CN101221183A - 一种鉴别人血白蛋白制品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别人血白蛋白制品的方法。由如下步骤组成：(1)配制枸橼酸缓冲液：取0.2mol/L枸橼酸和0.2mol/L枸橼酸钠按12.3∶7.7的体积比例混合，每升缓冲液加叠氮钠100mg，用0.2mol/L枸橼酸和0.2mol/L枸橼酸钠调pH至4.2；(2)配制BCG试剂：称取溴甲酚绿105mg，先溶于0.1mol/L NaOH 2.5ml中(隔水加热助溶)，再加入0.2mol/L pH4.2枸橼酸缓冲液1000ml中，再加吐温－80 1～2ml；(3)取BCG试剂2ml，加待测人血白蛋白制品1滴，摇匀，溶液颜色由黄色变为绿色的是正品，否则为伪劣品。本发明鉴别方法分析成本低、不需要专门设备、专属性较强、检验结果正确率高、适用于现场检验的人血白蛋白快速检验方法，以满足基层药品监督检验的需要。

Description

一种鉴别人血白蛋白制品的方法

技术领域

本发明涉及人血白蛋白，具体的说，涉及一种鉴别人血白蛋白制品的方法。

背景技术

人血白蛋白属生物制品，系自健康人静脉取血，经一系列严格的提取、纯化、灭菌过程制备而成，用于治疗严重失血、创伤、烧伤等引起的休克、脑水肿及大脑损伤所致的脑压增高，防治低蛋白血症、肝硬化、肾病引起的水肿或腹水，是一种名副其实的“救命药”，故该制品又称为“生命制品”。由于人血白蛋白在临床中一般使用于危重病人，所以国家食品药品监督管理局的要求特别严格，对人血白蛋白的生产销售实行批签发制度。假人血白蛋白不但延误危重病人的及时治疗，还会带来感染等一系列不良后果，严重威胁病人的生命健康。近年来，国家严格控制血源，血源紧张，导致市场上人血白蛋白制品紧俏，售价不断走高。而且一些地方群众存在认识误区，有滥用人血白蛋白情况，更加重了供不应求的局面，给了不法分子可乘之机。由于人血白蛋白价格昂贵，抽验成本较高，加上全国只有7家药检所具有检测人血白蛋白的资质，因此各级药监部门对人血白蛋白的市场监管存在很大的漏洞。一瓶假人血白蛋白的成本大约五元，而正品价格是三百多元，像这样六十来倍的暴利，高额的利差，促使一些造假分子铤而走险，利用药品监管的漏洞，让假人血白蛋白混迹于药品流通市场，给消费者带来巨大危害，尤其是在经济不发达的地区。2001年武汉市公安局查处一起销售假人血白蛋白案件，发现了假冒5个厂家共价值248万元的假人血白蛋白。近年来，湖南、江西、重庆、贵州、四川、辽宁、新疆等省以及我省清远市局都在稽查工作中发现了假人血白蛋白。而据白蛋白生产厂家反映，假人血白蛋白在青海、甘肃等边远省份和贫困地区更加猖獗，只是由于那里的监管力量更加薄弱，所以很少被发现曝光。由此看来，加强人血白蛋白的市场监管势在必行。

目前人血白蛋白的国家标准鉴别方法(《中国药典》2005年版三部附录VIII C、VIII D)包含免疫双扩散法和免疫电泳法，其优点是准确率高，但这两种方法对实验人员的技术要求较高，要求有特定仪器和固定的场地，而且检验周期较长，不适合作流动性大的现场检测。

一、免疫双扩散法(《中国药典》2005年版三部附录VIII C)

供试品溶液制备：用生理盐水将供试品的白蛋白浓度稀释至5％。

试剂：(1)0.5％氨基黑染色剂：取氨基黑10B 0.5g，加甲醇50ml、冰醋酸10ml与水40ml的混合液，溶解，即得。(2)脱色液：量取乙醇45ml、冰醋酸5ml与水50ml混合均匀，即得。

操作方法：将完全溶胀的1.5％琼脂糖溶液倾倒于水平玻板上(每平方厘米加0.19ml琼脂糖)，凝固后，按下图打孔，直径3mm，孔距3mm(方阵型)。中央孔加入抗人血清，周边孔加入供试品溶液，并留1孔加入相应阳性对照血清。每孔加样20ul。然后置水平湿盒中，37℃水平扩散24小时。用生理盐水充分浸泡琼脂板，以除去未结合蛋白质。将浸泡好的琼脂板放入0.5％氨基黑溶液中染色。用脱色液脱色至背景无色，沉淀线呈清晰蓝色为止。用适当方法保存或复制图谱。

结果判定：各阳性对照出现象样的沉淀线则试验成功，供试品与人血清抗体之间应出现相应沉淀线，表示两者为同源性。

二免疫电泳法(《中国药典》2005年版三部附录VIII D)

1.试剂

(1)巴比妥缓冲液(pH8.6)：取巴比妥4.14g与巴比妥钠23.18g，加适量水，加热使溶解，冷却至室温，再加叠氮钠0.15g，加水使溶解成1500ml。

(2)0.5％氨基黑染色液：取氨基黑10B 0.5g，加甲醇50ml、冰醋酸10ml与水40ml的混合液，溶解。

(3)1.5％琼脂糖溶液：取琼脂糖1.5g，加水50ml与巴比妥缓冲液50ml，加热使溶胀完全。

(4)脱色液：量取乙醇45ml、冰醋酸5ml与水50ml混合均匀。

2.对照品：正常人血清对照品。

3.供试品溶液的制备：用生理盐水将供试品白蛋白浓度稀释成0.5％。

4.检查法：将1.5％琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上，厚度约3mm，静置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层后，于琼脂板负极1/3处的上下各打一孔，孔径3mm，孔距10～15mm。测定孔加供试品溶液10ul和溴酚蓝指示液1滴，对照孔加正常人血清10ul和溴酚蓝指示液1滴。用3层滤纸搭桥和巴比妥缓冲液(电泳缓冲液)接触，100V恒压电泳约2小时(指示剂迁移到前沿)。电泳结束后，在两孔之间距离两端约3～5mm处挖宽3mm槽，向槽中加入血清抗体，槽满但不溢出。放湿盒中37℃扩散24小时。扩散完毕后，用生理盐水充分浸泡琼脂板，以除去未结合蛋白质。将浸泡好的琼脂板放入0.5％氨基黑溶液中染色。用脱色液脱色至背景基本无色。用适当方法保存或复制图谱。与对照品比较，供试品的主要沉淀线应为白蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种分析成本低、不需要专门设备、专属性较强、检验结果正确率高、适用于现场检验的人血白蛋白快速检验方法，以满足基层药品监督检验的需要。

一种鉴别人血白蛋白制品的方法，由如下步骤组成：

(1)配制枸橼酸缓冲液：取0.2mol/L枸橼酸和0.2mol/L枸橼酸钠按12.3∶7.7的体积比例混合，每升缓冲液加叠氮钠100mg，用0.2mol/L枸橼酸和0.2mol/L枸橼酸钠调pH至4.2；

(2)配制BCG试剂：称取溴甲酚绿105mg，先溶于0.1mol/LNaOH2.5ml中(隔水加热助溶)，再加入0.2mol/LpH4.2枸橼酸缓冲液1000ml中，再加吐温-801～2ml；

(3)取BCG试剂2ml，加待测人血白蛋白制品1滴，摇匀，溶液颜色由黄色变为绿色的是正品，否则为伪劣品。

测定原理：白蛋白具有与阴离子染料结合的特性，在pH为4.2条件下，溴甲酚绿与白蛋白结合生成绿色复合物，溶液由黄色变成绿色，绿色的深浅与白蛋白浓度呈正比。

白蛋白+溴甲酚绿→白蛋白-溴甲酚绿(绿色复合物)

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：目前人血白蛋白的国家标准鉴别方法(《中国药典》2005年版三部附录VIII C、VIII D)包含免疫双扩散法和免疫电泳法，但这两种方法对仪器、场地都有较高要求，而且检验周期较长(约需24小时)，对实验人员的技术要求较高，基层药监人员难以掌握，不利于日常监督打假的需要。

本发明的鉴别方法分析手续简便快速，仅需2～3分钟；准确率高，不需要任何仪器，分析成本低廉，适用于现场检验，基层药监人员容易掌握。

现有的假人血白蛋白产品大多是用氨基酸配上黄芪、当归等中药材熬制之后配色来假冒。为此，我们研究了氨基酸、多肽以及50多种中药材，发现它们对本鉴别方法均无干扰。

本发明鉴别方法的检测灵敏度为1％，目前市场上的人血白蛋白产品只有5％、10％、20％、25％四种规格，本鉴别方法对上述四种规格的产品均能出现正反应。

附图说明

图1为灵敏度实验结果图。

具体实施方式

实施例1操作方法

0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH4.2)：取0.2mol/L枸橼酸和0.2mol/L枸橼酸钠按12.3∶7.7的体积比例混合，每升缓冲液加叠氮钠100mg，用0.2mol/L枸橼酸和0.2mol/L枸橼酸钠调pH至4.2。

BCG试剂(0.15mmol/L)：称取溴甲酚绿105mg，先溶于0.1mol/LNaOH 2.5ml中(隔水加热助溶)，再加入0.2mol/LpH4.2枸橼酸缓冲液1000ml中，再加吐温-801～2ml。

取BCG试剂2ml，加供试品1滴，摇匀。

如供试品为5％～25％的人血白蛋白正品，溶液颜色应立即由黄色变为绿色，否则供试品为伪劣品。

实施例2灵敏度实验

如图1，六支试管均装有2ml BCG试剂，左边第一管为空白对照，剩下各管从左至右依次滴加人血白蛋白浓度分别为0.2％、1％、5％、10％、20％。从结果可以看出，白蛋白浓度越高，反应后的溶液绿色越深。通过肉眼判断，本鉴别方法对人血白蛋白的检测灵敏度为1％白蛋白浓度。

与国家标准鉴别方法(《中国药典》2005年版三部附录VIII C、VIII D)比较，运用本鉴别方法对市场抽验的80批人血白蛋白正品和16批人血白蛋白伪品均能得出正确的检验结论，检验结论准确率为100％。

Claims (1)

1.一种鉴别人血白蛋白制品的方法，其特征在于由如下步骤组成：

(1)配制枸橼酸缓冲液：取0.2mol/L枸橼酸和0.2mol/L枸橼酸钠按12.3∶7.7的体积比例混合，每升缓冲液加叠氮钠100mg，用0.2mol/L枸橼酸和0.2mol/L枸橼酸钠调pH至4.2；

(2)配制BCG试剂：称取溴甲酚绿105mg，先溶于0.1mol/LNaOH2.5ml中(隔水加热助溶)，再加入0.2mol/LpH4.2枸橼酸缓冲液1000ml中，再加吐温-801～2ml；

(3)取BCG试剂2ml，加待测人血白蛋白制品1滴，摇匀，溶液颜色由黄色变为绿色的是正品，否则为伪劣品。

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