CN101213307A - 来自粗糙脉孢菌的s－腺苷甲硫氨酸－6－n－赖氨酸－甲基转移酶，编码其的基因，包含其的载体和宿主细胞，以及使用该宿主细胞生产三甲基赖氨酸的方法 - Google Patents

来自粗糙脉孢菌的s－腺苷甲硫氨酸－6－n－赖氨酸－甲基转移酶，编码其的基因，包含其的载体和宿主细胞，以及使用该宿主细胞生产三甲基赖氨酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101213307A
CN101213307A CNA2006800240028A CN200680024002A CN101213307A CN 101213307 A CN101213307 A CN 101213307A CN A2006800240028 A CNA2006800240028 A CN A2006800240028A CN 200680024002 A CN200680024002 A CN 200680024002A CN 101213307 A CN101213307 A CN 101213307A
Authority
CN
China
Prior art keywords
methionin
adenosylmethionine
host cell
same
lysine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2006800240028A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101213307B (zh
Inventor
姜欢求
李炳旭
朴英薰
高恩圣
朱哉映
李真浩
金蕙园
崔惠真
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ Corp
Original Assignee
CJ Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CJ Corp filed Critical CJ Corp
Publication of CN101213307A publication Critical patent/CN101213307A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101213307B publication Critical patent/CN101213307B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供从粗糙脉孢菌获得的S－腺苷甲硫氨酸－6－N－赖氨酸－甲基转移酶，编码其的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞，以及通过培养所述宿主细胞而生产三甲基赖氨酸的方法。

Description

来自粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶，编码其的基因，包含其的载体和宿主细胞，以及使用该宿主细胞生产三甲基赖氨酸的方法
背景技术
本发明涉及从粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)获得的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶(LMT)，编码其的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞，以及通过培养所述宿主细胞而生产三甲基赖氨酸的方法。
L-肉碱(3-羟基-4-三甲基氨基丁酸)，在生物体中普遍存在，并且是在线粒体中将活化的长链脂肪酸经由线粒体内膜携带到线粒体基质中的两性离子化合物。已知在人体中L-肉碱可以从赖氨酸或蛋白质赖氨酸合成。在哺乳动物中，蛋白质赖氨酸通常用作L-肉碱生物合成的前体，然而，在粗糙脉孢菌中，使用游离赖氨酸。在L-肉碱的生物合成中，形成ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N，N，N-三甲基-β-羟基赖氨酸，N，N，N-三甲基氨基丁醛中间体，和γ-丁酰甜菜碱，并且推测γ-丁酰甜菜碱通过γ-丁酰甜菜碱羟化酶羟基化而成为L-肉碱。
甚至在现有技术中，当在粗糙脉孢菌从游离的赖氨酸生物合成L-肉碱时，参与将ε-N，N，N-三甲基赖氨酸转化成L-赖氨酸的第一步反应的酶还是未知的。所述酶可以有效用来从游离的赖氨酸生产L-肉碱。
本发明的发明人已经尝试产生应用廉价前体并且还具有高L-肉碱生产效率的微生物，并且发现具有将来自粗糙脉孢菌的L-赖氨酸转化成6-N-三甲基赖氨酸的活性的蛋白和基因，因此完成本发明。
附图描述
图1是显示洗脱溶液的天然-PAGE或SDS-PAGE分析的结果的图，所述洗脱溶液通过裂解粗糙脉孢菌培养物并且对裂解物进行DEAE柱层析而获得。
图2是显示在蛋白条带a、b和c与赖氨酸和S-腺苷甲硫氨酸反应后通过HPLC测量三甲基赖氨酸的结果的图表。
图3是显示通过HPLC分析通过将条带a蛋白与赖氨酸反应而获得的样品、条带a与三甲基赖氨酸标准物的结果的图表。
图4是显示使用琼脂糖电泳方法分析S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶基因的PCR产物的结果的图。
图5是显示pT7-7 LMT构建的图。
图6是显示上清液SDS-PAGE分析结果的图，所述上清液通过在存在IPTG时培养含有获得于粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶基因的大肠杆菌(E.coli)并且将从中获得的真菌菌体裂解而获得。
发明详述
技术问题
本发明提供一种具有将来自粗糙脉孢菌的L-赖氨酸转化成6-N-三甲基赖氨酸的活性的蛋白和编码其的基因。
本发明还提供包含所述基因的载体和宿主细胞。
本发明还提供通过培养所述宿主细胞而生产三甲基赖氨酸的方法。
技术方案
按照本发明的一个方面，提供一种具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列和S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶活性的蛋白。
按照本发明的蛋白来自于粗糙脉孢菌，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并且具有S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶活性。在本发明中，“S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶活性”意欲指使用L-赖氨酸作为底物催化从L-赖氨酸形成三甲基赖氨酸的反应的活性。
按照本发明的另一个方面，提供编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸的一个实例是具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸。
按照本发明的另一个方面，提供包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸的载体。在本发明中，“载体”表示可以作用为能够递送多核苷酸的运载工具(vehicle)的核酸构建体。所述载体，例如，衍生于质粒的载体及衍生于病毒的载体，包括在生物体中不但可以复制还可以不复制的核酸构建体。因此，术语“质粒”、“载体”及“盒”在本发明中互换地使用。另外，所述载体可以包括调节基因表达的调控序列，诸如启动子、操纵子、mRNA核糖体结合位点和转录/翻译信号、以及使得基因更容易操纵的序列。
按照本发明的另一个方面，提供包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸的宿主细胞。所述宿主细胞可以是属于埃希氏菌属(Escherichia genus)的微生物，并且优选为大肠杆菌BL21(DE3)CJ2004-1(保藏号KCCM-10637)。
按照本发明的另一个方面，提供生产三甲基赖氨酸的方法，所述方法包括在存在游离赖氨酸时培养包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸的宿主细胞。在本发明中，所述宿主细胞可以是BL21(DE3)CJ2004-1(保藏号KCCM-10637)。培养可以在通常所用的适当的培养基和培养条件下，根据选定的宿主细胞而进行。按照本发明的方法，培养宿主细胞，然后在细胞或培养物溶液中产生S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶，并且最终将赖氨酸转化成三甲基赖氨酸。按照本发明的方法可以用来通过将所产生的三甲基赖氨酸与同L-肉碱的生物合成相关的酶在细胞中或在体外反应而最终产生L-肉碱。所产生的L-肉碱可以通过本领域的技术人员已知的常规方法进行纯化。
有利效果
按照本发明的一个实施方案的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶可以在体外和在体内将游离的赖氨酸转化成三甲基赖氨酸。
按照本发明的一个实施方案的基因可以编码S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶，
按照本发明的一个实施方案的载体和宿主细胞表达S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶，由此有效地用于将游离的赖氨酸转化成三甲基赖氨酸的方法。
按照本发明的方法，三甲基赖氨酸可以由游离的赖氨酸而产生。
最佳方式
以下，将参考下列实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅是为了举例说明目的并且不是意图限制本发明的范围。
实施例
实施例1：从粗糙脉孢菌蛋白分离S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基 转移酶并且证实其功能
培养粗糙脉孢菌，并且收集细胞。然后，将细胞使用2mM DTT和包含0.2mM EDTA的1M pH 7.4的磷酸钾缓冲液裂解，然后提取蛋白。通过向获得的上清液中缓慢加入硫酸铵达到50％终饱和浓度而将蛋白沉淀下来，然后在离心分离之后向沉淀的蛋白加入少量0.1M pH 7.4的磷酸钾缓冲液。将溶液使用T1透析膜进行脱盐。脱盐的样品使用DEAE柱纯化。在此时，通过使用0.1M pH 7.4的磷酸钾缓冲液作为洗涤缓冲液而进行洗涤，通过使用包含0.3M NaCl的0.1M pH 7.4的磷酸钾缓冲液作为洗脱缓冲液而进行洗脱，并且合并洗脱的溶液。此后，将得到的样品使用T1透析膜脱盐。脱盐样品使用CM柱纯化。将0.1M pH 7.4的磷酸钾缓冲液用作所述柱的洗涤缓冲液，并且将没有吸附到柱上并且从柱上流出的样品都合并起来。
将蛋白样品再次加载到DEAE柱上，然后使用0.1M pH 7.4的磷酸钾缓冲液进行浓度梯度洗脱，达到0-0.3M的NACl浓度。使用天然-PAGE和SDS-PAGE对纯化的样品进行蛋白质分析。
图1是显示洗脱溶液的天然-PAGE或SDS-PAGE分析的结果的图，所述洗脱的溶液在进行上文所述的纯化步骤之后和在进行DEAE柱层析之后获得。在图1A中，泳道1代表标记，泳道2和3代表DEAE洗脱峰2的天然-PAGE分析的结果，并且泳道4和5代表DEAE洗脱峰3的天然-PAGE分析的结果。在图1B中，泳道1代表标记，泳道2代表DEAE洗脱峰2的天然-PAGE分析的结果，泳道3代表DEAE洗脱峰3的天然-PAGE分析的结果，泳道4和5代表DEAE洗脱峰2的SDS-PAGE分析的结果，并且泳道6和7代表DEAE洗脱峰3的SDS-PAGE分析的结果。
从图1的结果，将条带a、b和c选作LMT候选蛋白，并且测量每一蛋白的活性。首先，将与每一条带对应的凝胶切下，然后用匀浆器将凝胶压碎。然后，将5ml 1g/L赖氨酸(终浓度500mg/L)和2ml 1g/L甲基供体，S-腺苷甲硫氨酸，加入到获得的产物中，并且在28℃缓慢搅拌24小时，以使用HPLC分析三甲基赖氨酸峰。
图2是显示在蛋白条带a、b和c与赖氨酸和S-腺苷甲硫氨酸反应后通过HPLC测量三甲基赖氨酸的结果的图表。如在图2中所示，在与条带a反应的样品中，在大约15分钟的停留时间证实被视为三甲基赖氨酸的峰。在图2中，1、2和3代表与每一条带a、b和c相对应的结果。为了更准确地证实所述条带，将通过条带a与赖氨酸反应获得的样品与三甲基赖氨酸标准物进行比较。
图3是显示通过HPLC分析通过蛋白条带a与赖氨酸反应获得的样品并且将其与三甲基赖氨酸标准物比较的结果的图表。如在图3中所示，条带a的峰时，即，电压具有最高值的时间，与三甲基赖氨酸标准物完全一致。因此，证实条带a包括S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶，LMT。在图3中，1和2是指分别与标准物和条带a相对应的结果。独立的HPLC图表整合在图2和3中。接下来，分析N-端序列，以获得LMT蛋白的氨基酸序列。首先，将在SDS-PAGE凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，然后将蛋白条带切下，以通过Edman方法分析N-端序列。特别地，异硫氰酸苯酯(PTC)与肽在pH值8-9和室温反应，由此获得其中N-端被硫代氨甲酰化的PTC-肽，然后，将PTC-肽在酸性条件下反应，以从中仅分离N-端氨基酸。分离的氨基酸用乙酸乙酯提取，用HPLC鉴定，并且分析。结果，证实N-端序列为AFGKL(SEQ ID NO：5)。基于所证实的N-端氨基酸序列进行关于已知的粗糙脉孢菌的完整的基因组序列的探寻。结果，证实具有与LMT的N-端序列一致的氨基酸序列的蛋白和基因、以及核苷酸序列。
实施例2：来自粗糙脉孢菌的编码LMT的基因的证实
在本实施例中，构建来自粗糙脉孢菌的cDNA文库，并且证实其中编码LMT的基因。
(1)构建来自粗糙脉孢菌的cDNA文库
将分离自粗糙脉孢菌的mRNA作为模板，通过使用polyT作为引物的PCR而产生cDNA。使用EcoRI和XhoI，将获得的cDNA插入到λAD5克隆载体中。接着，为了获得质粒形式的cDNA库，进行下述步骤：将大肠杆菌BNN322在LB Km+0.2％麦芽糖中培养过夜；使用离心分离收集细胞；将细胞重悬在1ml 10mM MgSO4溶液中；将重悬的细胞与3.5×107个包含cDNA库的λ在30℃不搅拌地温育30分钟；向其中加入2ml LB培养基，并且将感染的细菌在30℃继续振荡培养大于1个小时；将得到的产物涂布到LB+氨苄青霉素(75μl/ml)培养基上；并且将质粒从所产生的菌落分离，以形成cDNA文库集合(pool)。
(2)S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶(LMT)基因(1mt)的证实
使用在实施例1中获得的LMT蛋白以及关于其基因序列的信息，构建包括寡核苷酸SEQ ID.Nos.3和4的引物组，以扩增1mt基因。
接着，使用cDNA文库作为模板，通过使用所述引物组作为引物的PCR而扩增S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶的基因。将获得的PCR产物通过琼脂糖电泳进行分析。结果，证实大约0.65kb的条带，并且通过自动碱基序列分析而证实基因碱基序列(SEQ ID NO：1)。作为应用NCBI BLAST的搜索工具关于所分析的碱基序列的相似信息的搜索结果，在脉孢菌(Neurospora)基因组序列中找到与1mt基因具有100％同一性的基因，并且证实所述基因关于其功能被视为唯一的假设蛋白。另外，S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶的氨基酸序列从所述基因序列推导为SEQ ID NO：2。图4是显示通过琼脂糖电泳分析S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶基因的PCR产物的结果的图。
接着，将PCR产物用NdeI和BamHI消化，并且连接到用相同的酶消化的pUC19中，然后用得到的产物转化大肠杆菌DH5α。然后，通过蓝/白斑检测而分离转化体。结果，证实存在S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶基因插入其中的质粒。
实施例3：在大肠杆菌中表达S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移 酶基因
在本实施例中，构建一种大肠杆菌表达载体，以在大肠杆菌中表达来自粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶基因。然后，将所述载体引入到大肠杆菌中，并且确定大肠杆菌是否表达来自粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶基因。
(1)构建大肠杆菌表达载体
构建用于在大肠杆菌中表达S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶基因的pT7-7LMT载体。
首先，将来自包含其的质粒的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶基因用限制性酶诸如Nde I和BamH I消化，然后，通过在低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳而只将S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶基因的DNA分离并且纯化。然后，将所述DNA插入到用Nde I和BamH I处理的pT7-7中(图5)。图5是表示pT7-7 LMT的构建的图。将连接混合物插入到大肠杆菌DH5α中，并且将细菌转化，然后在含有氨苄青霉素的固体平板培养基中分离转化体。将重组质粒从分离的转化体分离，并且用NdeI和BamHI消化。结果，证实S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶基因的插入，并且将所述载体叫作pT7-7LMT。
(2)构建其中引入pT7-7LMT的大肠杆菌BL21(DE3)
将大肠杆菌BL21 DE3用pT7-7LMT载体转化。将40μl大肠杆菌BL21DE3与1μl pT7-7LMT载体混合，置于冷的2mm缝隙的小杯中，并且在2.5kV，200Ω，和25μF的条件下通过电穿孔进行转化。将获得的转化体涂布到含有氨苄青霉素的固体平板培养基上，然后将质粒从在其中所选的转化体纯化，并且用Nde I和BamH I消化。结果，通过证实插入的基因和质粒的大小，而证实pT7-7LMT引入到质粒中，并且将其叫作BL21(DE3)/pT7-7LMT。
(3)在大肠杆菌中表达S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶
为了证实S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶的表达，培养BL21(DE3)/pT7-7LMT，其中大肠杆菌BL21(DE3)用pT7-7LMT转化。将BL21(DE3)/pT7-7LMT在50ml LB培养基中或在其中置有含有氨苄青霉素的LB培养基的装有挡板的250ml烧瓶中培养至OD600 0.6，然后在向其中加入1mM IPTG之后培养超过4个小时。以4,000xg进行离心15分钟，并且收集细胞。然后，将细胞重悬在1ml的裂解溶液中(140mM NaCl，200g/l甘油和1mM DTT，在10mM pH 7.4的磷酸钠缓冲溶液中)。将得到的培养细胞用冰覆盖，然后使用超声匀浆器将细胞裂解5次，每次10秒。此后，在4℃，10,000xg进行离心20-30分钟，然后去除细胞碎片，并且只收集上清液。通过SDS-PAGE证实约25kD的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶(图6)。图6是显示上清液的SDS-PAGE分析结果的图，其中所述上清液通过在存在IPTG时培养含有来自粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶基因的大肠杆菌并且将从中获得的细菌裂解而获得。
在图6中，泳道M是指标记，泳道1是指阴性对照，并且泳道2和3是指细胞裂解物，泳道2和3中的环形部分是指与LMT相对应的25kD的位置的条带。
实施例4：应用大肠杆菌BL21(DE3)/pT7-7LMT构建三甲基赖氨酸
将在实施例2中构建的大肠杆菌BL21(DE3)/pT7-7LMT在50ml LB培养基中或在其中置有含有氨苄青霉素的LB培养基的装有挡板的250ml烧瓶中培养至OD600 0.6，然后在向其中加入1mM IPTG后，在28℃再培养超过8小时，以形成酶的正确的三级结构，并且防止内含体的形成。在培养过程中，加入500mg/L的L-赖氨酸和200mg/L的S-腺苷甲硫氨酸作为反应溶液，并且测量培养溶液中的三甲基赖氨酸含量。结果在表1中显示。
在下述条件下通过HPLC测量三甲基赖氨酸。将来自Supelco的SUPELCOSIL LC-DABS用作柱，A缓冲液这样制备，以致将0.1％的三氟乙酸(TFA)加入到其中蒸馏水和乙腈以8∶2比例混和的缓冲液中，并且B缓冲液这样制备，以致将0.1％的TFA加入到其中蒸馏水和乙腈以2∶8的比例混和的缓冲液中。使用线性浓度梯度方法，保持0.8ml/min的流速，分析三甲基赖氨酸。
表1.
测试的物质 三甲基赖氨酸(μg/ml)
大肠杆菌BL21(DE3)/pT7-7(IPTG诱导)+500mg/L赖氨酸+200mg/L Ado-Met 0.0
大肠杆菌BL21(DE3)/pT7-7LMT(IPTG诱导)+500mg/L赖氨酸+200mg/LAdo-Met 20.0
如在表1中所示，证实来自粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶的基因在大肠杆菌中表达，并且从中将L-赖氨酸转化成三甲基赖氨酸。
在本实施例中获得的大肠杆菌BL21(DE3)/pT7-7LMT于2004年12月13日保藏在韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms，KCCM)，其为布达佩斯条约下的国际保藏单位(保藏名：BL21(DE3)CJ2004-1：保藏号KCCM-10637)。
申请人或代理机构文件参考 国际申请号
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示
(PCT细则13bis)
Figure A20068002400200121
PCR/RO/134表(1998年7月)
序列表
<110>CJ株式会社
<120>来自粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶，
     编码其的基因，包含其的载体和宿主细胞，以及使用该宿主细胞
     生产三甲基赖氨酸的方法
<130>PN060069
<160>4
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>651
<212>DNA
<213>粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)
<400>1
atggccttcg gaaagcttta cacctacgag gcgaaccccc gctccacggc catcttggct     60
gtcgcgaagg ccaacaacct cgacctcgag gttatcaagg tcgaccttga ggctgccatc    120
gaggagtaca agaaggtcaa ccctctcggc aaggtcccca ccttcgttgg tgccgacggc    180
tacactctct tcgagtgcat cgccatcgcc atctatgtcg cttcccagaa cgagaagacc    240
actctcctcg gcaagaccaa gcaggactat gcctccatcc tgaagtggct ctctttcttc    300
aacaccgagg tccttccccc tcttgctggc tggtaccgcc ctctccttgg caaggctccc    360
tacaacaaga aggctgttga ggacgctcag gctactgccc tcaaggccat ctctgtcgcc    420
gaggcccacc tcaagaacaa caccttcctc gttggcgagc gcatcaccct tgccgatctc    480
ttcgccactg gcatcattgc ccgcggcttc gagttcttct tcgacaaggc ctggcgcgag    540
cagtacccca acgtcacccg ttggtacacc actgtctaca accagcccat ctactcggcc    600
gttgctcctc ccttcgctct ccttgatacc cccaagttga ccaacgtcta a             651
<210>2
<211>216
<212>PRT
<213>粗糙脉孢菌
<400>2
Met Ala Phe Gly Lys Leu Tyr Thr Tyr Glu Ala Asn Pro Arg Ser Thr
  1               5                  10                  15
Ala Ile Leu Ala Val Ala Lys Ala Asn Asn Leu Asp Leu Glu Val Ile
             20                  25                  30
Lys Val Asp Leu Glu Ala Ala Ile Glu Glu Tyr Lys Lys Val Asn Pro
         35                  40                  45
Leu Gly Lys Val Pro Thr Phe Val Gly Ala Asp Gly Tyr Thr Leu Phe
     50                  55                  60
Glu Cys Ile Ala Ile Ala Ile Tyr Val Ala Ser Gln Asn Glu Lys Thr
 65                  70                  75                  80
Thr Leu Leu Gly Lys Thr Lys Gln Asp Tyr Ala Ser Ile Leu Lys Trp
                 85                  90                  95
Leu Ser Phe Phe Asn Thr Glu Val Leu Pro Pro Leu Ala Gly Trp Tyr
            100                 105                 110
Arg Pro Leu Leu Gly Lys Ala Pro Tyr Asn Lys Lys Ala Val Glu Asp
        115                 120                 125
Ala Gln Ala Thr Ala Leu Lys Ala Ile Scr Val Ala Glu Ala His Leu
    130                 135                 140
Lys Asn Asn Thr Phe Pro Val Gly Glu Arg Ile Thr Leu Ala Asp Leu
145                 150                 155                 160
Phe Ala Thr Gly Ile Ile Ala Arg Gly Phe Glu Phe Phe Phe Asp Lys
               165                 170                 175
Ala Trp Arg Glu Gln Tyr Pro Asn Val Thr Arg Trp Tyr Thr Thr Val
            180                 185                 190
Tyr Asn Gln Pro Ile Tyr Ser Ala Val Ala Pro Pro Phe Ala Leu Leu
        195                 200                 205
Asp Thr Pro Lys Leu Thr Asn Val
    210                 215
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
ggaattccat atggccttcg gaaagcttta cac                                 33
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
cgggatcctt agacgttggt caacttgggg                                     30

Claims (7)

1.一种蛋白，其具有S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶活性，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，催化从L-赖氨酸形成6-N-三甲基赖氨酸。
2.一种编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸。
3.权利要求2的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
4.一种含有权利要求2或权利要求3的多核苷酸的载体。
5.一种含有权利要求2的多核苷酸的宿主细胞。
6.权利要求5的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)CJ2004-1(保藏号KCCM-10637)。
7.一种生产三甲基赖氨酸的方法，所述方法包括在存在赖氨酸时培养按照权利要求5或权利要求6的宿主细胞。
CN2006800240028A 2005-07-07 2006-07-07 来自粗糙脉孢菌的s-腺苷甲硫氨酸-6-n-赖氨酸-甲基转移酶，编码其的因，包含其的载体和宿主细胞，以及使用该宿主细胞生产三甲基赖氨酸的方法 Expired - Fee Related CN101213307B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2005-0061143 2005-07-07
KR1020050061143 2005-07-07
KR1020050061143A KR100713104B1 (ko) 2005-07-07 2005-07-07 뉴로스포라 크라사 유래의ｓ-아데노실메티오닌-6-ｎ-라이신-메틸트란스퍼라제, 그를코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를포함하는 벡터 및 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용하여트리메틸라이신을 생산하는 방법
PCT/KR2006/002660 WO2007007986A1 (en) 2005-07-07 2006-07-07 S-ADENOSYLMETHIONINE-β-N-LYSINE-METHYLTRANSFERASE FROM NEUROSPORA CRASSA, A GENE ENCODING THE SAME, A VECTOR AND HOST CELL CONTAINING THE SAME, AND METHOD FOR PRODUCING TRIMETHYLLYSINE USING THE HOST CELL

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101213307A true CN101213307A (zh) 2008-07-02
CN101213307B CN101213307B (zh) 2011-10-19

Family

ID=37637322

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800240028A Expired - Fee Related CN101213307B (zh) 2005-07-07 2006-07-07 来自粗糙脉孢菌的s-腺苷甲硫氨酸-6-n-赖氨酸-甲基转移酶，编码其的因，包含其的载体和宿主细胞，以及使用该宿主细胞生产三甲基赖氨酸的方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US7598065B2 (zh)
EP (1) EP1899473B1 (zh)
JP (1) JP4759054B2 (zh)
KR (1) KR100713104B1 (zh)
CN (1) CN101213307B (zh)
WO (1) WO2007007986A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100713103B1 (ko) 2005-07-07 2007-05-02 씨제이 주식회사 뉴로스포라 크라사 유래 ｌ-카르니틴 생합성 관련 유전자를포함하는 엔테로박테리아세 속 미생물 및 이를 이용한ｌ-카르니틴의 제조방법
EP2616555B1 (en) 2010-09-16 2017-11-08 Gen-Probe Incorporated Capture probes immobilizable via l-nucleotide tail
EP3388532B1 (en) 2010-11-01 2021-03-10 Gen-Probe Incorporated Integrated capture and amplification of target nucleic acid for sequencing
EP3511426B1 (en) 2012-02-01 2022-08-17 Gen-Probe Incorporated Asymmetric hairpin target capture oligomers

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD221905B1 (de) * 1983-11-03 1987-03-18 Univ Leipzig Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten
US5643758A (en) * 1987-03-10 1997-07-01 New England Biolabs, Inc. Production and purification of a protein fused to a binding protein
PT1151130E (pt) * 1998-10-27 2005-06-30 Sigma Tau Ind Farmaceuti Coenzima utilizada na sintese de l-carnitina

Also Published As

Publication number Publication date
US20080199920A1 (en) 2008-08-21
JP4759054B2 (ja) 2011-08-31
KR20070006094A (ko) 2007-01-11
EP1899473B1 (en) 2012-09-19
EP1899473A1 (en) 2008-03-19
WO2007007986A1 (en) 2007-01-18
EP1899473A4 (en) 2009-05-27
JP2008544752A (ja) 2008-12-11
CN101213307B (zh) 2011-10-19
KR100713104B1 (ko) 2007-05-02
US7598065B2 (en) 2009-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Scholtz et al. Dichloromethane dehalogenase with improved catalytic activity isolated from a fast-growing dichloromethane-utilizing bacterium
EP2228441B1 (en) Enzyme involved in synthesis of equol
CN106661585A (zh) 微生物麦角硫因生物合成
ZA200700269B (en) A detoxifizyme having activity of transforming aflatoxin an the gene encodes thereof
Polley Purification and characterization of 3-dehydroquinate hydrolase and shikimate oxidoreductase. Evidence for a bifunctional enzyme
CN108251396B (zh) 5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用
CN101213307B (zh) 来自粗糙脉孢菌的s-腺苷甲硫氨酸-6-n-赖氨酸-甲基转移酶，编码其的因，包含其的载体和宿主细胞，以及使用该宿主细胞生产三甲基赖氨酸的方法
CN101014709B (zh) 由粗糙脉孢菌产生的γ-丁基甜菜碱羟化酶
Nakajima et al. cDNA encoding tropinone reductase-II from Hyoscyamus niger.
CN112322599A (zh) 一种转氨酶upta、制备方法和应用
Paterson et al. Molecular basis of altered enzyme specificities in a family of mutant amidases from Pseudomonas aeruginosa
CN101213293B (zh) 携带与l-肉碱生物合成相关基因的肠杆菌科属微生物和使用该微生物生产l-肉碱的方法
CN114395053B (zh) 一种虫黄藻来源的DHQS-OMT融合基因及其在高效合成MAAs中的应用
Sabaty et al. Induction by nitrate of cytoplasmic and periplasmic proteins in the photodenitrifier Rhodobacter sphaeroides forma sp. denitrificans under anaerobic or aerobic condition
CN103898071B (zh) P450sca‑2酶突变体、其制备方法和应用
CN102190730A (zh) 一种生物素蛋白连接酶融合蛋白
CN112391373A (zh) 一种高产γ-氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶GADZ1及其基因和应用
AU623641B2 (en) Antitumor antibiotic kedaricin
CN115806586B (zh) 美白短肽及其制备方法
CN110596029B (zh) 检测苏式β-羟基-α-氨基酸含量的方法
WO2022220263A1 (ja) エルゴチオネインの製造方法
Preiss et al. Cloning of the aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase structural gene from Escherichia coli K12
CN110268047B (zh) 产肝素酶的施氏假单胞菌菌株及从其衍生的肝素酶
CN109234251A (zh) 蛋白质及编码该蛋白质的核酸分子在制备磷酸水解酶中的应用
LEISINGER Dichloromethane Dehalogenase with Improved Catalytic Activity Isolated from Fast-Growing Dichloromethane-Utilizing Bacterium

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20111019

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee