CN101230344B - 一种快速提取真菌dna的sls裂解液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速提取真菌DNA的SLS裂解液，由以下组分组成(以溶液总体积计)：N-月桂酰肌氨酸钠1～3g/100ml、Tris-HCl 150～300mmol/L、NaCl 150～300mmol/L、EDTA 50～100mmol/L，pH 7.5～8.5。本发明的SLS裂解液以N-月桂酰肌氨酸钠为主要功能成分配制DNA提取液，将其用于真菌DNA的提取，利用其良好的生物降解性特点，直接破碎病原真菌细胞壁，避免了传统真菌DNA提取方法中繁琐的物理破除细胞壁的过程，极大简化了DNA的提取。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种快速提取真菌DNA的SLS裂解液及其应用。
背景技术
常用的真菌DNA提取方法有CTAB提取法(Saghai，M.A.，K.M.Soliman，R.A.Jorgensen & R.W.Allard，1984，Ribosomal DNA spacer-lengthpolymorphism in barley：Mendelian inheritance，chromosomal location andpopulation dynamics.Prov.Natl.Acad.Sci.USA，81(24)：8014-8018.)、尿素提取法(Sun，Y.，W.Zhang，F.Li，Y.Guo，T.Liu & H.Huang，2000，Identification and genetic mapping of four novel genes that regulate leafdevelopment in Arabidopsis.Cell Research，10(4)；325-335.)、SDS提取法(He，Y.Q.，2000，An improved protocol for fungal DNA preparation.Mycosystema，19(3)：434.)等。这些方法的主要技术路线是：利用液体培养基培养真菌，收集菌丝，用液氮研磨破碎细胞壁，再用各提取液提取DNA，经过纯化获得DNA沉淀。通过这些方法一次可提取大量DNA，但这类方法存在费时费力等缺点：
(1)不包括菌丝培养，仅平均提取时间就需要3h～12h；
(2)加液氮后，需要强力研磨，实际操作难度较大；
(3)一次提取的样品数量受研钵数量的限制，且容易产生交叉污染。
在一些利用已知序列开展真菌的分子鉴定、系统进化研究、抗药性分子检测和转化子鉴定等工作当中，往往一次需要提取很多种样品的DNA，而对每种样品的DNA的需求量不大。因此，建立一种快速简便的真菌DNA提取方法十分必要。
N-月桂酰肌氨酸钠(SLS)是一种阴离子型氨基酸类表面活性剂，具有低毒、低刺激性和良好的生物降解性等特点(李红、黎四芳、蔡兰珍，2004，N-月桂酰肌氨酸钠的合成与应用。精细石油化工进展，5(3)：35-38)。
中国专利申请01142507.5公开了一种DNA提取方法，包括以下步骤：(1)用裂解液处理样品并离心得到含有DNA的上清；(2)过滤步骤(1)中的上清得到滤液；(3)向上述(2)的滤液中加入萃取剂处理并离心得到上清液；(4)向上述(3)中的上清中加入树脂用于吸附DNA；(5)洗脱吸附于树脂上的DNA并离心得到含有DNA的滤液；(6)沉淀滤液中的DNA。
该专利提取DNA的方法操作复杂，步骤繁琐，费时费力。
发明内容
本发明提供了一种快速提取真菌DNA的SLS裂解液，该裂解液应用于真菌DNA的提取，可简化操作步骤，提高DNA的提取效率，降低成本。
一种快速提取真菌DNA的SLS裂解液，由以下组分组成(以溶液总体积计)：
N-月桂酰肌氨酸钠 1～3g/100ml
Tris-HCl 150～300mmol/L
NaCl 150～300mmol/L
EDTA 50～100mmol/L
水 余量
PH值为7.5～8.5。
保持裂解液的弱碱性，有利于提高对真菌细胞的裂解作用。
上述SLS裂解液应用于提取真菌DNA的方法，包括以下步骤：
(1)将真菌菌丝加入SLS裂解液中，在50～80℃下水浴加热10～15min后离心。
离心转速为13000r/min～15000r/min。
(2)将萃取剂加入步骤(1)离心所得的上清液中抽提DNA，再次离心。
萃取剂为氯仿和异戊醇的混合溶剂，体积比为24∶1，也可选用苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶剂，其体积比为25∶24∶1。萃取剂与步骤(1)制得的上清液体积比为1∶1～2∶1。
离心转速为13000r/min～15000r/min。
(3)将DNA沉淀剂加入步骤(2)离心所得的上清液中混合均匀，静置后离心沉淀DNA。
所述的DNA沉淀剂为无水乙醇或异丙醇。
DNA沉淀剂与步骤(2)离心所得的上清液体积比为2∶1～3∶1。
离心转速为13000r/min～15000r/min。
(4)将DNA沉淀用70％～75％的乙醇洗涤后干燥。
本发明提供的快速提取真菌DNA的SLS裂解液以N-月桂酰肌氨酸钠为主要功能成分配制DNA提取液，将其用于真菌DNA的提取，利用其良好的生物降解性特点，直接破碎病原真菌细胞壁，避免了传统真菌DNA提取方法中繁琐的物理破除细胞壁的过程，极大简化了DNA的提取。
本发明的SLS裂解液应用于真菌DNA提取，与传统方法相比具有以下优点。
(1)在常用的固体平板培养基上培养真菌即可，不需液体培养，操作简便。
(2)对原料菌丝需求量少，单个6cm培养皿，约10ml固体培养基培养的菌丝量即能满足提取需要。
(3)不需液氮研磨等繁琐的物理破壁过程，避免交叉污染。
(4)提取过程温和，有效保护DNA免受损伤。
(5)快速便捷，全程提取时间仅需1h。
(6)提取DNA过程中所用的试剂都是常用、廉价的生化试剂，水浴锅和台式离心机也是实验室常备仪器。
因此，与其他常用的DNA提取方法相比，具有简便、高效、快速和价廉等特点，能在短时间内完成对大量样品的DNA提取。用此法提取的DNA浓度和纯度理想，能完全满足酶切、PCR等各种常规真菌分子生物学研究的要求。
具体实施方式
SLS裂解液配置
称取Tris-HCl(分子量121.14)、EDTA(分子量372.24)、NaCl(分子量58.44)和N-月桂酰肌氨酸钠(分子量293.39)溶于适量无菌水中，用HCl(或NaOH)调整PH值至7.5～8.5，然后用无菌水定容，121℃湿热灭菌后备用。
DNA提取
实施例1
(1)用无菌手术刀片从PDA平板上刮取菌丝(约50-200mg，带有少量培养基不影响DNA提取)置于2.0-mL Eppendorf管中，加800μL SLS裂解液(200mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，200mmol/L NaCl，2g/100ml N-月桂酰肌氨酸钠，pH 8.0)，用无菌牙签充分搅拌分散菌丝，55℃水浴10min，其间振荡混匀2-3次，13200r/min离心10min；
(2)取上清液750μL于1.5-mL Eppendorf管中，加入等体积氯仿和异戊醇(体积比24∶1)的混合溶剂抽提DNA，13200r/min离心10min；
(3)取上清液于新的1.5-mL Eppendorf管中，加2倍体积无水乙醇混合混匀，-20℃静置10min后，于4℃、13200r/min离心4min，沉淀DNA；
(4)用70％无水乙醇洗涤沉淀，沉淀于室温放置自然干燥5-10min，溶于40μL TE溶液(pH 8.0)，-20℃保存备用。
实施例2
(1)用无菌手术刀片从PDA平板上刮取菌丝(约50-200mg)置于2.0-mL Eppendorf管中，加800μL SLS裂解液(150mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，1g/100ml(重量/体积)N-月桂酰肌氨酸钠，pH 8.0)，用无菌牙签充分搅拌分散菌丝，50℃水浴10min，其间振荡混匀2-3次，13000r/min离心10min；
(2)取上清液500μL于1.5-mL Eppendorf管中，加入两倍体积的氯仿和异戊醇(体积比24∶1)的混合溶剂抽提DNA，13000r/min离心10min；
(3)取上清液于新的1.5-mL Eppendorf管中，加3倍体积异丙醇混合混匀，-20℃静置10min后，于4℃、13000r/min离心4min，沉淀DNA；
(4)用70％乙醇洗涤沉淀，沉淀室温放置自然干燥5-10min，溶于40μL TE溶液(pH 8.0)，-20℃保存备用。
实施例3
(1)用无菌手术刀片从PDA平板上刮取菌丝(约50-200mg)置于2.0-mL Eppendorf管中，加800μL SLS裂解液(300mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，300mmol/L NaCl，3g/100ml(重量/体积)N-月桂酰肌氨酸钠，pH 7.5)，用无菌牙签充分搅拌分散菌丝，80℃水浴15min，其间振荡混匀2-3次，15000r/min离心10min；
(2)取上清液750μL于1.5-mL Eppendorf管中，加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇(体积比25∶24∶1)混合溶剂抽提DNA，15000r/min离心10min；
(3)取上清液于新的1.5-mL Eppendorf管中，加2倍体积异丙醇混合混匀，-20℃静置10min后，于4℃、15000r/min离心4min，沉淀DNA；
(4)用75％乙醇洗涤沉淀，沉淀于室温放置自然干燥5-10min，溶于40μL TE溶液(pH 8.0)，-20℃保存备用。
实施例4
(1)用无菌手术刀片从PDA平板上刮取菌丝(约50-200mg)置于2.0-mL Eppendorf管中，加800μL SLS裂解液(200mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，200mmol/L NaCl，2g/100ml N-月桂酰肌氨酸钠，pH 8.5)，用无菌牙签充分搅拌分散菌丝，55℃水浴10min，其间振荡混匀2-3次，13200r/min离心10min；
(2)取上清液500μL于1.5-mL Eppendorf管中，加2倍体积苯酚、氯仿和异戊醇(体积比25∶24∶1)的混合溶剂抽提DNA，13200r/min离心10min；
(3)取上清液于新的1.5-mL Eppendorf管中，加3倍体积无水乙醇混合混匀，-20℃静置10min后，13200r/min于4℃离心4min沉淀DNA；
(4)用70％乙醇洗涤沉淀，沉淀室温放置自然干燥5-10min，溶于40μL TE溶液(pH 8.0)，-20℃保存备用。
真菌种类
指状青霉(Penicillium digitatum)、意大利青霉(P.italicum)、扩展青霉(P.expansum)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、美澳型核果褐腐菌(Monilinia fructicola)、褐枝孢菌(Fulvia fulva)、整齐小核菌(Sclerotium rolfsii)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)。
上述菌种按实施例1、实施例2、实施例3和实施例4所述的方法各做1次实验，其中指状青霉包括对抑霉唑的抗性菌(Pd-01)和对抑霉唑的敏感菌(Pd-W-01)。
DNA样品的电泳分析和含量测定
用紫外分光光度计ND-1000测定波长260nm和280nm处的光吸收值，检测计算如实施例1所述方法提取的DNA样品的浓度和纯度，结果如表1。
| 病原菌 | 平均浓度(ng/μL) | A260/A280 |
| 指状青霉P.digitatum Pd-01 | 1958.0 | 1.90～1.93 |
| 指状青霉P.digitatum Pd-W-01 | 1635.1 | 1.91～1.95 |
| 意大利青霉P.italicum | 2303.8 | 1.87～1.94 |
| 扩展青霉P.expansum | 425.7 | 1.69～1.76 |
| 胶孢炭疽菌C.gloeosporioides | 1455.4 | 1.81～1.82 |
| 灰葡萄孢菌B.cinerea | 983.9 | 1.80～1.85 |
| 褐枝孢菌F.fulva | 1094.2 | 1.76～1.83 |
| 美澳型核果褐腐菌M.fructicola | 1260.4 | 1.71～1.85 |
| 齐整小核菌S.rolfsii | 572.7 | 1.63～1.77 |
| 病原菌 | 平均浓度(ng/μL) | A260/A280 |
| 尖孢镰刀菌F.oxysporum | 1132.5 | 1.80～1.94 |
| 禾谷镰刀菌F.graminearum | 1963.5 | 1.76～1.81 |
表1
一般认为高纯度DNA样品的260nm与280nm的吸收比值在1.8左右。可见，无论浓度还是纯度，SLS法提取的DNA样品均达到较高水平。
将上述DNA样品通过1.0％的琼脂糖凝胶电泳，经EB(溴化乙啶)染色，所得条带清晰均匀，进一步表明SLS提取法对病原真菌基因组DNA的破坏比较小，方法稳定。
DNA样品的限制性内切酶酶切分析
将按实施例1所述方法提取的DNA用限制性内切酶EcoR I(15U/μLDNA，Takara公司)于37℃酶切2h，65℃灭活15min。经琼脂糖凝胶电泳检测其酶切效果，所得片段大小分布比较均匀，说明在2h内基因组DNA被有效消化。
PCR扩增分析
通用引物扩增：
根据真菌18S rDNA的保守序列合成：
正向引物Pf：5’-CCAACCTG GTTGATCCTGCCAGTA-3’；
反向引物Pr：5’-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3’。
另外合成用于扩增ITS序列的引物：
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
ITS6：5’-GAAGGTGAA GTCGTAACAAGG-3’。
PCR反应体系：10×PCR buffer 2μL、dNTP(2mmol/L)2μL、MgCl2(25mmol/L)1.6μL、正、反向引物(5mmol/L)各2μL、Taq酶(5U/μL)0.2μL、模版DNA 1μL(如实施例1方法提取)、双蒸水补足至20μL。
PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min(ITS序列延伸1min)，进行35个循环，最后72℃延伸10min。
以Pf和Pr为引物进行PCR扩增，均得到约1800bp的18S rDNA片段。以ITS4和ITS6为引物进行PCR扩增，则均能得到大小为500bp左右的ITS序列。扩增产物条带清晰，明亮，产物量大。说明本发明方法提取的真菌基因组DNA中没有扩增酶反应的抑制物存在或其抑制作用微弱，不会对PCR带来影响，可以用于一般植物病原真菌的分子鉴定和系统发育，以及其他的分子生物学研究。
特异性引物扩增：
以指状青霉抑霉唑抗性菌(Pd-01)和抑霉唑敏感菌(Pd-W-01)DNA样品为模板，根据已公布的CYP51基因序列设计特异性引物：
A1：5’-TAGCTCCAAAACAAATCGTCTGCC-3’；
R2：5’-GGTGAAGATAT TGCCGTACTAGAC-3’。
以褐枝孢菌DNA样品为模板，合成褐枝孢菌β微管蛋白基因特异性引物：
CSP-F：5’-GAATGATAATGATACCCACGCAC-3’；
CSP-R2：5’-CGGTGGGATAA TACGAAAAACC-3’。(Yan，L.，C.Zhang，L.Ding & Z.Ma，2007，Development of a real-time PCR assay for thedetection of Cladosporium fulvum in tomato leaves.Journal of AppliedMicrobiology(In press).)
以美澳型核果褐腐菌DNA为模板，合成美澳型核果褐腐菌特异性鉴定引物：
ITS1Mfc1：5’-TATGCTCGCCAGAGGATAATTPCR-3’，
ITS4Mfc1：5’-TG GCTTTTGGCAGAAGCACACT-3’。(Ma，Z.& T.JMichailides，2007，Approaches for eliminating PCR inhibitors and designingPCR primers for the detection of phytopathogenic fungi.Crop Protection，26：145-161.)
反应体系与通用引物扩增相同；
PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，退火温度分别为58℃、62℃、60℃，退火45s，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。
以特异性引物A1、R2，对指状青霉进行PCR扩增，抑霉唑抗性菌株(Pd-01)能得到预期的约1000bp的产物，抑霉唑敏感菌株(Pd-W-01)能得到预期的约500bp的产物。以褐枝孢菌β微管蛋白基因特异性引物CSP-F、CSP-R2对褐枝孢菌基因组进行PCR扩增，能得到预期的约300bp的产物。以美澳型核果褐腐菌特异性鉴定引物ITS1Mfc1、ITS4Mfc1对褐腐病菌基因组进行PCR扩增，也得到预期的约300bp的产物。PCR扩增条带清晰，特异性好，表明用SLS法提取的病原真菌基因组DNA可以满足PCR的特异性扩增反应，能有效满足从分子生物学角度进行抗药性测定和菌种鉴定的需要。
Claims (6)
1.一种快速提取真菌DNA的SLS裂解液，其特征在于：以溶液总体积计，由以下组分组成：
N-月桂酰肌氨酸钠 1～3g/100ml
Tris-HCl 150～300mmol/L
NaCl 150～300mmol/L
EDTA 50～100mmol/L
水 余量
PH值为7.5～8.5。
2.根据权利要求1所述的SLS裂解液的应用，包括以下步骤：
(1)将真菌菌丝加入SLS裂解液中，在50～80℃下水浴加热10～15min后离心；
(2)将萃取剂加入步骤(1)离心所得的上清液中抽提DNA，再次离心；
(3)将DNA沉淀剂加入步骤(2)离心所得的上清液中混合均匀，静置后离心沉淀DNA；
(4)将DNA沉淀用70％～75％的乙醇洗涤后干燥。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的步骤(2)中萃取剂为氯仿和异戊醇的混合溶剂或为苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶剂。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的步骤(2)中萃取剂与步骤(1)离心所得的上清液体积比为1∶1～2∶1。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的步骤(3)中DNA沉淀剂为无水乙醇或异丙醇。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的步骤(3)中DNA沉淀剂加入步骤(2)离心所得的上清液体积比为2∶1～3∶1。
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| 陈峰等.一种可用于PCR和RAPD分析的基因组DNA单管快速提取法.国外医学遗传学分册20 3.1997,20(3),163. |
| 陈峰等.一种可用于PCR和RAPD分析的基因组DNA单管快速提取法.国外医学遗传学分册20 3.1997,20(3),163. * |
| 魏鑫丽等.用于PCR扩增的DNA简易制备法现状.菌物研究1 1.2003,1(1),52-54. |
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