CN101195645A - 抗乙肝病毒的鹊肾树提取物及其提取工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗乙肝病毒的鹊肾树提取物及其提取工艺，提取物是基本结构式为C₃－C₆－C₆－C₃的鹊肾树木脂素类化合物。提取工艺为：粉碎鹊肾树→乙醇或甲醇或水提取→提取液浓缩→浓缩液分别用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取→萃取物分别进行硅胶柱层析→用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、甲醇中的一种或一种以上梯度洗脱→鹊肾树木脂素类化合物。体外实验表明，对乙肝病毒HepG2.2.15细胞系HBsAg表达的抑制作用药物剂量在100μg/ml时抑制率达76.5％以上；对HbeAg表达的抑制作用药物剂量在100μg/ml时抑制率达81.6％以上。本发明不仅找到了抗乙肝病毒的一种新的中药药源，而且药物的提取工艺简单成熟，对开发高效低毒的抗乙肝病毒的新药有非常积极的意义。

Description

抗乙肝病毒的鹊肾树提取物及其提取工艺

技术领域：

本发明涉及中药及提取方法，具体说是抗乙肝病毒的鹊肾树提取物及其提取工艺。

背景技术：

乙肝是一种严重危害人类健康的传染病，引起该病的病原体是乙肝病毒。目前国内外治疗乙肝的药物主要用干扰素，核苷类药物，但这类药价格昂贵，治疗效果也只有30％左右，而且停止用药后，容易产生反复。我国是乙型肝炎高发区，现患病率为277人/万人，年发病率95人/万人，全国约有1.3亿人是乙肝病毒携带者，防治该病的任务繁重而又迫切。目前，越来越多的科技工作者把研究方向转向了来源丰富，价廉易得、毒副作用小的天然药物。

鹊肾树为桑科鹊肾树属植物，属于乔木或灌木，主要分布在广东、广西、云南、海南等省。鹊肾树具有多种药用疗效，其根提取液可以治疗发烧、痢疾、牙龈炎、口腔溃疡等，但鹊肾树提取物能有效抗乙肝病毒，及这种物质的提取工艺至今尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的是要提供一种能有效抗乙肝病毒的鹊肾树提取物及其提取工艺。

本发明的技术方案是：

本发明以鹊肾树的枝叶、心材、根、皮为原料经粉碎、提取、硅胶柱层析、洗脱得到鹊肾树提取物。

本发明的提取工艺包括如下步骤：

1.粉碎风干的鹊肾树枝叶、心材、根、皮；

2.用乙醇或甲醇或水提取，得提取液；

3.提取液浓缩得红色浓缩液，分别用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取、浓缩，得到各溶剂萃取物；

4.将上述各溶剂萃取物分别进行硅胶柱层析；

5.用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、甲醇中的一种或一种以上按不同比例梯度洗脱，得到鹊肾树木脂素类化物。

上述鹊肾树提取物经红外光谱，紫外光谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱的解析，并与文献对照，鉴定提取物的基本结构式为C₃-C₆-C₆-C₃，证实是包括乙芳基丁烷类、乙芳基丁烯类、芳基四氢萘类、芳基萘和芳基二氢萘类、四氢呋喃类、四氢呋类喃并四氢呋喃类、联苯环辛烯类、苯并呋喃类、二环辛烷类等木脂素类衍生物。

本发明利用2.2.15细胞培养系统对鹊肾树提取物进行抗乙肝病毒实验，结果表明：在体外实验中，具有较强的抗乙肝病毒作用，其有效部位经化学方法鉴定，证明，主要有效成分为木脂素类化合物。

鹊肾树提取物抑制乙肝病毒Hep G2的2.2.15细胞系50％活性时的药物浓度为IC₅₀(15ug/ml)，复筛药物浓度100ug/ml时，抑制率81.6％，实验证明：木脂素类化合物抗乙肝病毒作用强大，为高活性成分，正中开发抗乙用药物的靶点，对于开发高效低毒的天然抗乙肝冠状病毒的口服药、注射剂等药物具有重大意义；另外，鹊肾树为一味经典常用的中药，药性清楚，资源丰富，从鹊肾树中分离提取抗乙肝病毒有效成份的分离工艺成熟、简易；鹊肾树抗乙肝病素有效成分的化学结构与作用机理明确，以此开发抗乙肝病毒的新药前途非常光明。

具体实施方式：

实施例1：

(1)提取：取自然风干的鹊肾树枝叶、心材、根、皮2公斤，粉碎后用75％的乙醇回流提取，(3×30升)，合并提取液，过滤后回收溶剂，得红色浓缩液1000毫升，置于5000ml的分液漏斗中，分别用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂后，分别得到石油醚萃取物0.8克，乙醚萃取物3.2克，乙酸乙酯萃取物33克，正丁醇萃取物38克，水溶物87克。

(2)分离：

取乙醚萃取物3.2克进行硅胶柱层析(300-400目，200g)，用MeOH∶CHCL₃(0∶100→5∶95)梯度洗脱，得五个组分，重量分别是0.3g、0.6g、0.5g、0.2g和1.2g，再将每个组分分别经制备薄层层析，洗脱，分离得到3个纯化合物：木兰木脂素A(magnolignan A)、厚朴醛D(magnaldehyde D)、鹊肾树木脂素A(strebluslignan A)。

取乙酸乙酯萃取物33g进行硅胶柱层析(100-200目，1000g)用MeOH∶CHCL₃(0∶100→40∶60)梯度洗脱，得五个组分，重量分别是3.5g、4.0g、8.0g、6.0g和12g，再分别制备薄层层析分离得到2个纯化合物：鹊肾树木脂素B(streblusl ignan B)、落叶松树脂醇[(+)-isolariciresinol]。

取正丁醇萃取物38g进行硅胶柱层析(100-200目，200g)，用乙醇乙酯∶MeOH(0∶100→40∶60)梯度洗脱，得五个组分，重量分别是1.5g、5.6g、6.2g、4.3g和13.5g，再制备薄层层析分离得到4个纯化合物：木兰木脂素A-4′-O-β-D葡萄糖苷(magnolignan A 4′-O-β-D-glycoside)、(+)-lyoniresinol-2a-O-β-L-arabinopyranoside、5-甲基-9-β-木糖基-异落叶松树脂醇[5-methoxy-9-β-xylopyanosyl-(-)-isolariciresino]、9-β-木糖基-异落叶松树脂醇[9-β-xylopyanosyl-(-)-isolariciresinol]。.

实施例2：

鹊肾树正丁醇萃取物对HepG2.2.15、细胞系HBsAg和HbeAg表达的影响：

将HepG2.2.15细胞2×105/ml接种96孔细胞培养板中，每孔190ul，以800ug/ml、400ug/ml、200ug/ml、100ug/ml的药物浓度加入细胞培养板中，每个浓度设3孔，设10％DMSO组，3孔作用为阴性对照，分别于第3天，第6天取培养基上清液-20℃冻存，集中用ELISA法测定HBsAg、HbeAg，测定波长450nm处的吸光度，按下式计算药物对细胞的抑制率。

药物对HbsAg、HbeAg分泌的抑制率结果见表1、表2：

表1鹊肾树提取物对HepG2.2.15细胞系HbsAg表达的抑制作用(X±D，n＝3)

组别	剂量ug/ml	OD	第3天抑制率(％)	OD	第6天抑制率(％)
						10％DMSO		0.316±0.049		0.510±0.058
G5	800	0.017±0.004	97.4	0.011±0.001	100.0
						G5	400	0.042±0.024	89.3	0.032±0.021	96.0
G5	200	0.080±0.024	76.9	0.145±0.041	73.7
						G5	100	0.081±0.013	76.5	0.159±0.008	70.5

表2鹊肾树提取物对HepG2.2.15细胞系HbeAg表达的抑制作用(X±D，n＝3)

组别	剂量ug/ml	OD	第3天抑制率(％)	OD	第6天抑制率(％)
						10％DMSO		0.352±0.125		0.224±0.004
G5	800	0.018±0.019	48.8	0.016±0.03	98.1
						G5	400	0.024±0.065	31.4	0.018±0.005	97.0
G5	200	0.312±0.029	11.8	0.036±0.007	88.5
						G5	100	0.339±0.027	3.8	0.051±0.026	81.6

从以上实验可知，鹊肾树提取物在小剂量(100ug/ml)，中剂量(400ug/ml)和大剂量(800ug/ml)的抑制率在给药第3天分别为76.5％、89.3％、97.4％，第6天的抑制率分别为70.5％、96.0％、100％，对HBsAg平均抑制率分别为85.0％和85.1％，IC₅₀分别为64.68±56.12μg.mL^-1和63.98±51.02μg.mL^-1，结果表明该提取物具有很高的抗HbsAg表达的能力。当分别取小剂量(100ug/ml)，中剂量(400ug/ml)和大剂量(800ug/ml)进行抗HbeAg表达实验，抑制率于给药第3天分别是3.8％、31.4％、48.8％，效果不明显；但持续给药至第5天，其抑制率分别可以达到81.6％、97.0％、98.1％，平均抑制率为91.3％，IC₅₀为54.43±36.58μg.mL^-1，证明该提取物具有很强的抑制HbeAg表达的作用，从实验结果表明鹊肾树提取物具有很强的抗乙肝病毒的疗效。可以开发成片剂、胶囊、口服液、注射剂等剂型。

Claims (4)

1.一种抗乙肝病毒的鹊肾树提取物，其特征是：它由鹊肾树经粉碎、提取、浓缩、萃取、硅胶柱层析、洗脱得到的具有C₃-C₆-C₆-C₃基本化学结构的丙烯基酚及其衍生物和烯丙基酚及其衍生物的木脂素类化合物。

2.如权利要求1所述的鹊肾树提取物，其特征是：所述的鹊肾树木脂素类化合物包括乙醚萃取提取的3个化合物：木兰木脂素A即magnolignan A、厚朴醛D即magnaldehyde D、鹊肾树木脂素A即strebluslignan A，或乙酸乙酯萃取提取的2个化合物：鹊肾树木脂素B即strebluslignan B、落叶松树脂醇即(+)-isolariciresinol，或正丁醇萃取提取的4个化合物：木兰木脂素A-4′-O-β-D葡萄糖苷即magnolignan A 4′-O-β-D-glycoside、(+)-lyoniresinol-2a-O-β-L-arabinopyranoside、5-甲基-9-β-木糖基-异落叶松树脂醇即5-methoxy-9-β-xylopyanosyl-(-)-isolariciresino、9-β-木糖基-异落叶松树脂醇即9-β-xylopyanosyl-(-)-isolariciresinol。

3.抗乙肝病毒的鹊肾树提取物的提取方法，其特征是：包括如下步骤：

①.将风干的鹊肾树粉碎；

②.用乙醇或甲醇或水提取，得提取液；

③.提取液浓缩得红色浓缩液，分别用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取、浓缩，得到各溶剂萃取物；

④.将上述各溶剂萃取物分别进行硅胶柱层析；

⑤.用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、甲醇中的一种或一种以上按不同比例梯度洗脱，即得到基本化学结构为C₃-C₆-C₆-C₃的鹊肾树木脂素类化合物。

4.抗乙肝病毒的鹊肾树提取物，其特征是：将提取物鹊肾树木脂素化合物应用于抗乙肝病毒。