CN103143032A - 一种用于治疗乙肝的重组质粒疫苗及其组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组质粒DNA疫苗，本发明重组质粒DNA疫苗同时携带乙肝表面抗原蛋白编码基因和乙肝核心抗原蛋白编码基因，在所构建的重组质粒DNA疫苗上包括两个目的蛋白表达盒，其中一个为优化的目的蛋白表达盒，两个基因之间彼此通过一个目的蛋白表达盒隔开，本发明还涉及一种双质粒DNA疫苗，该双质粒DNA疫苗包括本发明所述重组质粒DNA疫苗和重组白介素12佐剂质粒。本发明构建的重组质粒DNA疫苗和及其组合物可用于制备具有预防和治疗乙型肝炎的药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗乙肝疾病的重组质粒DNA疫苗及其组合物，属于生物医学领域。
背景技术
乙型肝炎严重危害人类健康，目前尚无特效治疗手段，乙肝慢性化的主要原因是乙肝病毒（HBV）感染后机体缺乏持久的特异性细胞免疫及体液免疫。
HBV外壳蛋白是有大蛋白LS（S1S2S抗原，由前S1-前S2-S基因编码）、中蛋白MS（S2S抗原，由前S2-S基因编码）、小蛋白S（S抗原，由S基因编码）三种分子构成，其中，前S2抗原分子量小，抗原性强，涉及乙肝病毒对宿主细胞的吸附，因而含前S2抗原的疫苗对于接种者的保护作用应更为有效。
HBcAg是由乙型肝炎病毒基因C区基因编码，从第2个ATG起始翻译，含183-185个氨基酸多肽，分子量约为21KD，其C端富含精氨酸和多种蛋白酶作用位点，有结合RNA的能力，并与其组装成乙肝核心颗粒密切相关。HBcAg颗粒由多个核心蛋白亚基构成，呈正二十面体对称的颗粒样结构，单个核心蛋白亚基（包括183-185个氨基酸多肽链）先形成同型二聚体（Homodimer），二聚体再进一步聚集而形成HBcAg颗粒。
重组质粒DNA疫苗是把外源基因克隆到真核表达载体上，然后将重组质粒直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。与传统的疫苗相比，重组质粒DNA疫苗不仅能有效诱导体液免疫，还能诱导细胞免疫，可兼做预防和治疗性疫苗，DNA质粒疫苗已经在许多疾病的治疗和预防方面显示出广泛的应用前景。
Mancini（Mancini M,Hadchouel M,Davis HL,et al.DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigen chronic carrier state.Pro Natl Acad Sci USA.1996,93:12496-12501）等应用编码preS2/SHBV包膜蛋白的重组质粒免疫HBV转基因小鼠，经过一次肌肉注射就能清除转基因小鼠循环中的HBsAg，并且能够长期抑制肝细胞中的病毒复制，证实了DNA疫苗在治疗慢性乙肝携带者的潜在优势。Mancini-Bourgine M等（Mancini-Bourgine M,Fontaine H,Scott-Algara D,et al.Induction or expansion of T-cell responsese by a hepatitis B DanA vaccine administered to chronic HBV carriers.Hepatology.2004,40:874-882）应用编码preS2/S HBV包膜蛋白的重组质粒免疫10例慢性乙肝携带者，这10例携带者未接受过任何的抗病毒治疗。结果发现，疫苗能够很好地耐受，有2例携带者的PBMC发生抗原特异性的T淋巴细胞增殖反应，并且HBV特异性分泌IFN-γ的T细胞数目在免疫后有较大幅度的提高，有5例携带者的血清HBV DNA水平下降，但是这种下降仅仅是暂时性的。此次研究也证实了HBV DNA疫苗的安全性以及能够在部分慢性乙肝携带者体内诱导出特异的T细胞免疫应答。
HBcAg作为优势抗原，在乙肝疫苗的研究中也得到了广泛应用，Veremeiko TA等（Veremeiko TA,Lebedev LR,Chikaev NA,et al.Humoral immune response of Balb/c mice immunized with chimer HBcAg proteins carrying the epitopes of surface hepatic B virus protein.Vopr virusol,2007,52:40-45）把HBV外壳蛋白表位插入到HBcAg，成功构建了HBcAg-HBsAg融合蛋白，并以此融合蛋白免疫Balb/cxiaoshi，产生了高滴度的针对插入表位HBsAg和载体蛋白HBcAg抗体。张炜等（张炜，懂生福，孙淑惠，等.乙肝病毒核心抗原DNA疫苗诱导小鼠抗原特异性CD8+T细胞动态变化和动态分布.中国免疫学杂志.2004,20(6):379-383）研究了重组HBcAg真核表达质粒pHBc144对C57BL/6小鼠的免疫作用，结果发 现，pHBc144面以后抗原特异性CD8+T细胞逐渐增多，在初次免疫的第14天出现第一个免疫应答高峰，此后抗原特异性CD8+T细胞数量组建下降进入免疫记忆期并在1年内维持在稳定水平。
胸腺肽、GSF、IL-2、IL-4、IL-12或IFN-γ等为常作为免疫佐剂或增强剂，其中将胸腺肽、GSF、IL-2或IFN-γ作为佐剂与HBV疫苗联合使用已有研究。IL-12具有多种生物活性，是最强的N K细胞激活因子，可促进CD4+Th0细胞分化为Th1细胞，可协调亚适剂量IL-2诱导LAK(activated killer cells)细胞活性。作为重要的免疫调节分子，IL-12是迄今所知诱导Th1型免疫应答的最主要的细胞因子,原体如细菌、寄生虫、真菌和病毒感染所致疾病及肿瘤的DNA疫苗的研究。
中国专利CN1316518A公开了一种重组真核表达质粒pS2S，质粒中含有细胞击落刺激因子，并将重组疫苗质粒与含IL-2和IFN-γ的重做佐剂质粒联合使用，发现发现重组佐剂质粒可以提高重组疫苗质粒的免疫和治疗作用。目前该项目已进入临床研究阶段。
将乙肝表面抗原与乙肝核心抗原联合构建重组疫苗质粒时，现阶段通常是利用HBcAg能装配成直径为27nm的颗粒状结构的特点，直接以HBcAg作为表达载体将乙肝病毒表面抗原融合到HBcAg，构建得到融合蛋白疫苗，或者扩增HBV的S和C基因并拼接成SC融合片段，将融合片段插入真核表达载体中构建融合表达HBsAg/HBcAg的重组DNA质粒。但这种方式构建得到的重组DNA质粒，在获得其中一种抗体滴度时，另一种抗原所产生的抗体滴度很弱，下降明显。
虽然DNA疫苗的初步临床试验结果令人满意，但其免疫效果还未达到理想水平，因此如何增强免疫效果已成为DNA疫苗研究的关键，尤其是在如何保证 如何使DNA疫苗可同时获得较强的HBsAg和HBcAg的免疫效果方面。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于治疗乙型肝炎的经优化的重组质粒DNA疫苗，所述的重组质粒DNA疫苗同时携带乙肝表面抗原蛋白编码基因和乙肝核心抗原蛋白编码基因。
本发明中，所述的重组质粒DNA疫苗中的乙肝表面抗原蛋白编码基因和乙肝核心抗原蛋白编码基因不是通过直接连接而形成融合蛋白编码基因的形式，而是通过优化质粒，在重组质粒上设计两个目的蛋白表达盒，两编码基因彼此隔开。
本发明中，HBV便面抗原蛋白编码基因可以是S1S2S蛋白编码基因、S2S蛋白白编码基因或S蛋白编码基因，优选乙肝病毒包膜中蛋白S2S蛋白编码基因就，所述的乙肝核心抗原蛋白编码基因为编码乙肝病毒核心Core蛋白的编码基因。
本发明中，所述的乙肝病毒S2S蛋白编码基因，其核苷酸序列与Seq ID No.5具有至少70%的同源性，优选至少80%的同源性，更优选为至少90%的同源性，最优选为与天然的乙肝病毒中蛋白S2S编码基因核苷酸序列完全相同。
本发明中，所述的乙肝病毒Core蛋白编码基因，其核苷酸序列与Seq IDNo.11具有至少70%的同源性，优选至少80%的同源性，更优选为至少90%的同源性，最优选为与天然的乙肝病毒核心Core蛋白编码基因核苷酸序列完全相同。
本发明中，构建的重组质粒DNA疫苗还包括大肠杆菌复制起始点ColE1、卡那抗性基因序列Kan及两个目的蛋白表达盒；其中处于上游位置的表达盒为优化目的蛋白表达盒，其包括来源于SV40的增强子元件Enhancer、转录调控元 件内含子Intron1和外显子Exon1、来源于HBV的转录后调节元件HPRE。
本发明中，构建的重组质粒DNA疫苗可以是优化表达HBV包膜中蛋白S2S的同时表达乙肝核心Core蛋白（C）的重组疫苗质粒pS2S-C，所述的重组疫苗质粒pS2S-C具有如Seq ID No.1所示的核苷酸序列；或者是优化表达乙肝核心Core蛋白的同时表达乙肝包膜中蛋白的S2S的重组疫苗质粒pC-S2S，所述的重组疫苗质粒pC-S2S具有如Seq ID No.2所示的核苷酸序列。
本发明中，核心Core蛋白可以是天然的全长核心Core蛋白，也可以是截短后的核心Core蛋白，其截短后的Core蛋白含N末端的144aa，优选为全长的核心Core蛋白。
本发明的再一目的在于提供一种含有本发明所述的重组质粒DNA疫苗的组合物，所述的组合物除含有本发明所述重组质粒DNA疫苗外，还可以含有一些其它治疗或者具有辅助治疗性的药物，如核苷类治疗乙肝的药物，细胞因子，提高免疫作用的中药成分等。
本发明的再一目的在于提供通过基因重组技术而构建的一种用于治疗乙肝的双质粒DNA疫苗组合物，本发明所述的双质粒DNA疫苗组合物，包括HBVDNA重组疫苗质粒和白介素-12重组佐剂质粒pIL12。
本发明中，提供的双质粒DNA疫苗组合物，其中所构建的重组疫苗质粒为携带HBV中蛋白S2S编码基因和核心Core（C）蛋白编码基因的重组疫苗质粒，在所述的重组疫苗质粒中，抗原的表达先后顺序可以是先表达HBV中蛋白S2S后表达HBV核心Core蛋白，即构建的重组质粒为pS2S-C（质粒结构示意图见图1），具有如Seq ID No.1所示的核苷酸序列；也可以是先表达HBV核心Core蛋白后表达HBV中蛋白S2S，即构建的重组质粒为pC-S2S（质粒结构示意图见图2），具有如Seq ID No.2所示的核苷酸序列。
本发明中，所述的重组白介素12佐剂质粒（pIL12），其中白介素12可以是来源于鼠的白介素12，所述的鼠白介素12可以是大鼠、小鼠或其它鼠的白介素12，所构建重组佐剂质粒pmIL12（具有如Seq ID No.4所示的核苷酸序列）；也可以是来源于人的白介素12，构建重组佐剂质粒phIL12（具有如Seq ID No.3所示的核苷酸序列）。
本发明中，所述重组白介素12佐剂质粒还还包括大肠杆菌复制起始点ColE1、卡那抗性基因序列Kan及两个目的蛋白表达盒，以及来源于SV40的增强子元件Enhancer、免疫调节序列CpG等元件。
本发明中，所述的重组疫苗质粒和重组佐剂质粒还可携带有多克隆位点区MCS，所述的多克隆位点区包括SwaI、KpnI、SaII、EcoRV、BgIII等酶切位点。
本发明的目的还在于提供一种双质粒DNA疫苗组合物的构建方法。
1、重组质粒HBV DNA疫苗质粒pS2S-C（pRec2.0-preS2S-C）
(1)先构建重组质粒载体骨架pOE-EKS：
以pDRVISV1.0为模板，以Primer1与Primer2为引物，其中引物2为5’末端磷酸化的引物，扩增获得大小为748bp的复制子区域（Ori），同时引入EcoRI、KpnI及SwaI酶切位点；
Primer1:5’-GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAGC-3’
Primer2:5’-CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAGG-3’
以pDRVISV1.0为模板，以Primer3与Primer4为引物，其中引物3为5’末端磷酸化的引物，扩增获得大小为1056bp的卡那抗性标记基因（Kan），同时引入EcoRI酶切位点；
Primer3:5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCTC-3’
Primer4:5’-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTCT-3’
将上述两个片段分别以EcoRI进行单酶切，连接后构建重组克隆pOK-EKS;
(2)构建重组质粒DNA疫苗pRec2.0-PreS2.S
将合成基因PreS2S通过XhoI+XbaI双酶切与SalI+XbaI双酶切的载体pHPRE连接，构建获得重组克隆pHPRE-PreS2S；
所用的合成基因PreS2S委托北京雷默生物科技有限公司合成，其核苷酸序列为具有Seq ID No.5所示的核苷酸序列：
以pDRVISV1.0为模板，以Primer5与Primer6为引物，扩增获得大小为271bp的BGHpolyA区，同时在上游引入BamHI酶切位点，下游引入BglII-EcoRV-SalI-KpnI酶切位点；通过BamHI+KpnI双酶切后克隆入BglII+KpnI双酶切的pHPRE-PreS2S载体中，获得重组质粒pHPRE’-PreS2S；
Primer5:5’-CGGGATCCgctgtgccttctagttgccag-3’
Primer6:5’-GGGGTACCGTCGACAACGTTGATATCAACGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATCC-3’
通过EcoRI+KpnI将重组质粒pHPRE’-PreS2S的PreS2S表达盒克隆入载体pOK-EKS中，构建重组质粒pRec2.0-PreS2S。
(3)构建重组质粒pRec2.0-C
将合成基因CPreS1通过XhoI+XbaI双酶切与SalI+XbaI双酶切的载体pHPRE连接，构建获得重组克隆pHPRE-CPreS1;
合成基因CPreS1的核苷酸序列为Seq ID No.6所示的核苷酸序列。
以pDRVISV1.0为模板，以Primer5与Primer6为引物，扩增获得大小为271bp的BGHpolyA区，同时在上游引入BamHI酶切位点，下游引入BglII-EcoRV-SalI-KpnI酶切位点；通过BamHI+KpnI双酶切后克隆入BglII+KpnI双酶切的pHPRE-CPreS1载体中，获得重组质粒pHPRE’-CPreS1;
通过EcoRI+KpnI将重组质粒pHPRE’-CPreS1的CPreS1表达盒克隆入载体 pOK-EKS中，构建重组质粒pRec2.0-CPreS1;
以pRec2.0-CPreS1为模板，以Primer7与Primer8为引物，扩增获得大小为596bp的Core基因（C），并通过PstI+XbaI双酶切后克隆入PstI+XbaI双酶切的pRec2.0-CPreS1载体中，获得重组质粒pRec2.0-C。
Primer7:5’-gtcttttctgcagtcaccgtcgTCGAG-3’
Primer8:5’-GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3’
（4）构建重组质粒pRec2.0-PreS2S-C（pS2S-C）
以pRec2.0-C为模板，以Primer9与Primer8为引物，扩增获得大小为579bp的Core基因（C），通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得pcDNA3.1-C；
Primer9:5’-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGATATTG-3’
Primer8:5’-GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3’
通过BglII+PvuII双酶切从质粒pcDNA3.1-C上切出C表达盒，克隆入BglII+EcoRV双酶切的pRec2.0-PreS2S中，构建获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-C。
2重组HBV DNA疫苗质粒pC-S2S（即pRec2.0-C-preS2S）
以上述步骤（2）中构建得到的pRec2.0-PreS2S为模板，以Primer11与Primer12为引物，扩增获得大小为873bp的PreS2S基因，通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得pcDNA3.1-PreS2S；
Primer11:5’-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGCAGTGGAACTC-3’
Primer12:5’-GCTCTAGAATCAGATGTAAACCCAC-3’
通过BglII+PvuII双酶切从质粒pcDNA3.1-PreS2S上切出PreS2S表达盒，克隆入BglII+EcoRV双酶切的pRec2.0-C中，构建获得重组质粒 pRec2.0-C-PreS2S（pC-S2S）。
3重组佐剂质粒pmIL12的构建
(1)将合成基因mP35（具有Seq ID No.7所示的核苷酸序列）通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得重组质粒pcDNA3.1-mP35；
(2)通过BglII+PvuII双酶切从质粒pcDNA3.1-mP35中切出mP35基因表达盒，克隆入BglII+EcoRV双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S中，获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-mP35；
(3)将合成基因mP40（具有Seq ID No.8所示的核苷酸序列）通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得重组质粒pcDNA3.1-mP40；
(4)通过SalI+PvuII双酶切出mP40基因表达盒，克隆入SalI+SwaI双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S-mP35中，获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-mIL12；
(5)通过NdeI酶切质粒pRec2.0-PreS2S-mIL12，共切出3个条带（1870bp+3448bp+3855bp），回收1870bp片段及3855bp片段，将回收的3855bp片段进行CIP去磷酸化后，与1870bp片段进行连接，筛选正向克隆的重组质粒pmIL12。
4重组佐剂质粒phIL12的构建
(1)将合成基因hP35（具有Seq ID No.9所示的核苷酸序列）通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得重组质粒pcDNA3.1-hP35；
(2)通过BglII+PvuII双酶切从质粒pcDNA3.1-hP35中切出hP35基因表达盒，克隆入BglII+EcoRV双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S中，获得重组质粒 pRec2.0-PreS2S-hP35；
(3)将合成基因hP40（具有Seq ID No.10所示的核苷酸序列）通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得重组质粒pcDNA3.1-hP40；
(4)通过SalI+PvuII双酶切出hP40基因表达盒，克隆入SalI+SwaI双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S-hP35中，获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-hIL12；
(5)通过NdeI酶切质粒pRec2.0-PreS2S-hIL12，共切出3个条带（1882bp+3446bp+3812bp），回收1882bp片段及3812bp片段，将回收的3812bp片段进行CIP去磷酸化后，与1882bp片段进行连接，筛选正向克隆的重组质粒phIL12。
本发明的再一目的在于提供一种疫苗的制备方法，各质粒（pS2S-C、pC-S2S和pIL12）的制备方法相同，但分开生产，将重组质粒pS2S-C、pC-S2S、pmIL12、phIL12分别转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，含重组质粒的阳性单克隆经发酵培养、扩增，再经裂解和柱纯化后得到提纯的重组质粒，具体可以为：
发酵：在-70℃中取出含有质粒的大肠杆菌DH5α，用接种环沾取少量菌液，于平皿上挑取单克隆置于5-10ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养10-12h，以1：1000的比例将培养液加入2.5L含相应抗生素的LB培养基，37℃、200rpm培养12-16h后，将培养物进行离心处理，收集菌体，即得含质粒的发酵培养物。
裂解：将菌体加Buffer液，轻柔的颠倒离心管数次，室温放置，使其裂解充分。
柱层析：裂解后的菌体通过DNA制备柱，洗脱分离，收集质粒并用有机溶剂沉淀，用生理盐水溶解质粒DNA即得。
为了能够更加便捷高效地表达本发明所述的重组疫苗质粒和重组佐剂质粒，本发明还构建了含有本发明所述重组质粒的大肠杆菌，应用本发明所述的重组大肠杆菌，可以更为快捷地制备本发明中的各个质粒。
大肠杆菌菌株DH5α/pmIL12，含有重组佐剂质粒pmIL12，通过事先构建重组质粒pmIL12，转化大肠杆菌DH5α菌株后在含卡那抗性的LB平皿中筛选获得，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏日期：2010年04月13日，建议的分类名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号为：CGMCCNo.3726。
大肠杆菌菌株DH5α/phIL12，含有重组佐剂质粒phIL12，通过事先构建重组质粒phIL12，转化大肠杆菌DH5α菌株后在含卡那抗性的LB平皿中筛选获得，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏日期：2010年04月13日，建议的分类名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号为：CGMCC No.3727。
大肠杆菌菌株DH5α/pRec2.0-S2S-C，含有重组佐剂质粒pS2S-C，通过事先构建重组质粒pS2S-C，转化大肠杆菌DH5α菌株后在含卡那抗性的LB平皿中筛选获得，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏日期：2010年04月13日，建议的分类名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号为：CGMCCNo.3728。
大肠杆菌菌株DH5α/pRec2.0-C-S2S，含有重组佐剂质粒pC-S2S，通过事先构建重组质粒pC-S2S，转化大肠杆菌DH5α菌株后在含卡那抗性的LB平皿中筛选获得，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心（地址：北京 市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏日期：2010年04月13日，建议的分类名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号为：CGMCCNo.3729。
本发明的再一目的还在于提供本发明所述的重组质粒DNA疫苗和双质粒DNA疫苗在制备具有预防和治疗乙型病毒性肝炎药物中的应用。
本发明的还一目的在于提供一种本发明所述重组质粒DNA疫苗或双质粒疫苗在预防和治疗乙型肝炎时的免疫给药方式，其给药方式可以是皮下注射、肌肉注射或借助电穿孔方式，优选给药方式为借助电穿孔方式给药进行免疫或治疗。
本发明用于治疗乙肝的双质粒DNA疫苗的体外鉴定采用体外转染293-T和COS-7细胞，检测到目的蛋白（HBsAg、HBcAg、IL12）的高水平表达。双质粒DNA疫苗能诱导机体产生高水平的乙肝表面抗体（HBsAb）及核心抗体（HBcAb）水平和特异性的细胞免疫反应。
本发明更值得注意的是，借助于电穿孔技术进行面以后，乙肝双质粒DNA疫苗能够诱导出显著提高的免疫效果。
附图说明
图1为重组佐剂质粒phIL12的结构示意图。
图2为重组佐剂质粒pmIL12的结构示意图。
图3为重组佐剂质粒pmIL12酶切电泳图谱，其中：
泳道1为经PstI单酶切后，切出的三条普带，大小为280bp、2100bp、3300bp，其中280bp大小普带模糊，其余两条完全正确；
泳道2为经NdeI单酶切后切出的2条普带，大小分别为1900bp、3800bp，两条带完全正确；
泳道3为经EcoRI+BglII双酶切后切出的两条普带，大小分别为1700bp、4000bp，两条带完全正确；
泳道4、5分别为DL15000、DL2000marker；
泳道6为经EcoRI单切后的线性片段，大小约为5700bp；
泳道7为未进行酶切的重组佐剂质粒pmIL12。
图4为重组佐剂质粒phIL12酶切电泳图谱，其中：
泳道1、2分别为DL2000、DL15000marker。
泳道3为经HindIII单酶切后，切出的三条普带，大小分别为1496bp、1882bp、2343bp，现实完全正确；
泳道4为经EcoRI+BglII双酶切后，切出的两条普带，大小分别为1752、3942bp，两条带现实完全正确；
泳道5为经EcoRI单酶切后的线性片段，大小约为5700bp；
泳道6为未进行酶切的重组佐剂质粒phIL12。
具体实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
所用试剂及材料：大肠杆菌DH5α购自Invitrogen公司；携带转录后调节元件（HPRE）的DNA疫苗质粒pInH、质粒pDRVISV1.0由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室惠赠（该质粒的构建过程及详细资料已 在中国专利CN1560259A中完全公开）；真核表达质粒pcDNA3.1购自Invitrogen公司；真核表达载体pHPRE由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室构建；携带内部核糖体进入位点（IRES）的双顺反子表达质粒pIRESneo购自Clontech公司；293T、COS-7细胞购自于ATCC；小鼠脾细胞以1640完全培养基培养（10%胎牛血清，Invitrogen公司）；各种限制性内切酶、pfu聚合酶、DNA连接试剂Sol I均购自NEB公司；质粒抽提纯化试剂盒购自TIANGEN公司；乙肝表面抗原及表面抗体定量ELISA检测试剂盒（化学发光法）购自北京源德生物科技有限公司。小鼠IFN-γ的ELISPOT检测试剂盒购自BD公司。抗原刺激肽由北京赛百盛生物技术有限公司合成。基因合成及基因测序工作委托北京英峻生物科技有限公司进行。
实施例1重组质粒pRec2.0-preS2S-C（简写为pS2S-C）的构建
(1)先构建重组质粒载体骨架pOE-EKS，其核苷酸序列为Seq No.1所标示的核苷酸序列：
以pDRVISV1.0为模板，以Primer1与Primer2为引物，其中引物2为5’末端磷酸化的引物，扩增获得大小为748bp的复制子区域（Ori），同时引入EcoRI、KpnI及SwaI酶切位点；
Primer1:5’-GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAGC-3’
Primer2:5’-CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAGG-3’
以pDRVISV1.0为模板，以Primer3与Primer4为引物，其中引物3为5’末端磷酸化的引物，扩增获得大小为1056bp的卡那抗性标记基因（Kan），同时引入EcoRI酶切位点；
Primer3:5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCTC-3’
Primer4:5’-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTCT-3’
将上述两个片段分别以EcoRI进行单酶切，连接后构建重组克隆pOK-EKS;
(2)构建重组质粒DNA疫苗pRec2.0-PreS2.S
将合成基因PreS2S通过XhoI+XbaI双酶切与SalI+XbaI双酶切的载体pHPRE连接，构建获得重组克隆pHPRE-PreS2S；
以pDRVISV1.0为模板，以Primer5与Primer6为引物，扩增获得大小为271bp的BGHpolyA区，同时在上游引入BamHI酶切位点，下游引入BglII-EcoRV-SalI-KpnI酶切位点；通过BamHI+KpnI双酶切后克隆入BglII+KpnI双酶切的pHPRE-PreS2S载体中，获得重组质粒pHPRE’-PreS2S；
Primer5:5’-CGGGATCCgctgtgccttctagttgccag-3’
Primer6:5’-GGGGTACCGTCGACAACGTTGATATCAACGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATCC-3’
通过EcoRI+KpnI将重组质粒pHPRE’-PreS2S的PreS2S表达盒克隆入载体pOK-EKS中，构建重组质粒pRec2.0-PreS2S，其核苷酸序列为Seq No.2所标示的核苷酸序列。
(3)构建重组质粒pRec2.0-C
将合成基因CPreS1通过XhoI+XbaI双酶切与SalI+XbaI双酶切的载体pHPRE连接，构建获得重组克隆pHPRE-CPreS1;
以pDRVISV1.0为模板，以Primer5与Primer6为引物，扩增获得大小为271bp的BGHpolyA区，同时在上游引入BamHI酶切位点，下游引入BglII-EcoRV-SalI-KpnI酶切位点；通过BamHI+KpnI双酶切后克隆入BglII+KpnI双酶切的pHPRE-CPreS1载体中，获得重组质粒pHPRE’-CPreS1;
通过EcoRI+KpnI将重组质粒pHPRE’-CPreS1的CPreS1表达盒克隆入载体pOK-EKS中，构建重组质粒pRec2.0-CPreS1;
以pRec2.0-CPreS1为模板，以Primer7与Primer8为引物，扩增获得大小为 596bp的Core基因（C），并通过PstI+XbaI双酶切后克隆入PstI+XbaI双酶切的pRec2.0-CPreS1载体中，获得重组质粒pRec2.0-C。
Primer7:5’-gtcttttctgcagtcaccgtcgTCGAG-3’
Primer8:5’-GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3’
（4）构建重组质粒pRec2.0-PreS2S-C
以pRec2.0-C为模板，以Primer9与Primer8为引物，扩增获得大小为579bp的Core基因（C），通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得pcDNA3.1-C；
Primer9:5’-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGATATTG-3’
Primer8:5’-GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3’
通过BglII+PvuII双酶切从质粒pcDNA3.1-C上切出Core表达盒，克隆入BglII+EcoRV双酶切的pRec2.0-preS2S中，构建获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-C。实施例2重组质粒pRec2.0-C-preS2S（pC-S2S）的构建
以实施例1中构建得到的pRec2.0-PreS2S为模板，以Primer11与Primer12为引物，扩增获得大小为873bp的PreS2S基因，通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得pcDNA3.1-PreS2S；
Primer11:5’-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGCAGTGGAACTC-3’
Primer12:5’-GCTCTAGAATCAGATGTAAACCCAC-3’
通过BglII+PvuII双酶切从质粒pcDNA3.1-PreS2S上切出PreS2S表达盒，克隆入BglII+EcoRV双酶切的pRec2.0-C中，构建获得重组质粒pRec2.0-C-PreS2S（pC-S2S）。
实施例3重组佐剂质粒pmIL12的构建
(1)将合成基因mP35通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载 体pcDNA3.1进行连接，构建获得重组质粒pcDNA3.1-mP35；
(2)通过BglII+PvuII双酶切从质粒pcDNA3.1-mP35中切出mP35基因表达盒，克隆入BglII+EcoRV双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S中，获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-mP35；
(3)将合成基因mP40通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得重组质粒pcDNA3.1-mP40；
(4)通过SalI+PvuII双酶切出mP40基因表达盒，克隆入SalI+SwaI双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S-mP35中，获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-mIL12；
(5)通过NdeI酶切质粒pRec2.0-PreS2S-mIL12，共切出3个条带（1870bp+3448bp+3855bp），回收1870bp片段及3855bp片段，将回收的3855bp片段进行CIP去磷酸化后，与1870bp片段进行连接，筛选正向克隆的重组质粒pRec2.0-mIL12（pmIL12）。
实施例4重组佐剂质粒phIL12的构建
(1)将合成基因hP35通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得重组质粒pcDNA3.1-hP35；
(2)通过BglII+PvuII双酶切从质粒pcDNA3.1-hP35中切出hP35基因表达盒，克隆入BglII+EcoRV双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S中，获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-hP35；
(3)将合成基因hP40通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得重组质粒pcDNA3.1-hP40；
(4)通过SalI+PvuII双酶切出hP40基因表达盒，克隆入SalI+SwaI双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S-hP35中，获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-hIL12；
(5)通过NdeI酶切质粒pRec2.0-PreS2S-hIL12，共切出3个条带 （1882bp+3446bp+3812bp），回收1882bp片段及3812bp片段，将回收的3812bp片段进行CIP去磷酸化后，与1882bp片段进行连接，筛选正向克隆的重组质粒pRec2.0-hIL12。
实施例5融合方式构建的重组质粒pcDNA3.1-SC与本发明设计的重组质粒pS2S-C或pC-S2S对小鼠血清特异性抗体的检测
重组质粒pcDNA3.1-SC的构建按文献方法（周陶友，赵连三，陈敏，等.融合表达HBsAg/HBcAg的重组质粒诱导的小鼠免疫应答）构建得到。
6-8周龄Balb/c雌性小鼠购自中国医学科学院动物繁殖中心，清洁级饲养，30只小鼠随机分为3组，每组10只，分别腓肠肌注射重组质粒pcDNA3.1-SC（100μg）、重组质粒pS2S-C（50μg）、重组质粒pC-S2S（50μg），于第2、4周后各加强接种1次，采集小鼠血清。
小鼠血清特异性抗体检测：分别于初次接种后第3、5、8、12周采集小鼠眶静脉血，血清分离后置-80℃保存，将小鼠血清标本按1:5、1:10、1:25、1:50、1:100、1:250、1:500稀释，采用乙肝病毒抗-HBs和-抗-HBc检测试剂盒（ELISA法），对上述标本进行统一检测。
小鼠血清特异性抗体检查结果抗-HBs：开始接种后3、5、8、12周，pcDNA3.1-SC组小鼠血清抗-HBs阳转率分别为60%、80%、100%和70%，血清抗-HBs滴度逐渐升高，在第8周达到峰值，而其抗-HBc值较低，仅部分小鼠可以检测出，但其阳转率均低于30%。而对于优化的重组质粒pS2S-C组，于开始接种3、5、8、12周后，其血清抗-HBs阳转率分别为70%、100%、100%和80%，抗体滴度在第5周即可达到峰值，与此同时，血清抗-HBc阳转率分别为30%、40%、70%和50%，抗体滴度在第三周可达到最高，与重组质粒pcDNA3.1-SC组相比，获得血清抗-HBc阳转率显著要优，差异具有显著性(P<0.01)；对于优 化的重组质粒pC-S2S，于开始接种3、5、8、12周后，其血清抗-HBs阳转率分别为0、20%、30%和10%，抗-HBs阳转率较低，均低于30%，但其对于的血清抗-HBc阳转率分别为80%、100%、100%和90%，血清抗-HBc的滴度明显要高于pcDNA3.1-SC组。
实施例6双质粒体外细胞瞬时转染后HBsAg、IL12目的蛋白的表达
按常规方法分别培养COS-7细胞株、293T细胞株于含10%新生小牛血清（FBS）的RPMI1640（DMEM）培养基中，转染前24h用胰蛋白酶消化帖壁细胞，重悬于含小牛血清RPMI1640培养液，按3×105细胞/孔转种于6孔培养板中，37℃、5%CO2培养，待帖壁细胞生长达90%融合度，取重组疫苗质粒pS2S-C、pCS2S，重组佐剂质粒pmIL12、phIL12，用Lipofectamine2000转染试剂进行细胞转染（方法见Lipofectamine2000protocol，Invitrogen公司），质粒用量为5μg/孔，37℃、5%CO2条件进行细胞培养，继续培养并于转染后48h收集上清，检测目的基因的表达量，HBsAg和IL12的定量测定按各自试剂盒的说明书进行，结果见表1和表2。
表1重组疫苗质粒体外转染COS-7、293T细胞后HBsAg、HBcAg的体外检测
表2重组疫苗质粒体外转染COS-7、293T细胞后IL12的体外检测
从表1和表2的结果可以看出，重组疫苗质粒pS2S-C和pC-S2S均能在COS-7、293-T细胞进行目的基因HBsAg的表达，检测HBsAg的表达量分别为 93.2、15.1和67.9、8.4ng/ml，；重组佐剂质粒pmIL12和phIL12也均能在COS-7、293-T细胞进行目的基因IL12的表达，检测IL12的表达量分别为358.7、564.1和336.9、381.3ng/ml。
实施例7双质粒疫苗的制备
疫苗质粒（pS2S-C、pC-S2S）和佐剂质粒（pmIL12、phIL12）的制备方法相同，各质粒分开生产，具体步骤如下：
1)于平皿上挑取单克隆置于5-10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养10-12h；
2)以1:1000的比例将培养液加入2.5L含相应抗生素的LB培养基中，37℃，200rpm培养12-16h；
3)于4℃，6000rpm离心15min，弃去上清，将沉淀重悬于500ml冰预冷的STE溶液中，4℃，6000rpm离心15min，弃去上清；
4)菌体沉淀重悬于125ml的Buffer P1中,振荡至无沉淀团块出现，加入125ml的Buffer P2，轻柔的颠倒离心管数次，室温下静置5min，待裂解充分后加入125ml的Buffer P3,颠倒离心管数次,充分混匀；
5)将混匀后的裂解产物倒入滤器(Mega-Giga Cartridge)中，室温下静置20min以上，打开真空泵加压抽滤，待液体抽滤完毕后，加入50ml的Buffer FWB2，用无菌玻璃棒轻轻搅动沉淀团块，继续进行抽滤；
6)在裂解液中加入30ml的Buffer ER，颠倒混匀，冰浴30min，待溶液澄清后加入预先用75ml的Buffer QBT平衡好的制备柱；
7)待裂解液完全通过DNA制备柱后，用600ml的Buffer QC洗脱杂质，待液体全部过柱后，以100ml的洗脱液Buffer QN洗脱DNA；
8)收集DNA洗脱液，加入70ml的异丙醇，充分混匀后，于12℃，10000rpm 离心50min；
9)小心倒去上清，用10ml70%乙醇洗涤沉淀，倒去乙醇洗液，离心管倒置在纸巾上自然干燥；
10)加入5ml-10ml的生理盐水溶解质粒DNA；
11)分光光度计测定所制备的质粒DNA的浓度，根据测定的质粒浓度相应的进行稀释，稀释为终浓度为1μg/μl(或0.4μg/μl，40ng/μl)，-20℃保存。
实施例8双质粒DNA疫苗对健康Balb/c小鼠的体液和细胞免疫
6-8周龄Balb/c雌性小鼠购自中国医学科学院动物繁殖中心，清洁级饲养。35只小鼠分为7个组，6个免疫组分别注射质粒疫苗pS2S-C+pRec2.0(50+50)μg（组II）、pS2S-C+pmIL12（50+50）μg（组III）、pS2S-C+phIL12(50+50)μg（组IV）、pC-S2S+pRec2.0(50+50)μg（组V）、pC-S2S+pmIL12(50+50)μg（组VI）、pC-S2S+phIL12(50+50)μg（组VII），和一个空白对照组（注射pRec2.0空载体50μg，组I），每只小鼠按各组剂量注射质粒DNA，体积为100μl，每只小鼠两后肢胫前肌各注射50μl。免疫程序为0、2、4周各免疫一次，第6周杀鼠取血清并分离淋巴细胞。
体液免疫检测、细胞免疫检测及ELISPOT检测方法同实施例8中的方法。结果见表2
表2不同疫苗质粒对正常BaLb/c小鼠HBsAg、HBcAg的免疫水平
与(pS2S-C+pRec2.0)组相比，*P<0.05，**P<0.01；与(pC-S2S+pRec2.0)组 相比，#P<0.05。
从上表结果可知，pRec2.0空载体接种正常小鼠后几乎无血清抗-HBs和血清抗-HBc浓度产生，其小鼠抗-HBs和抗-HBc阳性数为0。与之相比，pS2S-C、pS2S-C+pmIL12、pS2S-C+phIL12均能诱导抗-HBs产生，(pS2S-C+pRec2.0)组对健康Balb/c小鼠HBsAg的细胞免疫值为(348.21±94.05)SFU/百万细胞，体液免疫值为(106.34±35.29)mIU/ml，HBcAg的细胞免疫呈阴性，体液免疫值为(46.41±19.14)U/ml，而注射(pS2S-C+pmIL12)对健康Balb/c小鼠HBsAg的细胞免疫值为(468.42±87.29)SFU/百万细胞、体液免疫值为(318.53±59.67)mIU/ml，HBcAg的细胞免疫呈阴性，体液免疫值为(278.49±62.53)U/ml，注射(pS2S-C+phIL12)对健康Balb/c小鼠HBsAg的细胞免疫值为(406.13±82.40)SFU/百万细胞，体液免疫值为(339.62±73.44)mIU/ml，HBcAg的细胞免疫呈阴性，体液免疫值为(231±66)U/ml，可以看出，重组疫苗质粒pS2S-C与重组白介素12佐剂质粒联合使用后，重组白介素12佐剂质粒可以明显提高重组疫苗质粒pS2S-C的HBsAg的细胞免疫和体液免疫值及HBcAg的体液免疫值，差异具有显著性。同样，将重组疫苗质粒pC-S2S与重组白介素佐剂质粒合用后，重组白介素12可以明显提高重组疫苗质粒pC-S2S的HBcAg的细胞免疫和体液免疫值，及HBsAg的细胞免疫值，差异具有显著性。因此，联合重组白介素12佐剂质粒后，其对健康Balb/c小鼠的免疫作用明显要强于单独注射重组疫苗质粒pS2S-C或pC-S2S。
实施例9不同给药方案对健康Balb/c雌性鼠的免疫效果比较
6-8周龄Balb/c雌性小鼠购自中国医学科学院动物繁殖中心，24只，随机分为四组，分别为(pS2S-C+pmIL12)组（肌肉注射给药，两质粒量均为50μg）、(pS2S-C+pmIL12)组（借助电穿孔方式免疫）、（pC-S2S+pmIL12）组（肌肉注射 给药，两质粒量均为50μg）、（pC-S2S+pmIL12）组（借助电穿孔方式免疫），免疫程序为0、2、4周各免疫一次，第6周杀鼠取血清并分离淋巴细胞。体液免疫检测、细胞免疫检测及ELISPOT检测方法同实施例8中的方法,实验结果见表3。
表3不同给药方案对健康Balb/c雌性鼠的免疫效果比较
与肌肉注射免疫方式相比，*P<0.05，**P<0.01
从上表结果可以看出，对于（pS2S-C+pmIL12）组，借助电穿孔方式进行免疫的方案的两个剂量组所取得的免疫效果均要强于肌肉注射组，差异具有显著性（P<0.05，P<0.01），尤其是(10+10)μg组，其HBsAg的细胞免疫值为（762.42±77.25）SFU/百万细胞、体液免疫值为(573.63±81.07)mIU/ml，HBcAg的体液免疫值为(384.47±68.39)U/ml，其值要明显高于肌肉注射方式进行免疫组，对应的值分别为(318.53±59.67)SFU/百万细胞、(468.42±37.29)mIU/ml、(278.49±62.53)U/ml，差异具有极其显著性（p<0.01）；对于(pC-S2S+pmIL12)组,应用电穿孔途径的两个剂量，进行免疫所取得的效果均要强于肌肉注射组所取得的免疫效果，差异具有显著性，其(10+10)μg剂量组对健康Balb/c小鼠的免疫，其HBsAg的细胞免疫值为(293.37±47.69)SFU/百万细胞，HBcAg的细胞免疫值为（347.25±65.53）SFU/百万细胞、体液免疫值为（415.38±77.26）U/ml，要强于肌肉注射方式免疫组，其值分别为(185.57±67.24)SFU/百万细胞、(332.46±97.06)U/ml、(257.39±63.17)SFU/百万细胞，差异具有显著性(p<0.05)。
Claims (9)
1.重组白介素12佐剂质粒，其特征是所述重组白介素12佐剂质粒包含白介素12P35亚基编码基因、白介素12P40亚基编码基因以及两个目的蛋白表达盒，两个目的蛋白表达盒将P35亚基编码基因及P40亚基编码基因彼此分隔开。
2.根据权利要求1所述的重组白介素12佐剂质粒，其特征在于所述重组佐剂质粒还包括大肠杆菌复制起始点ColE1、卡那抗性基因序列Kan；所述两个目的蛋白表达盒中，处于上游位置的表达盒为优化目的蛋白表达盒，其包括来源于SV40的增强子元件Enhancer、免疫调节序列CpG。
3.根据权利要求1所述的重组白介素12佐剂质粒，其特征在于所述重组白介素12佐剂质粒为重组人白介素12佐剂质粒(phIL12)或重组鼠白介素12佐剂质粒(pmhIL12)。
4.根据权利要求3所述的重组白介素12佐剂质粒，所述phIL12的核苷酸序列如Seq ID No.3所示，其包含hP35亚基编码基因和hP40亚基编码基因，所述hP35亚基编码基因核苷酸序列如Seq ID No.9所示，所述hP40亚基编码基因核苷酸序列如Seq ID No.10所示。
5.根据权利要求3所述的重组白介素12佐剂质粒，所述pmIL12的核苷酸序列如Seq ID No.4所示，其包含mP35亚基编码基因和mP40亚基编码基因，所述mP35亚基编码基因核苷酸序列如Seq ID No.7所示，所述mP40亚基编码基因核苷酸序列如Seq ID No.8所示。
6.构建权利要求4所述的重组人白介素12佐剂质粒phIL12的方法，其特征在于包括如下步骤：
将合成基因hP35通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得重组质粒pcDNA3.1-hP35，其中合成基因hP35的核苷酸序列如Seq ID No.9所示；
通过BglII+PvuII双酶切从质粒pcDNA3.1-hP35中切出hP35基因表达盒，克隆入BglII+EcoRV双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S中，获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-hP35；
将合成基因hP40通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得重组质粒pcDNA3.1-hP40，其中合成基因hP40的核苷酸序列如Seq ID No.10所示；
通过SalI+PvuII双酶切出hP40基因表达盒，克隆入SalI+SwaI双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S-hP35中，获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-hIL12；
通过NdeI酶切质粒pRec2.0-PreS2S-hIL12，共切出3个条带（1882bp+3446bp+3812bp），回收1882bp片段及3812bp片段，将回收的3812bp片段进行CIP去磷酸化后，与1882bp片段进行连接，筛选正向克隆的重组质粒phIL12。
7.构建权利要求5所述的重组鼠白介素12佐剂质粒pmIL12的方法，其特征在于包括如下步骤：
将合成基因mP35通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得重组质粒pcDNA3.1-mP35，其中合成基因mP35的核苷酸序列如Seq ID No.7所示；
通过BglII+PvuII双酶切从质粒pcDNA3.1-mP35中切出mP35基因表达盒，克隆入BglII+EcoRV双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S中，获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-mP35；
将合成基因mP40通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得重组质粒pcDNA3.1-mP40，其中合成基因mP40的核苷酸序列如Seq ID No.8所示；
通过SalI+PvuII双酶切出mP40基因表达盒，克隆入SalI+SwaI双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S-mP35中，获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-mIL12；
通过NdeI酶切质粒pRec2.0-PreS2S-mIL12，共切出3个条带（1870bp+3448bp+3855bp），回收1870bp片段及3855bp片段，将回收的3855bp片段进行CIP去磷酸化后，与1870bp片段进行连接，筛选正向克隆的重组质粒pmIL12（pmIL12）。
8.一株含有重组佐剂质粒phIL12的大肠埃希氏菌Esherichia coli，保藏编号为：CGMCC No.3727。
9.一株含有重组佐剂质粒pmIL12的大肠埃希氏菌Esherichia coli，保藏编号为：CGMCC No.3726。
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|---|---|---|---|---|
| CN101200730A (zh) * | 2007-07-02 | 2008-06-18 | 广州市恺泰生物科技有限公司 | Il-12表达载体及该载体表达的真核细胞株及应用 |
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2010
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