CN101200730B - Il-12表达载体及该载体表达的真核细胞株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及IL-12表达载体及该载体表达的真核细胞株及应用，本发明将rhIL-12的两个p35亚基和一个p40亚基的转录本构建于同一个载体中，每一个亚基都由特定的转录调控元件进行表达水平的调节，并通过引入能够提高表达水平的调控元件Intron和SV40 Enhancer实现rhIL-12的高效表达。

Description

IL-12表达载体及该载体表达的真核细胞株及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说本发明涉及白细胞介素12高效真核表达载体的构建，哺乳动物细胞的转染，rhIL-12高效表达细胞株的筛选、鉴定和rhIL-12的制备以及药学应用。

背景技术

rhIL-12(recombinant human interleukin12，rhIL-12)是一种分子量为75KD的糖蛋白，是由两个亚单位P35、P40靠二硫键连结形成的异源二聚体。IL-12具有抗病毒、抗肿瘤以及肿瘤转移的能力，主要是它可以激活细胞毒性T淋巴细胞((Brunda etal.(1993)J.Exp.Med.178，1223-1230；)，并与其刺激产生IFN-γ有关(Nastala，C.Journal of Immunology，1994；153：1697-1706；Seder，R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993；90：10188-10192)。目前已知IL-12是一种较好的细胞免疫的启动因子，可以作为增强细胞免疫的佐剂，具有巨大的应用前景。

国内外已经利用腺病毒、逆转录病毒、EB病毒、腺伴病毒以及杆状病毒等载体表达IL-12。由于IL-12是一种糖蛋白，哺乳动物细胞表达系统是最理想的选择。在真核细胞表达体系中，陈慰峰(生物化学与生物物理进展.1998；25：254-258)、刘锰等采用共转染的方式在CHO细胞中表达，羊东晔(湖南医科大学学报2003；28：338-342)利用双启动子控制表达IL-12的双亚基，而陈诗书(中国生物化学与分子生物学报，1999；15：48-53)则采用IRES连接小鼠IL-12双亚基，在COS细胞中表达。以上各种表达，由于转染效率、整合效率等的不均一性，导致表达效率不一、双亚基表达水平差异、双亚基相互不匹配等。目前已知正常细胞中IL-12的表达水平主要是由p35决定的，而一般情况下p35表达水平偏低，导致IL-12的表达水平难以大幅度提高，其生产和应用受到很大的限制。本发明解决了IL-12的这个关键问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达rhIL-12的载体，利用该载体在哺乳动物细胞系中高效表达rhIL-12及方法和其药学应用，所述的rhIL-12是通过基因工程技术制备的。

在第一方面，本发明提供了一种获得高效表达rhIL-12表达载体的方法。已经有资料表明，白介素12的两个亚基p35和p40，在哺乳动物细胞中表达水平是不匹配的，通常是p40亚基表达水平较高，而p35亚基表达水平较低，导致rhIL-12的表达水平较低。针对现有rhIL-12中两个亚基表达不匹配、转染细胞后通常难以筛选得到高表达目的克隆的问题，对表达rhIL-12的载体进行全新的设计：本发明将p35亚基转录本和p40亚基转录本构建在一个载体中。每一个亚基都分别由CMV启动子控制，从而保证两个亚基p35和p40都获得有效表达。本发明用以下两种方法提高p35亚基的表达水平，即在p35亚基的启动子之前设计了SV40的增强子元件，在启动子与p35亚基序列之间又引入了Intron元件(Buchman，AR.Mol.Cell.Biol.1988；8，4395-4405.)，形成一个p35亚基的表达单元，更进一步，将两个p35亚基表达单元串联在同一个载体中，以增加p35的表达水平。在p40亚基与筛选标记(Neo)基因之间引入IRES序列，以提高抗性筛选基因的表达水平，从而在保证较高压力条件下，更容易筛选得到所需克隆。通过以上设计，所获得的人IL-12表达载体主要结构如下：SV40Enhancer—pCMV—Intron—p35—SV40Enhancer—pCMV—Intron—p35—pCMV—p40—IRES—neo。利用上述载体转染的细胞株，易于获得高表达的、匹配较好的rhIL-12的两个亚基，进而获得高活性的rhIL-12。

本文中所用的术语“蛋白质”、“蛋白”、“多肽”具有相同的含义。本文中“rhIL-12”与“人IL-12”可以相互替换使用。当用基因工程手段表达本发明的蛋白时，根据生产中所使用的宿主细胞的不同，如，酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、哺乳动物乳腺反应器等，本发明的蛋白的糖基化形式可以是不一致或不均一的。

本发明中的人IL-12，除天然存在的氨基酸的形式外，亦包括其N末端带有甲硫氨酸的形式、两个亚基的各类突变体形式以及其截短突变体等。

优选地，本发明的人IL-12两个亚基的氨基酸序列如附录1a和附录1b所示。

本发明中适用的载体包括但不限于：在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。在一优选实施方式中，所述表达载体为哺乳动物细胞表达载体。

在第二个方面，表达载体包含选择标记基因，可以在真核细胞中采用的抗性基因，包括但不限于：新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因以及潮霉素抗性基因等。本发明所采用的压力筛选基因为新霉素抗性基因(neo基因)，为保证转染后筛选出的抗性细胞能够更有效的表达IL-12，本发明将新霉素抗性基因与白细胞介素12第二个亚基p40的基因构建于同一个启动子的调控下，同时在p40亚基和抗性筛选标记之间引入调控neo基因表达的IRES元件。本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码蛋白的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以便获得所需要的目的蛋白。

在第三个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有本发明第一个方面所述的载体，或者所述细胞已用本发明第一个方面所述的核酸分子转化或转染。宿主细胞可以是植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。如CHO、COS、MDCK(Pei D.et al.Protein Exp and Purif1998；13：277-281)细胞等。宿主细胞在转染含本发明所述编码蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需IL-12蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法等。在一个优选实施例中，采用了脂质体转染法。

在第四个方面，本发明提供了制备所述人IL-12蛋白的方法，其包括以下步骤：用本发明第三个方面获得的工程细胞，通过常规方法培养来表达所需要的蛋白。分离纯化方法包括但不限于：破碎细胞(超声波、渗透压)，离心，盐析，分子筛，离子交换色谱，吸附色谱，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，制备性等电聚焦等，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。

在第五个方面，本发明提供了所述IL-12的药物应用，如将本发明制备的人IL-12作为细胞免疫佐剂使用。

在第六个方面，本发明提供了所述IL-12的药物组合物的应用，如将本发明制备的人IL-12可以用于治疗乙型肝炎；本发明的药物组合物包括另外的治疗剂，这样，根据本发明的方法，包含有本发明的人IL-12的药物组合物可以作为组合治疗的一部分，与其他的药剂组合使用。

本发明中的附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

附图说明

图1为p35基因及p40基因PCR产物；

图2是重组质粒pDouble-P35结构示意图；

图3是重组质粒pP40IRESneo结构示意图；

图4是重组质粒pP75结构示意图；

图5重组质粒pDouble-P35酶切鉴定；

图6重组质粒pP40IRESneo酶切鉴定，图中：M1.DNA marker DL2000；M2.DNAmarker DL15000；1.KpnI单酶切2.EcoRI单酶切

图7重组质粒pP75酶切鉴定，图中：M1.DNA marker DL2000；M2.DNA markerDL15000；1.EcoRI单酶切；2.EcoRV单酶切

图8p2P35-1P40结构示意图；

图9IL-12原液变性与非变性SDS-PAGE，备注：1.变性IL-12；2.分子量Marker(116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD)；3.非变性IL-12

图10rhIL-12的分子量检测MALDI-TOF-MS图；

图11IL-12的Western Blot检测；

图12IL-12的质谱分析肽图。

具体实施方式

以下所述实验方法，没有具体说明的，均按照《分子克隆实验指南》(2002年，科学出版社)所述方法进行。

实施例1

引物设计与基因扩增

设计下列p35亚基扩增引物及p40亚基扩增引物(委托上海生工生物工程有限公司合成)，用RNeasy提取试剂盒(Qiagen公司产品)提取人细胞的总RNA，并作为逆转录PCR的模板，分别进行一步法RT—PCR扩增(Takara公司试剂盒)，得到长度为684bp的p35基因产物以及长度1002bp的p40基因产物(见图1)，均与预期大小相一致。

P35正向引物序列为(下划线表示SalI酶切位点)：

5’-TGGGTCGACGCCACCATGTGTCCAGCGCGCAGCCTC-3’

P35反向引物序列为(下划线表示SalI酶切位点)：

5’-TGGGTCGACTCAGGAAGCATTCAGATAGC-3’

P40正向引物序列为(下划线表示BamHI酶切位点)：

5’-CGGGATCCATGTGTCACCAGCAGTTG-3’

P35反向引物序列为(下划线表示BamHI酶切位点)：

5’-CGGGATCCTAACTGCAGGGCACAGATG-3’

实施例2

基因克隆

(1)重组质粒pDouble-P35的构建

载体pDouble携带双表达盒。将p35基因的PCR产物以SalI单酶切后克隆插入pDouble载体中，筛选获得正向插入的重组质粒并命名为pDouble-P35(结构示意图见图2)。

(2)重组质粒pP40IRESneo的构建

携带Neo抗性筛选标记的载体pIRESneo购自美国Clontech公司。将p40基因的PCR产物以BamHI单酶切后克隆插入pIRESneo载体中，筛选获得正向插入的重组质粒并命名为pP40IRESneo(结构示意图见图3)。

(3)重组质粒p75的构建

以NruI+XhoI双酶切载体pP40IRESneo，将携带整个P40-IRES-Neo的表达盒转移入KpnI单酶切并补平后的pDouble-P35载体中，获得的重组质粒命名为pP75(结构示意图见图4)。

实施例3

基因的鉴定与序列测定

重组质粒pDouble-P35、pP40IRESneo及pP75的鉴定

(1)分别用EcoRI和BglII单酶切对pDouble-P35进行酶切鉴定，得到大小约为2.3kb和4.4kb的两条带(EcoRI单酶切)以及大小约为1.3kb和5.4kb的两条带(BglII酶切)，结果与预期一致(图5)。

(2)分别用KpnI及EcoRI单酶切对pP40IRESneo进行酶切鉴定，得到大小约为1.9kb和4.3kb的两条带(KpnI单酶切)以及大小约为0.8kb和5.4kb的两条带(EcoRI单酶切)，结果与预期一致(图6)。

(3)分别用EcoRI及EcoRV单酶切对pP75进行酶切鉴定，得到大小约为0.76kb、1.04kb、2.25kb和5.37kb的四条带(EcoRI酶切)以及大小约为0.46kb、0.95kb和8kb的三条带(EcoRV单酶切)，结果与预期一致(图7)。

实施例4

P35的基因工程改造及真核表达载体的构建

携带2个P35亚基表达盒及1个P40亚基表达盒的重组质粒的构建

(1)以NruI+KpnI双酶切载体pDouble-P35(图2)，回收P35亚基表达盒(3285bp)，并通过T4DNA聚合酶进行补平。

(2)以NruI单酶切载体pP75(图4)，以CIP酶进行去磷酸化(9416bp)。

(3)连接1与2，转化大肠杆菌后筛选出阳性克隆p2P35-1P40(图8)。

实施例5

重组质粒p2P35-1P40瞬时转染HeLa细胞后IL-12的表达水平检测

HeLa细胞接入六孔板，培养至90％单层，重组质粒p2P35-1P40用Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen公司产品)转染HeLa细胞，操作按说明书进行，设置3个质粒转染孔和3个对照孔。在转染后24小时收集全部的上清培养液并加入新鲜的培养基继续培养，在转染后48、72和96小时也分别按如上操作收集上清培养液。IL-12的表达水平通过ELISA试剂盒(晶美公司产品)进行检测，平均的表达量见表1。

表1重组质粒p2P35-1P40瞬时转染HeLa细胞后IL-12的表达水平检测

 

	p2P35-1P40质粒转染孔IL-12的表达量	对照孔IL-12的表达量
			转染后24小时	22.4ng/ml	<1ng/ml
转染后48小时	186ng/ml	<1ng/ml
			转染后72小时	256ng/ml	<1ng/ml
转染后96小时	63.9ng/ml	<1ng/ml

实施例6

CHO细胞的转染与筛选

采用GIBCO/BRL的Lipofectin进行细胞转染，操作按说明书进行。表达载体p2P35-1P40经PEG纯化后转染CHO细胞。CHO细胞用1640完全培养基(含10％小牛血清)，37℃5％CO₂培养至细胞约80％汇片。按试剂盒说明操作，转染72h后收集上清，加G418筛选。培养约两周，在有明显克隆形成后，撤去G418。数天后收集培养细胞上清，进行IL_12的生物及免疫活性的检测。挑取活性高的克隆转移至24孔板中，再转移至6孔板中培养，进行加压筛选，获得表达IL-12高的克隆。从中检测出活性最高的克隆，形成工程细胞株。

实施例7

重组CHO细胞的培养

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞既可贴壁培养也可以悬浮方式生长，我们从含血清贴壁培养逐步过渡到少血清培养，以至无血清的悬浮式培养。无血清的细胞生物反应器的连续灌注培养的优点在于培养条件稳定可控，便于对细胞的状态进行精确的评估，加强对细胞外环境的检测，有利于增加细胞目的蛋白的分泌，使得目的蛋白的纯化变得容易进行。我实验室从含血清培养逐步减少培养液的血清含量，最后成功转化为无血清的连续悬浮培养。通过多次的反复探索，成功的驯化了表达rhIL-12的CHO细胞株，使其完全适合美国GIBCO公司的CHO-S-SFM II无血清培养液，采用德国贝朗2L动物细胞生物反应器进行连续灌注培养，通过对培养过程中各种营养物质的浓度以及代谢产物的浓度连续监控，使培养条件参数不断优化，培养上清液目的蛋白的浓度明显提高，每次连续培养约25天，细胞密度最高为1×10⁷/ml，总共可收获约20L培养上清液，CHO细胞能稳定高效表达rhIL-12，平均浓度为6μg/ml。

实施例8

IL-12的纯化

将含有IL-12的细胞培养上清液进行超滤或稀释，调整盐离子强度上阳离子交换柱，用buffer(20mM PBS，1M NaCI，pH6.0)进行阶段洗脱，分步收集分离组分；将含IL-12组分4M的(NH₄)₂SO₄(pH8.0)沉淀，去沉淀取上清上疏水柱，用buffer(20mM Tris-Cl，2M(NH₄)₂SO₄，pH8.5)进行阶段洗脱，分步收集分离组分；将含IL-12组分适当稀释调整离子强度后上阴离子交换柱，用buffer(20mM Tris-Cl，1M NaCl，pH8.5)进行阶段洗脱，分步收集分离组分；将含IL-12组分上分子筛层析柱；用buffer(120mM NaCl，20mM PB，pH7.0)进行洗脱，分步收集分离组分，经SDS-PAGE，HPLC等方法检测纯度达98％以上。

实施例9

rhIL-12的质量控制

1.rhIL-12分子量测定

(1)SDS-PAGE测定分子量

SDS-PAGE显示，IL-12的相对分子量为60—80kD(图9)。

(2)质谱MALDI-TOF检测分子量

纯化得到得IL-12样品脱盐后用50％乙腈配成浓度为0.05～0.5g/L的蛋白质溶液，取5μL溶液与5μL基质(SA)混合，取0.5～1μL混合液点在探头上，经样品制备仪抽干后上样。测试仪器型号：AutoFlex MALDI-TOF-MS；检测条件：N2激光源，波长337nm；检测方式：线性方式(飞行管长1.22M，加速电压20KV)。测定分子量结果为：60013.338Da(图10)。文献报道P35亚基分子量为22513Da；P40亚基分子量为34699Da；加上糖链部分的分子量，MALDI-TOF-MS测定分子量60013.34Da与理论相符合。

2.rhIL-12的Western Blot检测

用免疫印迹法Western Blot分析重组蛋白的表达。本法系以供试品与特异性抗体结合后，抗体与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。各批次rhIL-12原液的Western Blot结果一致，呈阳性反应(图11)。

3.rhIL-12的质谱肽图测定

用胰蛋白酶水解后，0采用质谱(MS)法测定，测定时采用波长337nm的N2激光源进行检测离子类型为正离子，检测方式为反射方式(飞行管长2.7M，加速电压20KV，反射电压23KV)检测基质为CCA，结果如图12。

根据理论胰蛋白酶理论水解位点，对肽质量酶谱分析，质谱肽图与理论序列相匹配的肽段(结果如表2)符合理论预期值。

表2质谱肽图与理论序列相匹配的肽段

4.rhIL-12的活性检测

rhIL-12生物活性检测采用PBMC IFN-γ诱生法

(1)NIBSC标准品(WHO国际标准品)和纯化rhIL-12的稀释：标准品和经准确定量的纯化rhIL-12用RMPI1640基础培养液稀释成以下浓度：8ng/mL、4ng/mL、2ng/ml、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.125ng/mL、0.0625ng/mL待用。

(2)分离PBMC细胞：抽取静脉血5mL，肝素抗凝，Hank液等量混匀，取5mlFicoll淋巴细胞分离液置于15mL刻度离心管中，将稀释的血液沿管壁缓缓叠加于分离液上，形成清晰的界面，置水平离心机中，2000r/min离心20min，用滴管直接吸出单个核细胞层置于另一刻度离心管中，加入4倍量以上的Hank液，充分混匀，1000r/min离心10min，倾去上清液，再用Hank液洗两次，用含10％灭活胎牛血清的RMPI1640基础培养液配制细胞悬液，计数细胞，同时用台盼兰检测细胞活力，要求细胞活力>95％以上，每孔加入100uL细胞悬液及相应稀释浓度标准品和纯化rhIL-12至96孔培养板，空白对照组加RMPI1640基础培养液，阳性对照组加抗人CD₃，终浓度(0.2ug/mL)，每个稀释度做两个复孔。

(3)37℃，5％CO₂，培养48小时

(4)收集细胞培养上清液每孔50ul，离心处理后ELISA(按BD公司试剂盒说明书操作)测定IFN-γ含量。

(5)结果计算：用MULTISKAN MK3酶标仪(Thermo公司)450nm测定各孔吸光度，Ascent software version2.6软件曲线定量计算IFN-γ含量。用标准品各稀释度体外刺激PBMCs IFN-γ产生量与纯化rhIL-12对应稀释度IFN-γ产生量对比。(t检验：P>0.05，两样品间无显著性差异)。或以IFN-γ含量对样品浓度作图，计算各实验样品的ED50(即IFN-γ含量为最大浓度的一半时的样品浓度)，按公式：待测样品效价＝标准品效价×(标准品的ED50/实验样品的ED50)。所纯化的rhIL-12的比活为6.4×10⁶IU/mg以上。

附录1a.GenBank公布的rhIL-12(hIL-12)的P35亚基编码基因序列

NM_000882.Reports Homo sapiens inte...[gi：24430218]

LOCUS       NM_000882     1444bp         mRNA      linear   PRI03-DEC-2006

DEFINITION  Homo sapiens interleukin 12A(natural killer cell stimulatory

          factor1，cytotoxic lymphocyte maturation factor1，p35)(IL12A)，

          mRNA.

ACCESSION  NM_000882

VERSION    NM_000882.2GI：24430218

KEYWORDS.

SOURCE     Homo sapiens(human)

 ORGANISM   Homo sapiens

        Eukaryota；Metazoa；Chordata；Craniata；Vertebrata；Euteleostomi；

        Mammalia；Eutheria；Euarchontoglires；Primates；Haplorrhini；

        Catarrhini；Hominidae；Homo.

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REMARK    GeneRIF：This review summarizes information on the expression and

       role of IL-12both in patients with Crohn′s diease and experimental

       models of colitis，thus emphasizing differencesbetween IL-12and

       IL-23activity on the development of intestinal inflammation.

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REMARK      GeneRIF：TSLP is a major regulatory cytokine for CD40

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REMARK     GeneRIF：IL12A gene polymorphisms may affectthe final steps of

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REMARK      GeneRIF：iC3b interferes with monocyte-derived dendritic cell

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PUBMED       7695626

REFERENCE    8   (bases1to1444)

AUTHORS      Sieburth，D.，Jabs，E.W.，Warrington，J.A.，Li，X.，Lasota，J.，

           LaForgia，S.，Kelleher，K.，Huebner，K.，Wasmuth，J.J.and Wolf，S.F.

TITLE      Assignment of genes encoding a unique cytokine(IL12)composed of

           two unrelated subunits to chromosomes3and5

JOURNAL     Genomics14(1)，59-62(1992)

PUBMED      1358798

REFERENCE   9   (bases1to1444)

AUTHORS     Schoenhaut，D.S.，Chua，A.O.，Wolitzky，A.G.，Quinn，P.M.，Dwyer，C.M.，

            McComas，W.，Familletti，P.C.，Gately，M.K.and Gubler，U.

TITLE         Cloning and expression of murine IL-12

JOURNAL   J.Immunol.148(11)，3433-3440(1992)

PUBMED    1350290

REFERENCE  10(bases1to1444)

AUTHORS   Wolf，S.F.，Temple，P.A.，Kobayashi，M.，Young，D.，Dicig，M.，Lowe，L.，

Dzialo，R.，Fitz，L.，Ferenz，C.，Hewick，R.M.et al.

TITLE   Cloning of cDNA for natural killer cellstimulatory factor，a

        heterodimeric cytokine with multiple biologic effects on T and

        natural killer cells

JOURNAL   J.Immunol.146(9)，3074-3081(1991)

PUBMED    1673147

COMMENT   REVIEWED REFSEQ：This record has been curated by NCBI staff.

The

         reference sequence was derived from M65291.1，AW472810.1and

         BG702253.1.

         OnOct30，2002this sequence version replaced gi:4504638.

         Summary：This gene encodes a subunit of a cytokine that acts on T

         and natural killer cells，and has a broad array of biological

         activities.The cytokine is a disulfide-linked heterodimer composed

         of the35-kD subunit encoded by this gene，and a40-kD subunit that

         is a member ofthe cytokine receptor family.This cytokine is

         required for the T-cell-independent induction of interferon

         (IFN)-gamma，and is important for the differentiation of both Th1

         and Th2cells.The responses of lymphocytes to this cytokine are

         mediated by the activator of transcription protein STAT4.Nitric

         oxide synthase2A(NOS2A/NOS2)is found to be required for the

         signaling process of this cytokine in innate immunity.

         Publication Note：This RefSeq record includes a subset of the

         publications that are available for this gene.Please see the

         Entrez Gene record to access additional publications.

         COMPLETENESS：complete on the3′end.

FEATURES     Location/Qualifiers

source     1..1444

           /organism＝＂Homo sapiens＂

           /mol_type＝＂mRNA＂

           /db_xref＝＂taxon:9606＂

           /chromosome＝＂3＂

           /map＝＂3p12-q13.2＂

gene       1..1444

           /gene＝＂IL12A＂

           /note＝＂interleukin12A(natural killer cellstimulatory

           factor1，cytotoxic lymphocyte maturation factor1，p35)；

           synonyms：CLMF，NFSK，NKSF1，IL-12A＂

           /db_xref＝＂GeneID：3592＂

           /db_xref＝＂HGNC：5969＂

           /db_xref＝＂HPRD：01193＂

           /db_xref＝＂MIM：161560＂

CDS        216..977

           /gene＝＂IL12A＂

           /note＝＂natural killer cell stimulatoryfactor1，35kD

           subunit；cytotoxic lymphocyte maturationfactor1，p35；

           interleukin12，p35；IL-12，subunitp35；NF cell

           stimulatory factor chain1；interleukin-12alpha chain

           precursor＂

           /codon_start＝1

           /product＝＂interleukin12A precursor＂

           /protein_id＝＂NP_000873.2＂

           /db_xref＝＂GI：24430219＂

           /db_xref＝＂CCDS：CCDS3187.1＂

           /db_xref＝＂GeneID：3592＂

           /db_xref＝＂HGNC：5969＂

           /db_xref＝＂HPRD：01193＂

           /db_xref＝＂MIM：161560＂

/translation＝＂MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLV

ATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPC

TSEE

IDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCL

SS

IYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQ

KSSLE

                    EPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS＂

sig_peptide         216..383

                    /gene＝＂IL12A＂

mat_peptide         384..974

                    /gene＝＂IL12A＂

                    /product＝＂interleukin12A＂

STS                 915..1340

                    /gene＝＂IL12A＂

                    /standard_name＝＂PMC105864P1＂

                    /db_xref＝＂UniSTS：270118＂

STS                 915..1197

                    /gene＝＂IL12A＂

                    /standard_name＝＂GDB：252062＂

                    /db_xref＝＂UniSTS：156323＂

STS                 972..1103

                    /gene＝＂IL12A＂

                    /standard_name＝＂RH17729＂

              /db_xref＝＂UniSTS:66784＂

STS            989..1336

               /gene＝＂IL12A＂

               /standard_name＝＂SHGC-12751＂

               /db_xref＝＂UniSTS：32985＂

polyA_signal   1414..1419

               /gene＝＂IL12A＂

polyA_site     1437

               /gene＝＂IL12A＂

               /experiment＝＂experimental evidence，no additional details

               recorded＂

ORIGIN

  1    tttcattttg ggccgagctg gaggcggcgg ggccgtcccg gaacggctgc ggccgggcac

  61   cccgggagtt aatccgaaag cgccgcaagc cccgcgggcc ggccgcaccg cacgtgtcac

  121  cgagaagctg atgtagagag agacacagaa ggagacagaa agcaagagac cagagtcccg

  181  ggaaagtcct gccgcgcctc gggacaatta taaaaatgtg gccccctggg tcagcctccc

  241  agccaccgcc ctcacctgcc gcggccacag gtctgcatcc agcggctcgc cctgtgtccc

  301  tgcagtgccg gctcagcatg tgtccagcgc gcagcctcct ccttgtggct accctggtcc

  361  tcctggacca cctcagtttg gccagaaacc tccccgtggc cactccagac ccaggaatgt

  421  tcccatgcct tcaccactcc caaaacctgc tgagggccgt cagcaacatg ctccagaagg

  481  ccagacaaac tctagaattt tacccttgca cttctgaaga gattgatcat gaagatatca

  541  caaaagataa aaccagcacagtggaggcct gtttaccatt ggaattaacc aagaatgaga

  601  gttgcctaaa ttccagagag acctctttca taactaatgg gagttgcctg gcctccagaa

  661  agacctcttt tatgatggcc ctgtgccttagtagtattta tgaagacttg aagatgtacc

  721  aggtggagtt caagaccatg aatgcaaagc ttctgatgga tcctaagagg cagatctttc

  781  tagatcaaaa catgctggca gttattgatg agctgatgca ggccctgaat ttcaacagtg

  841  agactgtgcc acaaaaatcc tcccttgaag aaccggattt ttataaaact aaaatcaagc

  901  tctgcatact tcttcatgct ttcagaattc gggcagtgac tattgataga gtgatgagct

  961  atctgaatgc ttcctaaaaa gcgaggtccc tccaaaccgt tgtcattttt ataaaacttt

  1021 gaaatgagga aactttgata ggatgtggat taagaactag ggagggggaa agaaggatgg

  1081 gactattaca tccacatgat acctctgatc aagtattttt gacatttact gtggataaat

  1141 tgtttttaag ttttcatgaa tgaattgcta agaagggaaa atatccatcc tgaaggtgtt

  1201 tttcattcac tttaatagaa gggcaaatat ttataagcta tttctgtacc aaagtgtttg

  1261 tggaaacaaa catgtaagca taacttattt taaaatattt atttatataa cttggtaatc

  1321 atgaaagcat ctgagctaac ttatatttat ttatgttata tttattaaat tatttatcaa

  1381 gtgtatttga aaaatatttt taagtgttct aaaaataaaa gtattgaatt aaagtgaaaa

  1441 aaaa

//

附录1bGenBank公布的rhIL-12(hIL-12)的P40亚基编码基因序列

1：NM_002187.Reports   Homo sapiens inte...[gi：24497437]

LOCUS        NM_002187     2347bp     mRNA     linear     PRI26-NOV-2006

DEFINITION   Homo sapiens interleukin12B(natural killer cellstimulatory

           fact2，cytotoxiclymphocyte maturation factor 2，p40)(IL12B)，

           mRNA.

ACCESSION   NM_002187

VERSION     NM_002187.2GI：24497437

KEYWORDS.

SOURCE       Homo sapiens(human)

ORGANISM      Homo sapiens

         Eukaryota；Metazoa；Chordata；Craniata；Vertebrata；Euteleostomi；

         Mammalia；Eutheria；Euarchontoglires；Primates；Haplorrhini；

         Catarrhini；Hominidae；Homo.

REFERENCE   1   (bases1to2347)

AUTHORS     Vujisic，S.，Lepej，S.Z.，Emedi，I.，Bauman，R.，Remenar，A.and

          Tiljak，M.K.

TITLE     Ovarian follicular concentration of IL-12，IL-15，IL-18and p40

         subunit of IL-12and IL-23

JOURNAL     Hum.Reprod.21(10)，2650-2655(2006)

PUBMED      16772281

REMARK      GeneRIF：Increased concentrations of p40subunit of IL-12/IL-23in

         follicles containing oocytes suggest an important role of this

         cytokine in reproduction.

REFERENCE   2   (bases1to2347)

AUTHORS     Suneetha，P.V.，Goyal，A.，Hissar，S.S.and Sarin，S.K.

TITLE       Studies on TAQ1polymorphism in the3′untranslatedregion of

           IL-12P40gene in HCV patients infected predominantlywith genotype

           3

JOURNAL     J.Med.Virol.78(8)，1055-1060(2006)

PUBMED      16789008

REMARK      GeneRIF：The association of IL-12p40A1188C polymorphism with the

         outcome of HCV infection is reported.

REFERENCE   3   (bases1to2347)

AUTHORS      Yanagihori，H.，Oyama，N.，Nakamura，K.，Mizuki，N.，Oguma，K.and

         Kaneko，F.

TITLE       Role of IL-12B promoter polymorphism inAdamantiades-Behcet′s

            disease susceptibility：Aninvolvement of Th1immunoreactivity

            against Streptococcus Sanguinis antigen

JOURNAL        J.Invest.Dermatol.126(7)，1534-1540(2006)

PUBMED         16514412

REMARK         GeneRIF：Our results provide evidence for anti-bacterial host

               response toward Th1-immunity mediated by IL-12B inpatients with

               Adamantiades-Behcet′s disease(ABD)，and the possible insight into

               the genetic susceptibilitythatis independent of HLA background.

REFERENCE     4   (bases1to2347)

  AUTHORS     Yoshikawa，H.，Sato，K.，Edahiro，S.，Furukawa，Y.，Maruta，T.，

           Iwasa，K.，Watanabe，H.，Takaoka，S.，Suzuki，Y.，Takamori，M.and

           Yamada，M.

  TITLE      Elevation of IL-12p40and its antibody in myasthenia gravis with

           thymoma

  JOURNAL        J.Neuroimmunol.175(1-2)，169-175(2006)

  PUBMED         16574246

  REMARK         GeneRIF：Among cytokines affecting T helper type1(Th1)-Th2

               balance，the levels of IL-12p40and its autoantibody are

               specifically elevated in patients with myasthenia gravis

               complicated by thymoma.

  REFERENCE   5   (bases 1 to2347)

  AUTHORS     Silswal，.N.Singh，A.K.，Aruna，B.，Mukhopadhyay，S.，Ghosh，S.and

            Ehtesham，N.Z.

  TITLE          Human resistin stimulates the pro-inflammatory cytokines TNF-alphaa

               and IL-12 in macrophages by NF-kappaB-dependent pathway

  JOURNAL           Biochem.Biophys.Res.Commun.334(4)，1092-1101(2005)

  PUBMED            16039994

  REMARK            GeneRIF：The pro-infiammatory nature of hResistin was further

           evident from the abillty of this protein to induce the nuclear

           translocation of NF-kappaB tramscroption factor as seen from

           electrophoretic mobility shift assays.

REFERENC   6   (bases 1 to 2347)

  AUTHORS Ling.P.，Gately，Gubler，U.，Stern，A.S.，Lin，P.，Hollfelder，K.，

          Su，C.，Pan，Y.C.and Hakimi，J.

  TITLE   Human IL-12p40 homodimer binds to the IL-12receptor but does not

        mediate biologic activity

  JOURNAL    J.Immunol. 154(1)，116-127(1995)

  PUBMED     7527811

REFERENCE    7   (bades 1 to 2347)

  AUTHORS    Aragane，y.，Riemann，H.,Bhardwaj,R.S.Schwarz，A.,Sawada，Y.，

             Yamada，H.，Luger，T.A.，Kubln，M.，Trinchierl，g.and Schwarz，T.

  TITLE      IL-12 is expressed and released by human keratinocytes and

             epidermoid carcinoma cell lines

 JOURNAL      J.Immunol .153(12)，5366-5372(1944)

 PUBMED       7527439

REFERENCE    8    (bases 1 to 2347)

  AUTHORS      Sieburth，D.，Jabs，E.W.，Warrington，.J.A.，Li，X.，Lasota，J.，

             LaForgia，S.，Kelleher，K.，Huebmer，K.，Wasmuth，.J.J.and Wolf，S.F.，

  TITLE        Assignment of genes encoding a unique cytokine (IL12)composed of

              two unrelated subunets to chromosomes3 and 5

 JOURNAL      Genomics 14(1，59-62(1992)

  PUBMED      1358798

REFERENCE   9   (bases 1 to 2347)

 AUTHORS    Gubler，U.，Chua，A.O.，Schoenhaut，D.S.，Dwyer，C.M.，McComas，W.，

            Motyka，R.，Nabavi，N.，Wolitzky，A.G.，Quinn，P.M.，Familletti，P.C.et

            al.

 TITLE        Coexpression of two distinct genes is required to generate secreted

            bioactive cytotoxic lymphocyte maturation factor

 JOURNAL        Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88(10)，4143-4147(1991)

  PUBMED         1674604

REFERENCE        10(bases1to2347)

AUTHORS          Wolf，S.F.，Temple，P.A.，Kobayashi，M.，Young，D.，Dicig，M.，Lowe，L.，

             Dzialo，R.，Fitz，L.，Ferenz，C.，Hewick，R.M.et al.

TITLE            Cloning of cDNA for natural killer cell stimulatory factor，a

             heterodimeric cytokine with multiple biologic effects on T and

             natural killer cells

JOURNAL         J.Immunol.146(9)，3074-3081(1991)

PUBMED           1673147

COMMENT           REVIEWED REFSEQ：This record has been curated by NCBI staff.

The

              reference sequence was derived from M65290.1and M65272.1.

              On Nov3，2002this sequence version replaced gi：4504640.

              Summary：This gene encodes a subunit of interleukin12，a cytokine

              that acts on T andnatural killer cells，and has a broad array of

              biological activities.Interleukin12is a disulfide-linked

              heterodimer composed ofthe40kD cytokine receptor like subunit

              encoded by this gene，and a35kD subunit encoded by IL12A.This

              cytokine is expressed by activated macrophages that serve as an

              essential inducer of Th1cells development.This cytokine has been

              found to be important for sustaining a sufficient number of

              memory/effector Th1cells to mediate long-term protection to an

              intracellular pathogen.Overexpression of this gene was observed in

              the central nervous system of patients with multiple sclerosis

              (MS)，suggesting a role of this cytokine inthe pathogenesis of the

              disease.The promoter polymorphism of this gene has been reported

              to be associated with the severityof atopic and non-atopic asthma

              in children.

              Publication Note：This RefSeq record includes a subset of the

              publications that are available for this gene.Please see the

              Entrez Gene record to access additional publications.

FEATURES                   Location/Qualifiers

   source           1..2347

                    /organism＝＂Homo sapiens＂

                    /mol_type＝＂mRNA＂

                    /db_xref＝＂taxon：9606＂

                    /chromosome＝＂5＂

                    /map＝＂5q31.1-q33.1＂

gene                1..2347

                   /gene＝＂IL12B＂

                   /note＝＂interleukin12B(natural killer cellstimulatory

                   factor2，cytotoxic lymphocyte maturationfactor2，p40)；

                   synonyms：CLMF，NKSF，CLMF2，NKSF2，IL-12B＂

                   /db_xref＝＂GeneID：3593＂

                   /db_xref＝＂HGNC：5970＂

                   /db_xref＝＂HPRD：01194＂

                   /db_xref＝＂MIM：161561＂

CDS                43..1029

                   /gene＝＂IL12B＂

                   /go_component＝＂extracellular space[pmid1673147]；

                   membrane＂

                   /go_function＝＂cytokine activity；

                   hematopoietin/interferon-class(D200-domain)cytokine

                   receptor activity；interleukin-12receptor binding[pmid

                   1674604]；signal transducer activity[pmid9789052]＂

                   /go_process＝＂antimicrobialhumoral response(sensu

                   Vertebrata)[pmid10320373]；interferon-gamma biosynthesis

                   [pmid1673147]；naturalkiller cellactivation[pmid

                   1673147]；positive regulation of activated T cell

                   proliferation[pmid1674604]；positive regulation of

                   interferon-gamma biosynthesis[pmid1673147]；regulation

                   of cytokine biosynthesis[pmid1673147]；T-helper cell

                   differentiation[pmid1673147]＂

                   /note＝＂natural killcr cell stimulatory factor-2；cytotoxic

                   lymphocyte maturation factor2，p40；interleukin12，p40；

                   natural killer cell stimulatory factor，40kD subunit；

                   interleukin-12beta chain；IL12，subunit p40＂

                   /codon_start＝1

                   /product＝＂interleukin12B precursor＂

                   /protein_id＝＂NP_002178.2＂

                   /db_xref＝＂GI：24497438＂

                   /db_xref＝＂CCDS：CCDS4346.1＂

                   /db_xref＝＂GeneID：3593＂

                   /db_xref＝＂HGNC：5970＂

                   /db_xref＝＂HPRD：01194＂

                   /db_xref＝＂MIM：161561＂

/translation＝＂MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEM

VVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSH

SLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLT

FSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIE

VMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWST

PHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSW

SEWASVPCS＂

    sig_peptide      43..108

                       /gene＝＂IL12B＂

  mat_peptide          109..1026

                       /gene＝＂IL12B＂

                       /product＝＂interleukin12B＂

  STS                  317..471

                       /gene＝＂IL12B＂

                       /standard_name＝＂PMC321570P1＂

                       /db_xref＝＂UniSTS：273112＂

  STS                  1053..1272

                       /gene＝＂IL12B＂

                       /standard_name＝＂SGC35786＂

                       /db_xref＝＂UniSTS：51991＂

  STS                  2015..2195

                       /gene＝＂IL12B＂

                       /standard_name＝＂RH17728＂

                       /db_xref＝＂UniSTS：24645＂

  STS                  2116..2324

                       /gene＝＂IL12B＂

                       /standard_name＝＂G10637＂

                       /db_xref＝＂UniSTS：60436＂

ORIGIN

             1    ctgtttcagg gccattggac tctccgtcct gcccagagca agatgtgtca ccagcagttg

             61   gtcatctctt ggttttccct ggtttttctg gcatctcccc tcgtggccat atgggaactg

             121  aagaaagatg tttatgtcgtagaattggat tggtatccgg atgcccctgg agaaatggtg

             181  gtcctcacct gtgacacccc tgaagaagat ggtatcacct ggaccttgga ccagagcagt

             241  gaggtcttag gctctggcaa aaccctgacc atccaagtca aagagtttgg agatgctggc

             301  cagtacacct gtcacaaagg aggcgaggtt ctaagccatt cgctcctgct gcttcacaaa

             361  aaggaagatg gaatttggtc cactgatatt ttaaaggacc agaaagaacc caaaaataag

             421  acctttctaa gatgcgaggc caagaattat tctggacgtt tcacctgctg gtggctgacg

             481  acaatcagta ctgatttgac attcagtgtc aaaagcagca gaggctcttc tgacccccaa

             541  ggggtgacgt gcggagctgc tacactctct gcagagagag tcagagggga caacaaggag

             601  tatgagtact cagtggagtg ccaggaggac agtgcctgcc cagctgctga ggagagtctg

             661  cccattgagg tcatggtgga tgccgttcac aagctcaagt atgaaaacta caccagcagc

             721  ttcttcatca gggacatcat caaacctgac ccacccaaga acttgcagct gaagccatta

             781  aagaattctc ggcaggtgga ggtcagctgg gagtaccctg acacctggag tactccacat

             841  tcctacttct ccctgacatt ctgcgttcag gtccagggca agagcaagag agaaaagaaa

             901  gatagagtct tcacggacaa gacctcagcc acggtcatct gccgcaaaaa tgccagcatt

             961  agcgtgcggg cccaggaccg ctactatagc tcatcttgga gcgaatgggc atctgtgccc

             1021 tgcagttagg ttctgatcca ggatgaaaat ttggaggaaa agtggaagat attaagcaaa

             1081 atgtttaaag acacaacgga atagacccaa aaagataatt tctatctgat ttgctttaaa

             1141 acgttttttt aggatcacaa tgatatcttt gctgtatttg tatagttaga tgctaaatgc

             1201 tcattgaaac aatcagctaa tttatgtata gattttccag ctctcaagtt gccatgggcc

             1261 ttcatgctat ttaaatattt aagtaattta tgtatttatt agtatattac tgttatttaa

             1321 cgtttgtctg ccaggatgta tggaatgttt catactctta tgacctgatc catcaggatc

             1381 agtccctatt atgcaaaatg tgaatttaat tttatttgta ctgacaactt ttcaagcaag

             1441 gctgcaagta catcagtttt atgacaatca ggaagaatgc agtgttctga taccagtgcc

  1501  atcatacact tgtgatggat gggaacgcaa gagatactta catggaaacc tgacaatgca

  1561  aacctgttga gaagatccag gagaacaaga tgctagttcc catgtctgtg aagacttcct

  1621  ggagatggtg ttgataaagc aatttagggc cacttacact tctaagcaag tttaatcttt

  1681  ggatgcctga attttaaaag ggctagaaaa aaatgattga ccagcctggg aaacataaca

  1741  agaccccgtc tctacaaaaa aaatttaaaa ttagccaggc gtggtggctc atgcttgtgg

  1801  tcccagctgt tcaggaggat gaggcaggag gatctcttga gcccaggagg tcaaggctat

  1861  ggtgagccgt gattgtgcca ctgcatacca gcctaggtga cagaatgaga ccctgtctca

  1921  aaaaaaaaaa tgattgaaat taaaattcag ctttagcttc catggcagtc ctcaccccca

  1981  cctctctaaa agacacagga ggatgacaca gaaacaccgt aagtgtctgg aaggcaaaaa

  2041  gatcttaaga ttcaagagag aggacaagta gttatggcta aggacatgaa attgtcagaa

  2101  tggcaggtgg cttcttaaca gccctgtgag aagcagacag atgcaaagaa aatctggaat

  2161  ccctttctca ttagcatgaa tgaacctgat acacaattat gaccagaaaa tatggctcca

  2221  tgaaggtgct acttttaagt aatgtatgtg cgctctgtaa agtgattaca tttgtttcct

  2281  gtttgtttat ttatttattt atttttgcat tctgaggctg aactaataaa aactcttctt

  2341  tgtaatc

//

Claims (4)

1.一种rhIL-12的表达载体，其特征在于：

(1)该表达载体包含人IL-12的两个p35亚基和一个p40亚基的转录本；

(2)p35亚基、p40亚基分别由各自的启动子CMV控制；(3)p35亚基的启动子之前设计了SV40的增强子元件，在启动子与p35亚基序列之间又引入了Intron元件；其方法是：用RNeasy提取试剂盒提取人细胞的总RNA，并作为逆转录PCR的模板，分别进行一步法RT-PCR扩增，得到长度为684bp的p35基因产物以及长度1002bp的p40基因产物；

(4)p40亚基和抗性筛选标记neo基因之间引入调控neo基因表达的IRES元件，其方法是：用携带Neo抗性筛选标记的载体pIRESneo，将p40基因的PCR产物以BamHI单酶切后克隆插入pIRESneo载体中，筛选获得正向插入的重组质粒并命名为pP40IRESneo；

(5)两个p35亚基表达单元串联在同一个载体中，其方法是：1)载体pDouble携带双表达盒，将p35基因的PCR产物以SalI单酶切后克隆插入pDouble载体中，筛选获得正向插入的重组质粒并命名为pDouble-P35；2)以NruI+XhoI双酶切载体pP40IRESneo，将携带整个P40-IRES-Neo的表达盒转移入KpnI单酶切并补平后的pDouble-P35载体中，获得的重组质粒命名为pP75；

(6)两个p35亚基串联于p40亚基之前；其方法是：1)以NruI+KpnI双酶切载体pDouble-P35，回收P35亚基表达盒3285bp，并通过T4 DNA聚合酶进行补平；2)以NruI单酶切载体pP75，以CIP酶进行去磷酸化9416bp；3)连接1与2，转化大肠杆菌后筛选出阳性克隆p2P35-1P40；

所述的表达载体为重组质粒重组质粒p2P35-1P40；

其中：p35亚基扩增引物及p40亚基扩增引物引物序列为：

P35正向引物序列为：下划线表示SalI酶切位点：

5’-TGGGTCGACGCCACCATGTGTCCAGCGCGCAGCCTC-3’

P35反向引物序列为：下划线表示SalI酶切位点：

5’-TGGGTCGACTCAGGAAGCATTCAGATAGC-3’

P40正向引物序列为：下划线表示BamHI酶切位点：

5’-CGGGATCCATGTGTCACCAGCAGTTG-3’

P35反向引物序列为：下划线表示BamHI酶切位点：

5’-CGGGATCCTAACTGCAGGGCACAGATG-3’。

2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于：载体的表达单元结构为CMV启动子-p35亚基-CMV启动子-p35亚基-CMV启动子-p40亚基。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于：载体的表达单元结构为如下核酸序列：SV40 Enhancer-pCMV-Intron-p35-SV40Enhancer-pCMV-Intron-p35-pCMV-p40-IRES-neo。

4.一种高效表达人IL-12真核细胞株，其特征在于：是在CHO哺乳动物细胞系中制备出来的，所述细胞含有权利要求1所述的表达载体，或者所述细胞已用权利要求3所述的核酸序列转染。

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