CN101224410A - 一种以染料为配基的纤维素亲和膜的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜的制备方法及其应用，制备：(1)活化后的纤维素膜，用热水洗数次后，放入到染料Cibacron Blue F3GA溶液中反应；(2)加入NaCl溶液处理，使染料吸附到纤维素膜上；(3)调节水浴温度，加入Na2CO3进行固色反应；(4)冷却，依次用热水、甲醇、NaCl、尿素、双蒸水充分洗涤后，或保存于Tris－HCl缓冲液，得到以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜。应用：该膜可应用于木瓜蛋白酶的吸附。该方法快速、简便、廉价、高效，适用于规模化生产。
Description
技术领域
本发明属纤维素亲和膜领域，特别是涉及以染料为配基的纤维素亲和膜的制备方法及其应用。
背景技术
近年来，随着生命科学、生物技术、药学以及医疗技术的日益发展，人们对生物大分子的分离、提取和精制的要求也越来越高。亲和色谱是实验室和工业中常用的一种生物大分子分离纯化技术。它是根据生物大分子与特定的固载化配基之间的亲和力，即特异性的可逆结合和解离而使生物大分子得到分离。它具有操作条件温和、无污染、无相变等特点，膜分离过程设备简单、易于放大、成本低、分离速度快、可连续操作，在许多方面都得到了应用。
膜基质材料在亲和膜的制备中具有重要的作用，因为它不但决定着所键合的间隔臂和配基种类，而且还直接决定着分离的效果。纤维素是自然界中含量最多的天然高分子，也是最早用于亲和分离的介质之一，由于纤维素分子含有大量的-OH，从而赋予纤维素良好的亲水性、生物相容性和可反应性，而且纤维素膜价格低廉，用于亲和分离时成本低，适合工业化应用。近年来，将纤维素运用于生化分离中越来越引起人们的广泛注意。
到目前为止，许多材料(如生物大分子、金属离子、染料)作为配基被结合到固体载体上，用于生物大分子的分离纯化。活性染料是一种常用的基团专一亲和配体，用染料做配基进行亲和色谱不仅克服了生物配体的不稳定性、洗脱条件苛刻、成本较高等局限性，而且具有稳定性好，价格便宜，易于制备和存储，应用范围广，与蛋白质的相互作用有很好的专一性等优点，又比金属螯和离子的吸附效率高，只需要一个步骤就可以把目标蛋白纯化。目前Cibacron Blue F3GA，Reactive Red，Procion Brown MX 5BR等一大批活性染料以用于亲和色谱分离。
发明内容
本发明的目的是提供一种以染料为配基的纤维素亲和膜的制备方法及其应用，该方法快速、简便、廉价、高效，可高效吸附木瓜蛋白酶，适用于规模化生产。
本发明的以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜的制备方法，包括下列步骤：
(1)活化后的纤维素膜，用热水洗数次后，放入到染料Cibacron Blue F3GA溶液中反应；
(2)加入NaCl溶液处理，使染料吸附到纤维素膜上；
(3)调节水浴温度，加入Na2CO3进行固色反应；
(4)冷却，依次用热水、甲醇、NaCl、尿素、双蒸水充分洗涤后，或保存于Tris-HCl缓冲液，得以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜。
所述的纤维素膜是普通纤维素滤纸；
所述活化是纤维素膜在60℃ 5M NaOH中水解，用体积比为5∶4环氧氯丙烷、二甲亚砜进行活化；
所述染料Cibacron Blue F3GA的浓度是10mg/ml；
所述的步骤(1)中的反应是40-80℃水浴振荡反应20-45min；
所述步骤(2)中的NaCl溶液处理是用20wt％的NaCl溶液在40-80℃水浴振荡处理20-45min；
所述步骤(3)中的Na2CO3固色反应是用25wt％Na2CO3在60-90℃水浴振荡反应3-6h；
所述步骤(4)中的洗涤是用40℃-50℃热水、含量为99.5-100％的甲醇、2M NaCl、6M尿素洗涤，洗涤程度是所洗后的洗涤液为无色；
所述步骤(5)中的保存是保存于4℃的0.05M pH7-8Tris-HCl缓冲液。
本发明的以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜可应用于木瓜蛋白酶的吸附。
本发明的有益效果：
(1)本发明的方法操作简单，耗时较少，吸附量大；
(2)本发明所使用的原材料廉价易得，本身含有丰富的可反应功能基团，无需改性处理，省时省力，减少了制备成本；
(3)原料来源方便，便于大规模提取纯化。
附图说明
图1是亲和膜和普通滤纸膜对不同浓度木瓜蛋白酶的吸附曲线，A代表亲和膜，B代表普通滤纸膜；
图2是反应pH的变化对木瓜蛋白酶吸附的影响曲线；
图3是反应离子强度的变化对木瓜蛋白酶吸附的影响曲线；
图4是Langmuir吸附等温式模型。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
取30张纤维素滤纸，用5M的NaOH 60℃水浴振荡处理30min，用热水洗数次后，放入体积比是4∶5的二甲亚砜、环氧氯丙烷混合液中60℃活化4h。
用热水洗数次后将活化后的膜放入到200ml10mg/ml的Cibacron Blue F3GA溶液当中60℃水浴振荡；30min后加入50ml20wt％的NaCl溶液60℃水浴振荡处理30min，以使染料吸附到纤维素膜上；加入20ml25wt.％Na2CO3进行固色，继续反应4h后冷却，依次用40℃-50℃热水、含量为99.5-100％的甲醇、2MNaCl、6M尿素、去离子水充分洗涤，直到洗涤液为无色，4℃保存于0.05M pH8.0Tris-HCl缓冲液。
实施例2
以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜的应用，具体步骤如下：
(1)吸附木瓜蛋白酶浓度的确定
称取6组各0.1g纤维素亲和膜，加入的缓冲液和浓度分别为0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0mg/ml的酶液中，25℃水浴振荡3h，测定吸附前后在280nm处的吸光度；算出吸附量最大的那个木瓜蛋白酶的浓度，用作下面实验。相同条件下用未经任何处理的纤维素膜作平行对比实验，测出非特异性吸附量，与亲和膜吸附量作对比。发现最适给酶量为2.0mg/ml。图1是亲和膜和普通滤纸膜对不同浓度木瓜蛋白酶的吸附曲线。
(2)反应pH值的确定
称取6组各0.1g纤维素亲和膜，加入的缓冲液和酶液的pH值分别为5.0，6.0，7.0，8.0，8.5，9.0，10.0，进行固定吸附。图2是反应pH的变化对木瓜蛋白酶吸附的影响曲线，当反应体系的pH值为8.5时，吸附量最高。
(3)反应离子强度的确定
准确称取0.1g制备好的干燥的亲和膜，放入用pH8.5的Tris-HCl缓冲液陪配制的一定浓度的木瓜蛋白酶溶液，用不同浓度的NaCl调节离子强度(0M、0.2M、0.5M、1.0M、2.0M)，25℃水浴振荡3h，测定吸附前后在280nm处的吸光度。图3是反应离子强度的变化对木瓜蛋白酶吸附的影响曲线，发现亲和膜对木瓜蛋白酶的吸附随离子强度的增加而减小。
(4)Langmuir吸附等温式模型的验证
Langmuir吸附模型代表了最简单的蛋白质吸附形式，该模型假设如下：可逆吸附；被吸附分子性能无变化；分子间无吸附；一个吸附位吸附一个分子；所有的吸附位对蛋白质有相同的亲和性。
在这种假设下，蛋白质在固载化配基上的吸附可用式1表达：
qeq＝(qmCe)/(Kd+Ce) (式1)
式3-1可转化为式2：
Ce/qeq＝Ce/qm+Kd/qm (式2)
此处，Ce(mg/ml)是蛋白质平衡时的浓度，qeq(mg/g)是平衡吸附量，qm(mg/g)是饱和吸附量，Kd是解离常数。
在4、25、37℃下，考察不同浓度的木瓜蛋白酶在尼龙亲和膜上的吸附情况，按照Langmuir模型的表达式，Langmuir模型参数见表1，以Ce/qeq-Ce作图，得到图4。由结果可推出，在所有温度下，对Langmuir吸附等温式模型都基本呈线性关系，线性相关系数都接近1，说明温度的升高对吸附是有利的，这与实验现象保持一致。
表1Langmuir模型参数
| Temperature(K) | Langmuir constants | ||
| qm(mg/g) | kd(mg/ml) | R2 | |
| 277298310 | 61.573.2131.9 | 1.351.092.68 | 0.99700.98940.9868 |
Claims (10)
1.以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜的制备方法，包括下列步骤：
(1)活化后的纤维素膜，用热水洗涤数次后，放入到染料Cibacron Blue F3GA溶液中反应；
(2)加入NaCl溶液处理，使染料吸附到纤维素膜上；
(3)调节水浴温度，加入Na2CO3进行固色反应；
(4)冷却，依次用热水、甲醇、NaCl、尿素、双蒸水充分洗涤后，或保存于Tris-HCl缓冲液，得到以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜。
2.根据权利要求1所述的以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜的制备方法，其特征在于：所述的纤维素膜是普通纤维素滤纸。
3.根据权利要求1所述的以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜的制备方法，其特征在于：所述活化是纤维素膜在60℃ 5M NaOH中水解，用体积比为5∶4环氧氯丙烷、二甲亚砜进行活化。
4.根据权利要求1所述的以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜的制备方法，其特征在于：所述染料Cibacron Blue F3GA的浓度是10mg/ml。
5.根据权利要求1所述的以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的反应是40-60℃水浴振荡反应20-45min。
6.根据权利要求1所述的以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的NaCl溶液处理是用20wt％的NaCl溶液在40-80℃水浴振荡处理20-45min。
7.根据权利要求1所述的以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的Na2CO3固色反应是用25wt％Na2CO3在60-90℃水浴振荡反应3-6h。
8.根据权利要求1所述的以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中的洗涤是用40℃-50℃热水、含量为99.5-100％的甲醇、2MNaCl、6M尿素洗涤，洗涤程度是所洗后的洗涤液为无色。
9.根据权利要求1所述的以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中的保存是保存于4℃的0.05M pH7-8Tris-HCl缓冲液。
10.以染料Cibacron Blue F3GA为配基的纤维素亲和膜可应用于木瓜蛋白酶的吸附。
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