CN101210239B

CN101210239B - 一种溶栓/抑制血小板凝集双功能分子及其用途

Info

Publication number: CN101210239B
Application number: CN2007103077240A
Authority: CN
Inventors: 郭蔼光; 张守涛
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2010-09-15
Anticipated expiration: 2027-12-21
Also published as: CN101210239A

Abstract

本发明公开了一种溶栓/抑制血小板凝集双功能分子及其用途，该溶栓/抑制血小板凝集双功能分子是含RGD序列的蛇毒纤溶酶Fibrolase的突变体，同时还公开了其制备方法。本发明公开的突变体为将Fibrolase的69-74位T(苏氨酸)-S(丝氨酸)-V(缬氨酸)-S(丝氨酸)-H(组氨酸)-D(天冬氨酸)序列替换为G(甘氨酸)-P(脯氨酸)-R(精氨酸)-G(甘氨酸)-D(天冬氨酸)-W(色氨酸)-R(精氨酸)-M(甲硫氨酸)-L(亮氨酸)-G(甘氨酸)。本发明的Fibrolase突变体可以作为一种新型溶栓药物使用，具有溶栓和抗凝双重功能。

Description

一种溶栓/抑制血小板凝集双功能分子及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种溶栓/抑制血小板凝集双功能分子及用途，具体的说，涉及一种溶栓/抑制血小板凝集双功能分子及其用途，该溶栓/抑制血小板凝集双功能分子具有在制备抑制血小板凝集、溶栓药物中的应用。

背景技术

Fibrolase是来自美国南方铜头蝮蛇(Agkistrodon contortrixcontortrix)的一种锌金属蛋白酶，具有纤溶活性，无出血活性。是一条由203个氨基酸残基组成的多肽链，分子量为23kD，N-端为环化的谷丙酰胺残基。1mol Fibrolase蛋白中结合1mol锌原子，失去锌将会导致其快速失活(Ahmed NK，et al.Haemostasis.1990，20(3)：147-154)。

Fibrolase能特异性的降解纤维蛋白原纤维蛋白(原)，使之成为45kDa和22.5kDa碎片。研究表明，Fibrolase的溶栓机制与现在临床上应用的溶剂t-PA和链激酶等完全不同，它直接作用于血栓，专一地裂解纤维蛋白(原)Aα-链的lys⁴¹³-leu⁴¹⁴键，因此也不受丝氨酸蛋白酶的抑制(Ahmed NK，etal.Haemostasis，1990，20(6)：334-340)。决定其裂解位点的是序列决定性，而非键决定性，至少与lys⁴¹³-leu⁴¹⁴周围的八个氨基酸顺序有关。另外Fibrolase对纤溶酶原无活化作用，也不水解其它凝血因子及血小板膜。所以Fibrolase是一种比血纤溶酶底物特异性更专一的纤溶酶。

Fibrolase无论在体内还是体外，均能直接溶解纤维蛋白凝块。Guan等应用动物静脉血栓模型对Fibrolase的溶栓活力进行了研究，注射Fibrolase的6只兔子髂静脉中的48h老龄血块全部被溶解，动物全部存活，副反应很少(Guan AL，et al.Arch Biochem Biophys，1991，289(2)：197-207)。

在凝血过程中，血小板粘附和聚集是一个重要步骤，而含RGD序列的整合素受体配基(纤维蛋白原)同其受体(GPIIbIIIa)的作用，又是血小板粘附所必不可少，而纤维蛋白原通过其γ链C端的RGD序列与GPIIbIIIa等受体相互识别并发挥其功能的。在发现具有RGD序列的去整合素能与血小板糖蛋白GPIIbIIIa结合、有效抑制血小板聚集后，为了更好的研究RGD序列的活性构象，人们合成了各种的含RGD序列的小肽，如RGDS、RGDW、GRGDS等。它们均具有抑制纤维蛋白原与血小板的结合和抑制血栓形成等作用。但其抑制活性比含同样序列的天然蛋白要低的多，且半衰期较短。随后又有各种环化的RGD肽被相继合成，通过不同形式的环化后，可以提高其抑制活性。这可能是由于线状肽中的天冬氨酸(Asp)容易被降解，而环化肽的刚性保证了天冬氨酸(Asp)的稳定性；环化可以束缚含RGD序列的片段，以形成局域构象，同时RGD残基形成一个突出的环状loop，这使它能够更容易插入到整合素GPIIbIIIa，所以具有比较强的抑制血小板聚集作用。

由于GPIIbIIIa在凝血过程中的作用，基于GPIIbIIIa的拮抗剂有可能成为治疗因不同病因导致的血栓疾病的有效药物。存在于纤维蛋白原(Fg)、纤维粘联蛋白等分子中的RGD肽序是GPIIbIIIa结合基序，Fg与活化血小板的GPIIbIIIa结合是血小板聚集的前提，因此外源RGD肽序通过与Fg竞争结合活化血小板表面的GPIIbIIIa，可以抑制活化血小板聚集，从而抑制血栓的形成(Plow EF，et al.Biochem pharmacol，1987，36(23)：4035-4041)。近年来，通过对RGD配体与整合素受体作用机制的广泛研究，通过蛋白质工程技术获得天然蛋白的突变体在人工条件下，将RGD序列引入到某些天然蛋白质中，在已知功能的蛋白质中再增加新的功能序列。Church等根据RGD肽与水蛭素C末端的十二肽分别具有独立抑制血小板凝集以及凝血酶凝血的活性，设计了一个十八肽，使WGRGDSA与水蛭素C末端嵌合在一起，得到了抑制血小板凝集与凝血酶凝集的双功能分子，但由于脱离了原有构象的支持，抑凝能力与线性肽相比没有显著的提高(Church FC，et al.J Biol Chem，1991，266(18)：11975-11979)。Knapp等通过hirudin晶体结构中发现，该分子上有一个突出的Finger结构暴露在溶剂中，由一个反平行β折叠与一个高度柔性的β转角结构组成，与去整合素中的RGD loop相类似，他将RGDS引入到该β转角区，结果保留了水蛭素的抑制凝血酶凝血活性的同时，抑制血小板聚集的活力也比线性的GRGDS-和RGDS-肽高3-5倍(Pfaff M，et al.Cell AdhesCommun.1994，2(6)：491-501)。

VanZyl WB等将RGD序列融合在SAK的C末端，构建的嵌合体多肽具有了抗凝功能，但溶栓活性却降低了(Vanzyl WB，et al.Thromb Res，1997，88(5)：419-426)；宁保安等将葡激酶的35、36、37位氨基酸分别替换为R、G、D，即在分子内引入了RGD序列，RGD-mSAK蛋白的溶栓活性不低于野生型葡激酶，同时具有抗血小板聚集效应，是低免疫原性的双功能分子(宁保安等.生物工程学报，2005，21(3)：693-697)。孙迎庆等构建了在尿激酶原K区C端的发夹区插入了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(RGDS)片段的尿激酶原嵌合体基因，突变体保留了全部尿激酶原的纤溶酶原激活活性，并具有很强的抗血小板聚集活性(孙迎庆等，中国生物化学与分子生物学报，1999，15(2)：189-193)。赵菁菁等在山蛭素氨基酸序列的33位至35位分别插入了RGDS和PRGDADP序列构建了2种含RGD序列的山蛭素突变体，这两种突变体都同时具有了抗血小板聚集和抑制凝血酶的活力(赵菁菁等.生物化学与生物物理进展，2004，31(12)：1125-1133)。

多个实验都表明，Fibrolase具有强烈而快速的纤溶活性且没有出血性，在体内和体外都能有效的溶解血栓，具有很好的应用前景，但却没有抗血小板凝集的功能，所以如果能通过一些手段引入这种性质，可能更有利于开发和利用。关于这方面的研究Markland等曾作过一些探索，他们用化学交联的方法将带有RGD序列的多肽交联到Fibrolase上，使Fibrolase具有纤溶和抗血小板凝集双功能(Swenson S，et al.Arch Biochem Biophys，2000，384(2)：227-237；Sanchez EF，et al.Thromb Res.1997，87(3)：289-302.)。但化学交联存在操作难度较大、活性易丢失、使成本大幅增加以及对环境还会有污染等问题存在。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子(RGD-Fibrolase)，并且验证该溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子能够用于在制备预防和治疗血栓性疾病药物中的应用。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子，其特征在于，该溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子的氨基酸序列是：

EQRFPQRYVQLVIVADHRMNTKYNGDSDKIRQWVHQIVNTINEIYRPLNIQFTLVGLEIWSNQDLITVGPRGDWRMLGTLASFGNWRETDLLRRQRHDNAQLLTAIDFDGDTVGLAYVGGMCQLKHSTGVIQDHSAINLLVALTMAHELGHNLGMNHDGNQCHCGANSCVMAAMLSDQPSKLFSDCSKKDYQTFLTVNNPQCILNKP。

上述溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子的制备方法，其特征在于，将蛇毒纤溶酶Fibrolase序列的69-74位的T-S-V-S-H-D序列替换为G-P-R-G-D-W-R-M-L-G，R-G-D两边的序列分别为G-P和W-R-M-L-G，替换后的序列形成突出的Loop结构，并使R-G-D序列置于Loop结构的顶端。

所述的蛇毒纤溶酶Fibrolase是指从美国南方铜头蝮蛇Agkistrodoncontortrixcontortrix中纯化的一种纤维蛋白溶解酶，该纤维蛋白溶解酶的氨基酸序列如下：

EQRFPQRYVQLVIVADHRMNTKYNGDSDKIRQWVHQIVNTINEIYRPLNIQFTLVGLEIWSNQDLITVTSVSHDTLASFGNWRETDLLRRQRHDNAQLLTAIDFDGDTVGLAYVGGMCQLKHSTGVIQDHSAINLLVALTMAHELGHNLGMNHDGNQCHCGANSCVMAAMLSDQPSKLFSDCSKKDYQTFLTVNNPQCILNKP。

经验证表明，本发明的溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子(RGD-Fibrolase)，能够用于在制备预防和治疗血栓性疾病药物中应用。

将本发明的溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子的DNA片段与和表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明不限于特定的表达载体，只要它能够与所述DNA片段重组，形成适宜表达的质粒。

上述重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。在优选实施方案中，本发明使用大肠杆菌菌株如DH5α，BL21(DE3)，JM109等。所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体，如商业PET系列载体和国内广泛使用的PBV220载体，优选PBV220载体。大肠杆菌可以是适合原核系统表达的配套大肠杆菌，当使用PET类载体，宿主菌优选BL21(DE3)系列；当使用PBV220载体时宿主菌可选择多种商业上提供的大肠杆菌，优选DH5α。

本发明的溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子(RGD-Fibrolase)的DNA与pBV220相连接，在大肠杆菌DH5中实现了高效表达。通过包涵体复性的方法，得到了纯度很高的同时具备溶栓活性和抑制血小板凝集两种可能的RGD-Fibrolase蛋白。

附图说明

图1是本发明的溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子(RGD-Fibrolase)的氨基酸序列。

图2是蛇毒纤溶酶Fibrolase的氨基酸序列。

图3是本发明溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子(RGD-Fibrolase)核苷酸序列。

图4显示蛇毒纤溶酶Fibrolase三级结构预测结果。A：从头预测；B：同源建模。

图5显示本发明的溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子(RGD-Fibrolase)三级结构预测结果。图中C和D代表不同的摆放方位。

图6显示了本发明的溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子(RGD-Fibrolase)在大肠杆菌中以包涵体表达的SDS-PAGE电泳照片。

图7显示了双功能突变体RGD-Fibrolase复性和纯化的SDS-PAGE结果。

图8显示了溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子(RGD-Fibrolase)和野生型Fibrolase的纤维平板法溶栓活性测定结果。其中1：空白对照；2：Fibrolase；2：RGD-Fibrolase。

图9显示了溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子(RGD-Fibrolase)和野生型Fibrolase的抗ADP诱导的血小板聚集试验结果。

以下结合附图和发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

本发明的溶栓/抑制血小板凝集的RGD双功能分子，在合成RGD-Fibrolase基因时将RGD编码顺序融合在野生型Fibrolase基因中。

根据Fibrolase的结构特点和作用方式，设计具有溶解血栓和抑制血小板聚集的双功能RGD-Fibrolase分子结构，并利用基因工程手段生产，所得产品除了具有高效、特异溶解血栓功能外，还具有抗血小板聚集的新特性，并且制备工艺简便、安全。

从Fibrolase的三维结构上看，69-74位氨基酸位于分子结构的外部，呈一个突出的Loop状，远离已知的活性中心。在该位置上引入RGD序列既能使RGD较好的发挥抗凝功能，又对Fibrolase的活性影响会较小，很好的保持fibrolase的溶栓活性。

本发明的溶栓/抑制血小板凝集的RGD双功能分子，是将蛇毒纤溶酶Fibrolase的69-74位T(苏氨酸)-S(丝氨酸)-V(缬氨酸)-S(丝氨酸)-H(组氨酸)-D(天冬氨酸)序列替换为G(甘氨酸)-P(脯氨酸)-R(精氨酸)-G(甘氨酸)-D(天冬氨酸)-W(色氨酸)-R(精氨酸)-M(甲硫氨酸)-L(亮氨酸)-G(甘氨酸)。在该位置上引入RGD序列不仅保持了Fibrolase的溶栓活性，同时具有较好的抑制血小板凝集的功能。

1、Fibrolase三级结构预测和突变体设计

(1)Fibrolase三级结构预测

根据蛇毒纤溶酶Fibrolase的氨基酸序列(如图1)，利用SWISS-MODEL网站(http://swissmodel.expasy.org/)对Fibrolase三级结构的预测，分别用两种方法进行预测：

①从头预测模式，选择好参数，进行预测；

②同源建模，先提交fibrolase氨基酸顺序，搜索已有PDB数据库中的同源序列，然后以这几个同源蛋白的结构为参考，进行预测。

(2)突变位点的选择

由于RGD序列在处于loop位置时抑制血小板凝集能力最强，并为了最大限度的不破坏Fibrolase原有的纤溶酶活性，按照以下原则选择突变位点：处于loop位置、远离Fibrolase活性中心和Zn²⁺结合位点、尽量少的改变氨基酸。最后选取69-74位，作为突变位点，将T(苏氨酸)-S(丝氨酸)-V(缬氨酸)-S(丝氨酸)-H(组氨酸)-D(天冬氨酸)序列替换为G(甘氨酸)-P(脯氨酸)-R(精氨酸)-G(甘氨酸)-D(天冬氨酸)-W(色氨酸)-R(精氨酸)-M(甲硫氨酸)-L(亮氨酸)-G(甘氨酸)，RGD-Fibrolase氨基酸序列如图2。

(3)RGD-Fibrolase序列的三级结构预测及与Fibrolase结构比较

将上述设计好的突变体的氨基酸序列提交SWISS-MODEL服务器，以Fibrolase三级结构为模板，按照同源建模方式，对突变体RGD-Fibrolase进行三级结构的预测并进行分析。预测结果显示，RGD-Fibrolase三级结构没有大的改变，符合预期要求(参见图4和图5)。

2、溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子的合成与表达

(1)RGD-Fibrolase的DNA合成

根据密码子表设计RGD-Fibrolase的核苷酸序列，用重叠引物延伸PCR法合成RGD-FibrolaseDNA。设计了14段平均60bp左右的片段，该长度可以保证化学合成的准确率和高产率，两个相邻片段之间的重叠区域为15bp左右，Tm值在45℃～50℃之间，并在5’-端依次加上酶切位点BamH I和起始密码子ATG，3’-端加上终止密码子TAA和酶切位点HindIII。在进行循环PCR合成全长RGD-fibrolase基因时，两个临近的片段互为引物进行第一轮PCR扩增，再以两个临近的PCR产物为模板，以这两个PCR产物的最外侧的两个DNA片段为引物进行下一轮扩增，以此类推，最后通过4轮PCR合成全长RGD-Fibrolase DNA(如图3)。PCR产物经BamH I/HindIII双酶切连接进表达载体pBV220中，并转化大肠杆菌DH5α。

(2)RGD-fibrolase的表达

热激诱导含有RGD-fibrolase重组质粒的大肠杆菌DH5α，重组蛋白获得高效表达，其分子量约23kDa与预期大小一致，色谱扫描仪检测显示，重组蛋白占菌体总蛋白的40％以上，表达蛋白主要以不溶性包涵体为主(图6)。

3、溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子(RGD-Fibrolase)复性和纯化

洗涤液I	0.01％TritonX-100，50mmol/LTris·Cl，10mmol/LEDTA，PH7.5
洗涤液I	0.01％TritonX-100，50mmol/LTris·Cl，10mmol/LEDTA，PH7.5	洗涤液II	2mol/LUraa，50mmol/LTris·Cl，10mmol/LEDTA，PH7.5
Buffer A	50mmol/LTris·Cl，50mmol/LNaCl，0.5mmol/LZnCl<sub>2</sub>，1.0mmol/LGSSG、2.0mmol/LGSH，PH7.5	洗涤液II	2mol/LUraa，50mmol/LTris·Cl，10mmol/LEDTA，PH7.5
Buffer A		Buffer B	4mol/L盐酸胍、50mmol/LTris·Cl，pH7.5
Buffer C	20mmol/L的Tris·Cl、0.5mmol/LZnCl<sub>2</sub>，(pH7.5)	Buffer B	4mol/L盐酸胍、50mmol/LTris·Cl，pH7.5
Buffer C	20mmol/L的Tris·Cl、0.5mmol/LZnCl<sub>2</sub>，(pH7.5)	Buffer D	20mmol/L的Tris·Cl、0.8mol/LNaCl和0.5mmol/LZnCl<sub>2</sub>，(pH7.5)

(1)包涵体洗涤和溶解：

12000rpm离心1min收获菌体，菌液沉淀用1/5体积破菌缓冲液(50mmol/LTris·Cl，50mmol/LNaCl，PH7.5)重悬，采用超声裂解菌体，超声条件：宁波新芝超声细胞破碎仪，功率400W，超5秒，间隔5秒，重复100次。菌体充分破碎后离心，收集沉淀；将沉淀用包涵体洗涤液I洗涤2次，再用包涵体洗涤液II洗涤2次，每次10min；4℃，10000rpm离心15min，收集沉淀，最后用PH7.5的50mmol/L Tris·Cl再洗一次。

(2)包涵体溶解：

以1g包涵体加2ml超纯水的比例将包涵体均匀悬浮，分别取20ml不同的变性液，分别加入不同浓度的DTT、β-ME，再以100ml变性液加入1g包涵体的比例加入包涵体。分别于37℃水浴45min、2h，并不断搅拌，观察溶解现象。水浴完毕，室温、14000rpm，离心20min。测沉淀量，上清稀释10倍，测蛋白浓度。

(3)包涵体纯化和脱还原剂：

Superdex G-75柱(Φ10mm×400mm)用Buffer B缓冲液平衡后，将浓度约为10～20mg/mL的1mL变性蛋白液样品在4℃～20℃环境中过柱，用BufferB洗脱，流速为0.5ml/min，收集的目标蛋白峰。

(4)用恒流泵以20μL/min左右的恒定流速将2ml变性液(含6mol/L盐酸胍、50mmol/L Tris)连续流加至100ml复性液Buffer A+1.5mol/L盐酸胍中，缓慢搅拌。流加结束后，在室温下继续缓慢搅拌24h。

(5)离子交换纯化选用的缓冲液为Buffer C，选用1ml的Hi Trap QSepharose FF离子交换层析柱。层析柱先用Buffer C缓冲液平衡后，RGD-fibrolase复性溶液进样，目的蛋白挂在柱上后，用Buffer C平衡缓冲液洗至基线平，再用Buffer C淋洗10个柱体积，然后用10个柱体积进行线性梯度洗脱，缓冲液为Buffer D，梯度范围从0-100％，收集含正确折叠体的洗脱峰。再根据梯度结果确定阶跃洗脱条件，流速为1mL/min。

(6)分子筛脱盐选用Superdex G-25柱(Φ10mm×400mm)脱盐，缓冲液为Buffer C，收集活性峰待分析测定，其SDS-PAGE分析结果如图7，纯度达95％以上。

4、双功能RGD-fibrolase突变体活性测定

(1)纤维平板法纤溶活性测定：

取2％琼脂溶液(pH7.4，含0.15mol/LNaCl，50mmol/LTris·Cl)5ml，铺板前加入1ml含10单位凝血酶溶液，在45℃～50℃水浴中与0.4％纤维蛋白原溶液(pH7.4，含0.15mol/LNaCl，50mmol/LTris·Cl)5ml，混合后倒入无菌培养皿中，室温凝固。在平板上打直径3mm的小孔，每孔加样10μL，置37℃保温18h，取出观察结果。

(2)抗血小板聚集活性的测定：

血小板聚集实验使用富血浆血小板(PRP)和贫血浆血小板(PPP)进行测定。取新鲜的鼠血以9∶1(v∶v)加入3.8％的柠檬酸钠做抗凝剂，缓慢颠倒混均。800rpm离心10分钟，小心吸取上层富含血小板的悬液，即为PRP(Platelet Rich Plasma)。剩余部分再以3000rpm离心10分钟，吸出上层液体，即为PPP(Platelet Pool Plasma)。将300ul的PRP按100∶1的比例与待测样品或对照缓冲液混合，在37℃保温3分钟，用PPP调节零点，加入诱导剂ADP(终浓度10μmol/L)，记录3分钟内的聚集波形，血小板聚集的抑制率＝(对照的最大聚集-样品的最大聚集率)/对照的最大聚集率。

5、结果分析

采用纤维蛋白溶圈法(平板法)测定结果如图8，无论野生型fibroalse还是其突变体都具有明显的纤溶酶活性，从溶圈大小看不出明显差异。

从图9可以看出野生型fibrolase几乎没有抑制ADP诱导的血小板聚集的生物活性，而突变体RGD-fibrolase则明显具有抑制血小板聚集的功能。

氨基酸序列

溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子的氨基酸序列：

EQRFPQRYVQLVIVADHRMNTKYNGDSDKIRQWVHQIVNTINEIYRPLNIQFTLVGLEIWSNQDLITVGPRGDWRMLGTLASFGNWRETDLLRRQRHDNAQLLTAIDFDGDTVGLAYVGGMCQLKHSTGVIQDHSAINLLVALTMAHELGHNLGMNHDGNQCHCGANSCVMAAMLSDQPSKLFSDCSKKDYQTFLTVNNPQCILNKP

溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子的核苷酸序列：

Gaacagcgtttcccgcagcgttacgtgcagcttgtgatcgttgcggatcaccgtatgaacacgaaatacaacggtg

attctgacaaaatccgtcaatgggtgcaccagattgtcaacactatcaatgaaatttaccgccctttgaacattcagttc

accttagttggcttagaaatttggtccaaccaggatttgattaccgtgggaccaagaggtgattggagaatgttcggta

ctttggcctcatttggtaactggcgtgaaaccgacttgttacgccgccaacgtcacgataacgcccagttattaacgg

ccattgactttgatggtgacactgtaggcttggcttatgtgggcggtatgtgccagttaaagcactctaccggtgttatc

caggatcatagcgcaatcaatcttttggttgcacttacaatggcccacgagctgggtcataacttaggcatgaatcac

gatggtaaccagtgtcattgcggtgctaactcgtgcgtgatggccgcaatgctaagcgatcaaccttccaaattattc

agcgattgtagtaagaaagactatcagacgtttcttaccgttaacaacccacaatgcattttaaataaaccg

纤维蛋白溶解酶的氨基酸序列：

EQRFPQRYVQLVIVADHRMNTKYNGDSDKIRQWVHQIVNTINEIYRPLNIQFTLVGLEIWSNQDLITVTSVSHDTLASFGNWRETDLLRRQRHDNAQLLTAIDFDGDTVGLAYVGGMCQLKHSTGVIQDHSAINLLVALTMAHELGHNLGMNHDGNQCHCGANSCVMAAMLSDQPSKLFSDCSKKDYQTFLTVNNPQCILNKP

Claims

1.一种溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子，其特征在于，该溶栓/抑制血小板凝集的RGD双功能分子的氨基酸序列如下：

2.权利要求1所述的溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子的制备方法，其特征在于，将蛇毒纤溶酶Fibrolase序列的69-74位的T-S-V-S-H-D序列替换为G-P-R-G-D-W-R-M-L-G，R-G-D两边的序列分别为G-P和W-R-M-L-G，替换后的序列形成突出的Loop结构，并使R-G-D序列置于Loop结构的顶端；

所述的蛇毒纤溶酶Fibrolase是指从美国南方铜头蝮蛇Agkistrodoncontortrix contortrix中纯化的一种纤维蛋白溶解酶，该纤维蛋白溶解酶的氨基酸序列如下：

3.如权利要求1所述的溶栓/抑制血小板凝集的双功能分子在制备预防和治疗血栓性疾病药物中的应用。