CN101199513A - 以催化反应形成具吲哚架构的化合物的方法及其在抗癌药物上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明揭示了具吲哚架构的化合物的形成方法，其包含一催化反应，且上述的催化反应是由至少一种路易士酸以催化α，β不饱和酮类与吲哚或其衍生物进行反应，或是催化α，β不饱和醛类与吲哚或其衍生物进行反应。上述的路易士酸包含下列族群中的一种：金属卤化物、卤素、无机铵盐与有机磺酸(盐)类。另一方面，本发明亦揭示了具三吲哚架构(3－indolebased)的化合物在抗癌药物上的应用。
Description
技术领域
本发明是有关于一种以催化反应形成具吲哚架构的化合物的方法，特别是有关于一种由路易士酸以催化形成具吲哚架构的化合物的方法及其在抗癌药物上的应用。
背景技术
所谓的癌细胞，是因为体内细胞多个癌症相关基因 (如抑癌基因、原致癌基因等)变异而转型成的，于分子层次上是跳脱一般我们正常细胞受到的死亡与生长的调控机制，癌细胞不易衰老、死亡且具有快速增殖的能力。在过去的研究发现，许多刺激生长的接受体和信息分子，如erb-B、HER-2和Ki-ras、c-myc，以及抗细胞凋亡的分子，像是Bcl-XL，于癌细胞中均有大量表现或过度活化的现象，这些分子我们称之为致癌基因(oncogenes)。另一方面，一些细胞周期中重要的调控分子，如p53、p16和pRb，它们可能在基因库上的序列整段被移除，或是在DNA序列促进端(promotor)上被严重的甲基化，也有可能是产生了突变，导致这些分子无法执行正常的功能，因而使细胞周期漫无章法的进行着，促使癌细胞不断的分裂增殖，所以，我们常称这些分子为肿瘤抑制基因(tumorsuppressor genes)。当然，癌细胞的形成不是只有单纯的几个分子失去调控而已，许多已知和未知的分子都有可能参与其中，也由于癌细胞本身的复杂性，更增添了我们在癌症治疗中的困难度。
先前的研究认为化学治疗的作用是在于造成肿瘤细胞的坏死，但近年来的文献报导指出许多抗癌剂是造成细胞生理的混乱，进而引起细胞的计划性死亡(programmed cell death)，所谓计划性死亡几乎存在所有组织细胞，当细胞老化、受损、失去功能时，多数细胞会经由自杀行为来清除这些无用的细胞，这样的死亡方式有别于一般的坏死，称为细胞凋亡(apoptosis)。正因为细胞凋亡不会像坏死一样引起发炎反应(inflammation)，且凋亡的细胞很快会被邻近细胞吞噬分解，所以不会造成因细胞死亡而导致的邻近细胞坏死或免疫系统失调。在哺乳动物中最早被分离出的细胞凋亡分子是bcl-2基因，当bcl-2 gene过度表现会抑制apoptosis的进行，某些癌症就是依赖bcl-2及相关基因，来防止细胞死亡。而前列腺癌、大肠癌的预后(prognosis)也和bcl-2的表现有关。另外，p53 gene也被广泛研究，当DNA受损时，p53大量表现，使细胞停留在G1/S期，直至DNA修复后才进入正常的周期。但是当DNA受损太严重时，p53则会促使细胞进入细胞凋亡，在许多癌症，可以侦测到p53 gene的缺陷，p53基因可谓目前文献中在癌细胞最广泛发生变异的基因。
吲哚及其衍生物因具有生物活性而闻名，例如：对癌细胞进行细胞凋亡(apoptosis)的诱导作用，长期以来有机化学家一直不断地努力在合成不同种类的具吲哚架构的化合物，包括二吲哚甲烷、β-吲哚硝基化合物、β-吲哚酮类和β-吲哚醇类等化合物。直到目前为止，只有极少的文献曾报导和上述化合物有关的研究，案例一是Keer等化学家曾观察在高压条件下，除了主产物外、同时亦分离出产率只有6％的另一个次要产物三吲哚环己烷(Harrington，P.；Keer，M.A.Can.J.Chem.1998，76，1256.)；案例二是Shi等化学家稍后也曾报导如果使用三氟甲基磺酸金属盐(metal triflate)为催化剂时，亦可得到相同的产物(Shi，M.；Cui，S.-C.；Li，Q.-J.Tetrahedron 2004，60，6679)。然而上述两个合成法均有其缺点，例如反应条件比较苛刻[13千巴(kilobar)的高压]、反应时间长(1-3天)以及必需使用昂贵的三氟甲基磺酸金属盐为催化剂。有鉴于此，仍有必要研发低成本、低毒性、不会污染环境与操作容易的制程以形成具吲哚架构的化合物，同时采用新的催化策略以提高产率并快速制造所需产物，这也是目前产业界相当重视的发展方向。
发明内容
鉴于上述的发明背景中，为了符合产业上的要求，本发明提供一种新的以催化反应形成具吲哚架构的化合物的方法及其在抗癌药物上的应用。
本发明的一目的在于使用路易士酸做为催化剂，以提供操作容易与稳定的制程由此形成具吲哚架构的化合物，本发明所使用的催化剂的优点是反应效率高、反应后的混合液容易处理、并且反应均可在温和或适温的条件如室温下进行，其可产生中等至极高产率的单一产物。据此，本发明能符合经济上的效益与产业上的利用性。
本发明的另一目的在于提供需要癌症治疗的病人治疗癌症的医药组合物，其包含具有三吲哚架构(3-indole based)的化合物、其对映异构物、非对映异构物、医药上可接受的盐或其任意组合，特别适用于肿瘤抑制基因p53发生变异的癌症细胞。
根据以上所述的目的，本发明揭示了具吲哚架构的化合物的形成方法，其包含一催化反应，且上述的催化反应是由至少一种路易士酸以催化α，β-不饱和酮类与吲哚或其衍生物进行反应，或是催化α，β-不饱和醛类与吲哚或其衍生物进行反应。上述的路易士酸包含下列族群中的一种：金属卤化物、卤素、无机铵盐与有机磺酸(盐)类。另一方面，本发明亦揭示了具三吲哚架构(3-indole based) 的化合物在抗癌药物上的应用。
附图说明
本发明在此所探讨的方向是为以催化反应形成具吲哚架构的化合物的方法。为了能彻底地了解本发明，将在下列的描述中提出详尽的制程步骤或组成结构。显然地，本发明的施行并未限定于熟知该项技艺者所熟习的特殊细节。另一方面，众所周知的组成或制程步骤并未特别描述于细节中，以避免造成本发明不必要的限制。本发明的较佳实施例将会详细描述如后，然而除了这些详细描述之外，本发明还可以广泛地施行在其它的实施例中，且本发明的范围不受限定，其是以之后的专利范围为准，其中：
图1是根据本发明的第三实施例中，3-indole药物处理各种癌细胞24小时后的细胞存活率结果，可以发现使用约10μM的3-indole药物即可达到IC50的毒杀效果；
图2是根据本发明的第三实施例中，3-indole药物对原位肿瘤模式动物试验的抑制效果。(A)取5×106个肺癌细胞A549注射至裸鼠背部皮下，至细胞团块形成为肿瘤达50mm3时开始注射3-indole，并以传统化疗药Taxol作为正控制组，3-indole的溶剂DMSO作为控制组。操作条件为每两天注射一次(0，2，4，6，8 day)，每次剂量为0.2mg。(B)取注射药物后的老鼠血液做血液及生化检验肝/肾功能是否正常。(C)取注射药物后的老鼠肝脏、肾脏做切片观察细胞型态；
图3是根据本发明的第三范例中，给予或不给予3-indole药物处理各种肺癌细胞24小时后的细胞周期分布图，其中，G1代表细胞有2套染色体(2N)，G2/M代表细胞有4套染色体(4N)，S介于G1与G2/M之间，代表DNA合成期，染色体数目介于2N与4N间，sub-G1代表细胞染色体小于2套，细胞发生DNA片断化情形，可能出现细胞凋亡。此外，实心箭头代表sub-G1 peak强度增加，空心箭头代表G2/M peak强度增加；
图4是根据本发明的第三范例中，利用DNA电泳法检测DNA断裂的情形。由30μM的3-indole药物分别处理各种肺癌细胞株：(A)24小时；(B)48小时；与
图5是根据本发明的第三范例中，利用西方转渍法观察由30μM的3-indole药物分别处理A549与H1437癌细胞，其GAPDH与Bcl-2的表现量。
具体实施方式
本发明的第一实施例揭露一种具吲哚架构的化合物的形成方法，其包含一室温催化反应，此处的室温是低于或等于30℃，且上述的催化反应是由至少一种路易士酸以催化α，β-不饱和酮类与吲哚或其衍生物进行反应。上述的路易士酸包含下列族群中的一种：金属卤化物、卤素、无机铵盐与有机磺酸(盐)类，其中，上述的金属卤化物包含下列族群中的一种：氯化铟(InCl3)、氯化铈(CeCl3)与氯化铝(AlCl3)。其次，上述的无机铵盐包含六硝酸二铵铈(ceriumammonium nitrate；CAN)。
再者，上述的有机磺酸(盐)类包含下列族群中的一种：烷基磺酸(盐)[如：十二烷基磺酸(盐)]、芳香基磺酸(盐)[如：对甲基苯磺酸(4-methylbenzenesulfonic acid)]、烷基芳香基磺酸(盐)[如：十二烷基苯磺酸(盐)]、二乙烯基苯交联磺酸化聚苯乙烯与全氟磺酸树脂(Nafion)。上述的二乙烯基苯交联磺酸化聚苯乙烯是一种酸性离子交换树脂，已广泛使用在工业催化剂上，目前商业化的产品有Amberlyst-15、Amberlyst XN-1005、AmberlystXN-1010、Amberlyst XN-1011、Amberlyst XN-1008、Amberlite 200…等。
于本实施例中，上述的α，β-不饱和酮类包含下列族群的一种：
此外，上述的吲哚或其衍生物包含下列族群的一种：
其中，X是为卤素，R4、R5与R6是独立选自下列族群中的一种：氢原子与直链烷基(例如：甲基、乙基)。
本发明的第二实施例揭露一种具吲哚架构的化合物的形成方法，其包含其包含一室温催化反应，此处的室温是低于或等于30℃，，且上述的催化反应是由至少一种路易士酸以催化α，β-不饱和醛类(α，β-unsaturated aldehyde)与吲哚或其衍生物进行反应，其中，上述的路易士酸、吲哚或其衍生物的选择与第一实施例相同。此外，上述的α，β-不饱和醛类包含下列族群的一种：
范例1
反应1
表1.于六硝酸二铵铈(cerium ammonium nitrate；CAN)催化下，α，β不饱和酮类1与吲哚2a的反应数据
| Entry | (lequiv) | (4equiv) | (equiv) | Time(h) | 4a(％) | 5a(％) |
| 1 | 1a | 2a | - | 20 | 4aa(-) | 5aa (-) |
| 2 | 1a | 2a | 0.1 | 12 | 4aa(14) | 5aa(85) |
| 3 | 1a | 2a | 0.1 | 20 | 4aa(-) | 5aa(93) |
| 4 | 1a | 2a | 0.3 | 6 | 4aa(8) | 5aa(92) |
| 5 | 1a | 2a | 0.3 | 13 | 4aa(-) | 5aa(99) |
| 6 | 1a | 2a | 0.5 | 2 | 4aa(11) | 5aa(77) |
| 7 | 1a | 2a | 0.5 | 4 | 4aa(-) | 5aa(85) |
| 8 | 1b | 2a | 0.3 | 1 | 4ba(99) | 5ba(-) |
| 9 | 1c | 2a | 0.3 | 1/6 | 4ca(90) | 5ca(-) |
| 10 | 1d | 2a | 0.3 | 72 | 4da(62) | 5da(-) |
| 11 | 1c | 2a | 0.3 | 4 | 4ca(60) | 5ea(-) |
aNMR yields
为了观察六硝酸二铵铈(CAN)的催化效果，在室温条件下使用二甲基亚飒(DMSO)/水(体积比5/1)作为为溶剂时，我们发现1当量的2-环己烯-1-酮(2-cyclohexen-1-one)1a可以和4个当量(equiv)的吲哚2a分别在使用不同催化量的六硝酸二铵铈条件下进行反应(结果如反应1和表1所标示)。首先在没有加入催化剂的条件下进行反应，虽然混合系统经过搅拌20小时，结果并无1，4-加成反应的产物4aa，亦无先进行1，4-加成反应再继续进行1，2-加成反应的最终产物5aa产生[实验1(entryl)]。相对地，当反应系统中加入了0.1当量的六硝酸二铵铈(CAN)后，反应进行12小时后则结果明显地改善，可得到14％的4aa和85％的5aa产物(实验2)；令人讶异的是，当相同反应进行20小时后可进一步获得93％的单一产物5aa(实验3)。
为了获得更佳的结果，我们亦尝试将六硝酸二铵铈(CAN)的量增加到0.3当量，一如预测，经过6个小时后4aa产率可减少至8％而5aa则增加到92％(实验4)。幸运的是，当相同反应进行13小时后可进一步获得99％的单一产物5aa(实验5)。虽然将六硝酸二铵铈的量增加为0.5当量后可明显地加速反应，但经过2小时反应后的结果是产物4aa和5aa的产率分别降到只剩11％和77％(实验6)，且进行4小时反应后仅获得85％的5aa(实验7)。合理的解释可能是因为稍为过量的六硝酸二铵铈(CAN)虽然会有较明显的催化作用，却使得反应发生太快或太剧烈，以致影响到反应系统的稳定性，并造成部份起始物或产物在反应过程中被破坏而降低产率。根据上述结果我们可观察到六硝酸二铵铈(CAN)的确具有高效率的催化效果，而且所使用的催化量为0.3当量时具有最佳的催化效果。除1a之外，其它的起始物如1b-e等也分别在相似的情况进行测试，实验结果如实验8-11中所显示。
根据表1的数据，我们观察到一些有趣的现象，特别是有关反应物1a和1b-e的差异之处。例如，仅有反应物1a可先进行1，4-加成反应而产生4aa，然后4aa可再与吲哚2a继续进行反应而获得5aa。然而，反应物1b-e只能进行1，4-加成反应而产生高产率的4ba-4ea，却不会继续进行其它反应如1，2-加成反应。关于1a和1b分别产生不同产物的原因，我们推测主要是因为“扭转张力因素”(torsional straineffect)的影响所致，此因素在反应期间对产物或中间产物扮演一个非常重要的影响角色，例如：当第一当量的2a先进行1，4-加成反应而加至1a或1b后可形成3-吲哚环己酮(3-indolylcyclohexanone)4aa或3-吲哚环戊酮(3-indolylcyclopentanone)4ba。当继续进行1，2-加成反应，则4aa中的羰基的碳原子的混成轨域会由sp2转换成sp3轨域并产生六环产物5aa，此种改变的结果使5aa具有交错(staggered)或称为椅状构形的结构，此结构并可明显地减少化合物内的扭转张力而增加5aa的稳定性；相反的情况如果是形成五环的产物5ba却会出现重叠(eclipsed)的构形而造成化合物的能量上升，反而使五环产物5ba变为更不稳定。
范例2
反应2
表2.于六硝酸二铵铈(cerium ammoniumnitrate；CAN)催化下，α，β不饱和醛类6与吲哚2a的反应数据
| Entry | 1 | 3(equiv) | Time(h ormin) | 7a(％) | 8a(％) |
| 1 | 6a | 0.1 | 1h | 7aa(99) | 8aa(-) |
| 2 | 6a | 0.1 | 10min | 7aa(64) | 8aa 29) |
| 3 | 6a | 0.1 | 1h | 7aa(32) | 8aa(66) |
| 4 | 6a | 0.1 | 5min | 7aa(20) | 8aa(80) |
| 5 | 6a | 0.1 | 15min | 7aa(-) | 8aa(99) |
aNMR yields
进一步的研究显示和酮类具有相似结构的醛类[如：α，β-不饱和醛(α，-unsaturatedaldehyde)6]，亦可与2a反应，实验结果如反应2和表2所标示。例如，2-烯丁醛(crotonaldehyde)6a与2a在使用0.1当量的六硝酸二铵铈(CAN)为催化剂的条件下，于室温反应1小时后，可产生99％的单一产物7aa(实验1，经NMR的鉴定及分析)，混合物经分析后亦未发现有二吲哚甲烷[bis(indolyl)methane]8aa的生成(经GCMS的鉴定及分析)。然而，当起始物使用3-甲基-2-烯丁醛(β-methylcrotonaldehyde)6b，则产生64％的7ba和29％的8ba(实验2)。另一方面，6c或6d的反应结果和6a或6b相似，可分别产生32％的7ca和66％的8ca(实验3)以及20％的7da和80％的8da(实验4)。令人讶异的是，当以6e为起始物时，可以获得99％的单一产物8ea(实验5)。
根据表1和表2的结果，我们发现在不同的情况下，α，β-不饱和酮1可能只产生单一产物4或5也可能同时产生产物4和5(可以简写成产物4或/和5)；同样的状况，α，β-不饱和的醛6亦可能只产生单一产物7或8或同时产生产物7和8。生成产物7的反应机构和产物5的反应机构相类似，首先，反应物6先进行1，4-加成反应后再继续进行1，2-加成反应而产生最终产物7。然而，产物8与4的反应机构并不相同，其中，产物4是经由1，4-加成反应途径而产生，而产物8则是经由1，2-加成反应而产生。上述不同的实验结果可能是因为醛和酮彼此间具有不同的立体障碍而造成，由于醛基的立体障碍比酮基小甚多，所以醛模拟酮类容易进行1，2-加成反应。上述假设亦可由醛类进行反应时只需使用0.1当量的六硝酸二铵铈(CAN)即可催化反应的进行，而酮类则至少需要0.3当量来催化类似的反应而得到证明。除此之外，当醛类分子结构内部具有不同立体障碍时，可得到产物7或/和8且彼此间的比例差异甚大，例如使用6a时只能够得到7aa(表2的实验1)，而使用6b-d时则可同时产生7和8(entries 2-4)；但如果是使用6e则仅获得8ea(实验5)。
范例3
反应3
反应4
表3.于碘(iodine)催化下，α，β-不饱和酮类1与吲哚2a/2b的反应数据
| Entry | (lequiv) | (4equiv) | I2(equiv) | Time(h) | 4a(％) | 5a(％) |
| 1 | 1a | 2a | 0.15 | 1.5 | 4aa(28) | 5aa(49) |
| 2 | 1a | 2a | 0.3 | 1 | 4aa(5) | 5aa(68) |
| 3 | 1a | 2a | 0.3 | 2 | 4aa(-) | 5aa(93) |
| 4 | 1a | 2a | 0.5 | 1 | 4aa(-) | 5aa(99) |
| 5 | 1a | 2a | 1 | 1 | 4aa(-) | 5aa(62) |
| 6 | 1a | 2b | 0.3 | 5/12 | 4ab(-) | 5ab(99) |
| 7 | 1b | 2a | 0.3 | 2/3 | 4ba(92) | 5ba(-) |
| 8 | 1c | 2a | 0.3 | 1/6 | 4ca(91) | 5ca(-) |
| 9 | 1d | 2a | 0.3 | 72 | 4da(43) | 5da(-) |
| 10 | 1e | 2a | 0.3 | 5 | 4ea(79) | 5ea(-) |
aNMR yields
我们亦尝试使用碘来做为催化剂，其反应程序与范例1相似。当1当量的α，β-不饱和酮类1与4当量的吲哚2a在1毫升的二乙基醚(diethyl ether；Et20)溶液中以碘为催化剂进行反应时，可能同时生成产物4和5，或只产生单一产物4或5，结果如反应3和表3所示。当使用0.15当量的碘为催化剂，结果同时产生4aa和5aa(实验1)。当碘9的用量提高到0.3或0.5当量并经2小时或1小时反应后可进一步获得93％或99％的单一产物5aa(实验3和4)。然而，当碘的用量增加到1当量时，却只有62％的5aa产生(实验5)。上述结果显示使用0.3当量的碘已能够有效率地催化整个反应。同理，如果使用分别使用1a-d与2a或2b反应，则可得到不同种类的产物4(实验6-10)。与表1中催化剂CAN的数据相比较，以碘做为催化剂的条件下，除了1d之外的大部分起始物都可以产生中等至极高产率的产物4。对于1d而言，以碘催化只有49％的4da产生，使用CAN催化则有62％的产率，唯一的差别在于CAN为催化剂需使用二甲基亚飒(DMSO)/H2O溶剂，而碘为催化剂需使用醚类溶剂。
有关产物4aa和5aa的反应机构说明如下，首先1a先进行1，4-加成反应产生4aa，然后4aa再继续与测的反应机构，将1当量的4aa与3当量的2a以及0.3当量的碘混合在1毫升的乙醚中进行反应，经过1个小时后可得到87％的5aa(反应4)。上述结果可以解释为什么相同的反应在较短的反应时间内可同时产生产物4和5，但经过较长时间后则只得到产物5。
范例4
反应5
表4.于碘(iodine)催化下，α，β-不饱和醛类6与吲哚2的反应数据
aNMR yields
b46％ of bis(indoly)methane 8da was also generated.
c99％ of bis(indoly)methane 8ca was generated.
根据范例1至范例3的结果，我们亦尝试将起始物6和2进行反应并使用0.1当量的碘为催化剂，实验结果如反应5和表4所显示。当碘为催化剂时，起始物6a-c和6f-g均只生成单一产物7aa-cb以及7fa-gb，并没有其它产物如8的生成(表4中entries1-6及9-12)。比较表2与表4的结果发现，使用六硝酸二铵铈(CAN)或碘为催化剂时会出现稍微不同的实验结果，可能的原因是因为六硝酸二铵铈(CAN)是属于较强的路易士酸，所以活性较大；但碘是属于较弱的路易士酸，所以活性较温和。由于两者的路易士酸度有差异，故对反应的影响不尽相同。例如相同的反应在使用碘为催化剂时，起始物6a-c和6f-g均先进行1，4-加成反应，然后再继续进行1，2-加成反应而产生单一产物7，这个现象对于起始物6b和6c的影响特别明显(entries 3-6)；但如果起始物6b和6c是使用六硝酸二铵铈(CAN)为催化剂则是产生混合物7和8(表2中entries 3-4)。但对起始物6d与6e而言，经由1，2-加成反应而产生的8da及8ea则是主要产物(实验7)及唯一的产物(实验8)，此结果不管是用碘或用六硝酸二铵铈(CAN)为催化剂的结果皆相似。上面这些特别的结果，除了和路易士酸度的差异有关外，亦可用起始物本身所具有的不同的立体障碍因素来解释。
范例5
反应6
表5使用其它催化剂的条件下，α，β-不饱和酮类1a与吲哚2a的反应数据
| catalyst(mmole) | time | solvent | yield ％(4aa/5aa) |
| InCl3(0.1) | 1day | EtOH | 23/4(S.M.83) |
| CeCl3(0.1) | 1day | EtOH | 12/2(S.M.72) |
| AlCl3(0.1) | 1day | EtOH | 10/90 |
| 十二烷基苯磺酸DodecylbenzenesulfonicAcid(0.1) | 1day | acetone/H2O | 0/99 |
| 4-methylbenzenesulfonicacid(0.1)对甲基苯磺酸 | 1day | Et2O | 0/85 |
| Amberlyst-15(0.1g) | 1day | EtOH | 19/11(S.M.26) |
| TCT(0.05) | 1day | Ether | 5/91 |
| NBS(0.1) | 2days | EtOH | 7/24(S.M.72) |
根据范例1至范例4的结果，我们亦尝试使用其它的催化剂以催化反应起始物1a和2a，实验结果如反应6和表5所显示。当使用0.1当量的金属卤化物为催化剂时，氯化铟(InCl3)与氯化铈(CeCl3)催化生成产物4aa的量较多，然而氯化铝(AlCl3)却是催化生成产物5aa为主，且其产率高达90％(表5中entries1-3)。其次，有机磺酸(盐)类的催化效果差异甚大，当使用0.1当量的十二烷基苯磺酸(dodecylbenzenesulfonic acid)可获得99％的单一产物5aa(实验4)，而使用0.1当量的对甲基苯磺酸(4-methylbenzenesulfonic acid)可获得85％的单一产物5aa(实验5)；相对地，0.1g酸性离子交换树脂Amberlyst-15却仅生成19％的产物4aa和11％的产物5aa(实验6)。此外，使用催化剂2，4，6-三氯-1，3，5-三嗪(2，4，6-trichloro-1，3，5-triazine；TCT)的效果相当不错，可生成5％的产物4aa和91％的产物5aa(实验7)。至于催化剂N-溴代丁二醯亚胺(N-Bromosuccinimide，NBS)则是生成7％的产物4aa和24％的产物5aa(实验8)。
范例6
表6于0.3当量碘(iodine)催化下，α，β不饱和酮类1与各种吲哚及其衍生物的反应数据
| Indoleanditsderitives | Time(h) | solvent | yield ％ |
| 2a：1-H(0.3) | 2 | Et2O | 4aa/5aa＝0/93 |
| 2b：1-CH3(0.3) | 5/12 | Et2O | 4ab/5ab＝0/99 |
| 2c：5-F(0.3) | 2Et2O | 4ac /5ac＝0/93 |
| 2d：5-Br(0.3) | 2Et2O | 4ad/5ad＝0/98 |
| 2e：7-Et(0.15) | 1Et2O | 4ae/5ae＝0/37 |
我们使用1当量的α，β-不饱和酮类1与4当量的吲哚及其衍生物2a-2e 在1毫升的二乙基醚(diethyl ether；Et20)溶液中以0.15或0.3当量碘(iodine)为催化剂进行反应时，只产生单一产物5，结果如表6所示。
在上述本发明的实施例中，推测本发明产生不同产物的原因可能是起始物或反应物因本身具有不同的立体障碍因素或/和催化剂彼此的路易士酸度稍有差异所造成。本发明所使用的催化剂的优点是反应效率高、反应后的混合液容易处理、并且反应均可在温和或适温的条件如室温下进行。此外，上述催化剂不但价钱便宜、容易获得、对环境的影响性低，符合环保的世界趋势。
细胞有增殖、分化及凋亡三方面的特性。在维持正常组织的生长平衡过程中，细胞增殖、分化与凋亡三者相互协调，共同调节，而其中细胞凋亡对细胞衰亡与更新、保持细胞数目的恒定方面起着重要的作用。长期以来学者着重于肿瘤增殖活性和分化特征方面的研究，并由于实验方法和手段限制，肿瘤细胞死亡方面的研究则相对薄弱。然而越来越多的资料显示，细胞凋亡失调与肿瘤形成有着密切关系。应该说，肿瘤不仅是增殖和分化异常的疾病，同时也是凋亡异常的疾病。目前肿瘤细胞凋亡研究已成为大家普遍关注在生命科学领域中的焦点。
如先前技术(prior art)中所述，细胞凋亡(apoptosis)又称为计划性细胞死亡(programmedcell death)。根据Kerr、Wyllie及Currie所描述：为一种由基因控制，维持细胞内环境稳定的自主而有序的死亡。它与细胞坏死(necrosis)不同，细胞凋亡不是一种被动的过程，而是一种主动的过程；它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，并非病理条件下自体损伤的现象，而是为了更好适应生存环境而主动采取的一种死亡过程。细胞凋亡的突出变化是内源性核酸内切酶(endogenous endonuclease)催化的细胞染色体DNA在核小体间的断裂，形成大约180-200bp整数倍的染色体DNA片段，即染色体DNA的片断化(DNA fragmentation)。发生细胞凋亡的细胞，细胞膜发生皱缩(shrinkage)、凹陷，染色质变得致密(condensation)，最后断裂成碎片；继而细胞膜将细胞质分割包围，并包围了细胞质的断片，形成了多个膜结构完整的泡状小体，就称为凋亡小体(apoptotic body)。细胞在发生凋亡过程中细胞质浓缩，细胞骨架蛋白被蛋白酶破坏。但粒线体、溶酶体等主要胞器的结构和功能则常维持到凋亡的晚期，内质网在早期还有合成蛋白质的功能，后来扩张成泡状，与细胞膜接触融合，形成胞质气泡。细胞膜则始终保持完整，细胞内容物无溢出，因此不引起发炎反应。
所以，细胞凋亡是一种极特殊的、自然的细胞过程，主要由多种遗传基因在导控，如pro-apoptoticgene：p53、Bax、Bad、Bak，及anti-apoptotic gene：Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等，细胞会按照自身设定的程序进行，直到细胞被吞噬，目的在保持细胞和组织的恒定。细胞凋亡具有四个重要外在特征：(1)细胞质皱缩，(2)染色体浓缩，(3)DNA片断化，(4)凋亡小体的产生。它的特性是细胞膜不会破裂，细胞内容物不会流出，因此不会有发炎反应的产生。在细胞凋亡过程中，细胞内双股DNA会被内切酶(caspase)切断，先形成约300bp大小，再进一步裂解为约185bp的核小体，最后形成凋亡小体，被吞噬细胞吞噬清除。而细胞凋亡在动物发育上有许多重要的功能，如形态改变、去掉不需要构造、控制细胞数目、去除不正常或使去功能或是有害的细胞以及产生分化细胞等。在侦测细胞死亡的实验分析方法，包括：(1)电泳分离技术：对凋亡细胞DNA的提取后，利用电泳分离技术，可以观察到DNA ladders梯状图谱，可了解DNA裂解程度。(2)流式细胞仪技术：分析各细胞周期(cellcycle)所占的比例，若细胞发生死亡现象，则流式细胞仪会在正常的细胞周期：包括G1(Gap1，间期1)、S(Synthesis，DNA合成期)、G2(Gap2，间期2)和M(mitosis，有丝分裂期)之外，侦测到副G1前期(sub-G1)的细胞，代表此细胞可能出现细胞凋亡的情形。
本发明的第三实施例揭露一种治疗癌症的医药组合物，其包含具有下列一般式的化合物：
其对映异构物、非对映异构物、医药上可接受的盐或其任意组合，其中，R1、R2、R3与R4是为下列族群中的一种：氢原子、烷基、取代型烷基、芳香基、取代型芳香基，或是R1、R2、R3与R4任意两者成环。
于本实施例的一较佳范例中，上述的化合物包含下列族群中的一种(以下简称为3-indole药物)：
于本实施例中，上述的癌症是选自下列族群中的一种或其任意组合：肺癌、食道癌、卵巢癌、乳癌、淋巴癌、胰脏癌、结肠直肠癌、头颈部癌和膀胱癌。上述的具有三吲哚架构(3-indole based)的化合物特别适用于肿瘤抑制基因p53发生变异的癌症细胞，例如：肺癌。临床上肺癌分为两大类，即小细胞癌(Small Cell Lung Cancers，SCLCs)与非小细胞癌(Non-Small Cell Lung Cancers，NSCLCs)，多数的患者属于非小细胞癌，非小细胞肺癌又可分为肺腺癌(adenocarcinoma lung cancer)、肺鳞状细胞癌(squamous cell lung cancer)和肺大细胞癌(largecell lung cancer)，其中肺腺癌为肺癌患者中最常见，无吸烟者所罹患肺癌常为此类，而肺鳞状细胞癌则常见于吸烟患者当中。
范例7材料与方法(以三吲哚环己烷为例)
细胞株(Cell lines)
本实验所使用到的五个肺癌细胞株，其p53基因型分述于下：H1299(p53null type)、CL1-1(p53mutanttype)、H1435(p53mutant)、H1437(p53mutant)、A549(p53wild-type)；另外，正常肺细胞株IMR90则作为控制组；二个食道癌细胞株，分别为KYSE170与KYSE510。其中H1299、CL1-1、H1437、A549与IMR90皆培养于含10％胎牛血清的Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium(DMEM)培养液，而H1435、KYSE170与KYSE510则培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液。
药物处(Drug treatment)
药物溶剂为dimethysulphoxide(DMSO)。将细胞以其专用培养基培养子37℃、5％CO2培养箱中；取定量细胞(约3×105个)利用6孔培养盘的culture dish培养12-16hr。隔天以含有不同浓度抗癌药3-indole的培养基于37℃培养24hr。并计数细胞在药物处理之后的存活率，了解抗癌药3-indole是肿瘤细胞死亡达50％所需的浓度(IC50)为何。
细胞存活率试验(MTT assay)
将细胞以其专用培养基培养于37℃、5％CO2培养箱中；取定量细胞(约3×105个)利用6孔培养盘的culture dish培养12-16hr。隔天以含有不同浓度3-indole的培养基于37℃培养24hr后去除培养基，加入含MTT[3-(4，5-cimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide]1ml/well的培养基并置于培养箱中1小时；去除含有MTT的培养基，加DMSO 600μl/well再置于水平振荡器上避光振荡作用5分钟；各取200μl/well于96孔培养盘，测570nm吸光值；并将取得的吸光值换算成细胞数目，以得知细胞的存活率。
DNA片断化分析(DNA ladder assay)
将细胞从培养盘上刮下来约200μl，加入20μlprotease K，和200μl AL buffer，混合15秒将细胞打散，置于56℃加热器上10秒，之后加入99％酒精200μl；将混合液移至QIAGEN Kit的管柱(column)中，离心8000转，1分钟，去除下层废液；加500μlQIAGEN Kit的AW1 buffer离心8000转，1分钟，去除下层废液；加入500μl QIAGEN Kit AW2 buffer离心14000转，3分钟；之后将上层column移至新的1.5ml离心小管(eppendorf)，加入200μl AE buffer至于室温下1分钟，然后离8000转，1分钟；最后将收集到的DNA去跑电泳，观察DNA ladder的情形。
细胞周期(Cell cycle)的检测
取定量细胞(约2×106个)以70％酒精以固定细胞静置在-20℃冰箱中放置24小时后，低速离心900转，5分钟，吸除上清液，可留约50ul溶液，将细胞团块均匀地打散，加5ml phosphate-based saline(PBS)来清洗细胞，以PBS清洗三次。加入1.0ml propidiumiodide(PI)/Triton X-100染色液，将细胞团块均匀地打散，并轻摇混合，在室温下暗室中作用30分钟(终浓度为Triton-X 0.1％，RNase A 0.2mg/ml，&PI20μg/ml)。上机前混匀样品，并以35-μm尼龙筛网过滤样品。以流式细胞仪(FACScan flow cytometry，BD，MountainView，CA)侦测细胞中PI的萤光强度，估算约一万个细胞DNA细胞周期DNA分布含量，以界定细胞周期的各个阶段，并利用Mofit LT Ver2.0软件计算各周期细胞所占的比例及分析作图。若细胞因药物处理而影响了原本的细胞周期，则机器侦测到的DNA分布含量会与未处理药物的样本不同。包括G1、S、G2和M。G1代表“Gap1”(间期1)，S代表“Synthesis”(DNA合成)，为DNA进行复制的阶段。G2代表“Gap2”(间期2)，M代表“mitosis”(有丝分裂)，为进行核裂(染色体分离)和质裂(细胞质分裂)的阶段。若在G1前期侦测到细胞，则此细胞可能出现细胞凋亡中会出现的DNA片断化的情形。
西方转渍法(Western Blot)：
将细胞加入适量RIPA[50mM Tris pH8.0，150mMNaCl，0.5％sodium deoxycholate，0.1％SDS，1％TritonX-100，5mM phenylmethylsulphonyl fluoride(PMSF)，10mg/mlleupeptin，20mM sodium phosphatepH7.0]溶解后，使用细胞刮取(scrapper)取下所有细胞，并于4℃离心10,000rpm 30分钟；取上清液4μl，进行蛋白质定量，剩余蛋白分装后保存于-20℃。
蛋白质定量：采用Bio-Rad DC(Detergent-Compatible)Protein Assay的方法，取5μlstandard或sample溶液至96 well培养盘中，加入25μl反应试剂A(alkaline copper tartratesolution)，然后再加入200μl反应试剂B(Folinreagent)混合作用15分钟，以630nm测吸光值。并以0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml的牛血清蛋白(bovineserum albumin standard)作为标准蛋白求出标准曲线，回归后求出直线方程式，换算样品中蛋白质浓度(mg/ml)。
电泳转渍：取30μg蛋白质加入样品缓冲液(3倍sample buffer，包括350mM Tris-HCl pH6.8，12％SDS，0.02％ bromophenol blue，35％ glycerol，30％mercaptoethnol)煮沸5分钟后，以SDS-PAGE(4％stacking gel及10％或15％resolving gel)先以电压80伏特进行10分钟后，将电压调至130伏特再进行电泳70分钟。
免疫呈色：将SDS-PAGE上的蛋白质转渍到PVDF膜上，之后将膜取出并浸泡于blocking solution(10％skim milk in PBS-T)，室温下作用1小时后，以PBS-T(phosphate-based saline-0.5％ Tween-20)清洗2次，每次10分钟。分别加入一级抗体Bcl-2(CellSignaling Technology，Beverly，MA 01915，USA)，室温下作用2小时后，以PBS-T清洗3次，每次10分钟，并加入二级抗体HRP-goat anti-rabbit IgG，于室温下作用1小时后，再以PBS-T清洗3次，每次10分钟。最后用ECL Chemiluminescent Western System(Amersham，Arlington Height，IL，USA)试剂组加在膜上，避光作用五分钟后，在暗房以X光底片压片显影。
原位肿瘤模式动物试验
以细胞计数器计算转殖的细胞数量，取5×106个细胞，用1倍的PBS冲洗，再以Hanks’Balanced SaltSolution(HBSS)冲洗2次；取100μl HBSS细胞悬浮液注入四周龄的Nude mice(小鼠)裸鼠(ICR-Foxnlnude mice，国家动物实验中心)的背部皮下。肿瘤细胞注射后约10-14天，当肿瘤长成50mm3大小时，将新颖抗癌药物3-indole或临床化疗药物Taxol注射于裸鼠腹部皮下，每两天注射一次(0，2，4，6，8day)，每次剂量为0.2mg，共注射5次(总剂量为50mg/Kg)。以30天为单位，(1)观察肿瘤大小变化并纪录，量取肿瘤最长的一边a与最短的一边b，肿瘤体积大小订为(a×b2)/2；(2)取注射药物后的老鼠血液做生化及血液的分析；(3)取肝脏及肾脏做切片观察。
范例8结果(以三吲哚环己烷为例)
细胞毒性试验：
吲哚架构的化合物(indole compounds)3-indole，对各型式肿瘤细胞毒杀作用实验结果显示，无论是在肺癌细胞株：H1299(p53null type)、CL1-1(p53mutant type)、H1435(p53mutant)、H1437(p53mutant)、A549(p53wild-type)细胞与二个食道癌细胞株，分别为KYSE170与KYSE510皆有极高的毒杀作用，以低剂量的处理的下即可达到抑制癌细胞生长的情形，而在正常的肺细胞IMR90中，同样的剂量处理的下，并无明显的毒杀作用(参考图1所示)，显示吲哚架构的化合物有潜力可以成为新颖的抗癌药物。动物试验：
在动物实验研究及体内药物代谢鉴定分析上，我们将肺癌细胞A549注射至裸鼠(ICR-Foxnl)背部皮下，至细胞团块形成为肿瘤达50mm3时开始注射3-indole，并以传统化疗药Taxol作为正控制组，3-indole的溶剂DMSO作为控制组。参考图2(A)所示，相较于控制组的结果，在注射3-indole之后，以肺癌细胞A549所形成的肿瘤的确有被抑制长达30％-50％的现象。另一方面，参考图2(B)所示，在血液及生化检验的结果分析上，经临床医师会同检验科人员判定，注射3-indole之后所呈现的血液生化数值皆在正常范围内[Glutamic oxaiacetic transaminase(GOT)，glutamic pyvuvic transaminase(GPT)]；组织切片染色结果经病理科医生判读后，确认在3-indole注射之后，对于老鼠的相关脏器并无伤害[如图2(C)所示]。
细胞周期及程序性细胞死亡鉴定：
为了解3-indole抑制肿瘤细胞生长的作用机制，分别通过流式细胞仪(FLOW cytometry)、DNA片断化分析(DNA ladder assay)及西方点渍法(Western blot)的实验来观察细胞周期中各时期细胞分布及进行程序性细胞死亡鉴定。参考图3所示，通过FLOW cytometry的实验，可知3-indole对细胞周期的影响呈现不同剂量的效应；肺癌细胞(A549、H1299、H1437、H1435、CL1-1)以10μM剂量处理24小时后，可使细胞周期停滞在G1期，而30μM剂量的处理可进一步导致细胞周期sub-G1增加，sub-G1增加显示细胞有死亡现象。参考图4，DNA ladder assay的实验结果显示，肺癌细胞(A549、H1299、H1435、H1437、CL1-1)其死亡机制是通过细胞程序性凋亡(apoptosis)，所以才会有DNA规则性片段化的情形。目前已知细胞凋亡连续反应进行有数个凋亡相关的分子参与，例如Bcl-2(B-cell leukemia/lymphoma)。参考图5所示，通过西方转渍法分析，我们确认3-indole诱发细胞凋亡与Bcl-2家族表现有关。
本发明发现经由phytochemical功能性的indole架构，研发新颖具诱发细胞凋亡功能的化学物质3-indole，无论是在p53wild-type的A549细胞、p53mutant的H1437、H1435与CL1-1细胞与p53null的H1299细胞中皆有极高的毒杀作用，并且在动物实验中有明显肿瘤生长抑制作用；进一步在活体外(in vitro)细胞模式信息传递路径分析上显示，3-indole药物可由Bcl-2信息传递路径诱发细胞凋亡(apoptosis)，并且对于各类p53变异的癌细胞皆具有生长抑制效果的作用，显示吲哚架构的化合物3-indole有潜力可以成为新颖的抗癌药物，可提升对于不同形式的癌症患者的治愈率。
显然地，依照上面实施例中的描述，本发明可能有许多的修正与差异。因此需要在其附加的权利要求项的范围内加以理解，除了上述详细的描述外，本发明还可以广泛地在其它的实施例中施行。上述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的申请专利范围；凡其它未脱离本发明所揭示的精神下所完成的等效改变或修饰，均应包含在下述申请专利范围内。
Claims (8)
1.一种供需要癌症治疗的病人治疗癌症的医药组合物，其特征在于，其包含具有下列一般式的化合物：
其对映异构物、非对映异构物、医药上可接受的盐或其任意组合，其中，R1、R2、R3与R4是为下列族群中的一种：氢原子、烷基、取代型烷基、芳香基、取代型芳香基，或是R1、R2、R3与R4任意两者成环。
2.如权利要求1项所述的供需要癌症治疗的病人治疗癌症的医药组合物，其特征在于，其中上述的化合物包含下列族群中的一种：
3.如权利要求1项所述的供需要癌症治疗的病人治疗癌症的医药组合物，其特征在于，其中上述的癌症细胞内的肿瘤抑制基因p53发生变异。
4.如权利要求1项所述的供需要癌症治疗的病人治疗癌症的医药组合物，其特征在于，其中上述的癌症是选自下列族群中的一种或其任意组合：肺癌、食道癌、卵巢癌、乳癌、淋巴癌、胰脏癌、结肠直肠癌、头颈部癌和膀胱癌。
5.如权利要求1项所述的供需要癌症治疗的病人治疗癌症的医药组合物，其特征在于，其中上述的癌症是为非小细胞肺癌。
6.如权利要求1项所述的供需要癌症治疗的病人治疗癌症的医药组合物，其特征在于，其中上述的癌细胞死亡是经由细胞凋亡程序发生。
7.如权利要求1项所述的供需要癌症治疗的病人治疗癌症的医药组合物，其特征在于，其是使用于抑制癌细胞分裂。
8.一种治疗哺乳类动物所患癌症的方法，其特征在于，其包含使用有效量的如权利要求1项的医药组合物。
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| CN103951603A (zh) * | 2014-01-26 | 2014-07-30 | 上海工程技术大学 | 一种具有三吲哚结构的化合物及其制备方法和应用 |
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2006
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080618 |