R4可以是-H。在本发明一些实施方案中，R4可以是CH3。在本发明的一些实施方案中，R4可以是-CH2CH3。在本发明的一些实施方案中，R4可以是-CH(CH3)2。
进一步的实施例包含以下结构(化合物28)：
Figure S2006800300279D00091
在本发明的一些实施方案中，R3和R4可以一起形成脂肪族环，该环与苯，5或6个原子的稠合，该5或6个原子含有一个杂原子O(氧)。
本发明的化合物可以有利地在医药领域中使用。
因此，本发明进一步涉及药物组合物，它含有作为活性成分的与一种或多种药学上可接受的赋形剂或辅助剂组合的一种或多种本发明的化合物。
此外，本发明涉及本发明的化合物在制备药物产品中的用途，所述药物产品用于预防和治疗表达PPARγ受体和EGF受体的肿瘤如食道、胃、胰、结肠、前列腺、乳腺、子宫及附件、肾和肺的肿瘤。
而且，本发明涉及本发明的化合物在制备药物产品中的用途，所述药物产品用于治疗慢性炎症疾病如局限性回肠炎和溃疡性直肠结肠炎。本发明还涉及治疗人和/或哺乳动物(包括啮齿类、家畜、家养宠物、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、狗、猫、猪、羊、牛、马)的方法。
特别地，除了上述特定化合物之外，以下化合物可以用于上述应用：
5-氨基水杨酰(salicylo)-异羟肟酸(化合物5)
3-二甲氨基水杨酸(化合物6)
2-甲氧基-4-氨基苯甲酸(化合物7)
2-甲氧基-5-氨基苯甲酸(化合物8)
5-甲氨基水杨酸(化合物9)
4-甲氨基水杨酸(化合物12)
4-乙酰氨基水杨酸(化合物16)
2-乙氧基-4-氨基苯甲酸(化合物18)
2-乙氧基-5-氨基苯甲酸(化合物19)
4-二甲氨基水杨酸(化合物24)
2-乙氧基-4-氨基苯甲酰基异羟肟酸(化合物25)
6-羟基喹啉-5-甲酸(化合物27)
2-(2-丙基)氧基-4-氨基苯甲酸(化合物30)
4-(1-哌嗪基)水杨酸(化合物41)。
本发明的分子产生自分子模建工作，使用美沙拉秦作为基础，评估所有化学上可行的变型，以便在计算机对接实验中取得最好得分(受体的亲和力和激活)。因此，据认为显示了比得上美沙拉秦的功能和/或活性的本发明的化合物是通过相似的生物学途径发挥作用的。据认为本发明分子中固有的与美沙拉秦相似的特征赋予了该分子与EGF途径有关的相似活性。
本文给出的实验制得了用于预测已经讨论的不同医学领域中化合物的用途的良好模型。所用的模型给出了富有意义的结果，不论作用的机理。
除了上述化合物之外，本发明提供了使用以下化合物(化合物号码跟着前缀“2-”)：
Figure S2006800300279D00101
Figure S2006800300279D00111
现在将为了举例说明的目的而描述本发明，但是不限于此，根据其优选的实施方案，特别参考附图中的图。
                 附图和表格简述
图1A显示了化合物13、14、17、26、31和38的结构。
图1B显示了分子17和31激活PPARγ受体，相对于用5-ASA和罗格列酮处理的细胞。用PPARγ(2XCYP)的反应元件转染并用分子17和31(30mM)处理的HT-29STD细胞显示了诱导了报道基因的约两倍活性其显示5-ASA和新化合物17和31诱导PPARγ激活的能力；结果表达为相对于未处理细胞而言激活(均值±SEM)增加的倍数。也显示了化合物13、14、26和38的激活。
图2显示了化合物17、26和31诱导的上皮细胞表达PPARγ蛋白的增加；PPARγ蛋白的表达水平是在未处理的HT-29细胞(对照)及用新化合物或用作阳性对照的5-ASA(30mM)或罗格列酮(10-5M)处理24小时之后通过蛋白质印迹进行评估的。计算每种条件的PPARγ的光密度值，其与相同样品中β-肌动蛋白内部对照的量成比例。
图3显示化合物17和31抑制上皮细胞的增殖；与5-ASA(30mM)和罗格列酮(10-5M)类似，化合物17和31抑制HT-29STD细胞的增殖，相对于仅用培养基培养的细胞(对照)，通过用细胞核Ki-67(浅灰色)染色测试；细胞核使用Hoechst 33342溶液染色成蓝色(图中黑灰色)；结果表达为在一个实验中计数的细胞的平均数。
图4显示了化合物31诱导上皮细胞的凋亡；与5-ASA(30mM)和罗格列酮(10-5M)相似，分子31诱导HT-29STD细胞中的凋亡，其通过TUNEL测定法鉴定。3％的自发凋亡是在未处理的HT-29细胞中观察到的；结果表达为在一个实验中计数细胞的平均数。
图5显示了不同化合物与PPARγ结合方式的对接模拟；与根据PPARγ的X-射线晶体结构中白色表面代表的配体结合域(LBD)中原子类型染色的新化合物(13至38)的相互作用比较；新分子和PPARγ之间的关键氢结合相互作用的描述。
图5B显示了美沙拉秦与PPARγ受体结合方式的详细对接模拟方式。
图5C显示了化合物17与PPARγ受体结合方式的更详细对接模拟方式。
图5D显示了化合物31与PPARγ受体结合方式的更详细对接模拟方式。
图6显示了在转染的HT-29细胞中，化合物13、14、17、26、28、31和38的PPARγ活性分析。这表明，新分子增加了报道基因活性，从而显示了类似或优于5-ASA的活性。
图7-8显示了指定物质对三种不同人结肠癌细胞系(即，HT29、HT115和DLD1)增殖的作用。细胞用增加浓度的物质(0.5-10mM))处理48小时，使用测量BrdU结合的比色测定法测定增殖。光密度(OD)是在450nm处使用ELISA读出器测定的。数据表明三个单独实验的均值±SD。
图9显示了化合物14对DLD-1细胞增殖的抑制作用的流式细胞计分析。显示了获得相似结果的3个代表性实验之一。细胞是用CFSE标记的，在培养48小时之后使用流式细胞计计算其增殖百分数。
图10A显示了化合物14在1.5(p＜0.01)和3mM(p＜0.001)的浓度时显著地增强了DLD1细胞死亡。让DLD1未受刺激(Unst)或用化合物14处理48小时。数据表达了3个单独实验的均值±SD，并显示细胞死亡的百分比，如通过AV和/或PI-阳性细胞的FACS分析评估的。
图10B显示了Z-VAD(一种泛-半胱天冬酶抑制剂)逆转了化合物14对DLD-1细胞死亡的作用。结果显示为膜联蛋白-V-FITC的双参数直方图，PI荧光使得能区别存活细胞、具有完整膜的凋亡细胞及经受第二次坏死的细胞。显示了获得相似结果的3个代表性的实验之一。
表1.指定化合物的分级剂量(0.5-10mM)的DLD-1细胞抑制的百分比。细胞在化合物存在或不存在下培养，然后在48小时培养之后通过比色法(BrdU)测定法来测定细胞生长。
实施例1
制备4-氨基-N-羟基-2-甲氧基苯甲酰胺(化合物13)的方法
Figure S2006800300279D00131
将2-甲氧基-4-氨基苯甲酸甲酯(10g，55.25mmol)及盐酸羟胺(15.36g，221mmol)溶解于MeOH(80ml)，小心加入KOH(15.4g，275mmol)的MeOH(55ml)溶液。得到的混合物回流下搅拌36小时。真空下除去挥发物。将残留物溶于1M NaOH(50ml)并用乙酸乙酯(EtOAc，50m1)洗。缓慢加入浓HCl直到固体沉淀(pH是10)。过滤掉固体，用水洗，然后用甲基-叔丁基醚(MTBE)洗，真空干燥。1H NMR显示了固体含有约1/3摩尔当量的乙酸乙酯。将固体溶于1M NaOH(100ml)，真空除去EtOAc。小心加入浓HCl直至固体沉淀(pH是8)。过滤收集固体，用水洗，然后用MTBE洗，并真空干燥以得到4.67g(47％)的标题化合物，为暗红色固体。
1H NMR(δ，250MHz，d6-DMSO)：3.75(s，3-H，OMe)，5.64(s，2-H，NH2)，6.14(dd，1-H，芳香族的)，6.18(brs，1-H，芳香族的)，7.48(d，1-H，芳香族的)，8.73(s，1-H，NH)，10.06(s，1-H，OH)。
实施例2
制备5-氨基-N-羟基-2-甲氧基苯甲酰胺(化合物14)的方法
Figure S2006800300279D00141
将2-甲氧基-5-硝基苯甲酸甲酯(10g，47.39mmol)和盐酸羟胺(13.17g，189.56mmol)溶于MeOH(100ml)，小心加入KOH(13.27g，236.95mmol)的MeOH(55ml)溶液。值得注意的是观察到放热反应；固体开始溶解，然后固体从溶液中沉淀出来。酸洗的等分样TLC(EtOAc中运行)显示了起始苯甲酸酯和新产物的痕迹。加入H2O(100ml)，过滤收集任何未溶的固体，用异丙醇(IPA)洗，真空干燥得到10.23g(＞100％)的N-羟基-2-甲氧基-5-硝基苯甲酰胺，为白色固体。
1H NMR(δ，250MHz，MeOD)：4.18(3-H，OMe)，7.43(d，1-H，芳香族的)，8.39(dd，1-H，芳香族的)，8.83(d，1-H，芳香族的)
将N-羟基-2-甲氧基-5-硝基苯甲酰胺(约47.39mmol)溶于IMS(500ml)，并加入10％碳载钯(50％湿润)(1g)。混合物在50psi下氢化1.5小时，然后通过硅藻土过滤，硅藻土用2M NaOH(200ml)洗。真空除去MeOH，所得的含水残留物用MTBE(100ml)洗。小心加入浓HCl，将水相的pH降低至7，过滤收集得到的沉淀固体，用水洗，然后用MTBE洗并高真空干燥过夜以得到5.33g的标题化合物(62％)，为浅棕色固体。
1H NMR(δ，250MHz，d6-DMSO)：4.09(3-H，OMe)，7.02(1-H，芳香族的)，7.18(1-H，芳香族的)，7.28(1-H，芳香族的)，9.36(1-H，NH)，10.83(1-H，OH)。
实施例3
制备5-氨基-2，3-二氢苯并[b]呋喃-7-甲酸(化合物17)的方法
Figure S2006800300279D00151
把硝酸(9ml)加入2，3-二氢苯并[b]呋喃-7-甲酸(5.1g，31mmol)的三氟乙酸(45ml)的冷却(冰浴)溶液。4小时之后，混合物在冰水(150ml)中急冷，过滤混合物得到5-硝基-2，3-二氢苯并[b]呋喃-7-甲酸，其用水洗，在下一阶段使用粗制品(湿的)。
1H NMR(δ，250MHz，CD3OD)：3.70(2H，t，8.7Hz)，5.21(2H，t，8.9Hz)，8.67(1H，d，2.7Hz)，8.83(1H，d，2.4Hz)
将粗制的5-硝基-2，3-二氢苯并[b]呋喃-7-甲酸溶解于最少量的甲醇(1.3L)，氮气穿过溶液鼓泡20分钟。加入含5％炭载钯(1.0g)的水(20ml)的混合物，混合物装入2L高压釜。2次连续的排气-氮气吹扫之后，容器充至5巴H2，搅拌4天。混合物用氮气吹扫，硅藻土过滤，浓缩得到5-氨基-2，3-二氢苯并[b]呋喃-7-甲酸(3.5g，19.5mmol，2步63％)。
1H NMR(δ，250MHz，CD3OD)：3.46(2H，t，8.5Hz)，4.85(2H，t，8.7Hz)，7.19(1H，br s)，7.27(1H，br s)
实施例4
制备5-氨基-2-乙氧基-N-羟基苯甲酰胺(化合物26)的方法
步骤1
将2-羟基-5-硝基苯甲酸甲酯(11.82g，60mmol)、三苯基膦(17.29g，66mmol)和EtOH(3.03g，3.85ml，66mmol)溶于THF(150ml)，用冰冷却。小心加入偶氮二羧酸二异丙基酯(8.31g，10ml，66mmol)，反应在室温下搅拌1小时。反应在真空下浓缩，残留物用EtOAc(50ml)研磨。由此形成的固体通过过滤收集，用MTBE洗，真空干燥得到12.2g的粗制2-乙氧基-5-硝基苯甲酸甲酯。真空蒸发滤液，得到的残留物用EtOAc(25ml)研磨。所得固体通过过滤收集，用MTBE洗并真空干燥以得到6.31g的第二批的粗制2-乙氧基-5-硝基苯甲酸甲酯。将合并的2-乙氧基-5-硝基苯甲酸甲酯的部分溶于热IPA(50ml)并冷却至室温。得到的固体通过过滤收集，用MTBE洗并真空干燥以得到纯的2-乙氧基-5-硝基苯甲酸甲酯(5.49g，40.5％)，为黄色固体。
1H NMR(δ，250MHz，DMSO-d6)：1.38(3H，t，CH3CH2O)，3.85(3H，s，OMe)，4.28(2H，q，CH3CH2O)，7.38(1H，d，芳香族的)，8.40(1H，dd，芳香族的)，8.48(1H，d，芳香族的)。
步骤2
将2-乙氧基-5-硝基苯甲酸甲酯(6.099g，26.99mmol)和50％wt/v的羟胺水溶液(40ml)溶于MeOH(100ml)并在室温下搅拌过夜。过滤收集得到的沉淀的黄色固体，用IPA洗，真空干燥。滤液真空蒸发，残留物用IPA(25ml)研磨。滤掉未溶的固体，用最少量的IPA洗，并真空干燥。将两次得到的固体混悬于水(300ml)中，小心加入浓盐酸降低pH至2。滤掉固体，用MTBE洗，并真空干燥以得到3.9g的粗制2-乙氧基-5-硝基-N-羟基苯甲酰胺。将来自以上的IPA母液与粗制2-乙氧基-5-硝基-N-羟基苯甲酰胺合并，真空蒸发。残留物用CH2Cl2(25ml)研磨，滤掉固体并真空干燥得到2-乙氧基-5-硝基-N-羟基苯甲酰胺(2.39g，39％)，为黄色固体。
1H NMR(δ，250MHz，DMSO-d6)：1.39(t，3-H，CH3CH2O)，4.28(q，2-H，CH3CH2O)，7.34(d，1-H，芳香族的)，8.38(dd，1-H，芳香族的)，8.48(d，1-H，芳香族的)，9.32(s，1-H，NH)，10.79(s，1-H，OH)。
步骤3
将2-乙氧基-5-硝基-N-羟基苯甲酰胺(2.39g，1.06mmol)混悬于EtOH(50ml)中并加入10％碳载钯(湿基)(240mg)。混合物在50psi下氢化1.5小时。加入MeOH(50ml)，通过硅藻土过滤混合物。真空下除去挥发物，将残留物溶于IPA(50ml)。混合物在60℃下加热0.5小时，然后在室温下保持过夜。过滤收集沉淀的固体，用MTBE洗，真空下干燥得到1.51g的5-氨基-2-乙氧基-N-羟基苯甲酰胺(73％)，为米色固体。
1H NMR(δ，250MHz，DMSO-d6)：1.28(t，3-H，CH3CH2O)，3.97(q，2-H，CH3CH2O)，4.81(s，2-H，NH2)，6.61(dd，1-H，芳香族的)，6.80(d，1-H，芳香族的)，6.87(d，1-H，芳香族的)，9.00(s，1-H，NH)，10.35(s，1-H，OH)。
实施例5
制备6-氨基-2，2-二甲基-4H-苯并[1，3]二_英-4-酮(化合物28)的方法
Figure S2006800300279D00171
步骤1
将5-硝基水杨酸(25g，136.6mmol)溶于丙酮(20ml)，加入三氟乙酸(150ml)和三氟乙酸酸酐(50ml)。混合物回流下加热。1小时之后，加入更多丙酮(30ml)，反应在回流下加热48小时。反应冷却至室温，真空下除去挥发物。得到的棕色油溶解于CH2Cl2(400ml)并用1∶1的H2O/饱和NaHCO3(400ml)洗。水相用CH2Cl2(2×200ml)萃取，干燥(MgSO4)合并的有机层，真空下蒸发。固体残留物用戊烷(150ml)研磨，过滤收集，用戊烷彻底地洗，并真空干燥以得到6-硝基-2，2-二甲基-4H-苯并[1，3]二_英-4-酮(27.84g，91％)，为暗黄色固体。
1H NMR(δ，250MHz，CDCl3)：1.79(s，6-H，CH3)，7.13(d，1-H，芳香族的)，8.43(dd，1-H，芳香族的)，8.87(d，1-H，芳香族的)。
步骤2
将6-硝基-2，2-二甲基-4H-苯并[1，3]二_英-4-酮(5g，22.42mmol)溶于EtOH(35ml)，加入10％碳载钯(湿基)(2.37g)。混合物在50psi下氢化1小时。混合物通过硅藻土过滤，真空下除去挥发物。加入IPA(50ml)，混合物在60℃下加热5分钟，然后使其冷却至室温。过滤得到的固体，用MTBE洗，真空下干燥得到2.93g的6-氨基-2，2-二甲基-4H-苯并[1，3]二_英-4-酮(68％)，为黄色固体。
1H NMR(δ，250MHz，CDCl3)：1.71(s，6-H，CH3)，6.80(d，1-H，芳香族的)，6.93(dd，1-H，芳香族的)，7.26(d，1-H，芳香族的)
实施例6
制备5-氨基-2-异丙氧基苯甲酸(化合物31)的方法
Figure S2006800300279D00191
将2-羟基-5-硝基苯甲酸甲酯(11.82g，60mmol)、三苯基膦(17.29g，66mmol)及iPrOH(3.96g，5ml，66mmol)溶于THF(150ml)，并在冰中冷却。小心加入偶氮二羧酸二异丙基酯(8.31g，10ml，66mmol)，反应在室温下搅拌过夜。真空下除去挥发物，残留物用EtOAc(50ml)处理。过滤除去未溶的固体，真空下蒸发滤液至干燥。残留物通过柱色谱法纯化得到2-异丙氧基-5-硝基苯甲酸甲酯(6.92g，48.5％)，为黄色油。
将2-异丙氧基-5-硝基苯甲酸甲酯(6.92g，28.95mmol)溶于THF/H2O(各自35ml)，并加入LiOH(1.39g，57.9mmol)。混合物在室温下搅拌过夜，加入浓盐酸降低pH至1，产物用乙酸乙酯(50ml)萃取。干燥(MgSO4)有机层，蒸发得到2-异丙氧基-5-硝基苯甲酸(6.02g，92.5％)，为黄色固体。
1H NMR(δ，250MHz，DMSO-d6)：1.32(d，6-H，CH3)，4.88(七重峰，1-H，CH)，7.37(d，1-H，芳香族的)，8.32(dd，1-H，芳香族的)，8.40(d，1-H，芳香族的)，13.13(s，1-H，CO2H)。
将2-异丙氧基-5-硝基苯甲酸(6.02g，26.75mmol)混悬于EtOH(100ml)中，加入10％的碳载钯(湿基)(600mg)。混合物在50psi下氢化2小时。混合物通过硅藻土滤过，真空除去挥发物。残留物用IPA研磨，滤掉得到的固体，用MTBE洗，真空干燥得到4.15g的5-氨基-2-异丙氧基苯甲酸(79.5％)，为浅黄色固体。
1H NMR(δ，250MHz，DMSO-d6)：1.21(d，6-H，CH3)，4.33(七重峰，1-H，CH)，7.68(dd，1-H，芳香族的)，6.84(d，1-H，芳香族的)，6.89(d，1H，芳香族的)
实施例7
制备4-二异丙基氨基水杨酸(化合物38)的方法
Figure S2006800300279D00201
将5-氨基水杨酸(3.3g，21.6mmol)、2-碘丙烷(9.1g，53.9mmol)及碳酸钾(7.4g，54mmol)的混合物在50℃在IMS(300ml)和水(100ml)中搅拌4天。停止加热，混合物浓缩成固体，其用100ml CH2Cl2洗。弃去洗液，固体在40℃在IMS(200ml)中加热30分钟。加热停止时，加入硫酸镁，继续搅拌25分钟，过滤除去无机固体之后，溶液浓缩，用二氧化硅色谱法(洗脱剂：10-20％甲醇/CH2Cl2)纯化。这得到0.51g的4-二异丙基氨基水杨酸。
1H NMR(δ，250MHz，d6-DMSO)：1.51(12H，br d，5.75Hz)，3.9-3.5(1H，br)，4.41(2H，br)，7.21(1H，d，8.8Hz)，7.70(1H，dd，8.8，2.7Hz)，8.12(1H，br s)
实施例8
研究本发明的新化合物对PPARγ激活/表达及细胞增殖和凋亡的调节的作用
材料和方法
化合物
5-ASA是自Sigma-AldrichTM(St Quentin Fallavier，法国)购得。罗格列酮是在Spi BioTM(Massy，France)获得。新分子13、14、17、26、31、38(图1A)是由Giuliani SpATM(Milano，意大利)赠予并由SAFC PharmaTM(Manchester，英国)合成。
细胞系
将结肠癌细胞系HT-29STD(ATCC HTB-38)常规地生长在补充了10％热-FCS和抗生素的DMEM中。细胞是单层生长，在37℃的5％CO2和95％相对湿度下培养。
用PPARγ瞬时转染并刺激细胞
根据生产商的说明书，HT-29STD细胞使用EffecteneTM转染试剂(QiagenTM)瞬时转染。为了测试PPARγ激活，我们用含有从细胞色素p450 4A(2XCYP)(1)得到的两拷贝PPRE的500ng最小启动子构建体进行转染。海鳃萤光素酶质粒(0.1μg/孔)也转染，作为监测转染效率和标准化萤火虫萤光素酶活性的内部对照。使转染的细胞在37℃下培养48小时。在细胞培养之后，在3-6-9-12-15-18-24小时期间使用浓度30mM的化合物13、14、17、26、31、38进行刺激，与用作阳性对照的PPARγ合成的配体5-ASA 30mM(2)和罗格列酮10-5M(2)比较。用NaOH调节药物溶液的pH至7.4。使用Passive溶胞缓冲液(PromegaTM，Madison，Wis.)制得总的细胞提取物。根据生产商的实验设计，使用PromegaTM双重萤光素酶测定系统测定20μl提取物中萤光素酶活性。一式三份在至少三个单独的实验中测定转染。萤光素酶活性表达为在用不同分子处理的细胞中获得的活性除以非刺激的细胞中的萤光素酶活性所得的倍数。
通过蛋白印迹分析评价PPARγ和β-肌动蛋白
在提取缓冲液中通过细胞匀浆化得到总的蛋白质，所述缓冲液是由含2％TritonTM的PBS、100mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)及传统的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(2)组成的。总蛋白质然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并电印迹。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜使用针对PPARγ的兔多克隆一抗(稀释度1/500，TEBU，Le Perray en Yveline，法国)孵培养过夜。使用稀释1/10,000的兔单克隆一抗(Sigma)检测β-肌动蛋白。使用二级过氧化物酶缀合的抗体(1/1000，DakoTM，Trappes，法国)和化学发光进行免疫检测，根据生产商的实验设计(ECLTM，AmershamPharmacia BioteehTM，Orsay，法国)。得到每种条件下的PPARγ的光密度值，其与相同样品中内部对照β-肌动蛋白的量成比例(2)。
使用Ki-67免疫染色分析细胞增殖
在24小时的培养之后，HT-29STD细胞在24小时期间使用30mM的新分子13、14、17、26和31处理。5-ASA(30mM)和罗格列酮(10-5M)用作阳性对照。分子38(实施例7)不包含在此实验中，因为其溶解度低。使用NaOH调节药物溶液的pH至7.4。细胞固定在4％PFA中，在4℃含有0.1％Triton X-100TM的PBS中渗透化，然后与山羊正常血清和阻断缓冲液(含1％BSA的PBS)培养至抗体的非特异性吸附最小化。
细胞增殖是通过细胞核Ki-67染色测定的，使用针对Ki-67的小鼠单克隆一抗(稀释度1∶50过夜；ZYMEDTM，ClinisciencesTM，Montrouge，法国)。使用缀合至吖啶红荧光染料(稀释度1∶100，Molecular ProbesTM，InvitrogenTM，Cergy Pontoise，法国)的Alexa 594驴抗小鼠IgG展现一抗。细胞核使用Hoescht 33342溶液(0.125mg/ml)(Sigma-AldrichTM)染色，并在荧光显微镜(LeicaTM，Bensheim，德国)下显影。阴性对照是由使用非特异性小鼠血清代替特异性抗体染色构成的。在一个实验中，至少500个细胞/样品的计数是系统盲法(blindly)完成的。结果表达为染色细胞数的平均值±SEM。
凋亡的检测
在24小时的培养之后，HT-29STD细胞在24小时期间使用30mM的新分子13、14、17、26和31处理。5-ASA(30mM)和罗格列酮(10-5M)是用作阳性对照。分子17和38(实施例3、7)不包含在此实验之内，由于其差溶解度。使用NaOH调节药物溶液的pH至7.4。使用末端转移酶dUTP切口末端标记测定盒(TUNEL盒，RocheDiagnosticsTM，Meylan，法国)通过酶标记DNA链来鉴定经受凋亡的细胞。在一个实验中，至少500个细胞/样品的计数是系统盲法完成的。
结果表达为染色细胞数的平均值±SEM。
结果
已经观察到，新分子17(实施例3)和31(实施例6)诱导PPARγ激活。化合物26(实施例4)也诱导PPARγ，但是程度较低。PPARγ的激活导致级联反应，所述反应导致结合特异性的DNA序列元件(称为过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)(7-9))。
我们通过使用海鳃萤光素酶PPRE质粒瞬时转染上皮细胞，研究了PPARγ转录活性。细胞在24小时期间使用不同的分子刺激。转染的HT-29细胞中PPARγ活性的分析显示了，新分子17(实施例3)和31(实施例6)在30mM浓度下增加了报道基因活性2倍，由此显示了与5-ASA和罗格列酮相似的活性(图1B)。分子13、14和38(实施例1、2、7)在30mM浓度下对上皮细胞发挥了快速细胞毒性效应，限制了在6小时之后研究PPARγ的激活(图1B)。
新分子17、26和31诱导PPARγ表达。在HT-29细胞系中，在蛋白质水平上，新分子诱导PPARγ表达的能力。在24小时期间用分子17、26和31处理的细胞中观察到由蛋白质印迹量化的平均2倍的PPARγ蛋白质水平的诱导(图2)。
新分子17和31(实施例3和6)抑制了上皮细胞增殖。我们在HT-29STD细胞系中评估了新分子在细胞增殖调节方面的作用(图3)。通过在增殖细胞中表达的细胞核蛋白Ki-67染色测定细胞增殖，Ki-67的存在对于保持细胞增殖是必要的(10)。比较未处理的细胞，HT-29细胞与分子17和31(30mM)培养24小时产生67-75％细胞增殖的抑制(图3)。没有测试化合物26的细胞增殖效应，因为其作为PPAR-γ激活剂具有较小作用。
用在其最佳浓度下使用的两个阳性对照罗格列酮(10-5M)和5-ASA(30mM)，观察到类似结果。证实分子13、14和26(实施例1、2、4)的潜在抗促细胞分裂效应受其在此浓度下对上皮细胞的快速细胞毒效应限制(未显示数据)。
通过PPARγ，新分子31(实施例6)诱导上皮细胞凋亡。与罗格列酮和5-ASA相似地，分子31在80％的上皮细胞中显示凋亡，其是通过使用末端转移酶dUTP切口末端标记(TUNEL)标记DNA链断裂鉴定的(图4)。与先前的实验类似地，30mM分子13、14和26诱导快速细胞毒性效应，阻碍了细胞凋亡分析。
实施例9
研究新化合物对于PPARγ激活的影响
材料和方法
化合物
5-ASA是在Sigma-AldrichTM(St Quentin Fallavier，法国)购得。新分子13、14、17、26、28、31、38(图1A)是根据实施例1-7所述的合成的。
细胞系
将结肠癌细胞系HT-29STD(ATCC HTB-38)常规生长于补充了10％热-FCS和抗生素的DMEM。细胞是单层生长，在37℃、5％CO2和95％相对湿度下培养。
使用PPARγ瞬时转染和刺激细胞
根据生产商的说明书，HT-29STD细胞使用EffecteneTM转染试剂(QiagenTM)瞬时转染。为了测试PPARγ激活，我们使用含有从细胞色素p450 4A(2XCYP)得到的两拷贝PPRE的500ng最小启动子构建体进行转染(1)。海鳃萤光素酶质粒(0.1μg/孔)也转染，作为监测转染效率和标准化萤火虫萤光素酶活性的内部对照。使转染的细胞在37℃下培养24小时。在细胞孵育后在18小时期间，使用浓度1mM的化合物13、14、17、26、28、31和38(参见图6)进行刺激，对比用作阳性对照的两个30mM的PPARγ合成配体5-ASA(2)。用NaOH调节药物溶液的pH至7.4。使用Passive溶胞缓冲液(PromegaTM，Madison，Wis.)制备总的细胞提取物。根据生产商的实验设计，使用PromegaTM双重萤光素酶测定系统测定20μl提取物中萤光素酶活性。一式三份在至少三个单独的实验中测定转染。萤光素酶活性表达为在用不同分子处理的细胞中获得的活性除以非刺激的细胞中萤光素酶活性所得的倍数。
结果
PPARγ的激活导致级联反应，所述反应导致结合特异性的DNA序列元件(称为过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)(7-9))。
我们通过使用海鳃萤光素酶PPRE质粒瞬时转染上皮细胞，研究了PPARγ转录活性。为了评价新分子是否较5-ASA更有效刺激PPAPγ激活，我们在1mM浓度下试验了这些分子。将在1mM浓度下新分子的作用同用作阳性对照的30mM最佳浓度的5-ASA比较。细胞在24小时期间使用不同的分子刺激。转染HT-29细胞中PPARγ活性的分析显示了，新分子增加了报道基因活性，由此显示了类似于或优于5-ASA的活性(新分子的浓度是小30倍，参见图6)。
实施例10
研究化合物对于结肠癌细胞生长的效应
试验以下物质13、14、17、26、28、31和38它们调节结肠癌细胞生长的能力。没有使用化合物28进行实验，因为这种物质不溶于培养基。
就此目的，使用三种人结肠癌细胞系(即，HT-29、HT-115和DLD-1)。这些细胞类型是基于环氧合酶-2(COX-2)表达来选择的。实际上，HT-115细胞表达生物学活性COX-2，HT-29细胞表达无功能的COX-2同工型，而DLD-1是COX-2-缺乏的细胞。
HT-29和DLD-1细胞分别在McCoy和RPMI1640培养基中培养，所述培养基补充了10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素(P/S)及50μg/ml的庆大霉素。HT-115是在补充了15％FBS和1％P/S的DMEM培养基中培养。细胞保持在37℃的存在5％CO2的加湿培养箱中。
对于细胞生长测定，单细胞悬浮液以2×103细胞/孔(HT115是4×103细胞/孔)接种在含0.5％FBS的培养基的96-孔培养皿中，并使其粘附。然后除去非粘附的细胞，向各孔中加入含有0.5％FBS的新鲜培养基。在存在或不存在指定物质下培养细胞。各个物质溶解在含0.5％FBS的培养基中作为25mM储备液，如果需要，用NaOH调节各个储备液的pH至7.4。物质是在0.5-10mM的最终浓度下使用的。通过使用商业上可购得的细胞增殖试剂盒(Roche DiagnosticsTM，Monza，意大利)测量掺入DNA的5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)来测定细胞增殖。BrdU在培养的最后6小时期间加入细胞培养物，在48小时培养之后使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)评估BrdU-阳性细胞水平。
在450nm处使用ELISA读数器测定光密度(OD)。实验是一式三份进行的，结果报告为均值±标准差(SD)。
为了进一步评估化合物14对结肠上皮细胞生长的效应，将血清饥饿的DLD-1细胞在37℃下在0.2μM羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺基酯(CFSE)(InvitrogenTM，Milan意大利)中培养30分钟，然后彻底地洗，并在加入或未加入化合物下培养。在培养2天之后，评估CFSE荧光，测定经受分裂的细胞的比例，因此允许计算前体频率和增殖指数。
还评估化合物14对结肠上皮细胞死亡的效应。为此目的，细胞按照如上指出的培养2天，然后使用商业上可得到的试剂盒(BeckmannCoulterTM，Milan，意大利)评估膜联蛋白V(AV)和/或碘化丙锭(propidium iodide)(PI)-阳性细胞的百分数。为了评估化合物14对结肠上皮细胞死亡的作用是否依赖于半胱天冬酶活性，在加入化合物14(1.5mM)之前，细胞使用z-VAD-fmk(40μM)(一种泛-半胱天冬酶抑制剂)预培养1小时。AV和PI-阳性细胞的百分数是在根据如上指出的培养48小时之后测定。
结果
化合物抑制结肠癌细胞生长的能力各不相同。结果是如图7和8所示。表显示了指定化合物抑制DLD-1细胞生长的百分比。物质13、14、17、26和38显示了显著的抗增殖效应。在这些物质中，化合物13和14以剂量依赖方式显著地降低了试验的三个细胞系每一个中的细胞生长(图7A和7B)。当在10mM的最终浓度下使用化合物时，观察到超过90％的细胞生长抑制作用。仅在2.5mM或更高浓度下观察到化合物17、26和38的抗促细胞分裂效应(图8A、8C、7D)。
化合物31在高剂量(10mM)使用时，显著地抑制细胞生长(图7C)。
全部以上数据表明，物质13、14和38是结肠癌细胞生长最有效的抑制剂。然而，细胞培养物中产生的沉淀物是在物质13和38存在下进行的。这接着是大量细胞死亡，这使得难于判断这些化合物的抗增殖效应是由于其抗促细胞分裂作用，还是由于其毒性作用所致。基于这些发现，随后的实验集中于化合物14的使用。
首先，通过流式细胞仪证实化合物14对DLD-1细胞生长的抑制作用。为了追踪细胞增殖，细胞用CFSE标记。与BrdU测定数据一致，化合物14抑制DLD-1细胞的增殖(图9)。重要地，在处理48小时之后，增殖细胞的百分数从未处理的培养物中的90±4％减少到用0.5、1和2.5mM处理的细胞培养物中的48±7、21±11和11±6％。
为了检查化合物14是否还调节结肠癌细胞的存活，DLD-1细胞在存在或不存在该化合物下培养48小时，然后通过流式细胞计量术评估膜联蛋白V和/或PI-阳性细胞的百分比。如图10A所示，化合物14在1.5或3mM的最终浓度使用时，显著地提高了细胞死亡的百分数。为了探究半胱天冬酶是否参与化合物14-介导的DLD-1细胞死亡，细胞用泛-半胱天冬酶抑制剂Z-VAD预培养，然后用化合物14处理。如图10B代表性实验中所示，用Z-VAD处理细胞大大地降低了AV/PI-阳性细胞的百分比。
分级剂量(0.5-10mM)的指定化合物抑制DLD-1细胞的百分比列在表1中。细胞在存在或不存在化合物下进行培养，然后在48小时培养之后通过比色(BrdU)测定法测定细胞生长。
实施例11
建立分子模型
分子建模研究是使用在Silicon GraphiesTM工作站上运行的SYBYL软件6.9.1版(Tripos Associates IncTM，St Louis，MO)完成的。由标准碎片库，建造5-ASA的两性离子形式的三维模型，随后使用Tripos力场(3)优化其几何形状。由于化合物的pKa仍然是未知的，使用SPARC在线计算器来测定在生理学pH(7.4)下存在的种类(http://ibmlc2.chem.uga.edu/sparc/index.cfm)。离子化化合物的三-维模型是由标准碎片库建造的，其几何形状随后使用Tripos力场(3)优化，包括由Gasteiger和Hückel原子电荷计算的静电项。在Maximin2程序中可用的Powell的方法用于能量最小化，直至梯度值小于0.001kcal/mol._。人PPARγ配体-结合域的结构是由其与在RCSB蛋白质数据库(1I7I)(4，5)可得到的tesaglitazar(AZ 242)络合的X-射线晶体结构获得。使用GOLD软件(6)完成化合物在受体活性位点中的柔性对接。最稳定的对接模型是根据GoldScore(6)和X-Score评分函数(7)预测的最好得分构象选择的。使用在Maximin2程序中可用的Powell方法和Tripos力场以及4.0的介电常数，使络合物能量降低到最小直至梯度值达到0.01kcal/mol._。使用退火函数定义配体热区域(10_)。
对接研究
通过与被认为是分子识别及PPARγ激活所需的关键决定子的His-323、His-449、Tyr-473和Ser-289的氢键合相互作用，所有新分子紧密地适合PPARγ-LBD(11-12)(图5A、5C、5D)。5-ASA的对接是如图5B所示。
结论
先前已经显示，5-ASA的抗炎作用是通过结肠中主要由上皮细胞表达的PPARγ介导的(2)。基于对接分析的首先六个新的优化的5-ASA分子的合理发展显示了2个分子31和17，在30mM的浓度下使用，激活PPARγ并诱导其被肠上皮细胞的表达。这两个新分子还抑制上皮细胞增殖并诱导凋亡，它们是参与结肠癌的发生促进PPARγ激活的两个重要的机制。关于四个其他分子(13、14、26、38)，其大多数在30mM的浓度时对上皮细胞具有直接的细胞毒性作用，阻碍分析PPARγ激活及细胞增殖和凋亡的调节和评估。
本发明该第一组的实例(实施例8)显示了两个优化分子31和17刺激PPARγ表达和激活，以及调节上皮细胞增殖和凋亡的能力。化合物13、14和26在30mM时对上皮细胞的细胞毒性作用可能与其结构中存在高度活性的异羟肟酸基团有关，已知所述基团对很多不同酶显示了大的亲和力。
本发明第二组的实例(实施例9)表明，在30倍小于5-ASA的工作浓度的工作浓度下在24小时期间，其他试验分子也显示了相似于或优于5-ASA的活性。
本发明最后组的实例(实施例10)显示了，化合物影响结肠癌细胞系HT-29、HT-115和DLD1生长的不同程度的抑制，化合物13、14和38显示了最高的效应。为了阐明细胞死亡的性质，对化合物14进行了进一步研究并用流式细胞术证实在随着时间增加浓度下，抑制DLD-1结肠癌细胞的生长。
这些分子对于不表达COX-2的细胞也是有效的，因此本发明的分子可以用于不表达COX-2的细胞，用于治疗肿瘤及本文描述的其他应用的目的。
总的结论
合成的最高等级的化合物，根据建模研究表明，全部显示了与美沙拉秦相似的活性/优于美沙拉秦的活性。
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Claims (30)

1、通式(I)的化合物
Figure S2006800300279C00011
其中
R1和R2，其可以是相同或不同的，选自-H、-CnH2n-1、具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，或者一起形成具有5或6个原子的芳香族环或脂肪族环；
R3选自-CO-CH3、-NHOH、-OH、-OR6，其中R6是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基；
R4选自H、具有1至6个碳原子的直链或支链烷基、苯基、苄基、-CF3或-CF2CF3、乙烯基或烯丙基；R5、R7、R8是氢原子；或者
R3和R4、R4和R5、或R7和R8一起形成环，该环与苯环、具有5或6个原子的芳香族环或脂肪族环稠合，所述5或6个原子含有1至2个独立地选自N、O的杂原子。
2、权利要求1的化合物，其中具有1至6个碳原予的直链或支链烷基选自-CH3、-C2H5、异丙基、丙基、-CnH2n-1。
3、权利要求1的化合物，其中R3和R4形成下式(II)的环
Figure S2006800300279C00012
4、权利要求1的化合物，其中R4和R5形成下式(III)的环
Figure S2006800300279C00021
5、权利要求1的化合物，其中R7和R8形成下式(IV)或(V)的环
Figure S2006800300279C00022
6、根据上述权利要求任一项的式(I)化合物，其中该化合物选自：
4-氨基-N-羟基-2-甲氧基苯甲酰胺
5-氨基-N-羟基-2-甲氧基苯甲酰胺
5-氨基-2，3-二氢苯并呋喃-7-甲酸
5-氨基-2-乙氧基-N-羟基苯甲酰胺
6-氨基-2，2-二甲基-4H-苯并[1，3]二_英-4-酮
1，2，3，4-四氢-6-羟基喹啉-5-甲酸
5-氨基-2-异丙氧基苯甲酸
6-甲氧基喹啉-5-甲酸
6-甲氧基-1，2，3，4-四氢喹啉-5-甲酸
5-二异丙基氨基水杨酸
4-二异丙基氨基水杨酸。
7、权利要求1的化合物，其中R1和R2均是-CH(CH3)2。
8、权利要求7的化合物，包含以下结构：
Figure S2006800300279C00031
9、权利要求1的化合物，其中R1和R2均是-H。
10、权利要求1或9的化合物，其中R3是-NHOH。
11、权利要求10的化合物，包含以下结构
Figure S2006800300279C00032
12、权利要求10的化合物，包含以下结构
Figure S2006800300279C00033
13、权利要求10的化合物，包含以下结构
Figure S2006800300279C00034
14、权利要求9的化合物，其中R3是-OH。
15、权利要求14的化合物，包含以下结构
16、权利要求14的化合物，包含以下结构
Figure S2006800300279C00042
17、权利要求3的化合物，包含以下结构
Figure S2006800300279C00043
18、一种药物组合物，它包含作为活性成分的权利要求1至17任一项中定义的一种或多种化合物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或辅助剂。
19、权利要求1至17任一项的化合物或权利要求18的药物组合物的用途，用于医疗领域中。
20、权利要求1至17任一项的化合物或权利要求18的药物组合物在制备用于预防和治疗表达PPARγ受体和EGF受体的肿瘤的药物产品中的用途。
21、根据权利要求20的用途，其特征在于所述肿瘤选自食道、胃、胰、结肠、前列腺、乳腺、子宫及附件、肾和肺的肿瘤。
22、权利要求1至17任一项的化合物或权利要求18的药物组合物在制备用于治疗慢性炎症疾病的药物产品中的用途。
23、根据权利要求22的用途，其特征在于所述慢性炎症疾病选自局限性回肠炎和溃疡性直肠结肠炎。
24、权利要求1至17任一项的化合物或权利要求18的药物组合物在制备用于治疗慢性炎症疾病的药物产品中的用途。
25、根据权利要求19至24任一项的用途，其特征在于所述化合物选自：
5-氨基水杨酰基-异羟肟酸
3-二甲氨基水杨酸
2-甲氧基-4-氨基苯甲酸
2-甲氧基-5-氨基苯甲酸
5-甲氨基水杨酸
4-甲氨基水杨酸
4-乙酰氨基水杨酸
2-乙氧基-4-氨基苯甲酸
2-乙氧基-5-氨基苯甲酸
4-二甲氨基水杨酸
2-乙氧基-4-氨基苯甲酰基异羟肟酸
6-羟基喹啉-5-甲酸
2-(2-丙基)氧基-4-氨基苯甲酸
4-(1-哌嗪基)水杨酸。
26、权利要求19至24任一项的用途，其特征在于所述化合物选自化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物12、化合物15、化合物16、化合物18、化合物19、化合物24、化合物25、化合物27、化合物29、化合物36、化合物37、化合物41、化合物42。
27、一种治疗人或动物的方法，它包括用权利要求1至17任一项的化合物或权利要求18的药物组合物或权利要求19至26任一项的用途治疗所述人或动物。
28、实质上如本文参照附图和表格所述的化合物。
29、实质上如本文参照附图和表格所述的用途。
30、实质上如本文参照附图和表格所述的药物组合物。
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