CN101217962A - 靶向NCCa-ATP通道的治疗剂及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及靶向星形细胞、神经元或毛细血管内皮细胞的NCCa-ATP通道的治疗组合物和使用该组合物的方法。更具体地,涉及NCCa-ATP通道拮抗剂。该组合物用于防止细胞死亡和治疗与脊髓损伤相关的继发性损伤。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2004年9月18日提交的U.S.临时申请No.60/610,758和2005年7月11日提交的U.S.临时申请No.60/698,272的优先权,在此将其全部引入作为参考。
关于联邦政府资助研究或发展的声明
本发明部分使用了国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)给予的拨款号No.NS048260的政府支持和美国退伍军人事务部(United States Department of Veterans Affairs)的Merit Review拨款而进行。美国政府在本发明中具有一定的权利。
关于其他资助研究或发展的声明
本发明部分在来自Christopher Reeves瘫痪基金会(CRPF)拨款支持下进行。CRPF在本发明中具有一定的权利。
技术领域
本发明涉及细胞生物学、生理学和医学领域。更具体地,本发明提出了治疗患者的新方法,包括给药靶向在星形细胞中发现的独特非选择性阳离子钙-ATP通道(NCCa-ATP通道)的治疗化合物。在特定的实施方案中,治疗化合物是拮抗剂,及其在得益于阻断和/或抑制NCCa-ATP通道的治疗如脊髓损伤治疗中的用途。还涉及含有NCCa-ATP通道的组合物。
发明背景
NCCa-ATP通道
最初在天然反应性星形细胞(NRA)中,之后,如在此所述的,在中风或外伤性脑损伤后的神经元和毛细血管内皮细胞中,鉴定出独特的非选择性单价阳离子ATP-敏感性通道(NCCa-ATP通道)(参见,Simard等的国际申请WO03/079987,以及Chen和Simard,2001,各自在此全部引入作为参考)。认为NCCaATP通道是由1型磺酰脲受体(SUR1)调节亚基和孔-形成亚基组成的杂多聚体结构,与胰腺β-细胞中的KATP通道相似(Chen等,2003)。NCCa-ATP通道的孔-形成亚基仍未表征。
SUR赋予对于抗糖尿病的磺酰脲类如格列本脲(glibenclamide)和甲苯磺丁脲(tolbutamide)的敏感性,并负责通过称为“K+通道开放剂”如二氮嗪、吡那地尔(pinacidil)和cromakalin的一组化学上多种多样的试剂的激活(Aguilar-Byran等,1995;Inagaki等,1996;Isomoto等,1996;Nichols等,1996;Shyng等,1997“)。在各种组织中,分子上不同的SUR结合不同的孔-形成亚基来形成具有可区分的生理和药理特征的不同KATP通道。胰腺β-细胞中的KATP通道由连接Kir6.2的SUR1形成,而心肌和平滑肌KATP通道各自由连接Kir6.2和Kir6.1的SUR2A和SUR2B形成(Fujita等,2000)。尽管由截然不同的孔-形成亚基组成,NCCa-ATP通道对磺酰脲化合物也是敏感的。
此外,和KATP通道不一样,NCCa-ATP通道以接近相等的能力传导钠离子、钾离子、铯离子和其他单价阳离子(Chen和Simard,2001),进一步表明了NCCa-ATP通道的表征及因此对某些化合物的亲和性不同于KATP通道。
已经鉴定出通过胞内Ca2+激活并通过胞内ATP抑制的其他非选择性阳离子通道,但不是在星形细胞中。此外,关于钙敏感性和腺苷酸敏感性,在星形细胞中表达和发现的NCCa-ATP通道在生理上不同于其他通道(Chen等,2001)。
已经在内皮细胞中鉴定出其他通过胞内Ca2+激活并通过胞内ATP抑制的非选择性阳离子通道(Csanady和Adam-Vizi,BiophysicalJournal,85:313-327,2003),但是这些通道不受SUR1调节且不受格列本脲抑制。
脊髓损伤
脊髓的挫伤通常通过来自组织炎症和肿胀的继发性损害而恶化。扩大不可逆损害区域的继发性损伤原则上应当是可以防止的,因为其在医护下以延迟的方式产生,但是尚未获得有效的治疗。继发性损伤通常涉及围绕最初损伤的称为半影的潜在有活力的组织区域。半影中神经组织的生存力是不稳定的,且那些组织易于死亡。
与炎症有关的基因表达的改变是脊髓损伤后最早和最强烈的应答之一(Bareyre和Schwab,2003;Bartholdi和Schwab,1997)。
炎症应答是致病事件消退所需要的,但是它的许多副产物的毒性引起了附近或附带组织损伤。通常认为炎症可以是有害的,因为可能释放细胞毒性物质如TNFα和NO,且因为炎症促进了水肿和肿胀的形成,其进而促成组织缺血。因此,强烈的炎症应答可以引起最初组织死亡区域的扩大。相反,缓解炎症应答可以减小损害的整体范围。
脊髓损伤中最有力的炎症刺激剂之一是从损伤后断裂的毛细血管外渗的血液。普遍认为血液对中枢神经系统组织包括脊髓是高度毒性的。
细胞通过凋亡和坏死而死亡。区别是重要的,不是对于死亡的细胞,而是对于周围组织-半影-中的细胞,其可能存活,虽然最初微弱。坏死性死亡引发炎症应答,而凋亡性死亡则不。没有完全了解负责坏死性细胞死亡后炎症的分子机理,但很可能是坏死性死亡(和凋亡性死亡不一样)伴随着细胞膜裂解时胞内分子的释放。这些胞内分子当释放时激活了其他细胞,特别是小神经胶质细胞,它的激活导致进而吸引炎症细胞的趋化因子的表达。因此,合乎逻辑的治疗目标是降低坏死,即使只是将其转化成凋亡,来减少启动炎症的胞内分子的释放。
一类重要的可以启动坏死性死亡中的炎症的胞内分子是热激蛋白(HSP)。脊髓损伤引起星形细胞的激活和发育上调节的胞内蛋白包括波形蛋白、巢蛋白和HSP的上调。HSP-32和HSP-70特别引人关注,因为它们在脊髓损伤中上调(Song等,2001;Mautes等,2000;Mautes和Noble,2000)。在星形细胞中,HSP-32(血红素加氧酶-1)受到血液和血液制品的诱导,HSP-70受到缺氧或葡萄糖剥夺的诱导(Regan等,2000;Matz等,1996;Lee等,2001;Currie等,2000;Xu和Giffard,1997;Papadopoulos等,1996;Copin等,1995)。
HSP-70和HSP-32在体内激活小神经胶质细胞(Kakimura等,2002),激活的小神经胶质细胞进而释放吸引巨噬细胞和多形核白细胞(PMN)的炎性趋化因子。因此,导致炎症介导的继发性损伤的有害病理事件可以部分源于星形细胞的坏死性死亡和HSP的释放以及源于外渗的血液。因此,本发明涉及降低反应性星形细胞的坏死性死亡和减少血液的外渗,作为改进的治疗策略来治疗脊髓损伤。
发明简述
本发明涉及含有神经元细胞、神经胶质细胞或内皮细胞的NCCa-ATP通道的拮抗剂的治疗组合物。
本发明涉及减轻有此需要的患者中的脊髓损伤的方法,包括给药神经元细胞、神经胶质细胞或内皮细胞的NCCa-ATP通道的拮抗剂。拮抗剂抑制(关闭、阻断、灭活、降低生物活性)NCCa-ATP通道。脊髓损伤可以包括脊髓的挫伤。
本发明的一个实施方案包括治疗患有脊髓损伤的患者的方法,包括将有效抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。该化合物通过关闭、阻断、部分阻断和/或灭活NCCa-ATP通道来有效抑制该通道,从而减少Na+流入以及其他单价离子流入细胞中,减少细胞中水的累积,因此减轻细胞肿胀。因此,本发明的化合物降低、减少或抑制NCCa-ATP通道的激活,其减少钠离子(Na+)的流入,由此降低和/或防止或减少细胞的去极化。
患者可以包括患有脊髓损伤的患者或处于脊髓损伤风险中的患者。处于风险中的患者可以包括接受外科手术治疗和/或放疗的那些患者。处于风险中的其他患者可以包括具有脊髓病症的患者,例如,节段性畸形、由任何已知类型的疾病或感染引起的脊髓压迫。例如,库兴氏综合征可以导致压迫脊髓的硬膜外脂肪组织的生长。其他疾病可以包括脊柱的关节炎疾病。
本发明的组合物可以消化道或非肠道传送。消化道给药的实例包括但不限于口服、口含、直肠或舌下。非肠道给药可以包括但不限于肌内、皮下、腹膜内、静脉内、肿瘤内、动脉内、心室内、腔内、膀胱内、鞘内或胸膜内。其他给药方式还可以包括局部、粘膜(即鼻内)或经皮。
可以给予细胞的NCCa-ATP通道拮抗剂的有效量包括约0.0001nM至约2000μM的剂量。更具体地,待给药的剂量为约0.01nM至约2000μM;约0.01μM至约0.05μM;约0.05μM至约1.0μM;约1.0μM至约1.5μM;约1.5μM至约2.0μM;约2.0μM至约3.0μM;约3.0μM至约4.0μM;约4.0μM至约5.0μM;约5.0μM至约10μM;约10μM至约50μM;约50μM至约100μM;约100μM至约200μM;约200μM至约300μM;约300μM至约500μM;约500μM至约1000μM;约1000μM至约1500μM和约1500μM至约2000μM。当然,所有这些量是示例性的,可以预料到这些点之间的任何量在本发明中也是有用的。
作为治疗的NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物的有效量根据待治疗的宿主和特定的给药方式而改变。本发明的一实施方案中,NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物的剂量范围为约0.01μg/kg体重至约20,000μg/kg体重。当待治疗的是动物的时候,术语“体重”是适用的。当待治疗的是分离的细胞时,在此所用的“体重”应当理解为意思是“总细胞体重”。术语“总体重”可以适用于分离的细胞和动物治疗。认为在本申请中表示为“体重”或简单表示为“kg”的所有浓度和治疗水平也涵盖了类似的“总细胞体重”和“总体重”浓度。然而,本领域技术人员将认识到多种剂量范围的效用,例如0.01μg/kg体重至20,000μg/kg体重、0.02μg/kg体重至15,000μg/kg体重、0.03μg/kg体重至10,000μg/kg体重、0.04μg/kg体重至5,000μg/kg体重、0.05μg/kg体重至2,500μg/kg体重、0.06μg/kg体重至1,000μg/kg体重、0.07μg/kg体重至500μg/kg体重、0.08μg/kg体重至400μg/kg体重、0.09μg/kg体重至200μg/kg体重或0.1μg/kg体重至100μg/kg体重。此外,本领域技术人员将认识到各种不同的剂量水平是有用的,例如,0.0001μg/kg、0.0002μg/kg、0.0003μg/kg、0.0004μg/kg、0.005μg/kg、0.0007μg/kg、0.001μg/kg、0.1μg/kg、1.0μg/kg、1.5μg/kg、2.0μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg、15.0μg/kg、30.0μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg、120μg/kg、140μg/kg、150μg/kg、160μg/kg、180μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、750μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg和/或30mg/kg。当然,所有这些剂量是示例性的,且可以预料这些点之间的任何剂量在本发明中也是有用的。对于NCCa-ATP通道的拮抗剂或其相关化合物可以使用以上任何的剂量范围或剂量水平。
通过1型磺酰脲受体(SUR1)的拮抗剂阻断或灭活或抑制NCCa-ATP通道和通过SUR1激活剂打开NCCa-ATP通道。更具体地,1型磺酰脲受体(SUR1)的拮抗剂包括KATP通道的阻断剂,SUR1激活剂包括KATP通道的激活剂。更具体地,本发明的NCCa-ATP通道对钾离子(K+)具有20至50pS的单通道电导。NCCa-ATP通道还受到细胞膜胞质侧的生理浓度范围内的Ca2+刺激,其中浓度范围为10-8至10-5M。NCCa-ATP通道还受到生理浓度范围内的细胞质ATP抑制,其中浓度范围为10-1至10M。NCCa-ATP通道还能透过以下阳离子:K+、Cs+、Li+、Na+;达到任何两种阳离子之间的通透性比例高于0.5且低于2的程度。
通过NCCa-ATP通道的抑制剂、NCCaATP通道阻断剂、1型磺酰脲受体(SUR1)拮抗剂、SUR1抑制剂或能够降低通过通道的膜电流大小的化合物可抑制通道。更具体地,SUR1拮抗剂选自格列本脲、甲苯磺丁脲、瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(nateglinide)、美格列奈(meglitinide)、咪格列唑(midaglizole)、LY397364、LY389382、glyclazide、格列美脲(glimepiride)、雌激素、雌激素相关化合物(雌二醇、雌酮、雌三醇、染料木黄酮、非甾族雌激素(例如,乙烯雌酚)、植物雌激素(例如,香豆雌酚)、玉米烯酚等),和已知能抑制或阻断KATP通道的化合物。MgADP也可以用于抑制通道。可以用来阻断或抑制KATP通道的其他化合物包括但不限于甲苯磺丁脲、格列本脲(glyburide)(1[p-2[5-氯-O-茴香酰胺)乙基]苯基]磺酰]-3-环己基-3脲);氯丙嗪(1-[[(对氯苯基)磺酰]-3-丙基脲;格列吡嗪(glipizide)(1-环己基-3-[[p-[2(5-甲基吡嗪酰胺)乙基]苯基]磺酰]脲);或妥拉磺脲(tolazamide)(苯磺酰胺-N-[[六氢-1H-氮杂-1基)氨基]羰基]-4-甲基)。
特定实施方案中,给药于患者的SUR1拮抗剂的量在约0.0001μg/kg/天至约20mg/kg/天、约0.01μg/kg/天至约100μg/kg/天或约100μg/kg/天至约20mg/kg/天的范围内。再进一步,可以以治疗的形式将SUR1拮抗剂给药于患者,其中治疗可以包括每天(1、2、3、4等)、周(1、2、3、4、5等)、月(1、2、3、4、5等)等给药的SUR1拮抗剂的量或SUR1拮抗剂的剂量。可以给予治疗使得给药于患者的SUR1拮抗剂量在约0.0001μg/kg/治疗至约20mg/kg/治疗、约0.01μg/kg/治疗至约100μg/kg/治疗或约100μg/kg/治疗至约20mg/kg/治疗的范围内。
特定实施方案中,拮抗剂治疗与中枢神经系统的细胞毒性和离子性水肿相关的不利病症。这样的病症包括外伤、脊髓损伤,即继发性神经元损伤,例如但不限于出血转化、免疫系统反应、氧化性损伤、钙和兴奋毒性、坏死和凋亡,和/或轴突损伤。通过NCCa-ATP通道的灭活和/或抑制的保护作用与水肿的减轻、细胞死亡的降低、损伤部位中血液外渗的减少、反应性氧化物质产生的减少、炎症或炎症应答的减轻和/或出血转化的降低相关。因此,与如果不给药化合物的症状水平相比较,本发明的化合物减轻这些症状。
特定实施方案中,NCCa-ATP通道被阻断、抑制或以其它方式降低活性,使得离子Na+和/或其他单价离子通过通道的流入得到降低、中止、减少和/或停止。拮抗剂可以防止或降低细胞的去极化,因此减轻由于Na+流入所致的渗透改变和细胞的去极化引起的细胞肿胀。因此,对NCCa-ATP通道的抑制可以减轻细胞毒性水肿和细胞的死亡,例如,细胞的坏死性死亡,因此,本发明的拮抗剂可以用来降低与脊髓损伤相关的继发性损伤。
更进一步,本发明可以包括降低或减少患有脊髓损伤的患者发病率的方法,包括给药有效量的抑制和/或灭活神经元细胞、神经胶质细胞、内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物。发病率的降低导致患者身体和/或运动结果和/或感觉的改善。因此,患者运动范围的增加和/或感觉的提高是发病率得到降低的指标。进一步的实施方案中,患者身体良好状态的提高也是患者发病率得到降低的指标。
再进一步,本发明可以包括降低脊髓损伤患者挫伤部位中或附近或周围的血液和/或血红蛋白浓度的方法,包括给药有效量的抑制神经元细胞、神经胶质细胞、内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物。
更进一步,另一个实施方案包括减小患者脊髓损伤的损伤大小的方法,包括给药有效量的抑制神经元细胞、神经胶质细胞、内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物。损伤大小的减小降低了对侧累及的可能性。
本发明的另一个实施方案包括提高或改善有髓鞘的长束(tract)的保存,包括给药有效量的抑制神经元细胞、神经胶质细胞、内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物。
再进一步,本发明的另一个实施方案包括降低脊髓损伤患者中GFAP上调的方法,包括给药有效量的抑制神经元细胞、神经胶质细胞、内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物。
再进一步,另一个实施方案包括降低血液从脊髓损伤外渗的方法,包括给药有效量的抑制神经元细胞、神经胶质细胞、内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物。患者可以是患有脊髓损伤或可能处于脊髓损伤风险中的患者,例如,接受外科手术或放疗的患者。因此,可以在外科手术和/或放疗之前、之中或之后给药化合物。
本发明的另一个实施方案包括减轻患者脊髓损伤半影中水肿的方法,包括给药有效量的抑制神经元细胞、神经胶质细胞、内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物。
再进一步,本发明的另一个实施方案包括治疗处于脊髓损伤风险中的患者的方法,包括给药有效量的抑制神经元细胞、神经胶质细胞、内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物。处于风险中的患者可以包括接受外科手术治疗和/或放疗的那些患者。处于风险中的其他患者可以包括具有脊髓病症的患者,例如,节段性畸形、由任何已知类型的疾病或感染例如库兴氏综合征或脊柱的关节炎疾病引起的脊髓压迫。
再进一步,本发明的另一个实施方案包括诊断患者脊髓中神经元细胞水肿和/或细胞毒性损伤的方法,包括:标记SUR1的拮抗剂;将标记的SUR1拮抗剂给药于患者;测量患者脊髓中标记SUR1拮抗剂的水平,其中患者脊髓中标记SUR1拮抗剂的存在表明脊髓中的神经元细胞水肿和/或细胞毒性损伤。标记的拮抗剂可以包括用荧光标记和/或放射性标记标记的化合物。化合物可以包括SUR1的抑制剂、SUR1的抗体和/或核酸分子等。
另一个实施方案包括测定患者脊髓损伤后半影的方法,包括:标记SUR1的拮抗剂;将标记的SUR1拮抗剂给药于患者;显现患者脊髓中标记的SUR1拮抗剂,其中标记SUR1拮抗剂的存在表明患者脊髓损伤后的半影。
特定实施方案中,测定半影表明神经元损伤的位置和/或监测疾病进展。
之前已经相当宽泛地列出了本发明的特征和技术优势,以便可以更好地理解以下本发明的详述。下文中将描述本发明的其他特征和优势,其形成本发明权利要求的主题。本领域技术人员可以认识到公开的概念和特定的实施方案可以容易地用作改进或设计其他用于实施本发明相同目的的构造的基础。本领域技术人员还可以认识到这样的等同构建不脱离所附权利要求中列出的本发明的精神和范围。结合附图考虑时,从以下的描述可以更好地理解认为是本发明特征性的新特征,关于其组成及操作方法,以及更多的目的和优势。然而,要清楚地理解各附图只是为说明和描述的目的而提供的,并不旨在作为本发明限定的定义。
附图简述
为了更全面理解本发明,现在参照以下结合附图的描述,其中:
图1A-1C显示了扫描电镜显微照片,显示了新鲜分离的反应性星形细胞(图1A)和暴露于1mM叠氮化钠后5分钟(图1B)和25分钟(图1C)起泡的外观。分开的标记显示出细胞是GFAP阳性的。
图2显示了相差显微照片,显示了对照条件下新鲜分离的反应性星形细胞和暴露于1mM叠氮化钠后起泡的外观。起泡由单独的二氮嗪来再现,其打开NCCa-ATP通道,而叠氮化钠诱导的起泡被阻断通道的格列本脲阻断了。分开的标记显示出细胞是GFAP阳性的。
图3显示了外源磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸(PIP2)的加入引起了NCCa-ATP通道的激活,尽管浴槽液(bath solution)中存在ATP。最初,在来自R1星形细胞的内面向外式膜片中记录通道活性,使用含有1μM Ca2+和10μM ATP的浴槽液,其足以阻断通道活性。50μM PIP2的加入导致通道激活,反映出通道对ATP的亲和性明显降低。
图4显示了R1星形细胞中的NCCa-ATP通道受到雌激素的抑制。记录的最初部分显示出许多叠加通道的活跃活性,记录于从雌性获得的R1星形细胞的细胞附着的膜片中。将10nM雌激素加入浴槽中迅速地引起对通道活性的强烈抑制。认为所涉及的机理与雌激素受体介导的磷脂酶C(PLC)激活相关,导致膜PIP2耗尽,并反映出对ATP亲和性的显著提高。
图5A-5B显示了蛋白质印迹,证明了来自雄性和雌性的R1星形细胞都表达雌激素受体和SUR1,SUR1是NCCa-ATP通道的标志。从雄性(M)和雌性(F)的明胶海绵植入物获得细胞裂解物并在两个稀释度(4x和1x)研究,将来自子宫的裂解物用作对照。图5A使用对抗雌激素受体(ER)的抗体显影,证明了在来自两个性别的星形细胞中都表达ERα和ERβ。蛋白质印迹显示出来自两性的细胞也表达SUR1,将胰腺组织用作对照(图5B)。
图6显示了雄性R1星形细胞中的NCCa-ATP通道受到雌激素的抑制。记录的最初部分显示出来自许多叠加通道的活跃活性,记录于从雄性获得的R1星形细胞的细胞附着的膜片中。将10nM雌激素加入浴槽中迅速地引起对通道活性的强烈抑制。
图7A-7B显示了叠氮化钠诱导的起泡之后为新鲜分离的反应性星形细胞的坏死性死亡。使用鉴定坏死性死亡的碘化丙锭(PI)(图7A)和鉴定凋亡性死亡的膜联蛋白V(图7B)来评价细胞死亡。1μM格列本脲强烈减弱了由1mM叠氮化钠诱导的坏死性死亡的显著升高(图7A)。暴露于叠氮化钠后凋亡性死亡是极少的(图7B)。
图8A-8B显示了半影中的1个细胞(图8A)和脑中风中间的2个细胞(图8B、8C)的免疫荧光图像,对SUR1免疫标记;GFAP的共同标记证实了它们为星形细胞的身份;注意标记的“气泡-样”模式。
图9A-9B显示了输注二氮嗪诱导反应性星形细胞坏死性死亡后外伤性脑损伤部位的图像。用核标记DAPI来标记切片,显示出小细胞层(图9A),并用抗MMP-8抗体进行免疫标记,鉴定这些细胞为PMN(图9B)。
图10A-10D显示了来自对照(图10A)和严重双侧胸段脊髓挤压伤后24小时的脊髓切片的免疫荧光(合成)图像,对SUR1(图10A、10B、10D)或GFAP(图10C)标记。在高放大倍数下,在(图10B)中看见的单个SUR1-阳性轨迹对应于符合反应性星形细胞的GFAP-阳性星状细胞(图10D)。
图11A-11C显示了中等严重程度的颈段半脊髓挫伤(SCI;所有随后例示中所用的同一模型)中的SUR1上调。显示了来自对照区域(图11A)以及低放大倍数(图11B)和高放大倍数(图11C)下来自挫伤区域的对SUR1免疫标记的脊髓组织的表面荧光(epifluorescence)图像。高放大倍数视图证明了在这种模型中,24小时时的SUR1表达主要发生于毛细血管中。
图12A-12H显示了SCI中毛细血管中SUR1和波形蛋白上调。挫伤后24小时对SUR1免疫标记(图12A、12D)和对波形蛋白共同免疫标记(图12B、12E、12F)的2只大鼠的脊髓组织的表面荧光图像;还显示了叠加的图像。
图13A-B显示了转录因子SP1的上调,它是已知调节SUR1表达的主要转录因子。来自对SP1免疫标记的2只大鼠的脊髓组织的表面荧光免疫图像,对照未损伤脊髓(图13A),和挫伤后24小时的脊髓(图13B)。
图14A-14C显示了格列本脲处理降低了出血转化。图14A和14B显示了用盐水处理的大鼠(图14A)和用格列本脲处理(图14B)的大鼠挫伤后24小时脊髓冷冻切片的图像;注意到用格列本脲处理,较小出血和对侧结构的保存。图14C显示了含有挫伤后24小时的脊髓匀浆的试管,用盐水处理的2只大鼠(左)和用格列本脲处理的2只大鼠(右);注意到颜色的差异,反映出用格列本脲处理,血红蛋白浓度明显降低。
图15显示了格列本脲处理对脊髓损伤(SCI)后出血转化时间过程的作用。在SCI后的不同时间评估损伤区域中外渗的血液。在处死时,通过灌注首先除去血管内的血液,然后切下5mm包括挫伤区域的脊髓节段,称重并在9x组织质量体积的蒸馏水中匀浆。使用Drabkin试剂定量血含量(每组5只大鼠)。将数值表示为560nm处的吸光度或血液的微升数,假定40%的血细胞比容。在盐水处理的动物中,血量随着SCI后的时间逐渐增加,在损伤后6小时达到平台(实心方块)。在格列本脲处理的动物中,45分钟时的值与对照相似,但是随着SC I后的时间推移,值的增加显著低于对照中(实心圆)。
图16A-16D显示了格列本脲处理减小了损伤大小、GFAP表达并保存了对侧的长束。图16A和16B显示了用盐水处理的大鼠(图16A)和用格列本脲处理的大鼠(图16B)中,挫伤后24小时脊髓切片的表面荧光图像,对胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)进行免疫标记。图16C和16D显示了用盐水处理的大鼠(图16C)和用格列本脲处理的大鼠(图16D)中,挫伤后24小时脊髓切片的图像,使用羊毛铬花青-R对髓磷脂进行染色。注意到使用格列本脲的情况下,较小的损伤和对侧结构的保护(sparing)。
图17显示了格列本脲处理改善了SCI挫伤后的垂直探查。条形图显示了挫伤后24小时,每三分钟的观察阶段垂直探查(直立)所花费的秒数,6只用盐水处理的大鼠,和5只用格列本脲处理的大鼠。
发明详述
I.定义
除非另外限定,在此所用的技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意思。为了本发明的目的,以下定义了下列术语。
当词语“一个”或“一种”结合权利要求和/或说明书中的术语“包括/包含”使用时可意味着“一个/种”,但也与“一或多个/种”、“至少一个/种”和“一或多于一个/种”的意思相一致。权利要求中术语“或”的使用用来表示“和/或”,除非明确地表示仅仅是指择一或者互相排斥的选择,尽管公开内容支持表示只是择一和“和/或”的定义。
如在此所用的,术语“拮抗剂”指的是在体内作用来降低另一种化学或生物物质的生理活性的生物或化学剂。术语拮抗剂包括但不限于小分子、化学物质、蛋白质、肽、核酸分子等。在本发明中,拮抗剂阻断、抑制、减少和/或降低神经元细胞、神经胶质细胞或神经内皮细胞(例如,毛细血管内皮细胞)中NCCa-ATP通道的活性。在本发明中,拮抗剂联合、结合、连接神经元细胞、神经胶质细胞或神经内皮细胞(例如毛细血管内皮细胞)的NCCa-ATP通道,使得NCCa-ATP通道关闭(灭活、部分阻断、阻断或抑制),意味着患病状态中就生物活性而言降低的生物活性。特定实施方案中,拮抗剂联合、结合和/或连接NCCa-ATP通道的调节亚基,特别是SUR1。或者,拮抗剂联合、结合和/或连接NCCa-ATP通道的孔-形成亚基,使得NCCa-ATP通道关闭(灭活和/或抑制)。术语拮抗剂或抑制剂可以交替使用。
如在此所用的,术语“去极化”指的是细胞膜对钠离子通透性的提高,其中降低或消除了跨细胞膜的电位差。
如在此所用的,术语“有效量”或“治疗有效量”可互换并指的是导致疾病或病症的症状改善或缓解的量。本领域技术人员理解有效量可以改善患者或对象的状况,但可能不是疾病和/或病症的完全治愈。
如在此所用的,术语“内皮”指的是衬在体腔、血管和淋巴管内表面或形成毛细血管的一层细胞。
如在此所用的,术语“内皮细胞”指的是内皮的细胞或衬在体腔例如血管或淋巴管或毛细血管表面的细胞。特定实施方案中,术语内皮细胞指的是神经内皮细胞或是神经系统例如中枢神经系统或脑的一部分的内皮细胞。
如在此所用的,术语“出血转化”指的是缺血后在毛细血管中发生的病理结果。本领域技术人员知道出血转化是由于毛细血管的灾难性损伤而引起的,在该过程中所有血液成分外渗进入周围的组织中。根据Starling定律,理解这些阶段需要鉴定2个情况:(i)“推动”物质进入组织中的驱动力;和(ii)允许这些物质穿过进入组织中的通透性孔。
如在此所用的,术语“抑制”指的是化合物阻断、部分阻断、干扰、减少、降低或灭活NCCa-ATP通道的能力。因此,本领域技术人员理解术语抑制包括NCCa-ATP通道活性的完全和/或部分丧失,如通过细胞去极化降低、钠离子流入或任何其他单价离子流入的降低、水流入的降低、血液外渗的降低、细胞死亡的降低以及改善所示的。
如在此所用的,术语“损伤”指的是组织的任何病理性或外伤性的不连续性或其一部分的功能的丧失。例如,损伤包括与脊髓相关的任何损伤,例如但不限于挫伤、压迫损伤等。
如在此所用的术语“发病率”是患病的状态。再进一步,发病率还可以指患病率,或患病患者或病例在给定群体中的比例。
如在此所用的术语“死亡率”是死亡或引起死亡的状态。再进一步,死亡率还可以指死亡比率,或死亡数与给定群体的比例。
如在此所用的,术语“神经元细胞”指的是作为神经系统的形态和功能单位的细胞。该细胞包括神经细胞体、树突和轴突。术语神经元(neuron)、神经细胞(nerve cell)、神经元的(neuronal)、神经元(neurone)和神经细胞(neurocyte)可以交替使用。神经元细胞类型可以包括但不限于典型的显示内部结构的神经细胞体、来自大脑皮层的(Cajal)水平细胞;Martinottic细胞、双极细胞、单极细胞、Pukinje细胞和大脑皮层运动区的锥体细胞。
如在此所用的,术语“神经的”指的是与神经系统相关的一切。
如在此所用的,术语“神经胶质”或“神经胶质细胞”指的是作为神经系统非神经元细胞元件的细胞。术语神经胶质、神经胶质细胞(neurogliacyte)和神经胶质细胞(neuroglial cell)可以交替使用。神经胶质细胞可包括但不限于室管膜细胞、星形细胞、少突神经胶质细胞或小神经胶质细胞。
如在此所用的,术语“降低/减轻”指的是与没有使用本发明的化合物处理相比较,细胞死亡、炎症应答、出血转化、血液外渗等的减少。因此,本领域技术人员能够测定与没有治疗和/或没有干预会发生的情况相比较,其中患者已经接受本发明处理的脊髓损伤相关的任何症状和/或病症的减轻范围。
如在此所用的术语“预防”指的是最小化、降低或抑制发生疾病状态的风险或与疾病状态或进展或其他异常或不利状况相关的参数。
如在此所用的,“脊髓”、“与脊椎节段相关的脊神经组织”、“与脊椎节段相关的神经组织”或“与脊椎节段或水平相关的脊髓”包括任何与脊柱水平或节段相关的脊神经组织,上述所有术语都是可互换的。因此,本领域技术人员知道脊髓组织包括所有神经元细胞,以及与其相关的任何神经胶质细胞。本领域技术人员知道脊髓和其相关组织与颈段、胸段和腰段脊柱相关。如在此所用的,C1指的是颈椎节段1,C2指的是颈椎节段2,诸如此类。T1指的是胸椎节段1,T2指的是胸椎节段2,诸如此类。L1指的是腰椎节段1,L2指的是腰椎节段2,诸如此类,除非另外特别指出。
如在此所用的术语“患者”理解为表示根据在此所述的方法给药组合物的任何哺乳动物对象。本领域技术人员认识到哺乳动物患者,包括但不限于人、猴子、马、猪、牛、狗、猫、大鼠和小鼠。特定的实施方案中,本发明的方法用来治疗人类患者。进一步的实施方案中,患者处于发生脊髓损伤的风险中。因此,患者可能知晓或不知晓其疾病状态或潜在的疾病状态,且可能知道或不知道它们需要处理(治疗性治疗或预防性治疗)。
如在此所用的术语“治疗”指的是将治疗有效量的组合物给药于患者,使得患者具有疾病或病症的改善。改善是任何可观察的或可测量的改善。因此,本领域技术人员认识到治疗可以改善病人的状况,但可能不是疾病的完全治愈。治疗还可以包括治疗处于发生疾病和/或病症风险中的患者。
II.本发明
本发明涉及治疗组合物以及使用该治疗组合物的方法。一实施方案中,治疗组合物是神经元细胞、神经胶质细胞或神经内皮细胞NCCa-ATP通道的拮抗剂。
特定实施方案中,本发明的治疗化合物包括神经元细胞、神经胶质细胞或内皮细胞NCCa-ATP通道的拮抗剂。考虑将拮抗剂用于治疗与中枢神经系统的细胞毒性和离子性水肿相关的不利病症。这样的病症包括外伤、脊髓损伤,即继发性神经元损伤,例如但不限于出血转化,免疫系统反应,氧化性损伤,钙和兴奋毒性,坏死和凋亡,和/或轴突损伤。通过抑制NCCa-ATP通道的保护作用与水肿的减轻、反应性氧化物质产生的降低、激发炎症的降低和/或出血转化的降低相关。
一方面中,NCCa-ATP通道受到阻断、抑制,或以其它方式活性降低。这样的实例中,给药和/或运用NCCa-ATP通道的拮抗剂。拮抗剂调节NCCa-ATP通道,使得通过通道的流量减少、中断、降低和/或停止。对于神经元细胞、神经胶质细胞、内皮细胞或其组合的NCCa-ATP通道的活性,拮抗剂可以具有可逆或不可逆的活性。拮抗剂可以防止或减少细胞的去极化,因此减少由细胞去极化引起的渗透性改变而产生的细胞肿胀。因此,对NCCa-ATP通道的抑制可以降低细胞毒性水肿和内皮细胞的死亡,例如细胞的坏死性死亡。
优选的实施方案中,本发明提供了减轻患者脊髓损伤的方法,包括给药神经元细胞、神经胶质细胞或内皮细胞NCCa-ATP通道的拮抗剂,其中拮抗剂结合所述通道。对NCCa-ATP通道的结合阻断了Na+和水流入星形细胞、神经元细胞和内皮细胞中,从而减轻了损伤处或周围的肿胀。更特别地,拮抗剂减轻来自最初脊髓损伤的继发性损伤,例如,降低毛细血管病理性累及的进展,即,出血转化,降低免疫系统反应、降低氧化性损伤、降低钙和兴奋毒性、降低坏死和细胞死亡,和/或减轻轴突损伤。
III.NCCa-ATP通道
本发明部分基于特定通道NCCa-ATP通道的发现,其在US申请公开No.20030215889中定义为星形细胞上的通道,在此将其全部引入作为参考。更具体地,本发明进一步限定了该通道不仅在星形细胞上表达,还在中枢神经系统外伤例如脊髓损伤或其他与这些事件相关的继发性神经元损伤后在神经细胞、神经胶质细胞和/或神经内皮细胞上表达。
NCCa-ATP通道受钙离子(Ca2+)激活并对ATP是敏感的。因此,该通道是由胞内Ca2+激活并由胞内ATP阻断的非选择性阳离子通道。通过耗尽胞内ATP打开时,该通道负责由大量Na+流入引起的完全去极化,这形成了Cl-的电梯度和H2O的渗透梯度,导致细胞毒性水肿和细胞死亡。当通道受到阻断或抑制时,不产生大量Na+,因此防止了细胞毒性水肿。
特定的功能特征将NCCa-ATP通道与其它已知离子通道区分开来。这些特征可包括,但不限于1)容易使Na+、K+和其他单价阳离子通过的非选择性阳离子通道;2)通过胞内钙的增加和/或通过胞内ATP的减少来激活;3)受1型磺酰脲受体(SUR1)的调控,此前认为SUR1专门与KATP通道相关,如胰腺β细胞中发现的那些。
更具体地,本发明的NCCa-ATP通道具有20至50pS的钾离子(K+)单通道电导。NCCa-ATP通道还受到生理浓度范围内细胞膜胞质侧的Ca2+的刺激,其中浓度范围为10-8至10-5M。NCCa-ATP通道还受到生理浓度范围内的细胞质ATP的抑制,其中浓度范围为10-1至10M。以下离子也能透过NCCa-ATP通道:K+、Cs+、Li+、Na+;至任何两种阳离子之间的通透性比例为高于0.5且低于2的程度。
IV.NCCa-ATP通道的抑制剂
本发明包括所述通道的抑制剂,例如,所述通道的拮抗剂。本发明拮抗剂的实例可以包括US申请公开No.20030215889中鉴定的拮抗剂,在此将其全部引入作为参考。本领域技术人员认识到NCCa-ATP通道由两个亚基构成,调节亚基SUR1和孔形成亚基。本领域技术人员知道可以在GenBank中容易地获得SUR1的核酸序列和氨基酸序列,例如,GenBank登录号L40624(GI:1311533)和AAA99237(GI:1311534),在此将其各自全部引入作为参考。
A.SUR1的抑制剂
特定实施方案中,磺酰脲受体-1(SUR1)的拮抗剂适用于阻断通道。合适的SUR1拮抗剂实例包括但不限于格列本脲、甲苯磺丁脲、瑞格列奈、那格列奈、美格列奈、咪格列唑、LY397364、LY389382、glyclazide、格列美脲、雌激素、雌激素相关化合物(雌二醇、雌酮、雌三醇、染料木黄酮、非甾族雌激素(例如,乙烯雌酚)、植物雌激素(例如,香豆雌酚)、玉米烯酚等)及其组合。本发明的优选实施方案中,SUR1拮抗剂选自格列本脲和甲苯磺丁脲。再进一步,另一种拮抗剂可以是MgADP。其他拮抗剂包括KATP通道的拮抗剂,例如但不限于,甲苯磺丁脲、格列本脲(1[p-2[5-氯-O-茴香酰胺)乙基]苯基]磺酰)-3-环己基-3-脲);氯丙嗪(1-[[(对氯苯基)磺酰]-3-丙基脲;格列吡嗪(1-环己基-3-[[p-[2(5-甲基吡嗪酰胺)乙基]苯基]磺酰]脲);或妥拉磺脲(苯磺酰胺-N-[[六氢-1H-氮杂-1基)氨基]羰基]-4-甲基)。
B.SUR1转录和/或翻译的抑制剂
特定实施方案中,抑制剂可以是调节SUR1(调节亚基)和/或包括孔形成亚基的分子实体的转录和/或翻译的化合物(蛋白质、核酸、siRNA等)。
1.转录因子
转录因子是结合特定DNA序列(例如,启动子和增强子)并调节编码DNA区域转录的调节蛋白。因此,转录因子可以用来调节SUR1的表达。通常,转录因子包括结合DNA的结合结构域(DNA结合结构域)和控制转录的调节结构域。在调节结构域激活转录的情况中,将调节结构域称为激活结构域。在调节结构域抑制转录的情况中,将调节结构域称为抑制结构域。
更具体地,转录因子如Sp1和HIF1α可以用来调节SUR1的表达。本领域技术人员认识到,Sp1和HIF1α可以调节SUR1表达。因此,可以防止通常由缺血/缺氧和/或高血糖诱导的Sp1的表达/激活,这进而将防止SUR1的表达(Chae YM等,2004,在此引入作为参考)。因此,本发明包括防止Sp1和/或HIF1结合的抑制剂或分子。其他这样的Sp1抑制剂可以包括但不限于光神霉素。
因此,考虑候选物质或SUR1抑制剂可以是DNA-结合蛋白或转录因子或分子或化合物,其抑制或干扰转录因子如Sp1或HIF1的活性或结合。提出SUR1抑制剂可以结合位于基因内的调节元件来改变基因的转录或可以防止DNA-结合蛋白或转录因子如Sp1或HIF1的结合。本发明中还考虑了推定的SUR1抑制剂与另一种化合物例如蛋白质的相互作用来形成复合物,这与DNA相互作用来改变转录,如防止或降低转录。将理解与推定的SUR1抑制剂相互作用的化合物可以是一种或多于一种的化合物。
2.反义和核酶
结合翻译或转录起始位点或剪接点的反义分子是理想的抑制剂。反义、核酶和双链RNA分子靶向特定的序列来获得特定多肽如SUR1的减少或消除。因此,考虑构建反义、核酶和双链RNA以及RNA干扰分子并用于调节SUR1。
a.反义分子
反义方法利用了核酸易于与互补序列配对的事实。互补表示多核苷酸是根据标准Watson-Crick互补规则能够碱基配对的那些多核苷酸。即,较大的嘌呤将与较小的嘧啶碱基配对来形成鸟嘌呤和胞嘧啶配对(G:C)以及在DNA的情况中腺嘌呤和胸腺嘧啶配对(A:T),或在RNA的情况中腺嘌呤和尿嘧啶配对(A:U)的组合。在杂交序列中包括不太常见的碱基如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基胞嘧啶、次黄嘌呤和其它碱基不干扰配对。
用多核苷酸靶向双链(ds)DNA导致三螺旋形成;靶向RNA将导致双螺旋形成。反义多核苷酸在引入目标细胞中时,将特异性地结合它们的目标多核苷酸并干扰转录、RNA加工、转运、翻译和/或稳定性。反义RNA构建体或编码这样反义RNA的DNA,用来在体外或在体内抑制宿主细胞内的基因转录或翻译或两者,如在宿主动物包括人患者体内。
设计反义构建体来结合启动子和其他控制区域、外显子、内含子乃至基因的外显子-内含子边界。考虑最有效的反义构建体可以包括与内含子/外显子剪接点互补的区域。因此,使用具有与内含子-外显子剪接点的50-200个碱基内的区域的互补性的反义构建体。已经观察到一些外显子序列可以包括在构建体内而不严重影响其目标选择性。所包括的外显子材料的量根据所用的特定外显子和内含子序列而改变。简单地通过体外测试构建体来测定正常细胞功能是否受到影响或具有互补序列的相关基因的表达是否受到影响,本领域技术人员易于测试是否包括了太多外显子DNA。
有利的是将基因组DNA的部分组合cDNA或合成序列来产生特定的构建体。例如,在最终构建体中需要内含子的情况中,需要使用基因组克隆。cDNA或合成多核苷酸可以提供更方便的限制位点用于构建体剩余的部分,因此,用于序列的剩余部分。
b.RNA干扰
本发明中还考虑了将双链RNA用作干扰分子,例如,RNA干扰(RNAi)。通过简单地将双链RNA分子注射、浸浴或饲喂给目标生物体,将RNA干扰用于“击倒”或抑制特定的目标基因。该技术选择性地“击倒”基因功能而不需要转染或重组技术(Giet,2001;Hammond,2001;Stein P等,2002;Svoboda P等,2001;Svoboda等,2000)。
另一种类型的RNAi通常称为小干扰RNA(siRNA),这也可以用于抑制SUR1。siRNA可以包括双链结构或单链结构,它的序列与目标基因的至少一部分“基本上相同”(参见WO04/046320,在此将其全部引入作为参考)。“同一性”,如本领域已知的,是两个或多个多核苷酸(或多肽)序列之间的关系,如通过比较序列来测定。在本领域中,同一性还表示多核苷酸序列之间的序列相关性的程度,如通过这样序列之间的核苷酸次序的匹配所测定的。可以容易地计算同一性。参见,例如:Computational Molecular Biology(计算机分子生物学),Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects(生物计算机化:信息学和基因组计划),Smith,D.W.ea.Academic Press,New York,1993,和WO 99/32619、WO 01/68836、WO 00/44914和WO 01/36646中公开的方法,在此特意引入作为参考。存在多种方法用于测定两个核苷酸序列之间的同一性,该术语是本领域公知的。通常设计测定同一性的方法来产生核苷酸序列匹配的最大程度,且通常体现为计算机程序。这样的程序对于相关领域的那些技术人员是可获得的。例如,GCG程序包(Devereux等)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul等)和CLUSTAL(Higgins等,1992;Thompson等,1994)。
因此,siRNA包含与目标基因的至少一部分基本上相同的核苷酸序列,所述目标基因例如SUR1或与NCCa-ATP通道相关的任何其他分子实体如孔形成亚基。本领域技术人员知道易于在GenBank中获得SUR1的核酸序列,例如,GenBank登录号L40624(GI:1311533),在此将其全部引入作为参考。优选,siRNA包含与目标基因的至少一部分完全相同的核苷酸序列。当然,将RNA序列与DNA序列比较时,“相同的”RNA序列在DNA序列含有脱氧核糖核苷酸的位置将含有核糖核苷酸,此外RNA序列通常在DNA序列含有胸腺嘧啶的位置含有尿嘧啶。
本领域技术人员将认识到可以在较长片段的整个长度比较两个不同长度的多核苷酸。或者,可以比较小区域。为了最终估计它们在本发明实践中的可用性,通常比较相同长度的序列。优选用作siRNA的dsRNA和目标基因(例如,SUR1)的至少15个连续核苷酸之间的序列同一性为100%,尽管具有70%、75%、80%、85%、90%或95%或更高同一性的dsRNA也可以用于本发明中。与目标基因至少一部分基本上相同的siRNA也可以是dsRNA,其中两个互补链之一(或,在自我互补RNA的情况中,两个自我互补部分之一)与目标基因的该部分的序列相同或相对于目标基因该部分的核苷酸序列含有一个或多个插入、缺失或单点突变。因此siRNA技术具有能够耐受可能预期由遗传突变、菌株多态性或进化趋异形成的序列变异的特性。
存在几种制备siRNA的方法,如化学合成、体外转录、siRNA表达载体和PCR表达盒。与使用的方法无关,设计siRNA分子中的第一步是选择siRNA靶向位点,其可以是目标基因中的任何位点。特定实施方案中,本领域技术人员可以人工选择基因的目标选择区域,可以是ORF(可读框)作为目标选择区域并可以优选“ATG”起始密码子下游的50-100个核苷酸。然而,存在几种容易获得的程序来用于辅助设计siRNA分子,例如Promega的siRNA Target Designer、GenScriptCorp.的siRNA Target Finder,Imgenex Corp.的siRNA RetrieverProgram、EMBOSS siRNA算法、Qiagen的siRNA程序、Ambion siRNA预测器、Ambion siRNA预测器、Whitehead siRNA预测器和Sfold。因此,设想上述程序的任一种可以用来产生可以用于本发明中的siRNA分子。
c.核酶
核酶是以位点特异性方式切割核酸的RNA-蛋白复合物。核酶具有特定的催化结构域,该结构域具有核酸内切酶活性(Kim和Cech,1987;Forster和Symons,1987)。例如,许多核酶以高度特异性加速磷酯转移反应,通常只切割寡核苷酸底物中的几种磷酯中的一种(Cech等,1981;Reinhold-Hurek和Shub,1992)。已经将这种特异性归因于在化学反应之前底物通过特异性碱基配对相互作用结合到核酶的内部指导序列(“IGS”)的要求。
主要观察到核酶催化作为涉及核酸的序列特异性切割/连接反应的一部分(Joyce,1989;Cech等,1981)。例如,U.S.专利5,354,855报道了特定核酶可以作为核酸内切酶,具有高于已知核糖核酸酶和近似DNA限制酶的序列特异性。因此,序列特异性核酶介导的基因表达抑制特别适用于治疗应用(Scanlon等,1991;Sarver等,1990;Sioud等,1992)。大部分的这种工作涉及目标mRNA的修饰,基于通过特异性核酶切割的特定突变密码子。根据在此包括的信息和本领域普通技术人员的知识,特异性瞄准给定基因的其他核酶的制备和使用现在将是清楚简易的。
其他合适的核酶包括来自具有RNA切割活性的RNase P的序列(Yuan等,1992;Yuan和Altman,1994)、发夹核酶结构(Berzal-Her ranz等,1992;Chrowrira等,1993)和基于δ肝炎病毒的核酶(Perrotta和Been,1992)。核酶指导的RNA切割活性的一般设计和最佳化已经详细讨论过了(Haseloff和Gerlach,1988;Symons,1992;Chowrira等,1994;和Thompson等,1995)。
关于核酶设计的其他变量是给定目标RNA上的切割位点的选择。根据通过互补碱基对相互作用与位点的退火,将核酶靶向给定序列。对于这种瞄准需要同源性的两段序列。这些同源序列片段位于以上限定的催化核酶结构的侧面。每段同源序列可以长为7至15个核苷酸。对于限定同源序列仅有的要求是,在目标RNA上,它们通过作为切割位点的特异性序列分开。对于锤头状核酶,切割位点是目标RNA上的二核苷酸序列,尿嘧啶(U)接着腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶(A、C或U;Perriman等,1992;Thompson等,1995)。这种二核苷酸在任何给定的RNA中发生的频率在统计学上是16个中3个。
用于目标RNA有效切割的核酶的设计和测试是本领域技术人员公知的过程。Chowrira等(1994)以及Lieber和Strauss(1995)描述了设计和测试核酶的科学方法实例,各自引入作为参考。靶向SUR1的核酶中所用的有效和优选序列的鉴定只是制备和测试给定序列的问题,且是本领域技术人员已知的常用筛选方法。
C.筛选抑制剂的方法
本发明进一步的实施方案可以包括鉴定NCCa-ATP通道抑制剂例如拮抗剂的方法。这些测定可以包括候选物质大文库的随机筛选;或者,可以将测定用于聚焦特定类别的化合物,这些化合物是着眼于认为使它们更有可能调节NCCa-ATP通道的功能或活性或表达的结构性质而选定的。
功能表示本领域技术人员可以测试mRNA表达、蛋白表达、蛋白活性或通道活性,更具体地,调节剂抑制或阻断NCCa-ATP通道的能力。因此,根据本发明筛选的化合物包括但不限于结合NCCa-ATP通道并阻断通道(例如,拮抗剂)的天然或合成有机化合物、肽、抗体及其片段、肽拟似物(peptidomimetics)。
关于影响NCCa-ATP通道的化合物的筛选,可以筛选已知化合物的文库,包括天然产物或合成化学物质,和生物活性物质,包括蛋白质,选择作为抑制剂或激活剂的化合物。优选,这样的化合物是NCCa-ATP拮抗剂,其包括NCCa-ATP通道抑制剂、NCCa-ATP通道阻断剂、SUR1拮抗剂、SUR1抑制剂和/或能够减小通过通道的膜电流大小的化合物。
化合物可以包括但不限于小的有机或无机分子、化合物文库中可获得的化合物、肽,例如,可溶性肽,包括但不限于随机肽文库中的成员(参见,例如,Lam,K.S.等,1991,Nature 354:82-84;Houghten,R.等,1991,Nature 354:84-86),和组合化学衍生的分子文库,由D-和/或L-构型氨基酸、磷酸肽(包括,但不限于,随机或部分简并的、定向的磷酸肽文库的成员;参见,例如,Songyang,Z.等,1993,Cell 72:767-778)、抗体(包括,但不限于,多克隆、单克隆、人源化、抗独特型、嵌合或单链抗体,和FAb、F(ab′)2和FAb表达文库片段及其表位结合片段)构成。
根据本发明可以筛选的其他化合物包括但不限于能够穿过血脑屏障、进入合适的神经细胞并影响NCCa-ATP通道基因或一些其他涉及NCCa-ATP通道活性的基因的表达(例如,通过与涉及基因表达的调节区域或转录因子相互作用)的小有机分子;或影响NCCa-ATP通道的活性或涉及NCCa-ATP通道活性的一些其他胞内因子的活性的化合物。
为了鉴定、制备、产生、提供、制造或获得抑制剂,通常测定候选物质存在、不存在或两种情况下的NCCa-ATP通道活性,其中将抑制剂或拮抗剂定义为下调、减小、抑制、阻断或降低NCCa-ATP通道表达或活性的任何物质。例如,方法可通常包括:
提供怀疑在体外或在体内抑制NCCa-ATP通道表达或活性的候选物质;
评估候选物质在体外或在体内抑制NCCa-ATP通道表达或活性的能力;
选择抑制剂;和
制造抑制剂。
特定实施方案中,可选的评估步骤可以评估候选物质在体外或在体内特异性结合NCCa-ATP通道的能力;
进一步的实施方案中,可以在细胞或无细胞系统中提供NCCa-ATP通道并将NCCa-ATP通道接触候选物质。接着,通过评估候选物质对NCCa-ATP通道活性或表达的作用来选择抑制剂。一旦鉴定了抑制剂,方法可以进一步提供抑制剂的制造。
V.脊髓损伤的治疗
其他实施方案中,本发明的治疗化合物包括神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合的NCCa-ATP通道的拮抗剂。考虑将拮抗剂用于治疗与脊髓损伤相关的不利病症。这样的病症包括与脊髓损伤相关的继发性损伤,例如,但不限于细胞水肿、细胞死亡(例如,坏死性细胞死亡)、炎症、氧化性损伤、轴突损伤、出血转化等。拮抗剂保护表达NCCa-ATP通道的细胞,这对于其中形成离子性或细胞毒性水肿、其中丧失毛细血管完整性的临床治疗是有利的。通过抑制NCCa-ATP通道的保护作用与离子性和细胞毒性水肿的减轻相关。因此,抑制NCCa-ATP通道的化合物是神经保护性的。
一方面中,将NCCa-ATP通道阻断、抑制或以其它方式降低活性。这样的实例中,给药和/或运用NCCa-ATP通道的拮抗剂。拮抗剂调节NCCa-ATP通道,使得通过通道的流量(离子和/或水)减少、中止、降低和/或停止。对于神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合的NCCa-ATP通道的活性,拮抗剂可以具有可逆或不可逆的活性。因此,对NCCa-ATP通道的抑制可以降低细胞毒性水肿和内皮细胞的死亡,这与离子性水肿的形成和出血转化相关。
因此,本发明在与脊髓损伤相关炎症的治疗或缓解中是有用的。根据本发明的特定实施方案,有效量活性化合物的给药可以阻断所述通道,而如果其保持打开则导致神经元细胞肿胀和细胞死亡,这导致炎症应答的启动。多种SUR1的拮抗剂适用于阻断所述通道。合适的SUR1拮抗剂的实例,包括但不限于,格列本脲、甲苯磺丁脲、瑞格列奈、那格列奈、美格列奈、咪格列唑、LY397364、LY389382、glyclazide、格列美脲、雌激素、雌激素相关化合物及其组合。本发明的优选实施方案中,SUR1拮抗剂选自格列本脲和甲苯磺丁脲。另一种可以使用的拮抗剂是MgADP。可以采用防止神经细胞肿胀和细胞死亡的其他治疗“策略”,包括但不限于维持神经细胞极化状态的方法和防止强烈去极化的方法。
进一步的实施方案中,NCCa-ATP通道的抑制剂或拮抗剂可以用来降低或缓解或消除出血转化和/或损伤部位附近或周围外渗的血液。随着NCCa-ATP通道拮抗剂的给药,由于NCCa-ATP通道的打开内皮细胞去极化得到消除、减缓、降低或抑制。因此,细胞去极化的消除导致Na+流入的消除或抑制,这防止了渗透梯度的改变,因此防止了水流入内皮细胞中并停止了细胞肿胀、起泡和细胞毒性水肿。因此,防止或抑制或减轻内皮细胞去极化可以防止或降低出血转化和/或损伤部位附近或周围外渗的血液。
因此,使用拮抗剂或其相关化合物可以降低脊髓损伤患者的死亡率和/或拯救半影区域或防止半影区域中的损伤,所述半影区域包括处于变成不可逆损伤风险中的组织区域。
其中可以给药NCCa-ATP通道拮抗剂的神经元细胞可包括表达SUR1的任何细胞,例如,任何神经元细胞、神经胶质细胞或神经内皮细胞。
可以用拮抗剂或其相关化合物治疗的患者包括患有脊髓损伤的那些。可以用本发明的拮抗剂治疗的其他患者包括处于发生脊髓损伤风险或倾向于发生脊髓损伤的那些患者,如接受脊髓外科手术或脊髓放疗的患者。这样的情况中,在实际治疗之前用本发明的拮抗剂或其相关化合物治疗患者。预治疗可以包括在实际治疗或外科手术或放疗之前给药拮抗剂和/或相关化合物几个月(1、2、3等)、几周(1、2、3等)、几天(1、2、3等)、几小时(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)或几分钟(15、30、60、90等)。在治疗和/或外科手术过程中以及治疗和/或外科手术后可以持续拮抗剂和/或相关化合物的治疗直至患者发生脊髓损伤的风险得到降低、减少或缓解。再进一步,处于脊髓损伤风险中的其他患者可以包括具有节段性畸形和/或其他脊髓病症或压迫疾病例如关节炎或库兴氏病的那些患者。
可以给予细胞的NCCa-ATP通道拮抗剂的有效量包括约0.0001nM至约2000μM的剂量。更具体地,给药的剂量为约0.01nM至约2000μM;约0.01μM至约0.05μM;约0.05μM至约1.0μM;约1.0μM至约1.5μM;约1.5μM至约2.0μM;约2.0μM至约3.0μM;约3.0μM至约4.0μM;约4.0μM至约5.0μM;约5.0μM至约10μM;约10μM至约50μM;约50μM至约100μM;约100μM至约200μM;约200μM至约300μM;约300μM至约500μM;约500μM至约1000μM;约1000μM至约1500μM和约1500μM至约2000μM。当然,所有这些量是示例性的,且预期这些点中间的任何量在本发明中也是有用的。
拮抗剂或其相关化合物可以非肠道或消化道给药。非肠道给药包括,但不限于,静脉内、皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内,U.S.专利No.6,613,308、5,466,468、5,543,158;5,641,515;和5,399,363(在此特意将每篇全部引入作为参考)。消化道给药包括但不限于口服、口含、直肠或舌下。
本发明治疗化合物和/或治疗的给药可以包括全身、局部和/或区域性给药,例如,局部(皮肤、经皮)、通过导管、可植入的泵等。或者,也可以考虑其他给药途径,如动脉灌注、腔内、腹膜内、胸膜内、心室内和/或鞘内。本领域技术人员知道使用标准方法和程序来确定合适的给药途径。说明书别处讨论了其他的给药途径并在此引入作为参考。
治疗方法将包括用有效量的含有NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物的组合物来治疗个体。通常将有效量限定为足以可检测和可重复地改善、降低、最小化或限制疾病或其症状程度的量。更具体地,预想用NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物的治疗将抑制细胞去极化、抑制Na+流入、抑制渗透梯度改变、抑制水流入细胞中、抑制细胞毒性细胞水肿、降低中风大小、抑制出血转化和降低患者的死亡率。
待使用的NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物的有效量是在接受动物或病人中有效产生有益效果的那些量,特别是对于中风治疗。通过阅读公开文献、通过进行体外测试或通过在健康实验动物中进行代谢研究可初步确定这样的含量。在用于临床环境中之前,在动物模型中进行证实研究是有益的,优选广泛公认的待治疗特定疾病的动物模型。用于特定实施方案中的优选动物模型是啮齿动物模型,因为它们使用经济,特别是因为广泛公认获得的结果可以作为临床值的预测,因此是优选的。
如本领域公知的,活性化合物如NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物对于任何特定患者的特定剂量水平取决于各种因素,包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、药物组合和接受治疗的特定疾病的严重程度。负责给药的人将决定用于个体患者的合适剂量。此外,对于人给药,制剂应当满足无菌、热原性、一般安全性和纯度标准,如FDA生物学标准办公室所要求的。
本领域技术人员知道拮抗剂或其相关化合物的有效量可以是获得所需结果需要的量:炎症的减轻、细胞死亡的降低、出血转化的降低、外渗血液的减少、损伤大小的降低、cGFAP上调的降低等。该量还可以是维持患者合理血糖水平的含量,例如,拮抗剂的量维持至少60mmol/l的血糖水平,更优选,将血糖水平维持在约60mmol/l至约150mmol/1的范围内。因此,该量防止患者变成血糖过低。如果葡萄糖水平不正常,那么本领域技术人员将根据患者是血糖过低或血糖过高而给药胰岛素或葡萄糖。
因此,特定实施方案中,本发明包括共同给药NCCa-ATP通道的拮抗剂和葡萄糖或相关的碳水化合物来维持合适的血清葡萄糖水平。合适的血糖水平在约60mmol/l至约150mmol/l的范围内。因此,联合给药葡萄糖或相关碳水化合物,以将血清葡萄糖维持于该范围内。
作为治疗的NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物的治疗有效量根据待治疗的宿主和特定的给药方式而改变。本发明的一实施方案中,NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物的剂量范围为约0.01μg/kg体重至约20,000μg/kg体重。当待治疗的是动物的时候,术语“体重”是适用的。当待治疗的是分离的细胞时,在此所用的“体重”应当理解为意思是“总细胞体重”。术语“总体重”可以适用于分离的细胞和动物治疗。还认为本申请中表达为“体重”或简单“kg”的所有浓度和治疗水平涵盖了类似的“总细胞体重”和“总体重”浓度。然而,本领域技术人员将认识到多种剂量范围的可用性,例如,0.01μg/kg体重至20,000μg/kg体重、0.02μg/kg体重至15,000μg/kg体重、0.03μg/kg体重至10,000μg/kg体重、0.04μg/kg体重至5,000μg/kg体重、0.05μg/kg体重至2,500μg/kg体重、0.06μg/kg体重至1,000μg/kg体重、0.07μg/kg体重至500μg/kg体重、0.08μg/kg体重至400μg/kg体重、0.09μg/kg体重至200μg/kg体重或0.1μg/kg体重至100μg/kg体重。此外,本领域技术人员将认识到各种不同的剂量水平是有用的,例如,0.0001μg/kg、0.0002μg/kg、0.0003μg/kg、0.0004μg/kg、0.005μg/kg、0.0007μg/kg、0.001μg/kg、0.1μg/kg、1.0μg/kg、1.5μg/kg、2.0μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg、15.0μg/kg、30.0μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg、120μg/kg、140μg/kg、150μg/kg、160μg/kg、180μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、750μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、1mg/kg、5mg/kg、0mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg和/或30mg/kg。当然,所有这些剂量是示例性的,且预期这些点中间的任何剂量在本发明中也是有用的。对于NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物,可以使用以上任一个的剂量范围或剂量水平。
将按照用于治疗剂给药的一般方案将本发明治疗性的NCCa-ATP通道拮抗剂组合物给药于病人或患者,如果有的话,考虑NCCa-ATP通道拮抗剂的毒性。预期按照需要可以重复治疗循环。还考虑了各种标准疗法,以及外科手术干预,可以结合上述治疗使用。
治疗可以包括各种“单位剂量”。将单位剂量定义为含有计算产生与其给药(例如,合适的途径和治疗方案)相关期望应答的预定量治疗组合物(NCCa-ATP通道的拮抗剂或其相关化合物)。待给药的量,以及特定的途径和制剂,是临床领域技术人员的技术范围内的。待治疗的患者也是重要的,特别是患者的状态和所需的保护。单位剂量不需要作为单次注射给药,而是可以包括设定时间段内的连续输注。
VI.联合治疗
在本发明的范围内,考虑可以将NCCa-ATP通道的拮抗剂或其相关化合物联合其他治疗剂使用来更有效地治疗脊髓损伤。一些实施方案中,考虑常规疗法或药剂,包括但不限于药理学治疗剂,可以联合本发明的拮抗剂或其相关化合物。
药理学治疗剂和给药方法、剂量等是本领域技术人员公知的(参见例如,“Physicians Desk Reference”(医师案头参考),Goodman& Gliman的“The Pha rmacological Basis of Therapeutics”(治疗的药理学基础)、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”(雷明顿药物科学)和“The Merck Index,Eleventh Edition”(默克索引,第十一版),在此将相关部分引入作为参考),并根据在此的公开内容可以与本发明联合。根据待治疗患者的状况必定产生剂量的一些改变。任何情况下,负责给药的人将决定用于个体患者的合适剂量,且这样的个体决定是在本领域普通技术人员的技术范围内的。
可以用于本发明中的药理学治疗剂的非限制性实例包括抗炎剂。抗炎剂包括但不限于非甾体抗炎剂(例如,萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、celeoxib)和甾体抗炎剂(例如,糖皮质激素、地塞米松、甲基强的松龙)。
可以联合本发明的拮抗剂使用的其他药剂可包括但不限于抗氧化剂、钙阻断剂、控制兴奋毒性的药物和增强轴突信号作用的药物,如4-氨基吡啶。
可以联合本发明的拮抗剂使用的更多其他药剂还可包括设计通过使用营养因子促进再生的药剂,和生长抑制物质。
再者,非药理学干预也可以结合本发明的拮抗剂使用,如移植、外周神经移植、降低体温(冷却)。
当其他的治疗剂,只要其他治疗剂的剂量没有超过之前所引用的毒性水平,可以将其他治疗剂的有效量简单地定义为当结合NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物给药于动物时有效减轻水肿或减轻继发性损伤的量。这可以通过监测动物或病人并测定表示给定治疗成功的那些健康和疾病的物理和生化参数容易地确定。这样的方法在动物测试和临床实践中是常规的。
为了使用本发明的方法和组合物抑制出血转化、降低氧化应激、降低细胞死亡、减轻细胞肿胀等等,通常将细胞接触NCCa-ATP通道的拮抗剂或其相关化合物,结合其他的治疗剂,如抗炎剂等。以有效抑制出血转化、细胞肿胀、细胞死亡和水肿等的组合量来提供这些组合物。该过程包括将细胞接触NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物,同时结合其他治疗剂或因子。这可以通过以下方式来实现:将细胞接触包括两种药剂的单一组合物或药物制剂,或将细胞同时接触两种不同的组合物或制剂,其中一种组合物包括NCCa-ATP通道的拮抗剂或其衍生物,另一种包括其他药剂。
或者,可以在其他药剂治疗之前或之后以几分钟至几小时至几周至几个月的时间间隔来使用NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物进行治疗。在将其他药剂分开运用至细胞的情况中,通常确保每次传送时间之间的有效时间段没有期满,使得药剂仍然能够对细胞发挥有利的组合作用。在这样的情况中,考虑在彼此约1-24小时内将细胞接触两种治疗形式,更优选,在彼此约6-12小时内。
VII.制剂和化合物的给药途径
本发明的药物组合物包括溶解或分散于药物学上可接受载体中的有效量的一种或多种NCCa-ATP通道的抑制剂(拮抗剂)或相关化合物或其他药剂。短语“药物学或可药用”指的是给药于动物例如如果合适给药于人时不产生不利、过敏或其他不适反应的分子实体和组合物。本领域技术人员根据本发明的公开内容将知道含有至少一种NCCa-ATP通道的调节剂(拮抗剂和/或激动剂)或相关化合物或其他活性成分的药物组合物的制备,如Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学),18版,Mack Printing Company,1990,中所示例的,在此引入作为参考。此外,对于动物(例如,人)给药,将理解制剂应当满足无菌、热原性、一般安全性和纯度标准,如FDA生物学标准办公室所要求的。
如在此所用的,“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、衣料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如,抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料,类似的物质及其组合,如本领域技术人员已知的(参见,例如,Remington’sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学),18版,Mack PrintingCompany,1990,pp.1289-1329,在此引入作为参考)。除非任何常规载体与活性成分不相容,否则考虑将其用于药物组合物中。
根据是否以固体、液体或气溶胶形式给药,和对于如注射这样的给药途径是否需要无菌,NCCa-ATP通道的抑制剂(拮抗剂)或相关化合物可以包括不同类型的载体。本发明可以静脉内、皮内、经皮、鞘内、心室内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、肌内、皮下、粘膜、口服、局部、区域、吸入(例如,气溶胶吸入)、注射、输注、连续输注、直接浸浴目标细胞的局部灌注、通过导管、通过灌洗、霜剂、液体组合物(例如,脂质体),或通过其他方法或之前的任意组合来给药,如本领域技术人员已知的(参见,例如,Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学),18版,Mack PrintingCompany,1990,在此引入作为参考)。
可以将NCCa-ATP通道的抑制剂(拮抗剂)或相关化合物配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。可药用盐,包括酸加成盐,例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的那些,或与无机酸如盐酸或磷酸或有机酸如醋酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成。与游离羧基形成的盐也可以源自无机碱,例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁;或者有机碱,如异丙基胺、三甲胺、组胺或普鲁卡因。配制时,以与药剂相容的方式和治疗有效的量来给予溶液。可以以各种剂型来容易地给药制剂,如为非肠道给药而配制的,如注射液,或用于传送至肺的气溶胶,或为了消化道给药而配制的,如药物释放胶囊等。
进一步根据本发明,在可药用载体中提供适于给药的本发明的组合物,用或不用惰性稀释剂。载体应当是可同化的并包括液体、半固体,即,糊状物,或固体载体。除非任何常规介质、试剂、稀释剂或载体对接收者或其中含有的组合物的治疗有效性是有害的,否则用于本发明方法实践中的可给药组合物中是合适的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等,或其组合。组合物还可以包括各种抗氧化剂来防止一种或多种成分的氧化。此外,可以通过防腐剂来防止微生物的作用,如各种抗细菌和抗真菌剂,包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如,对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、水杨乙汞或其组合。
根据本发明,以任何常规和实用的方式将组合物与载体混合,即,通过溶解、悬浮、乳化、混合、包胶、吸收等。这样的方法对于本领域技术人员是常规的。
本发明的特定实施方案中,将组合物与半固体或固体载体彻底合并或混合。可以以任何常规方式如研磨来进行混合。在混合过程中还可以加入稳定剂,以便保护组合物以免丢失治疗活性,即,在胃中的变性作用。用于组合物中的稳定剂实例包括缓冲剂、氨基酸如甘氨酸和赖氨酸、碳水化合物如葡聚糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甘露糖醇等,
进一步的实施方案中,本发明可以涉及药物脂质载体组合物的使用,该组合物包括NCCa-ATP通道的抑制剂(拮抗剂)或相关化合物、一种或多种脂质和含水溶剂。如在此所用的,将术语“脂质”限定为包括特征在于在水中不溶且用有机溶剂可以提取的大范围物质中的任何一种。这一大类的化合物是本领域技术人员公知的,如术语“脂质”在此使用的,不限于任何特定结构。实例包括含有长链脂肪族烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然产生的或是合成的(即,通过人设计或生产的)。然而,脂质通常是生物物质。生物脂质是本领域公知的,并包括例如,中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂质、鞘糖脂、糖脂、硫苷脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合的脂质,及其组合。当然,本发明的组合物和方法也包括除了在此特意所述那些以外的本领域技术人员理解为脂质的化合物。
本领域技术人员熟知多种可以将组合物分散在脂质载体中的技术。例如,可以将NCCa-ATP通道的抑制剂(拮抗剂)或相关化合物分散于含有脂质的溶液中、用脂质溶解、用脂质乳化、与脂质混合、与脂质合并、与脂质共价结合、作为悬浮液包含于脂质中、包含或复合胶束或脂质体,或通过任何本领域技术人员已知的任何方式与脂质或脂质结构另外结合。分散可以导致或可以不导致脂质体的形成。
给药于动物患者的本发明组合物的实际剂量可以通过物理和生理因素来决定,如体重、病症的严重程度、待治疗疾病的类型、之前或目前的治疗和/或预防性干预、患者的自发病和给药的途径。根据给药的剂量和途径,根据患者的应答可以改变优选剂量和/或有效量的给药次数。负责给药的医师将在任何情况下决定用于个体患者的组合物中活性成分的浓度和合适的剂量。
特定实施方案中,药物组合物可以包括,例如,至少约0.1%活性化合物。其他实施方案中,活性化合物可以包括约2%至约75%重量单位,或例如约25%至约60%,以及从此衍生的任何范围。自然地,以在任何给定单位剂量化合物中获得合适剂量的方式来制备每个治疗上有用组合物中的活性化合物的量。本领域技术人员制备这样的药物制剂将考虑因素如溶解性、生物利用率、生物半衰期、给药途径、产品货架期以及其他药理学考虑,因而,各种剂量和治疗方案是所希望的。
A.消化道组合物和制剂
本发明的优选实施方案中,将NCCa-ATP通道的拮抗剂或相关化合物配制成通过消化道途径来给药。消化道途径包括其中组合物直接接触消化道的所有可能给药途径。具体地,在此公开的药物组合物可以口服、口含、直肠或舌下给药。因此,可以将这些组合物与惰性稀释剂或可同化的可食载体一起配制,或可以封装于硬-或软-壳明胶胶囊中,或可以压制成片剂,或可以直接掺入膳食的食物中。
特定实施方案中,活性化合物可以掺入赋形剂并以可摄取的片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、水等形式来使用(Mathiowitz等,19971;Hwang等,1998;U.S.专利No.5,641,515;5,580,579和5,792,451,在此特意将每篇全部引入作为参考)。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以含有以下物质:粘合剂,如,例如,黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合;赋形剂,如,例如,磷酸二钙、甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合;崩解剂,如,例如,玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻朊酸或其组合;润滑剂,如,例如,硬脂酸镁;润湿剂,如,例如,蔗糖、乳糖、糖精或其组合;调味剂,如,例如,薄荷、冬绿油、樱桃调味料、橙子调味料等。当单位剂型是胶囊时,除了上述种类的物质,可以含有脂质载体。可以存在各种其他材料来作为包衣或以其它方式改变单位剂量的物理形式。例如,片剂、丸剂或胶囊可以包覆虫胶、糖,或两者。当剂型是胶囊时,除了上述类型的物质,可以含有载体,如液体载体。可以将明胶胶囊、片剂或丸剂肠溶包衣。肠衣防止组合物在pH是酸性的胃或上部肠中变性。参见,例如,U.S.专利No.5,629,001。达到小肠时,其中的碱性pH溶解包衣并允许组合物释放和通过专门的细胞例如上皮消化道细胞和派伊尔结M细胞来吸收。酏剂的糖浆可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、染料和调味剂,如樱桃或橙子香精。当然,制备任何单位剂型中所用的任何材料应当是药物学纯的并在所用的量中是基本上无毒的。此外,可以将活性化合物掺入持续释放的制剂和配方中。
对于口服,本发明的组合物可以可选地掺入一种或多种赋形剂以漱口水、牙膏、口含片、口腔喷雾或舌下口服给药制剂的形式。例如,可以将活性成分以所需的含量掺入合适的溶剂中,如硼酸钠溶液(Dobell’s溶液),来制备漱口水。或者,活性成分可以掺入口服溶液如含有硼酸钠、甘油和碳酸二钾的溶液中,或分散于牙膏中,或以治疗有效量加入包括水、粘合剂、磨料、调味剂、起泡剂和湿润剂的组合物中。或者,可以将组合物制成可以置于舌下或以其它方式溶解于口中的片剂或溶液形式。
适于其他消化道给药方式的其他制剂包括栓剂。栓剂是各种重量和形状的固体剂型,通常是加有药物的,用于插入直肠中。插入后,栓剂在腔液体中软化、熔化或溶解。通常,对于栓剂,典型的载体可以包括,例如,聚乙二醇、甘油三酯或其组合。特定实施方案中,栓剂可以由含有例如约0.5%至约10%优选约1%至约2%活性成分的混合物形成。
B.非肠道组合物和制剂
进一步的实施方案中,可以通过非肠道途径来给药NCCa-ATP通道的拮抗剂或相关化合物。如在此所用的,术语“非肠道”包括绕开消化道的途径。具体地,在此公开的药物组合物可以例如但不限于静脉内、皮内、肌内、动脉内、心室内、鞘内、皮下或腹膜内,U.S.Pat.Nos.6,7537,514、6,613,308、5,466,468、5,543,158;5,641,515;和5,399,363(在此将每篇全部引入作为参考)。
可以在水中制得作为游离碱或药物学上可接受盐的活性化合物的溶液,合适地混合表面活性剂,如羟基丙基纤维素。可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制得分散剂。在常规的存储和使用条件下,这些制剂含有防腐剂来防止微生物的生长。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散剂,和用于无菌注射液或分散剂临时制备的无菌粉末(U.S.专利5,466,468,在此特意全部引入作为参考)。在所有的情况中,形式必须是无菌的并必须流动至易于注射力存在的程度。在制造和存储的条件下必须稳定且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质,含有,例如,水、乙醇、DMSO、多元醇(剂,甘油、乙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物,和/或植物油。例如通过使用包衣如卵磷脂,或在分散体的情况中通过维持所需的粒径,和通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。通过各种抗细菌和抗真菌剂来防止微生物的作用,例如,对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、水杨乙汞等。许多情况中,优选包括等渗剂,例如,糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收剂例如一硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。
对于水溶液的非肠道给药,例如,如果需要,溶液应当得到适当地缓冲,并使用足量的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。关于这点,根据本发明的公开内容可以使用的无菌含水介质是本领域技术人员已知的。例如,可以将一剂药溶解于1ml等渗NaCl溶液中并加入1000ml皮下灌注术流体或在提议的输注部位注射(参见,例如,Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学),15版,p1035-1038和1570-1580)。根据待治疗患者的情况,必定发生剂量的一些改变。负责给药的人员在任何情况下将决定用于个体患者的合适剂量。此外,对于人给药,制剂应当满足无菌、热原性、一般安全性和纯度标准,如FDA生物学标准办公室所要求的。
通过将活性化合物以所需量掺入合适的溶剂中制得无菌注射液,根据需要,使用以上列举的各种其他配料,接着无菌过滤。通常,通过将各种无菌的活性成分掺入无菌载体中制得分散体,该载体含有基础的分散介质和来自以上列举那些的所需其他配料。在用于制备无菌注射液的无菌粉末情况中,优选的制备方法是真空干燥和冻干技术,这从之前无菌过滤溶液产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。将粉末状的组合物与液体载体混合,如例如,水或盐溶液,用或不用稳定剂。
C.混杂的药物组合物和制剂
本发明的其他优选实施方案中,可以配制NCCa-ATP通道的拮抗剂或相关化合物来用于通过各种混杂途径给药,例如,局部(即,经皮)给药、粘膜给药(鼻内、阴道等)和/或吸入。
用于局部给药的药物组合物可以包括活性化合物,配制成用于加有药物的应用如膏剂、糊剂、霜剂或粉末。膏剂包括所有用于局部应用的油质的、吸收、乳化和水溶性基础组合物,而霜剂和洗剂是只包括乳化基料的那些组合物。局部给药的药物可以含有渗透增强剂来帮助活性成分通过皮肤的吸收。合适的渗透增强剂包括甘油、醇、烷基甲基亚砜、吡咯烷酮和luarocapram。用于局部应用组合物的可能基料包括聚乙二醇、羊毛脂、冷霜和矿脂以及任何其他合适的吸收剂、乳化剂或水溶性膏剂基料。局部制剂还可以包括乳化剂、胶凝剂和抗微生物防腐剂,按照需要来保护活性成分并提供均匀的混合物。本发明的经皮给药还可以包括“贴剂”的使用。例如,贴剂可以在固定的时间段内以预定的速率和连续方式提供一种或多种活性物质。
特定实施方案中,可以通过滴眼剂、鼻内喷雾、吸入和/或其他气溶胶传送载体来传送药物组合物。已经描述了通过鼻气溶胶喷雾将组合物直接传送至肺的方法,例如,U.S.专利No.5,756,353和5,804,212(各自在此特意全部引入作为参考)。同样,使用鼻内微粒树脂(Takenaga等,1998)和溶血磷脂酰-甘油化合物(U.S.专利No.5,725,871,各自在此特意全部引入作为参考)的药物传送在药物学领域中也是公知的。同样,以聚四氟乙烯支持基质形式经粘膜的药物传送描述于U.S.专利No.5,780,045中(在此特意全部引入作为参考)。
术语气溶胶指的是分散于液化或加压气体推进剂中的液体的细分固体颗粒的胶体系统。本发明用于吸入的典型气溶胶由液体推进剂或液体推进剂和合适溶剂混合物中的活性成分悬浮液构成。合适的推进剂包括烃类和烃醚。合适的容器将根据推进剂的压力需要而改变。气溶胶的给药将根据患者的年龄、体重以及症状的严重程度和应答而改变。
VIII.诊断
拮抗剂或相关化合物可以用于诊断、监测或预测脊髓损伤,例如监测神经元的损伤,或监测水肿区域中的神经元细胞等。
A.遗传诊断
本发明的一个实施方案包括检测NCCa-ATP通道任何部分的表达的方法,例如,调节单元SUR1的表达,和/或孔形成亚基的表达。这可以包括测定所表达的SUR1水平和/或所表达的孔-形成亚基水平。通过本发明理解的是NCCa-ATP通道表达的上调或提高涉及提高的SUR1水平,这与增加的神经元损伤相关,如水肿。
首先,从患者获得生物样品。生物样品可以是组织或液体。特定实施方案中,生物样品包括来自脊髓的细胞和/或内皮细胞或与脊髓或脊组织相关的微血管。
根据标准方法(Sambrook等,1989)从生物样品中所含的细胞分离所用的核酸。核酸可以是基因组DNA或分级分离的或全细胞RNA。在使用RNA的情况中,将RNA转化成互补DNA(cDNA)是理想的。一实施方案中,RNA是全细胞RNA;另一实施方案中,是多-A RNA。通常,将核酸扩增。
根据格式,直接使用扩增或扩增后使用第二种已知的核酸来鉴定样品中特定的目标核酸。接着,检测所鉴定的产物。在特定的应用中,通过目测方式来进行检测(例如,凝胶的溴化乙锭染色)。或者,检测可以包括产物的间接鉴定,通过化学发光、放射性标记的放射性闪烁扫描法或荧光标记乃至通过使用电或热脉冲信号的系统(AffymaxTechnology;Bellus,1994)。
检测后,可以将给定患者中看到的结果与正常患者和已经诊断为脊髓损伤和或与其相关的继发性损伤等的患者的统计学显著参照组相比较。
更进一步,考虑基于芯片的DNA技术如Hacia等(1996)和Shoemaker等(1996)所述的那些可以用于诊断。简而言之,这些技术涉及用于快速而准确地分析大量基因的定量方法。通过用寡核苷酸标记基因和使用固定的探针阵列,可以使用芯片技术来分离作为高密度阵列的目标分子并基于杂交来筛选这些分子。请参阅Pease等(1994);Fodor等,(1991)。
B.其他类型的诊断
为了提高分子例如化合物和/或蛋白质和/或抗体作为诊断剂的效用,通常连接或共价结合或复合至少一种所需的分子或部分。
缀合物的特定实例是其中分子(例如,蛋白质、抗体和/或化合物)连接可检测标记的那些缀合物。“可检测标记”是由于特异性的功能特征和/或化学特征可被检测的化合物和/或元素,它的使用可以使它们连接的抗体得到检测,和/或如果需要的话进一步定量。
通常优选将缀合物用作诊断剂。诊断通常属于两个类别,用于体外诊断如各种免疫测定中的那些,和/或用于体内诊断方案的那些,通常称为“分子定向成像”。
许多合适的成像剂是本领域已知的,它们连接分子例如抗体的方法同样是已知的(参见,例如,U.S.专利No.5,021,236;4,938,948;和4,472,509,各自在此引入作为参考)。所用的成像部分可以是顺磁离子;放射性同位素;荧光染料;NMR-可检测物质;X-射线成像。
在顺磁离子的情况中,举例来说可以提及离子如铬(III)、镁(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III),特别优选钆。其他情况如X-射线成像中有用的离子,包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II),尤其是铋(III)。
在放射性同位素用于治疗和/或诊断应用的情况中,可以提及砹211、11碳、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m和/或钇90。通常优选将125I用于特定实施方案中,由于低能量和用于长范围检测的合适性,锝99m和/或铟111通常也是优选的。
考虑用作缀合物的荧光标记中包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5,6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、Pacific Blue、REG、若丹明绿、若丹明红、Renographin、ROX、TAMRA、TET、四甲基若丹明和/或Texas Red。
本发明中考虑的其它类型的缀合物是主要旨在用于体外的那些,其中分子连接第二结合配体和/或在接触发色底物时将产生有色产物的酶(酶标记物)。合适酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素和/或抗生物素蛋白和链霉抗生物素。这样标记的使用是本领域技术人员公知的并描述于例如U.S.专利3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149和4,366,241;各自在此引入作为参考。
在科学文献如例如Nakamura等(1987)中已经描述了各种其他有用的免疫检测方法的步骤。免疫测定最简单和最直接的理解是结合测定。特定的优选免疫测定是各种类型的放射性免疫测定(RIA)和免疫珠子捕获测定。使用组织切片的免疫组织化学检测也是特别有用的。然而,显而易见的是检测不限于这样的技术,蛋白质印迹、点印迹、FACS分析等也可以结合本发明使用。
结合蛋白质印迹使用的基于免疫学的检测方法包括酶-、放射性标记-或荧光-标记的第二分子/对抗NCCa-ATP通道SUR1或调节亚基的抗体,在这方面认为特别有用。涉及这样标记使用的U.S.专利包括3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149和4,366,241,各自引入作为参考。当然,通过使用第二结合配体如二抗或生物素/抗生物素蛋白配体结合排列可以发现其他优势,如本领域已知的。
除了以上成像技术,本领域技术人员还知道正电子发射技术、PET成像或PET扫描,也可以用作诊断检查。PET扫描涉及生理图像的获取,基于来自正电子发射的放射检测。正电子是给药于患者时从放射性物质发射的微小颗粒。
因此,本发明的特定实施方案中,拮抗剂或其相关化合物是酶-、放射性标记-、或荧光标记的,如上所述并用于诊断、监测和/或分级脊髓损伤中的神经元损伤,和/或预测或分级与脊髓损伤相关的继发性损伤。例如,标记的拮抗剂或其相关化合物可以用于确定或限定半影或处于脊髓损伤后损害风险中的区域。
IX.诊断或治疗盒
在此所述的任何组合物可以包含于药盒中。非限制性的实施例中,预想诊断盒中可以包括选择性结合或识别SUR1的化合物。将这样的化合物称为“SUR1标记”,其可以包括但不限于抗体(单克隆或多克隆)、SUR1寡核苷酸、SU1多肽、小分子或其组合、拮抗剂等。预想这些SUR1标记中的任何一种可以连接放射性物质和/或荧光标记和/或酶标记物,用于快速检测。药盒还可以在合适的容器装置中包括脂质和/或其他试剂,例如放射性或酶或荧光标记。
药盒可以包括合适等分的本发明的SUR1标记、脂质和/或其他试剂组合物,不管标记或未标记,如同可以用于制备检测测定的标准曲线。可以在含水介质中或以冻干形式包装药盒的组成成分。药盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置,将成分置于其中,优选,适当等分。在药盒中存在多于一种成分的情况中,药盒通常还含有第二个、第三个或其他另外的容器,可以将其他的成分分开置于其中。然而,小瓶中可以包括成分的各种组合。本发明的药盒通常还包括用于商业出售的密闭结构的包含SUR1标记、脂质、其他试剂和任何其他试剂容器的装置。这样的容器可以包括注射或吹塑的塑料容器,其中保存所需的小瓶。
本发明的治疗药盒是包括拮抗剂或其相关化合物的药盒。因此,药盒可包括SUR1拮抗剂或其相关化合物来阻断和/或抑制NCCa-ATP通道。这样的药盒通常在合适的容器装置中含有SUR1拮抗剂或其相关化合物的药物学可接受制剂。药盒可以具有单个的容器装置,和/或可以具有用于每种化合物的不同容器装置。
以一种和/或多种液体溶液提供药盒的组成成分时,液体溶液是水溶液,特别优选无菌水溶液。还可以将SUR1拮抗剂或其相关化合物配制成可注射的组合物。在这种情况中,容器装置可以自身是注射器、移液管和/或其他这样的类似装置,从其将制剂施加至身体的受感染部位,注射至动物中,和/或甚至运用至和/或混合药盒的其他成分。
水溶液的实例包括但不限于乙醇、DMSO和/或林格氏溶液。特定实施方案中,所用的DMSO或乙醇浓度不高于0.1%或(1ml/1000L)。
然而,可以以干粉提供药盒的成分。当以干粉提供试剂和/或成分时,可以通过加入合适的溶剂来重建粉末。预想还可以在另一个容器装置中提供溶剂。
容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或其他容器装置,其中合适地分配SUR1拮抗剂或其相关化合物。药盒还可以包括第二个容器装置,用于盛装无菌的、可药用缓冲剂和/或其他稀释剂。
本发明的药盒通常还包括供商业销售的密闭构造的用于包含小瓶的装置,如,例如,注射和/或吹塑塑料容器,其中保存所需的小瓶。
与容器的数量和/或类型无关,本发明的药盒还可以包括用于辅助SUR1拮抗剂或其相关化合物注射/给药和/或放置至动物体内的装置,和/或用这样的装置包装本发明的药盒。这样的装置可以是注射器、移液管、镊子和/或任何医学上批准的传送载体。
除了SUR1拮抗剂或其相关化合物,药盒还可以包括第二种活性成分。第二种活性成分的实例包括防止低血糖的物质(例如,葡萄糖、D5W、胰高血糖素等)和甾类(例如甲基强的松龙)等。这些第二种活性成分可以和SUR1拮抗剂或其相关化合物合并于相同的小瓶中,或它们可以包含于分开的小瓶中。
更进一步,本发明的药盒还可以包括葡萄糖测试盒。因此,使用葡萄糖测试盒测量患者的血糖,然后可以将SUR1拮抗剂或其相关化合物给药于患者,接着测量患者的血糖。
除了上述药盒,可以装配本发明的治疗盒使得IV袋包括可以打开或破坏以将化合物释放至IV袋中的隔膜或室。另一种药盒可以包括推注药盒,其中推注药盒可以包括预先装满的注射器或相似的易于使用的快速给药装置。输液药盒可以包括小瓶或安瓿和用于在输注之前将小瓶或安瓿加入其中的IV溶液(例如,林格氏溶液)。输液药盒还可以包括推注药盒,用于在输液之前、之中或之后将推注/负荷剂量给药于患者。
X.实施例
包括以下实施例来展示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当认识到以下实施例中公开的技术代表发明人发现在本发明的实践中发挥良好作用的技术,因此可以认为构成了实践的优选方式。然而,本领域技术人员根据本发明的公开内容应当认识到可以在公开的特定实施方案中形成许多改变并仍然获得相像或相似结果,而没有脱离本发明的精神和范围。
实施例1
对NCCa-ATP通道的调节
通过Na+的大量流入令细胞去极化时,由于渗透梯度,H2O进入细胞中。H2O的流入导致细胞起泡,即,细胞毒性水肿。使用扫描电子显微镜(SEM)和相差显微镜来检查R1星形细胞的这种现象。用SEM检查的新鲜分离的细胞显示出有多个细小突起装饰的复杂表面(图1A)。暴露于叠氮化钠后不久,但在预期去极化后,复杂的细胞表面开始由表面气泡替代,伴随着膜的变平(图1B)。之后,膜外观主要为气泡,其完全失去了在对照中观察到的精细突起(图1C)。
在ATP耗尽不存在下,通过用二氮嗪简单打开NCCa-ATP通道,再现了起泡(图2)。相反,通常用叠氮化钠诱导的APT耗尽观察到的起泡完全受到格列本脲的阻止(图2)。起泡和细胞毒性水肿预示着坏死性细胞死亡。
实施例2
通过刺激素的调节
KATP通道(Kir6.1、Kir6.2)的特征性特征是通过膜脂质磷脂酰肌醇4,5-双磷酸(PIP2)的存在来调节对ATP的通道亲和性。将PIP2应用至膜的胞质侧提高KATP通道的打开状态稳定性(Ashcroft,1998;Baukrowitz等,1998;Rohacs等,1999)。打开状态稳定性的提高呈现为ATP不存在下通道打开可能性的提高,以及相应的对ATP抑制敏感性的降低(Enkvetchakul等,2000;Haruna等,2000;Koster等,1999;和Larsson等,2000)。
已知KATP通道和NCCa-ATP通道之间的众多相似之处,发明人假定NCCa-ATP通道的ATP-敏感性将以相同的方式来应答PIP2。通过研究内面向外式膜片中的NCCa-ATP通道来测试这一点,使用Cs+作为电荷载体,并在浴槽中使用1μM Ca2+和10μM ATP,期望后者完全阻断通道。在这些条件下,在R1星形细胞中只记录NCCa-ATP通道。将PIP2(50μM)加入浴槽中时,通道活性变得明显(图3),如通过PIP2对KATP通道作用的类推所预测的。通过格列本脲阻断了这种通道活性,证实了通道的鉴定。
为了测定受体介导的机制是否涉及NCCa-ATP通道活性的调节,使用公知的磷脂酶C(PLC)来研究PLC激活是否引起PIP2的降解和消耗并因此提高对ATP的亲和性,例如,降低通道打开。雌激素是公知的脑中以及别处的PLC激活剂(Beyer等,2002;Le Mellay等,1999;Qui等,2003)。对于这个实验,研究细胞附着的膜片来防止胞内信号机制的改变。通过暴露于叠氮化钠引起细胞ATP的耗尽来产生NCCa-ATP通道活性(图4,记录的最初部分)。
将雌激素(E2;10nM)运用至浴槽中时,很快终止了由NCCa-ATP通道引起的活性(图4)。这表明了雌激素发挥了对NCCa-ATP通道的调节控制,并表明了这些细胞上存在能够快速(非基因组)激活信号级联的雌激素受体。
其次,为了测定在来自雄性和雌性的R1星形细胞中是否可以检测到雌激素受体。在一组3只雌性大鼠(F)和另一组3只雄性大鼠(M)中植入后7天收集明胶海绵植入物。通过蛋白质印迹在2个稀释度(4x=50μg总蛋白;1x=12.5μg总蛋白)分析从每个组集合的蛋白,将来自子宫的蛋白用作对照(图5A)。用识别α和β雌激素受体的抗体对膜进行印迹。雄性和雌性在α(66kDa)和β(55kDa)受体的合适分子量处显示出明显的条带(图5)(Hiroi等,1999)。还将来自雄性和雌性的相同蛋白样品用于证实SUR1的存在,将来自胰腺的蛋白用作阳性对照(图5B)。值得注意的是,之前已经报道过来自雄性和雌性星形细胞中的雌激素受体(Choi等,2001)。在大脑皮层中,报道了β同种型含量更大(Guo等,2001),如通过蛋白质印迹所表明的。
接下来,使用从雄性大鼠收集的R1星形细胞重复图4的电生理实验。如上,研究了细胞附着的膜片,其中通过暴露于叠氮化钠后耗尽胞内ATP来激活NCCa-ATP通道的活性(图6A)。检查较高时间分辨的记录证实了对于NCCa-ATP通道合适电导的充分限定通道的活性(图6B)。将雌激素运用至浴槽中时(图6,E2,10nM,箭头),快速终止了由NCCa-ATP通道引起的活性(图6)。这些数据提供了更多雌激素对NCCa-ATP通道发挥了调节控制的证据,此外表明了这种应答在来自雄性和雌性的R1星形细胞中同样强烈。
通过对雌激素作用的类推,预期耗尽PIP2的其他机制,包括其他受体介导的机制以及更直接的PLC激活剂如C-蛋白等,对NCCa-ATP通道的活性具有相似的抑制作用并因此发挥保护效果。
实施例3
NCCa-ATP通道和坏死性死亡
申请人发现了脑损伤和中风中反应性星形细胞坏死性死亡的新机制,所述反应性星形细胞在脊髓损伤中有重要作用。起泡和细胞毒性水肿预示着坏死性细胞死亡。用碘化丙锭和膜联蛋白V来标记新鲜分离的反应性星形细胞,其中碘化丙锭是坏死性死亡的标记,膜联蛋白V是凋亡性死亡的标记。暴露于叠氮化钠的细胞显示出坏死性死亡但非凋亡性死亡的显著增加(图7)。然而,当格列本脲存在时,叠氮化钠诱导的坏死性细胞死亡得到显著降低(图7)。这些体外数据表明NCCa-ATP通道在反应性星形细胞的坏死性死亡中的重要作用,并表明了SUR1的拮抗剂如格列本脲在体内防止细胞毒性水肿和坏死性死亡中是有用的。
申请人在中风的啮齿动物模型中研究了NCCa-ATP通道。在半影中,在也是GFAP-阳性的星状细胞中发现了SUR1标记(图8A)。在中风的中间,不存在星状细胞,但是在也是GFAP-阳性的呈现水泡样外观的圆形细胞中发现了SUR1标记(图8B、C)。原位起泡的圆形细胞类似在体外暴露于叠氮化钠后经历坏死性死亡的反应性星形细胞。测定了格列本脲与盐水相比的效果。通过皮下植入的渗透迷你泵来给药(300μM,0.5μl/hr)。在盐水处理的大鼠中,中风后3-天死亡率为68%,而在格列本脲处理的大鼠中,3-天死亡率降低至28%(每组n=29;通过x2,p<0.001)。在分开的动物中,发现格列本脲处理大鼠中的中风半球只含有盐水处理大鼠中一半那样多的过量水(每组n=5;通过t-检验,p<0.01),证实了NCCa-ATP通道在水肿形成中的重要作用。
还在外伤啮齿动物模型中研究了SUR1。检查了使用植入的渗透迷你泵将药物直接输注至外伤部位中的效果。将通道抑制剂格列本脲用于降低反应性星形细胞的死亡,用通道激活剂二氮嗪促进星形细胞死亡。简而言之,发现与对照相比较,格列本脲输注降低了整体的损伤应答,稳定了异物植入物周围的神经胶质膜囊并最小化了炎症应答。
相反地,二氮嗪实质性地破坏了神经胶质膜囊并引起了巨大的炎症应答,特征在于PMN的大量流入(图9A、B)。这些数据表明NCCa-ATP通道在损伤应答中起着关键作用,它们强烈地支持炎症与NCCa-ATP通道的活性和反应性星形细胞的坏死性死亡密切相关的假设。
实施例4
脊髓挫伤中功能性NCCa-ATP通道的表达
鉴定了脊髓挫伤啮齿动物模型中的SUR1。免疫标记的脊髓切片显示出与对照(图10A)相比较,损伤区域中SUR1表达的大量增加(图10B)。SUR1与GFAP共同定位(图10C),证实了反应性星形细胞的参与。高放大倍数下检查细胞证实了SUR1-阳性细胞是星状(图10D)GFAP-阳性细胞,与脊髓损伤中的反应性星形细胞表达NCCa-ATP通道的假设相一致。
通过使用荧光辅助细胞分选(FACS)从损伤后3-5天的挫伤脊髓分离反应性星形细胞来进行对反应性星形细胞的进一步表征。将新鲜分离的细胞进行膜片钳来证明具有预期的生理学和药理学性质的通道。使用脊髓损伤(SCI)模型并包括NYU-型碰撞器的使用(Yu等,2001)。使用抗SUR1抗体和FACS从酶解分散的脊髓组织分离反应性星形细胞。使用FACS分离脑损伤中另一种亚型的反应性星形细胞(Dalton等,2003)。将膜片钳方法用来测量单通道电导、对ATP的敏感性以及对格列本脲和二氮嗪的敏感性,如从脑损伤分离的星形细胞所述的(Chen等,2001;Chen和Simand,2003)。
实施例5
对SUR1的阻断防止了延迟的出血转化
脊髓挫伤中的损伤不仅由对组织的物理外伤引起,而且由导致最初的损伤扩大和恶化神经危害的继发性损伤引起。继发性损伤的机制通常归因于缺血、水肿、刺激性氨基酸的释放、氧化性损伤和炎症的发生。申请人发现了出血也是这种继发性损伤过程中关键的组成成分。损伤后由于毛细血管的进行性病理性牵连而导致出血扩大,这是一种称为“出血转化”的现象。
为了研究SUR1调节的NCCa-ATP通道在SCI中的作用,使用了半-颈段脊髓挫伤模型。对于这种模型,将10克重量落下2.5cm到成年雌性Long-Evans大鼠中C4-5处暴露的硬脑脊膜的左半边上。损伤后24小时的组织病理学研究显示出损伤部位周围的毛细血管中SUR1的大量上调,而在对照中不存在(图11)。此外,还发现损伤部位中显示出SUR1上调的毛细血管表达波形蛋白(图12),波形蛋白是一种通常与星形细胞相关的中间丝状蛋白,但是也由脑和脊髓中损伤的毛细血管内皮细胞表达。
为了提供SUR1参与的更多分子证据,还检测了脊髓损伤中组织中的转录因子SP1,这是主要的已知调节SUR1表达的转录因子。与对照(图13A)相比较,损伤区域中组织的免疫标记显示出SP1的显著上调(图13B)。
为了评估新表达的SUR1在SCI中的作用,研究了2组动物,一个对照组和一个处理组,两组都接受了半颈段脊髓挫伤加损伤后植入(盲法)皮下传送盐水或选择性SUR1阻断剂的迷你渗透泵,其中SUR1阻断剂为低剂量的格列本脲(以0.5μl/hr s.q.传送300μM溶液)。损伤后24小时的研究表明,与对照相比较,格列本脲处理的动物在挫伤部位具有显著较少的血液(图14A、B)。此外,脊髓组织的匀浆显示出显著较少的来自血红蛋白/含铁血黄素的着色(图14C)。对作为脊髓挫伤后时间的函数的血红蛋白浓度的定量研究显示出盐水处理的动物中在损伤后头6个小时中的进行性增加,这种增加通过格列本脲处理得到显著缓解(图15)。
接着,使用GFAP来标记反应性星形细胞和用羊毛铬花青-R来标记髓磷脂,评估了两组动物中的损伤。损伤后24小时的研究表明,与对照相比较,格列本脲处理的动物具有显著较小的损伤、显著降低的GFAP表达和显著较好的对侧长束的保存(图16)。
再进一步,进行了两组动物中的行为评估。将动物拍摄录像并在动物之前没有暴露过的环境中定量垂直探查行为。损伤后24小时的研究表明,与对照相比较,格列本脲处理的动物呈现出显著改善的垂直探查行为(图17)。
认识到脊髓挫伤中延迟的出血转化现象提供了特别的减轻继发性损伤的机会。如公知的,血液对于CNS组织是极为毒性的,并引起水肿的形成、活性氧类别的产生和引发炎症。延迟的出血转化的概念是SCI中的新概念,且发现格列本脲可以用于缓解这种状况提供了没有先例的通过减轻继发性损伤而改善结果的机会。
实施例6
NCCa-ATP通道在细胞毒性水肿和星形细胞的坏死性死亡
以及促进组织炎症的生物活性分子的释放中的作用
本发明中还考虑了在坏死性细胞死亡过程中细胞膜裂解释放的在启动脊髓损伤中的炎症应答中起作用的候选胞内分子的鉴定。使用FACS从损伤后3-5天的挫伤脊髓中分离反应性星形细胞。使用新鲜分离的细胞,通过以下方法评估了叠氮化钠(1mM)vs.叠氮化钠加格列本脲(1μM)在中毒后头3个小时过程中对坏死性死亡vs.凋亡性死亡的作用:使用相差显微镜、扫描电子显微镜和透射电子显微镜进行形态学研究;对碘化丙锭vs.膜联蛋白V进行标记;和使用TUNEL标记和DNA断裂成梯来评估DNA降解。
使用新鲜分离的细胞,使用ELISA来测量叠氮化钠诱导的星形细胞坏死性死亡后HSP-32和HSP-70的释放。此外,使用相同的实验模式,我们将评估格列本脲对叠氮化钠诱导的HSP-32和HSP-70释放的保护性效果。使用标准FACS方法以及扫描和透射电子显微镜和相差显微镜,后者使得可以在起泡过程中连续追踪单个细胞。还使用了免疫荧光,如在此所述的。
实施例7
NCCa-ATP通道的拮抗剂在体内降低脊髓挫伤中炎症应答的能力
在损伤后约3天研究了组织。用盐水或格列本脲处理的脊髓挫伤大鼠中,使用对激活的小神经胶质细胞(OX-42)、巨噬细胞(MAC-387,Novus)、PMN(MMP-8,Chemicon)和iNOS的定量免疫荧光标记来评估原位炎症应答。对于这些实验,研究了挫伤区域中或附近的脊髓的新鲜-冷冻切片。进行了对巨噬细胞(MAC-387)和PMN(MMP-8)的定量FACS分析。对于这些实验,获得15-mm包含挫伤区域的脊髓节段并进行酶解分散以用于FACS分析。对SUR1和iNOS的定量蛋白质印迹,对于这些实验,获得15-mm包含挫伤区域的脊髓节段并匀浆以用于蛋白质印迹。如上所述,使用标准方法和材料,包括FACS分析、蛋白质印迹和免疫荧光显像。
参考文献
说明书中提及的所有专利和出版物表示本发明所属领域技术人员的水平。在此将所有专利和出版物引入作为参考,程度与如同指示各篇出版物具体和单独引入作为参考相同。
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尽管已经详细描述了本发明及其优势,应当理解在此可以进行各种改变、置换和替换而不脱离所附权利要求限定的本发明的精神和范围。此外,本申请的范围不限于说明书中所述过程、仪器、制造、物质组成、装置、方法和步骤的特定实施方案。正如本领域技术人员从本发明的公开内容将容易地认识到,根据本发明可以使用现有的或之后待发展的执行基本上相同的动能或获得与在此所述的相应实施方案基本上相同结果的过程、仪器、制造、物质组成、装置、方法或步骤。因此,所附的权利要求旨在其范围内包括这样的过程、仪器、制造、物质组成、装置、方法或步骤。
Claims (43)
1.治疗患有脊髓损伤的患者的方法,包括将有效抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。
2.权利要求1的方法,其中化合物降低细胞死亡。
3.权利要求1的方法,其中化合物降低炎症应答。
4.权利要求1的方法,其中化合物降低出血转化。
5.权利要求1的方法,其中化合物降低与脊髓损伤相关的继发性损伤。
6.权利要求1的方法,其中化合物是1型磺酰脲受体(SUR1)拮抗剂。
7.权利要求6的方法,其中SUR1拮抗剂选自格列本脲、甲苯磺丁脲、瑞格列奈、那格列奈、美格列奈、咪格列唑、LY397364、LY389382、glyclazide、格列美脲、雌激素和雌激素相关化合物。
8.权利要求6的方法,其中给药于患者的SUR1拮抗剂的量为约0.0001μg/kg/天至约20mg/kg/天。
9.权利要求6的方法,其中给药于患者的SUR1拮抗剂的量为约0.01μg/kg/天至约100μg/kg/天。
10.权利要求6的方法,其中给药于患者的SUR1拮抗剂的量为约100μg/kg/天至约20mg/kg/天。
11.权利要求6的方法,其中以推注来给药SUR1拮抗剂。
12.权利要求6的方法,其中以输注来给药SUR1拮抗剂。
13.权利要求6的方法,其中以推注结合输注来给药SUR1拮抗剂。
14.权利要求6的方法,其中给药于患者的SUR1拮抗剂的量为约0.0001μg/kg/治疗至约20mg/kg/治疗。
15.权利要求6的方法,其中给药于患者的SUR1拮抗剂的量为约0.01μg/kg/治疗至约100μg/kg/治疗。
16.权利要求6的方法,其中给药于患者的SUR1拮抗剂的量为约100μg/kg/治疗至约20mg/kg/治疗。
17.权利要求6的方法,其中SUR1拮抗剂阻断Na+流入细胞中,从而防止细胞的去极化。
18.权利要求6的方法,其中SUR1拮抗剂阻断了Na+流入细胞中,从而防止细胞毒性水肿。
19.权利要求1的方法,其中通过消化道或非肠道来给药化合物。
20.权利要求19的方法,其中消化道给药包括口服、口含、直肠或舌下给药。
21.权利要求19的方法,其中非肠道给药包括静脉内、皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下、腹膜内或心室内给药。
22.权利要求1的方法,其中通过粘膜给药化合物。
23.权利要求22的方法,其中粘膜给药包括鼻内给药。
24.权利要求1的方法,其中对NCCa-ATP通道的抑制导致患者发病率的降低。
25.权利要求1的方法,其中对NCCa-ATP通道的抑制导致患者挫伤部位附近外渗血液的减少。
26.权利要求1的方法,其中对NCCa-ATP通道的抑制减小了脊髓损伤的大小。
27.权利要求2 4的方法,其中损伤大小的减小降低了脊髓对侧的累及。
28.权利要求1的方法,其中对NCCa-ATP通道的抑制降低了GFAP的上调。
29.权利要求1的方法,其中对神经元细胞、神经胶质细胞、内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的抑制保存了有髓鞘的长束。
30.权利要求1的方法,其中对NCCa-ATP通道的抑制改善了患者的运动或感觉。
31.减轻患者脊髓损伤半影中水肿的方法,包括将有效抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。
32.治疗处于发生脊髓损伤风险中的患者的方法,包括将有效抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。
33.权利要求32的方法,其中患者正在接受外科手术治疗。
34.权利要求32的方法,其中患者正在接受放疗。
35.减少血液从脊髓损伤外渗的方法,包括将有效抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCA-ATP通道的化合物给药于患者。
36.权利要求35的方法,其中化合物是1型磺酰脲受体(SUR1)拮抗剂。
37.权利要求36的方法,其中SUR1拮抗剂选自格列本脲、甲苯磺丁脲、瑞格列奈、那格列奈、美格列奈、咪格列唑、LY397364、LY389382、glyclazide、格列美脲、雌激素和雌激素相关化合物。
38.权利要求35的方法,其中患者处于脊髓损伤的风险中。
39.权利要求38的方法,其中在外科手术治疗或放疗之前、之中或之后给药化合物。
40.诊断患者脊髓中神经元细胞水肿和/或细胞毒性损伤的方法,包括:
标记SUR1的拮抗剂;
将标记的SUR1拮抗剂给药于患者;
测量患者脊髓中标记的SUR1拮抗剂的水平,其中患者脊髓中标记的SUR1拮抗剂的存在表明脊髓中的神经元细胞水肿和/或细胞毒性损伤。
41.测定患者中脊髓损伤后半影的方法,包括:
标记SUR1的拮抗剂;
将标记的SUR1拮抗剂给药于患者;
显现患者脊髓中标记的SUR1拮抗剂,其中标记的SUR1拮抗剂的存在表明患者中脊髓损伤后的半影。
42.权利要求41的方法,其中测定半影表明神经元损伤的位置。
43.权利要求41的方法,其中测定半影监测疾病的进展。
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