CN101220083A - 合成多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种包含“Asn－Gly－Arg”序列的合成多肽，其氨基酸序列为X－Asn－Gly－Arg－Y－Z，其中Asn－Gly－Arg为氨基酸序列，X选自Gly或Cys，Y选自非碱性氨基酸残基，Z由Lys或包括Lys在内的3～50个氨基酸的残基组成。本发明的合成多肽可用于纳米载体的靶向修饰，对纳米载体表面的化学基团没有特殊要求，适用于各种表面呈电负性、中性和弱阳性的纳米载体的靶向修饰，为非病毒纳米药物载体的靶向修饰提供了一种新颖的方法，在制备用于预防和治疗肿瘤的药物中有着重要的应用。
Description
技术领域
本发明涉及药物合成领域，具体涉及一种对纳米药物载体进行靶向修饰的小分子多肽。
背景技术
纳米药物是指以纳米脂质体、固体脂质纳米粒、纳米粒、聚合物胶束、以及缩合体为载体，以一定的方式与药物结合在一起制成的制剂，其粒径通常在10nm到1000nm之间。纳米药物载体是用于包裹或吸附药物作为药物输送系统的物质，它对药物的释放、分布、药效等有很重要的影响，是近年来国内外研究的热点，如：纳米脂质体(nanoliposome)、固体脂质(solid lipid nanopartices，SLN)、纳米粒(nano-particles，NP)、缩合体(condensates)及聚合物胶束以等。纳米载体最大的特点就是多用途性，他们具有很大的比表面积，药物更容易吸收，而且通过包裹和吸附机制还可以对药物起到保护作用，这样就延长了药物在体内的半衰期，增加药物的药理作用。
能否将治疗药物有效地转运至靶器官或靶组织细胞，并维持治疗浓度一定的时间，是药物治疗成功与否的关键。对于多数纳米制剂来说，网状内皮系统的清除作用和非特异性细胞反应是其应用的主要障碍。纳米载体能够和许多血液内容物以及非靶细胞非特异性结合，严重影响了纳米药物的治疗作用，同时伴随着副作用的增加。M.origs和M.kursa等研究发现，以PEI为载体的缩合体(核酸载体的一种)能够和血液中的清蛋白、纤维蛋白原、载脂蛋白(A-I、A-II、H、C-III)以及甲状腺素转运蛋白结合迅速聚集而被清除，导致治疗基因无法到达靶细胞。更为严重的是PEI/DNA复合物与红细胞结合后，很可能会引起血管或肺部毛细支气管堵塞而产生严重后果(M.Ogris，P.Steinlein，M.Kursa，K.Mechtler，R.Kircheis，E.Wagner，The size of DNA/transferrin-PEIcomplexes is an important factor for gene expression in cultured cells，Gene Ther.5(1998)1425-1433.)。目前主要采取亲水修饰和靶向修饰的方法来克服PEI/DNA缩合体的这些缺点。
纳米载体经亲水性聚合物修饰后，稳定性增加，体内循环时间延长，并具有一定的RES逃逸能力，但是由于表面的电荷被屏蔽，甚至被反转，极大地影响了纳米制剂的细胞摄取效率，加之其特异性差，很难达到理想的治疗效果。为此研究者们在进行亲水性修饰的同时在缩合体表面偶联各种各样的配体，以提高缩合体的转染效率。包括一些糖类化合物、转运铁蛋白、叶酸、生长因子以及具有特异性定位作用的抗体(Kai Kraemer，Susanne Fuessel，Uta Schmidt.etal，Antisense-mediated hTERT Inhibition Specifically Reduces the Growth ofHuman Bladder Cancer Cells.Clinical Cancer Research.2003；(9)：3794-3800.)。
“NGR序列”是指包含“Asn-Gly-Arg”在内一类多肽序列，是最近发现的一种肿瘤靶向配体，它能够被表达于新生血管的氨基肽酶N(CD13)特异性的识别，由于肿瘤生长迅速，血管生长旺盛，CD13多表达于肿瘤组织和肿瘤细胞(Corti A，Ponzoni M，Tumor vascular targeting with tumor necrosis factoralpha and chemotherapeutic drugs.Ann N Y Acad Sci.2004；1028：104-12.)。与其它肿瘤靶向配体不同的是，“NGR序列”不仅能够与CD13阳性肿瘤细胞结合，更能特异的靶向肿瘤组织的新生血管，相对于靶向肿瘤细胞的配体而言，它更有利于缩合体突破微循环障碍这个转运的瓶颈。Moffatt.S等制备了CNRGC-PEG-PEI/DNA-beta缩合体，在体外实验中，转染CD13阳性的肺癌细胞、纤维肉瘤细胞、膀胱癌细胞以及人脐静脉内皮细胞的效率是PEG-PEI/DNA-beta的5倍，在体内实验中发现，肿瘤内的荧光强度是肺脏的12倍，充分证明了“NGR序列”的肿瘤靶向性(Moffatt S，Wiehle S，Cristiano RJ，Tumor-specific gene delivery mediated by a novel peptide-polyethylenimine-DNApolyplex targeting aminopeptidase N/CD13.Hum Gene Ther.2005；16(1)：57-67.)。
发明内容
本发明的目的在于克服纳米药物体内肿瘤靶向性差的难题，提供一种新型广谱纳米药物载体的靶向修饰剂合成多肽。
本发明的另一个目的在于提供合成多肽在制备用于预防和治疗肿瘤的纳米药物中的应用。
本发明根据纳米载体的一般特性设计了一系列的多肽分子，适用于表面呈电负性、中性和弱阳性的纳米载体的靶向修饰。
一种合成多肽(NGR多肽)，包含“Asn-Gly-Arg”序列，其氨基酸序列为
X-Asn-Gly-Arg-Y-Z
其中：Asn-Gly-Arg为氨基酸序列，X选自Gly或Cys，Y选自非碱性氨基酸残基，Z由Lys或包括Lys在内的5～50个氨基酸的残基组成。
所述非碱性氨基酸残基Y的非碱性氨基酸指除赖氨酸、精氨酸和组氨酸以外的其他氨基酸。
所述氨基酸的残基Z由Lys所组成或由Lys和其他氨基酸的残基组成，Lys的数量占总氨基酸残基数的摩尔百分含量不少于40％。
Asn表示英文名称为asparagine，中文名称为天冬酰胺的氨基酸的相应残基，简称N。
Gly表示英文名称为glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基，简称G。
Arg表示英文名称为arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基，简称R。
Cys表示英文名称为cysteine，中文名称为半胱氨酸的氨基酸的相应残基，简称C。
Lys表示英文名称为lysine，中文名称为赖氨酸的氨基酸的相应残基，简称K。
本发明所涉及的多肽序列，包括式(I)所表示的片段、类似物和同族物以及他们的衍生物，如反手链、反向序列及Cys残基间在自然条或实验室条件下所形成的新序列。
上述合成多肽与纳米药物载体结合制成的纳米药物具有肿瘤靶向性，用于预防和治疗肿瘤，其中纳米药物载体为纳米脂质体、固体脂质纳米粒、纳米粒、聚合物胶束中的一种，或其缩合体的一种。
纳米脂质体：英文名称为nanoliposome，其特征在于，一种由磷脂双分子层组成的闭合囊泡，其粒径在10nm到1000nm之间；
固体脂质纳米粒：英文名称为solid lipid nanopartices(SLN)，其特征在于，一种将药物包裹于类脂材料中制成的固体颗粒，其粒径在10nm到1000nm之间；
纳米粒：英文名称为nanoparticles(NP)，其特征在于，一种以聚合物固态胶体颗粒为载体，以一定方式与药物结合而制成的制剂，包括纳米球(nanospheres，NS)和纳米囊(nanocapsules，NC)。其粒径在10nm到1000nm之间；
缩合体：英文名称为condensates，其特征在于，一种以多聚阳离子和高价金属离子为载体，与核酸通过静电力结合后，卷曲、塌陷、紧缩后形成的非病毒基因载体，其粒径10nm到1000nm之间；
聚合物胶束：其特征在于，一种以同时具有亲水集团和疏水基团，由亲水和熟水高分子组成的二嵌段共聚物在水中形成的胶束为载体，以一定方式与药物结合而制成的制剂，其粒径在10nm到1000nm之间。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明所涉及的多肽序列，源于以纳米药物载体为底物的靶向修饰研究，实验显示上述多肽序列明显提高了纳米药物载体的靶向性，显著提高了纳米制剂对肿瘤生长的抑制作用。
本发明所涉及的合成多肽可用于纳米载体的靶向修饰，对纳米载体表面的化学基团没有特殊要求，适用于各种表面呈电负性、中性和弱阳性的纳米载体的靶向修饰，为非病毒纳米药物载体的靶向修饰提供了一种新颖的方法，在制备用于预防和治疗肿瘤的药物中有着重要的应用。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但不局限于下列实施例。
实施例1
NGR多肽(CNGRCK2HK3HK11，“H”指组氨酸残基)修饰的ASON/L-PEI缩合体的制备(1)。
将反义寡聚核苷酸(ASON，5′-CCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTT-3′)溶于含有5％葡萄糖、1％Dextran-70的水溶液中，得ASON溶液；将线型聚乙烯亚胺(L-PEI)和NGR多肽按一定比例溶于含有5％葡萄糖、1％右旋糖酐70的水溶液中，得L-PEI、NGR多肽混合溶液；将L-PEI/NGR混合液与ASON溶液等体积混合，涡旋振荡5s，放置20min，得核酸浓度N/P(PEI中氨基数/ASON中磷酸根残基数)为6.8(6.5PEI+0.3NGR)的缩合体混悬液。
实施例2
NGR多肽(GNGRCK6HK13HK7HK15，“H”指组氨酸残基)修饰的ASON/L-PEI缩合体的制备(2)。
将反义寡聚核苷酸(ASON，5′-CCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTT-3′)溶于含有5％葡萄糖、1％Dextran-70的水溶液中，得ASON溶液；将线型聚乙烯亚胺(L-PEI)和NGR多肽按一定比例溶于含有5％葡萄糖、1％右旋糖酐70的水溶液中，得L-PEI、NGR多肽混合溶液；将L-PEI/NGR混合液与ASON溶液等体积混合，涡旋振荡5s，放置20min，得核酸浓度N/P(PEI中氨基数/ASON中磷酸根残基数)为6.8(6.5PEI+0.3NGR)的缩合体混悬液。
实施例3
NGR多肽(CNGRSK5，“S”指丝氨酸残基)修饰的ASON/L-PEI缩合体的制备(3)。
将反义寡聚核苷酸(ASON，5′-CCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTT-3′)溶于含有5％葡萄糖、1％Dextran-70的水溶液中，得ASON溶液；将线型聚乙烯亚胺(L-PEI)和NGR多肽按一定比例溶于含有5％葡萄糖、1％右旋糖酐70的水溶液中，得L-PEI、NGR多肽混合溶液；将L-PEI/NGR混合液与ASON溶液等体积混合，涡旋振荡5s，放置20min，得核酸浓度N/P(PEI中氨基数/ASON中磷酸根残基数)为6.8(6.5PEI+0.3NGR)的缩合体混悬液。
实施例4
NGR多肽(GNGRCK50)修饰的他莫昔芬聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备(1)。
取pH为1.5的盐酸水溶液适量，加入一定量的右旋糖酐-70和他莫昔芬，搅拌溶解后，缓慢滴加适量的氰基丙烯酸正丁酯(5d/min)，继续搅拌6h；0-45μm的垂融玻璃漏斗过滤，取滤液置于透析袋(截留分子量：8000～12000)中，于10体积的pH为1.5的盐酸水溶液中进行透析，每8h换水一次，透析24h；透析结束后，以1mol/LNaOH调节溶液的pH至中性，加入适量的NGR多肽，缓缓搅拌30min，即得。
实施例5
NGR多肽(GNGRCK5NK7NK9HK17，“H”指组氨酸残基)修饰的他莫昔芬聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备(2)。
取pH为1.5的盐酸水溶液适量，加入一定量的右旋糖酐-70和他莫昔芬，搅拌溶解后，缓慢滴加适量的氰基丙烯酸正丁酯(5d/min)，继续搅拌6h；0.45μm的垂融玻璃漏斗过滤，取滤液置于透析袋(截留分子量：8000～12000)中，于10体积的pH为1.5的盐酸水溶液中进行透析，每8h换水一次，透析24h；透析结束后，以1mol/LNaOH调节溶液的pH至中性，加入适量的NGR多肽，缓缓搅拌30min，即得。
实施例6
NGR多肽(GNGRDK5QK7QK19，“D”指天冬氨酸，“Q”指谷氨酰胺残基)修饰的质粒DNA脂质体的制备。
取1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)、2-硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、2-硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)各适量，置于圆底烧瓶中，加入于氯仿/乙醇混合液适量，振摇使脂质完全溶解，置于旋转蒸发器上，常温下真空旋转蒸发溶剂得均匀干膜。加入Tris·HCl缓冲溶液，超声分散。加入超螺旋的质粒DNA适量，涡旋振荡2min。旋转蒸发除去部分水分，将圆底烧瓶放入干冰冷冻5min，取出放入水浴锅，40℃水浴2min，重复本步操作10次。加入超纯水适量稀释，涡旋混匀。依次用400nm，200nm，100nm和50nm的聚碳酸酯膜加压过滤。加入胰腺内切酶I和外切酶III，37℃孵育1h，加入EDTA溶液。用琼脂糖凝胶柱，以PH＝7.0的HEPES缓冲溶液为洗脱剂进行洗脱。最后加入NGR多肽适量，缓缓搅拌30min，即得产物。
实施例7
NGR多肽(GNGRCK11SK13NK17，“S”指丝氨酸残基)修饰的质粒DNA脂质体的制备。
取1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)、2-硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、2-硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)各适量，置于圆底烧瓶中，加入于氯仿/乙醇混合液适量，振摇使脂质完全溶解，置于旋转蒸发器上，常温下真空旋转蒸发溶剂得均匀干膜。加入Tris·HCl缓冲溶液，超声分散。加入超螺旋的质粒DNA适量，涡旋振荡2min。旋转蒸发除去部分水分，将圆底烧瓶放入干冰冷冻5min，取出放入水浴锅，40℃水浴2min，重复本步操作10次。加入超纯水适量稀释，涡旋混匀。依次用400nm，200nm，100nm和50nm的聚碳酸酯膜加压过滤。加入胰腺内切酶I和外切酶III，37℃孵育1h，加入EDTA溶液。用琼脂糖凝胶柱，以PH＝7.0的HEPES缓冲溶液为洗脱剂进行洗脱。最后加入NGR多肽适量，缓缓搅拌30min，即得产物。
实施例8
NGR多肽(GNGRCK5HK11HK13HK14，“H”指组氨酸残基)修饰的紫杉醇固体脂质纳米粒的制备
取紫杉醇和硬脂酸适量，加入一定量的丙酮，振荡混合均匀，超声使其充分溶解。加入适量的卵磷脂和DSPE，微热使其溶解，得有机相。另取F68和DSPE-PEG2000适量，置于圆底烧瓶中，加入一定量的蒸馏水，超声使其充分溶解，加热使温度保持在74±3℃，得水相。搅拌下将有机相注入水相中，继续搅拌，使丙酮完全挥发并浓缩至水相体积的1/2左右。取出反应残液，将另外一份等体积的水相快速注入反应残液中，搅拌下加入适量的NGR多肽，继续搅拌3h，即得。
实施例9
NGR多肽(CNGRCK3FK2YK3FK5，“F”指苯丙氨酸，“Y”酪氨酸)修饰的紫杉醇两亲性嵌段共聚物纳米囊的制备。
以熔融缩聚反应合成聚乙二醇单甲醚-b-聚(D，L-乳酸)两亲性二嵌段共聚物(PEDLLA)，将适量的紫杉醇和PEDLLA溶于丙酮，在氮气保护下加热至60℃蒸发2h，得到紫杉醇共聚物固体基材；真空干燥，2℃～8℃储存。制备PMT时，紫杉酚共聚物固体基材在60℃恒温水浴中预热至透明胶状，涡流搅拌下加入60℃的超纯水，形成载药纳米囊分散液，3000r/min离心30min.取上清，加入适量的NGR多肽，搅拌30min，即得。
Claims (4)
1.一种合成多肽，包含“Asn-Gly-Arg”序列，其氨基酸序列为
X-Asn-Gly-Arg-Y-Z
其中：Asn-Gly-Arg为氨基酸序列，X选自Gly或Cys，Y选自非碱性氨基酸残基，Z由Lys或包括Lys在内的3～50个氨基酸的残基组成。
2.根据权利要求1所述的合成多肽，所述非碱性氨基酸残基Y的非碱性氨基酸指除赖氨酸、精氨酸和组氨酸以外的其他氨基酸。
3.根据权利要求1所述的合成多肽，氨基酸的残基Z由Lys所组成或由Lys和其他氨基酸的残基组成，Lys的数量占总氨基酸残基数的摩尔百分含量不少于40％。
4.权利要求1～3任一合成多肽与纳米药物载体结合制成的纳米药物具有肿瘤靶向性，用于预防和治疗肿瘤，其中纳米药物载体为纳米脂质体、固体脂质纳米粒、纳米粒、聚合物胶束中的一种，或其缩合体的一种。
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| CNA2008100491690A CN101220083A (zh) | 2008-01-29 | 2008-01-29 | 合成多肽及其用途 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN111449233A (zh) * | 2019-01-21 | 2020-07-28 | 济南万泉生物技术有限公司 | 一种促进机体造血与增强免疫力的新生牛骨髓酶解物保健品片剂的制备方法 |
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2008
- 2008-01-29 CN CNA2008100491690A patent/CN101220083A/zh active Pending
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| CN111449233A (zh) * | 2019-01-21 | 2020-07-28 | 济南万泉生物技术有限公司 | 一种促进机体造血与增强免疫力的新生牛骨髓酶解物保健品片剂的制备方法 |
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