CN101196525A - 鸡毒霉形体抗体免疫胶体金快速检测试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫应用领域，涉及动物分子生物学、免疫学等相关领域。公开了一种用于快速检测鸡毒霉形体抗体的试剂盒。该试剂盒包含盒体、设在盒体内的试纸卡和样品稀释液。其中的试纸卡是由样品垫、吸收垫、分别包被有鸡毒霉形体pMGA1.2重组蛋白作为检测线和包被有抗鼠IgG作为质控线的硝酸纤维素膜依次按吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫的顺序粘贴在不吸水的支撑薄片上构成。所述的试剂盒检测相应的抗体具有特异性强、灵敏度高、操作简便和诊断快速的显著优点。

Description

鸡毒霉形体抗体免疫胶体金快速检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于免疫应用领域，涉及动物分子生物学、免疫学等相关领域。具体的讲，本发明属于鸡毒霉形体抗体快速检测试剂盒，分别用于鸡血清中鸡毒霉形体抗体的检测，以确定被检鸡是否感染鸡毒霉形体或免疫过的鸡体内是否产生了相应的抗体。

背景技术

众所周知，禽流感、新城疫、法氏囊、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、鸡毒霉形体病、马立克、减蛋综合症等疫病是危害全球养禽业的重要疫病。

鸡毒霉形体(Mycoplasma gallisepticum)是一类缺乏细胞壁、能独立繁殖的最小的单细胞原核微生物，属于原核生物中软壁菌门软皮体纲。主要引起鸡的慢性呼吸道疾病，是养禽业相当棘手的疾病问题之一。主要引起呼吸道感染及免疫抑制，多年来一直在各类鸡群中广泛存在，至今仍没有有效的疫苗进行防控，致使鸡群长期带毒，常引起其他疫病的继发感染，给我国养鸡业生产造成了很大的经济损失。

根据血清学调查，霉形体病在我国感染率很高，大部分鸡群的感染率超过50％，有的甚至高达70％-90％，而且经常继发其它疾病，尤其是与大肠杆菌或新城疫、传染性支气管炎等病原并发感染，造成鸡群大量死亡(王承宇，宣华.鸡毒支原体病研究进展.中国预防兽医学报，2000，22(增刊)：208-211)。而清除这种疫病的最有效的方法是淘汰带毒鸡群，保留健康不带毒的鸡群。要做到这一点，就要有一种快速简便的检测方法来确定感染鸡群。而已有的研究中，没有合适的快速检测鸡毒霉形体的新方法。如琼脂扩散试验(Agarose gel immunodiffusion；AGID)、血凝抑制试验(Hemagglutination inhi-bition；HI)和酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay；ELISA)、血清平板凝集试验(serum plate agglutination test；SPA)等，这些方法有的耗费时间长(如琼脂扩散试验需24～48小时；血凝抑制试验需2～3小时；ELISA试验需3～5小时等)，有的需要昂贵的仪器设备和繁琐的操作步骤，只能在实验室完成，不便于适时和快速诊断，血清平板凝集试验判定结果的时间比较短，但其主观性比较强，没有一定的经验很难做出准确的判定。

免疫层析(immunochromatography)是出现于八十年代初期的一种独特的免疫分析方法，该方法的核心技术是以条状纤维层析材料为固相，通过毛细管作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗原或抗体)发生高特异性、高亲和性的免疫反应。胶体金免疫层析分析(gold-immunochromatography assay；GICA)是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术(Osikowicz G et al.One-step chroma-tographic immunoassay for qualitative determination of choricogonadotropin in urine.ClinChem.1990，36，1586)。层析过程中，金标记物与事先固相化于层析材料(例如硝酸纤维素膜，即NC膜)上的抗原或抗体(检测线)发生特异性的免疫反应而被截留，进一步富集，形成肉眼可见的紫红色条带，从而得到直观的实验结果，达到快速检测的目的。这种方法对所使用的抗原抗体的要求较高，要求具有好的特异性和高纯度。

依据这种原理，已经研制出了很多胶体金免疫层析快速检测试纸条。在人医应用方面，国内外已在激素、传染病病原的抗原和抗体、性病病原、细菌、寄生虫、肿瘤标记物、心血管病标志物、药物以及其他一些蛋白质等方面应用了金标免疫层析试纸条。在兽医应用方面，例如在猪瘟、犬细小病毒病等方面也应用了金标免疫层析试纸条。在鸡疫病诊断和检测方面，中国发明专利(专利号ZL99101537.1)，公开了一种畜禽疫病快速诊断试纸条的制备及应用，但该发明的要点是针对畜禽疫病病原的检测，并未涉及对鸡毒霉形体抗体的诊断检测。

附图说明：

图1：本发明的总体技术路线图

图2：本发明试纸卡的侧视图，图中：

1样品垫(样品端)；2为金标垫；3为硝酸纤维素膜(NC膜)；4为吸收垫(手柄端)；5为检测线，即T线；6为质控线，即C线；7为不吸水的支撑薄片条；8为测试卡；9为加样孔。

图3：本发明试纸卡的俯视图，图中：

1样品垫(样品端)；2为金标垫；3为硝酸纤维素膜(NC膜)；4为吸收垫(手柄端)；5为检测线，即T线；6为质控线，即C线；8为测试卡；9为加样孔。

图4：发明试纸卡结果判定示意图，图中：

a为阳性结果++++；b性结果+++；c为阳性结果++；d为阳性结果+；e为阴性结果；f、g为试纸卡失效

图5：本发明涉及的pMGA1.2重组蛋白表达质粒的物理构建图

发明内容

本发明的在于克服现有技术的缺陷，其第一个目的是组装一种用于检测鸡毒霉形体抗体的试剂盒。第二个目的是本发明的试剂盒在鸡毒霉形体抗体检测中的应用。

本发明的总体技术路线图见图1所示。

本发明是这样实现的：

本发明的试剂盒是由盒体和包含在盒体内的试纸卡、样品稀释液组成。试纸卡(结构图如图2、3所示)是本发明的试剂盒的核心，由试纸条与测试卡组成。试纸条由吸收垫(4)、硝酸纤维素膜(3)、金标垫(2)、样品垫(1)的依次粘贴在不吸水的支撑薄片(7)上构成。的金标垫(2)上包被有胶体金标记的抗鸡IgG Fc单克隆抗体(分泌该抗体的杂交瘤细胞系BDRPDP已经公布在本申请人在先授权的专利文献中，专利号：ZL200510011521.8，该杂交瘤细胞系的已于2005年3月17日保藏在中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C200501)；硝酸纤维素膜(NC膜)(3)上分别包被有鸡毒霉形体重组血凝素蛋白pMGA1.2蛋白构成的检测线(T线)(5)和兔抗鼠IgG构成的质控线(C线)(6)；将试纸条装入测试卡(8)中构成试纸卡。样品稀释液为蒸馏水。所述硝酸纤维素膜、吸收垫、金标垫、样品垫、不吸水的支撑薄片均购自Millipore公司。所述亲和层析柱购自AmershamBiosciences公司。本发明所述的重组pKG-pMGA1.2蛋白，是由大肠杆菌BL21/pKG-pMGA1.2所表达的，包含重组质粒pKG-pMGA1.2的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pKG-pMGA1.2于2007年12月20日保藏在位于中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M207207)

本发明的原理是选用亲和层析纯化的鸡毒霉形体重组血凝素pMGA1.2蛋白作为检测线，抗鸡IgG Fc片断单克隆抗体作为胶体金标记的抗体，利用间接法(Shyu RH等，Colloidal gold-based immunochromatographic assay for detection of ricin J Toxicon2002，40(3)：255-258)来检测被检材料中是否含有鸡毒霉形体抗体。检测时，样品中所有的鸡IgG分子的Fc片段先和金标记抗鸡IgG Fc片段单克隆抗体结合，由于毛细管作用，反应复合物沿包被膜向前泳动，若样品中有抗鸡毒霉形体的特异性抗体，到达检测线时，遇到包被在硝酸纤维素膜上的重组蛋白，就会形成重组蛋白-抗体-金标记单克隆抗体复合物，从而富集在检测线上，形成特异性的红色沉淀线；不是抗鸡毒霉形体的抗体形成的抗体-金标记单克隆抗体复合物则会通过检测线，富集在质控线上，形成红色沉淀线，即判为阳性结果。若样品中不含有鸡毒霉形体抗体，反应复合物到达检测线时，遇到捕获抗原就不会形成重组蛋白-抗体-金标记单克隆抗体复合物，反应复合物通过检测线，富集在质控线上，形成红色沉淀线，即判为阴性结果。

本发明优点：

1、本发明的优点之一是生物安全性高。本发明所涉及到的表达载体pGEX-KG是分子生物学中常用的表达载体，没有生物危险性，在此基础上构建的表达载体pKG-pMGA1.2也没有任何生物危险性。重组大肠杆菌BL21/pKG-pMGA1.2是将表达载体pKG-pMGA1.2转化至分子生物学中常用的大肠杆菌BL21感受态细胞后经氨苄青霉素抗性筛选获得，也不具生物危险性。本发明中的试纸条检测线包被的是本发明制备的鸡毒霉形体重组血凝素蛋白(pMGA1.2蛋白)，制备过程中不涉及鸡毒霉形体活病毒，因此没有鸡毒霉形体活病毒逃逸、扩散的潜在危险。

2、本发明的优点之二是生产成本低。本发明所提供的试剂盒所需的核心试剂是抗鸡IgG Fc段单克隆抗体与毒霉形体重组血凝素蛋白(pMGA1.2蛋白)。抗鸡IgG Fc单克隆抗体可以通过将分泌抗鸡IgG Fc片断的单克隆杂交瘤细胞系(保藏编号为CCTCCNO：C200501)注射Balb/C小鼠腹腔，诱生腹水，通过经济的辛酸-硫酸铵方法纯化而大量获得。pMGA1.2蛋白可以通过重组大肠杆菌BL21/pKG-pMGA1.2在体外得到大量的表达，适合大规模的生产。

3、与已公开的用于鸡毒霉形体抗体检测的血清平板凝集试验(SPA)方法相比，本发明的试剂盒具有许多SPA方法所不能比拟的优点，如灵敏度高，特异性好，结果容易判定；检测过程中只需一种试剂(蒸馏水)，对人体无危害，对环境无污染；储存方便，对温度要求不高，在4℃下有效保存期可达一年；在室温下可保存六个月(表1)。

表1本发明的试剂盒与血清平板凝集试验(SPA)方法的比较

本发明的试剂盒	血清平板凝集试验(SPA)
		特异性强，灵敏度高检测过程仅需一种蒸馏水，生物安全性高储存方便，对温度要求不高，在4℃下有效保存期可达一年；在室温下可保存六个月	特异性差，灵敏度低检测过程中需用到，处理过的鸡毒霉形体活毒，如果处理不干净，存在散毒的危险，有一定的生物安全隐患只能储存在2～8℃，有效期三年

具体实施方式

实施例1

鸡毒霉形体pMGA1.2蛋白的制备：

所使用的分子生物学方法参见文献：萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主编(金冬雁等译)，分子克隆实验指南.第二版，北京科学出版社，1992中提供的方法进行。

1、pMGA基因片段的PCR及克隆

本发明所涉及的pMGA1.2基因是申请人从pMGA重组质粒MgW17(Genbank登录号为AF275312，质粒的构建见文献：翁长江等鸡毒霉形体HS株pMGA多基因族的研究，中国兽医学报，2003，23(2)：149-152)自己亚克隆得到的。整个MgW17重组质粒共计约10.6kb，含有的鸡毒霉形体DNA片段为7434bp，其中包含有两个完整的pMGA基因(pMGA1.2、pMGA1.3)和两个不完整的pMGA基因的头部(pMGA1.1)和尾部(pMGA1.4)(见图---)。pMGA1.1基因位于整个片段的最前端，阅读框的前半部分被切除，剩下的后半部序列在1-720bp，共720bp，终止密码为TAA；本研究准备克隆的pMGA1.2基因的阅读框在1040-3010bp处，全长1971bp，起始密码为GTG，终止密码为TAA，编码656个氨基酸；编码色氨酸的TGA密码分别位于1928、2111和2489处，考虑到跨膜区内疏水性氨基酸及其相临近的膜内、膜外氨基酸在黏附素抗原性上的相对不重要性以及对表达的不利影响，所以，在设计引物时，申请人删除了该基因氨基端的膜内区、跨膜区以及脯氨酸间隔区序列共计161bp，从1201-3010共计1800bp，其中3个TGA密码子将1800bp分解成700bp，216bp，381bp和538bp4个片段。为了表达出全序列，必须对3个TGA进行点突变，因此，申请人首先分别扩增出前后4个片段，经两两整合成两个大片段后，再重新将两个大片段整合到原核表达载体中，从而构建完整表达pMGA1.2基因的载体。根据MgW17中的pMGA1.2基因3个色氨酸编码子“TGA”附近的核苷酸序列设计9条特异引物，由上海博雅生物技术公司合成并经PAGE纯化。引物序列如下：

引物    引物序列                         引物起止序列片段大小(bp)   下划线备注

0.0#    5’-TCGGAATTCAACTTGAAGTGA-3’    -12-4                       EcoRI

1.0#      5’-TTTGAATTCCTAGTGGTGGTATGA-3’      162-179       EcoRI

                                                                                              700

1.1#      5’-GGAATTGTAGTTTCT-3’                                 870-884       MunI

1.2#      5’-

AACTTCTCAAAG A-3’                  885-901                                                 MunI

                                                                                               216

1.3#      5’-ACCGGTTGAAGGTCCGTAATAA-3          1050-1060                                               Cfr10I

1.4#      5’-

TTATACTTCC CT-3’                   1066-1087                                               Cfr10I

                                                                                               381

1.5#      5’-CGCTAGCCAAACTATAAGC ACT-3’       1426-1447                                               NheI

1.6#      5’-GCTAGCGATTCAACATTTATC-3’       1441-1465                                               NheI

                                                                                               538

1.7#      5’-GGCTCGAGGTTAGTAGTTTAATAG-3’      1966-1987                                               XhoI

说明：方框标记出TGA同义突变为TGG

以MgW17为模板，用引物0.0#和1.7#进行PCR，然后以该PCR产物为模板用上述其他引物按以下条件进行PCR扩增。反应体系为：10x反应缓冲液10μl，dNTP 2μl(10mM)，上游引物2μl(20μM)，下游引物2μl(20μM)，TaqDNA聚合酶1μl(5u/μl)，模板DNA1μl，去离子水82μl，共100μl。反应条件为94℃变性4min；94℃变性30Sec，不同温度退火30Sec，72℃延伸90Sec，共30个循环，最后72℃延伸10min。其中引物对0.0#和1.7#，1.0#和1.7#，1.0#和1.1#，1.2#和1.3#，1.4#和1.5#及1.6#和1.7#PCR时的退火温度分别为51，51，50，52和51℃，扩增的片段分别为pMGA1.2’，pMGA1.2，I，II，III和IV。取10μlPCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，然后用DNA回收试剂盒E.Z.N.A Gel Extraction Kit回收目的片段。在16℃条件下将纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接过夜，然后转化到新制备的感受态DH5α中并涂布含IPTG、Xgal和Amp的LB固体培养基上，37℃培养16-18h。将培养好的平皿4℃放置数小时后挑白斑进行扩大培养提质粒进行酶切和PCR鉴定。将鉴定的阳性克隆pMD-I，pMD-II，pMD-III和pMD-IV中的I和II，III和IV利用特定酶进行酶切后再T4连接酶整合为pMD-V(I+II)和pMD-VI(III+Iv)。

2、表达载体pKG-pMGA1.2的构建

用EcoRI和XhoI双酶切pMD-pMGA1.2，EcoRI和Cfr10I双酶切含V的质粒pMD-V，Cfr10I和XhoI双酶切含VI的质粒pMD-VI后，用E.Z.N.A Gel Extraction Kit回收分离并纯化片段pMGA1.2、V和VI。在16℃条件下，用T4连接酶将回收的酶切片段与用EcoRI和XhoI双酶切的Amersham Biosciences公司的表达载体pGEX-KG片段进行连接过夜构建表达载体。重组表达载体转化新鲜制备的DH5α感受态细胞，并将转化菌涂布含氨苄青霉素的LB琼脂平板37℃培养过夜。挑数个单菌落培养过夜后用碱裂解法小量制备质粒，进行酶切分析和PCR扩增鉴定。将得到的阳性克隆命名为pKG-pMGA1.2。包含该重组质粒pKG-pMGA1.2的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pKG-pMGA1.2保藏在位于中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日：2007年12月20日；保藏编号：CCTCC NO：M207207。对阳性克隆用常规的碱裂解法大量制备质粒DNA，并分装冻存于-20℃。重组表达质粒pKG-pMGA1.2构建流程如图5所示。

3、鸡毒霉形体pMGA1.2蛋白的表达：

将构建好的表达质粒pKG-pMGA1.2转入表达用大肠杆菌的感受态细胞Escherichiacoli BL21(DE3)(Escherichia coli BL21(DE3)购自Stratagene公司)中，涂布到含有抗生素(氨苄青霉素60μg/mL)的LB平皿上，37℃培养16～18h，长出单菌落。挑取数个单菌落于加有抗生素(氨苄青霉素60μg/mL)的3mL LB中培养过夜，进行细菌活化。将过夜培养物按比例1∶50稀释入新鲜的LB培养基中，37℃中振荡培养(250～300rpm)到OD600＝0.5～0.8时，加入终浓度为1mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，继续培养诱导表达3h。4℃条件下8,000rpm离心15min，收集细菌。细菌用0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS，配方如下：140mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.2)洗涤一次后离心，反复快速冻融3～4次，用适量缓冲液STE(配方：100.0mmol/LNaCl，10.0mmol/LTris-Cl，1.0mmol/LEDTApH8.0)重悬。用大超声头，设定功率400瓦、20个循环和破碎5秒、间隔10秒，在冰浴中超声破碎1min。4℃条件下12,000rpm离心15min，弃沉淀，将上清对0.01M pH7.2 PBS进行充分透析后浓缩至体积为5mL，按蛋白纯化柱(Glutathione Sepharose^TM 4B HiTrapaffinity columns，Amersham Biosciences公司产品)说明书提供的程序进行亲和层析纯化，得到纯化的pMGA1.2蛋白。该蛋白可用于制备检测鸡毒霉形体抗体的试剂。

实施例2

兔抗鼠IgG抗体的制备：

1、Balb/C小鼠IgG的提取

IgG的提取和纯化按沈关心等(沈关心等，现代免疫学实验技术(第二版)[M]，湖北科学技术出版社，2002)等所述方法进行：取10.0mL健康Balb/C小鼠血清与等量生理盐水混合后，逐滴加入饱和(NH₄)₂SO₄溶液20.0mL，使成50％饱和度的(NH₄)₂SO₄溶液。4℃静置30min后取出；4℃下3,000r/min离心30min，弃上清，沉淀中加20.0mL生理盐水；待沉淀溶解后，缓慢加入10.0mL饱和(NH₄)₂SO₄溶液，使成33％饱和度的(NH₄)₂SO₄溶液。4℃放置30min后取出；4℃下3,000r/min离心30min。弃上清，沉淀重复进行上述操作后，将沉淀溶于1.0mL生理盐水(原血清量体积的1/10)，装入透析袋内用生理盐水透析除盐。用2％BaCl₂溶液检测(NH₄)₂SO₄是否已被透析完全。透析完全后，蛋白溶液用聚乙二醇(PEG)-20,000浓缩至适当体积，4℃下12,000r/min离心10min，取上清，测定蛋白质含量，即得到粗提的Balb/C小鼠IgG。

2、Balb/C小鼠IgG的纯化

根据样品的种类与容积及所选择的层析柱来确定所选葡聚糖凝胶的种类和柱床的体积。柱床的体积按如下公式计算：

Vt＝πr²h

(Vt-柱床的体积；π-圆周率；r-半径；h-柱床高)

根据样品的种类，本发明用葡聚糖凝胶(Sephadex G-200)作为层析材料。

纯化的具体过程如下：

称取3.0g Sephadex G-200倒入数倍体积的蒸馏水中混合均匀，置室温浸泡3d，每天换蒸馏水2次，慢慢将上层含漂浮颗粒的部分倒掉后，再加入原体积的蒸馏水，凝胶浸泡好后置4℃冰箱保存备用。

将洁净的层析柱垂直固定于实验架上，加少量洗脱液(0.01mol/L，pH7.2 PBS)，检查出液管的通畅性，合格后，关闭出液口。从4℃冰箱取出浸泡好的Sephadex G-200，平衡至室温后灌装层析柱。在装好的层析柱凝胶上轻轻放上与柱内径相当的滤纸片，0.01mol/L pH7.2的PBS平衡过夜，在凝胶的上方留出1cm～2cm高的液层，准备加样。

加样时，将凝胶上方的液层放出，待刚露出滤纸片时，立即关闭出液口。用滴管吸取样品，在接近滤纸处沿管壁流下，取少许生理盐水冲洗样品瓶，将洗液加入，最后用洗脱液清洗管壁。打开出液口，在样品全部进入柱床且刚出现滤纸时，立即加入洗脱液，使柱床上部形成5cm～10cm厚的液层。样品上柱后，不时以20％磺基水杨酸液检测洗出液，当洗出液出现轻微乳浊反应时，立即用已经编号的1.5mL EP管收集洗出液，每管1mL，直至洗出液用20％磺基水杨酸检测不出浑浊时结束收集。

结束收集后，用紫外分光光度计测定每管流出液中蛋白质含量，以EP管编号为横坐标，管内流出液蛋白质含量为纵坐标绘制曲线图，根据蛋白浓度分布收集所需溶液，装入透析袋中，PEG-20,000浓缩至适当体积。4℃12,000r/min离心10min，收集上清，用紫外分光光度计测定经过浓缩后的Balb/C小鼠IgG蛋白含量，置-20℃冻存。

3、家兔的免疫及兔抗Balb/C小鼠IgG的提取与纯化

选取体重在2.5kg左右的成年雄性健康家兔，用1和2中制备的抗原，首次免疫用弗氏完全佐剂乳化的Balb/C小鼠IgG，免疫剂量为2mgIgG/只家兔，以后各次用弗氏不完全佐剂乳化的Balb/C小鼠IgG免疫。除首免与二免间隔3周外，其余每次免疫间隔10天，且每次免疫剂量中Balb/C小鼠IgG的含量较前一次高0.8mg，每次免疫途径全部采用皮下多点注射。免疫3次后，采血检测血清效价，当血清AGID(琼脂凝胶免疫扩散试验(agar gel immunodiffusion，AGID)简称琼扩试验)效价达到1∶32时，再加强免疫1次，10天后颈动脉放血，分离血清，用于兔抗Balb/C小鼠IgG的提取。

按照本实施例步骤1和步骤2的方法进行兔抗Balb/C小鼠IgG的提取与纯化。即可得到本发明所需高特异性、高效价的兔抗鼠IgG抗体。利用该抗体可作为本发明胶体金试纸卡的质控线(C线)。

实施例3

硝酸纤维素膜的制备

1包被缓冲液的配制：含3％甲醇的0.01M pH7.2 PBS缓冲液为包被缓冲液，0.22μ膜滤过，置4℃备用，有效期一周。1000ml 3％甲醇的0.01M pH7.2 PBS缓冲液配方：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄ 0.2g、甲醇30ml，用双蒸去离子水定容至1000ml。

2硝酸纤维素膜的制备：用本实施例步骤1中的包被缓冲液将pMGA1.2蛋白稀释到50～100μg/ml，调整机器，划线为T线，即为检测线，T线靠近金标垫端，距金标垫端约5mm；用包被缓冲液将兔抗鼠IgG抗体稀释到50～100μg/ml，调整机器，划线为C线，即为质控线，C线靠近吸收垫，距吸收垫约3mm。两线距离5～8mm，线应细致、均匀。37℃烘干，封装备用。

实施例4

胶体金、金标记单克隆抗体的制备

1、溶液的配制

(1)氯金酸的配制：用双蒸去离子水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃备用，有效期四个月。1000ml 1％氯金酸溶液配方：10g氯金酸；双蒸去离子水定容至1000ml。

(2)1％柠檬酸三钠的配制：用双蒸去离子水溶解柠檬酸三钠，配成1％溶液，0.22μm膜滤过，现配现用。

(3)0.1M碳酸钾的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml 0.1M碳酸钾溶液配方：13.8g碳酸钾；双蒸去离子水定容至1000ml。

(4)2％聚乙二醇(PEG)-20000的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml 2％PEG-20000溶液配方：20g PEG-20000；双蒸去离子水定容至1000ml。

(5)标记洗涤保存液的配制：2％牛血清白蛋白(BSA)、0.05％叠氮钠(NaN3)、0.01MpH7.2 PBS溶液，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml标记洗涤保存液配方：20g BSA、0.5g NaN3、0.01M pH7.2 PBS溶液定容至1000ml。

2、胶体金的制备：

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100ml 0.01％氯金酸加入2ml 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。

3、胶体金标记单克隆抗体的制备：

用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按8～10μg抗体/ml胶体金加入抗鸡IgG Fc单克隆抗体，磁力搅拌器混匀30min，搅拌下加入BSA至终浓度为1％，静置1小时。13000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬，置4℃备用，有效期一周。

实施例5

金标垫的制备

1封闭液的配制：

2％牛血清白蛋白BSA、0.5％Tween-20、0.05％NaN₃、0.01M pH7.2 PBS溶液，0.22μm微孔滤膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml封闭液配方：20g BSA、0.5g NaN₃、5ml Tween-20、0.01M pH7.2 PBS溶液定容至1000ml。

2金标垫的制备：

将金标垫浸泡于本实施例步骤1中的封闭液中30min后，于37℃烘干。然后将制备好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4℃备用。

实施例6

试纸条样品垫的制备

1封闭液的配制：

2％牛血清白蛋白(BSA)、0.5％Tween-20、0.05％NaN3、0.01M pH7.2 PBS溶液，0.22μm微孔滤膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml封闭液配方：20g BSA、0.5g NaN3、5ml Tween-20、0.01M pH7.2 PBS溶液定容至1000ml。

2样品垫的制备：

将样品垫浸泡于本实施例1中的封闭液中30min后，于37℃烘干，封装，置4℃备用。

实施例7

试纸卡的组装

将硝酸纤维素膜、吸收垫、玻璃纤维、样品垫按图依次层叠起来，切成3.6mm宽的小条，然后装入测试卡。每十个一包，加入干燥剂，真空封装。4～8℃保存，有效期一年；常温保存，有效期6个月。

实施例8

1快速检测鸡毒霉形体抗体的试剂盒包括：

①试纸卡        一包(10个/包)

②样品稀释液    一瓶(10ml/瓶)

2相关溶液的配制

快速检测鸡毒霉形体抗体的试剂盒的样品稀释液：蒸馏水。

实施例9

本发明试剂盒的使用方法：

1.样品制备：鸡血清样品的制备，将血清样品用蒸馏水稀释20倍。

2.检测：取出试剂盒，室温平衡20分钟；打开包装袋，取出试纸卡，取100μl制备好的样品滴入试纸卡的加样孔中，10-15分钟内判定结果。

3.结果判定：如图4所示，当试纸卡出现肉眼可见的紫红色质控线，没有出现肉眼可见的紫红色检测线，结果判为阴性，记为“-”；当试纸卡出现肉眼可见的紫红色质控线，同时也出现肉眼可见的紫红色检测线，结果判为阳性，记为“+”；检测线颜色深度与被检血清中的抗体效价呈正相关，颜色越深说明被检测样品的抗体效价越高；检测线颜色浓厚，与质控线颜色一致或接近时判为++++，颜色深度介于+与++++之间时酌情判++或+++。达到+及以上的颜色深度时，判为该份被检血清的抗体为阳性。质控线无条带出现则判为检测试纸卡失效。

实施例10

快速检测鸡传染性法氏囊抗体的试剂盒稳定性考核

设计温度：20℃、4℃

设计时间：0天、10天、20天、30天、2月、4月、6月、8月、10月、12月

保存方法：试纸卡真空封装(贮存在4℃的冰箱内或20℃室温中)

考核指标：敏感性

表2本发明试剂盒试纸卡稳定性测试结果

	0天	10天	20天	30天	2月	4月	6月	8月	10月	12月
											0℃20℃	1∶10241∶1024	1∶10241∶1024	1∶10241∶1024	1∶10241∶1024	1∶10241∶1024	1∶10241∶1024	1∶10241∶256	1∶256失效	1∶64	1∶16

实施例11

快速检测鸡毒霉形体抗体的试剂盒的制备及应用

1快速检测鸡毒霉形体抗体的试剂盒的制备

按实施例1-9的方法制备快速检测鸡毒霉形体抗体的试剂盒。

2速检测鸡毒霉形体抗体的试剂盒的应用

2.1鸡标准血清的检测

①特异性试验：分别将鸡禽流感病毒H5、H9亚型阳性血清(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)、鸡新城疫(ND)阳性血清、鸡传染性支气管炎(IB)阳性血清、鸡传染性法氏囊(IBD)阳性血清(购自中国兽医药品监察所)按本发明实施例9所述方法(GICA)进行试验。结果见表3。表3显示，本发明检测试纸卡与鸡毒霉形体阳性血清试验后，质控线及检测线均出现明显的紫红色条带；而与蒸馏水(空白)、SPF鸡阴性血清、鸡新城疫(ND)、鸡传染性法氏囊(IBD)、鸡传染性支气管炎(IB)等阳性血清试验后，检测线不出现紫红色条带。这表明本发明试纸卡特异性高，与鸡的其他呼吸道疫病病毒抗体无任何交叉反应。

表3本发明的试剂盒对鸡标准血清检测结果

检测样品	水	SPF鸡血清	MG阳性血清	ND阳性血清	IB阳性血清	IB阳性血清	H5阳性血清	H9阳性血清
									检测结果	-	-	++++	-	-	-	-	-

②敏感性试验将鸡毒霉形阳性血清(购自中国中国兽医药品监察所)进行倍比稀释，取100μl稀释好的样品按本发明方法(GICA)进行试验。同时，用常规平板凝集(SPA)(沈关心，周汝麟.现代免疫学实验技术(第二版)[M]，湖北科学技术出版社，2002)测定MG标准阳性血清的效价(试验结果见表4)。结果表明，本发明检测试剂盒的灵敏度比平板凝集试验高128倍。

表4本发明试剂盒与常规检测方法对鸡毒霉形体抗体检测的敏感性试验结果

	GICA检测	SPA检测
			MG标准阳性血清	1∶1024	1∶8

2.2送检鸡血清样品的检测

从湖北、河南等地的3个鸡场共采集120份鸡血清，按本发明方法(GICA)进行试验。同时，用常规平板凝集(SPA)测定效价。(结果见5)。表5显示，GICA法检出率为44.17％(53/120)，SPA法为24.17％(29/120)，二者的符合率为61.67％((18+56)/120，(SPA和GICA同为阳性+SPA和GICA同为阴性)/总样品数)；SPA法检出率为24.17％(29/120)，比GICA法检出率低，是因为GICA法的敏感度比SPA高128倍(1024/8)，使得GICA法阳性时而SPA法为阴性，二者的符合率为61.67％((18+56)/120，(SPA和GICA同为阳性+SPA和GICA同为阴性)/总样品数)。

表5本发明的试剂盒与常规方法检测效果的比较

	阳性	阴性	阳性率
				本发明的方法(GICA)平板凝集(SPA)	5329	6791	44.17％24.17％

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种适用于检测鸡毒霉形体抗体的试剂盒，它包含盒体、设在盒体内的试纸卡和样品稀释液，其特征在于其中的试纸卡由试纸条与测试卡组成；试纸条由吸收垫(4)、硝酸纤维素膜(3)、金标垫(2)、样品垫(1)依次粘贴在不吸水的支撑薄片(7)上构成。所述的金标垫(2)上包被有胶体金标记的抗鸡IgG Fc片段单克隆抗体；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有鸡毒霉形体重组血凝素pMGA1.2蛋白构成的检测线(5)和兔抗鼠IgG构成的质控线(6)；所述的样品稀释液为蒸馏水。

2.权利要求1中所述的试剂盒在检测鸡毒霉形体抗体中的应用。

Images