CN101191128A - 用单个小室破裂细胞并纯化核酸的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

提供了在单一芯片中破裂细胞或病毒并纯化核酸的方法，该方法包括：向芯片照射激光束，在芯片中，增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物顺序沉积在固体支持物上。通过开发可以在单个小室中进行细胞富集、细胞裂解、和核酸纯化的芯片，可以实现芯片实验室的集成化，所述三个工艺可以在一个芯片中进行，因此可以减少制造芯片的成本。

Description

用单个小室破裂细胞并纯化核酸的方法和装置
技术领域
本发明涉及用单个小室破裂细胞并纯化核酸的方法和装置。
背景技术
用具有结合DNA倾向的材料实施从细胞分离DNA的方法。用于DNA分离的材料的例子包括硅石、玻璃纤维、阴离子交换树脂和磁珠(Rudi，K.等，Biotechniqures 22，506-511(1997)；和Deggerdal，A.等，Biotechniqures 22，554-557(1997))。为了避免手工操作和去除操作误差，已经开发了几种自动化机器用于高生产率的DNA提取。
在分子生物学中，高纯度双链质粒DNAs、单链噬菌体DNAs、染色体DNAs、以及琼脂糖凝胶纯化的DNA片段的生产是非常重要的。纯化DNAs的理想方法应当简单快速，并且几乎不包括额外的样品操作。用这种方法获得的DNAs易于直接转化、限制酶分析、连接或测序。这样的方法在DNA样品的自动化生产中非常有吸引力，其在研究和诊断实验室中很受喜爱。
传统上，用固相纯化核酸的方法是已知的。例如，美国专利5,234,809披露了用结合核酸的固相纯化核酸的方法，该方法包括：混合起始材料、高渗(chaotropic)材料、和结合核酸的固相；从液体中将结合有核酸的固相分离并冲洗固相核酸复合物。然而，该方法是费时且复杂的，因此不适合于芯片实验室(Lab-On-a-Chip，LOC)。同时，该方法存在问题，因为需要用高渗材料。
美国专利6,291,166披露了用固相基质获取核酸的方法。由于核酸不可逆地结合于固相基质，因而存储后对核酸固相基质复合物的延迟分析或重复分析是可能的，因此该方法具有优势。然而，根据该方法，具有正电荷表面的矾土(Al2O3)需要用碱性材料如NaOH亲水化处理，核酸不可逆地结合于亲水化处理的矾土，因此不能从矾土分离。
美国专利6,936,414披露了从试样分离核酸的方法，该方法包括：使试样与金属氧化物支持材料和结合缓冲液接触以形成核酸/金属氧化物支持材料复合物；从试样分离该复合物；并从金属氧化物支持材料洗脱核酸。然而，尽管美国专利6,936,414中公开的发明在使用金属氧化物与核酸的结合方面同本发明类似，但美国专利6,936,414所公开的发明不同于本发明，因为核酸结合于金属氧化物支持物时，美国专利6,936,414所公开的发明使用高渗盐和去垢剂作为结合材料，但本发明不是。
本发明的发明人研究了基于上述传统技术的破裂细胞和纯化核酸的方法，并证实通过开发进行细胞富集、细胞裂解的技术、以及芯片实验室技术在单个小室中所需的纯化核酸方法，可以实现芯片实验室的集成化，并因此完成了本发明。
发明内容
本发明提供在单个芯片中破裂细胞或病毒并纯化核酸的方法，该方法包括：向芯片照射激光束，在所述芯片中，增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物顺序沉积在固体支持物上。
本发明还提供用单个小室破裂细胞或病毒并纯化核酸的方法，该方法包括：
将增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物顺序沉积在固体支持物上；
将含细胞或含病毒的溶液加到固体支持物上，以用结合细胞或病毒和核酸的沉积的金属氧化物结合细胞或病毒，其中增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物沉积在所述固体支持物上；
通过照射激光束破裂结合于结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物的细胞或病毒，以用结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物结合核酸；
用冲洗缓冲液冲洗未结合于结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物的试样；和
通过添加核酸洗脱缓冲液洗脱结合于结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物的核酸。
本发明还提供芯片，其中将增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物顺序沉积在固体支持物上。
本发明还提供用单个小室破裂细胞并纯化核酸的装置，该装置包括：芯片，其中将增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物顺序沉积在固体支持物上；和产生激光的部件。
附图说明
通过参考附图详细描述本发明的示例性实施方案，本发明上述的以及其他的特征和优势将更为明显，其中：
图1图示根据本发明的实施方案，在单个小室中浓缩细胞并纯化核酸的方法；
图2为根据本发明实施方案的固体支持物即具有柱状结构的芯片的视图，金属氧化物沉积在所述固体支持物上；
图3A图示芯片的上部、中部和下部，其中用作细胞裂解增强层的金属氧化物沉积在芯片上；
图3B为在上述各个位置拍摄的图3A芯片的一系列场致发射扫描电子显微镜(FE-SEM)图像；
图4为FE-SEM图像，其显示根据不同类型芯片的大肠杆菌(E.coli)细胞的结合效率；
图5为FE-SEM图像，其显示根据不同类型芯片的大肠杆菌细胞裂解；
图6为显示大肠杆菌基因组DNA(gDNA)的洗脱效率相对于冲洗缓冲液和核酸洗脱缓冲液的图表；
图7为显示洗脱DNA相对于输入大肠杆菌细胞浓度的定量曲线图；和
图8为显示PCR产物相对于输入大肠杆菌细胞浓度的定量曲线图。
具体实施方式
现在将参考附图更为详细地描述本发明，附图中显示本发明的示例性实施方案。
本发明提供在单个芯片中破裂细胞或病毒并纯化核酸的方法，该方法包括：向芯片照射激光束，在所述芯片中，增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物顺序沉积在固体支持物上。
在根据本发明实施方案的方法中，细胞或病毒破裂和核酸纯化在单个芯片中进行。在芯片中，增强细胞裂解的金属氧化物首先沉积，然后能够与细胞或病毒和核酸结合的金属氧化物沉积，当激光照射到芯片时，细胞或病毒裂解，随后可以在单个芯片中从裂解的细胞或病毒纯化核酸。
本发明还提供用单个小室破裂细胞或病毒并纯化核酸的方法，该方法包括：将增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物顺序沉积在固体支持物上；向沉积增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物的固体支持物添加含细胞或含病毒的溶液，以用沉积的结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物结合细胞或病毒；通过照射激光束破裂结合于结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物的细胞或病毒，以用结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物结合核酸；用冲洗缓冲液冲洗未结合于结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物的试样；和通过添加核酸洗脱缓冲液洗脱结合于结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物的核酸。
在根据本发明实施方案的方法中，可以在单个小室中进行细胞浓缩、细胞裂解和核酸纯化。在传统方法中，从细胞浓缩到核酸纯化需要许多步骤，每个步骤都需要小室，并且需要许多阀和泵。因此，所述方法不能在单个小室中进行。
图1示例根据本发明的实施方案，在单个小室中浓缩并破裂细胞，并由此纯化核酸的方法。参见图1，用具有疏水特性的金属氧化物对柱状结构进行表面处理，并因此浓缩细胞。随后，通过吸收具有激光波长的光，向柱状结构施加细胞裂解增强层以裂解浓缩的细胞。用冲洗缓冲液和洗脱缓冲液处理裂解的细胞以进行核酸纯化。上述所有过程均在单个小室中进行。
根据本发明的实施方案，使金属氧化物沉积在固体支持物上，然后向固体支持物添加含细胞或含病毒的溶液，由此细胞或病毒结合到所述固体支持物。然后，向结合的细胞或病毒照射激光束，由此破裂结合到固体支持物的细胞或病毒，且通过细胞或病毒的破裂而释放的核酸结合到固体支持物。随后，用冲洗缓冲液冲洗未结合到固体支持物的杂质如细胞碎片和蛋白质。然后通过添加核酸洗脱缓冲液洗脱结合到固体支持物的核酸。最后，洗脱的核酸可用于随后的进程。
在根据本发明当前实施方案的方法中，通过首先沉积增强细胞裂解的金属氧化物，然后沉积在其上可以结合细胞的金属氧化物，完成金属氧化物在固体支持物上的沉积。增强细胞裂解的金属氧化物是具有下述层的材料，所述层能够通过照射激光束而增强细胞裂解，行使与磁珠实施细胞裂解类似的功能，其可以是金属氧化物如Fe2O3。其中可以结合细胞的金属氧化物具有结合细胞的倾向，该金属氧化物可以是Al2O3。其中可以结合细胞的金属氧化物也应当是透明的，以使激光束可以透过，然后到达增强细胞裂解的金属氧化物，并且能够与由激光束破裂的细胞或病毒的核酸结合。图2为根据本发明实施方案的固体支持物即具有柱状结构的芯片的视图，其中，金属氧化物沉积于固体支持物上；在图2中，Fe2O3用作增强细胞裂解的金属氧化物，Al2O3用作可以结合细胞的金属氧化物。Fe2O3吸收具有808nm波长的激光束，因此增强细胞裂解。
在根据本发明当前实施方案的方法中，结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物，或者增强细胞裂解的金属氧化物可以是但不限于Al2O3、TiO2、Ta2O3、Fe2O3、Fe3O4、或HfO2。优选结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物是Al2O3，增强细胞裂解的金属氧化物是Fe2O3。
在根据本发明当前实施方案的方法中，固体支持物可以是玻璃载片、硅片、磁珠、聚苯乙烯、膜(membrane)、金属板，等等，但不限于这些。所述固体支持物可以是其上能够沉积金属氧化物的任何不溶于水的支持材料。当固体支持物可溶于水时，核酸纯化后很难从固体支持物分离核酸溶液。此外，希望所用的固体支持物具有大的表面积，因为可以在其上沉积更多的金属氧化物。因此，对于平面支持材料如玻璃或薄片，对平面支持材料进行表面处理使其具有柱状(pillar)结构以增加其表面积。
在根据本发明当前实施方案的方法中，含细胞或含病毒的溶液可以具有3-10的pH。当含细胞或含病毒溶液的pH超出该范围时，结合于固体支持物的细胞或核酸的结合效率下降，DNA可能物理和化学变性，其中固体支持物上沉积有结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物。因此，可能影响随后的进程。
在根据本发明当前实施方案的方法中，冲洗缓冲液可以具有3-10的pH。当冲洗缓冲液的pH超出该范围时，核酸结合于固体支持物的结合效率下降，DNA可能物理和化学变性，其中金属氧化物沉积于固体支持物上。因此，可能影响随后的进程。
在根据本发明当前实施方案的方法中，含细胞或含病毒的溶液、冲洗缓冲液和核酸洗脱缓冲液可以是磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、Tris、硫酸盐等，但不限于这些。
在根据本发明当前实施方案的方法中，含细胞或含病毒溶液的浓度可以在10-1,000mM范围内。当含细胞或含病毒溶液的浓度小于10mM时，结合于固体支持物的细胞或病毒的结合效率下降，其中在固体支持物上沉积有结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物。当含细胞或含病毒溶液的浓度大于1,000mM时，很难制备溶液。
在根据本发明当前实施方案的方法中，冲洗缓冲液的浓度可以为10-1,000mM。当冲洗缓冲液的浓度小于10mM时，杂质例如细胞碎片或蛋白质的冲洗效率下降。当冲洗缓冲液的浓度大于1,000mM时，很难制备溶液。
在根据本发明当前实施方案的方法中，核酸洗脱缓冲液可以具有8-10的pH。当核酸洗脱缓冲液的pH小于8时，核酸的洗脱效率下降。当核酸洗脱缓冲液的pH大于10时，可能影响随后的进程。
在根据本发明当前实施方案的方法中，核酸洗脱缓冲液的浓度可以为10-100mM。当核酸洗脱缓冲液的浓度超出该范围时，结合于固体支持物的核酸的洗脱效率下降，也可能影响随后的进程，其中在固体支持物上沉积有金属氧化物。
在根据本发明当前实施方案的方法中，可以通过物理气相沉积(PVD)、原子层沉积(ALD)、溶胶-凝胶法等等沉积金属氧化物。通常，可以用已知的技术例如PVD、ALD、溶胶-凝胶法等等将金属氧化物沉积在固体支持物上。
PVD是用于形成薄膜的方法，最近作为表面固化(surface curing)的手段而倍受喜爱，因为薄膜可以通过低温处理相对简单地获得，而不能用其它方法实施。PVD方法的例子包括不使用离子的蒸发沉积法、使用离子的溅射法、离子电镀法、离子植入法、离子束混合法等等。近来，离子电镀法、离子植入法、离子束混合法等等的使用受到欢迎，因为可以在低温下有效地使用离子能量形成优异的薄膜。在真空中加热时金属将蒸发，将这个原理应用在蒸发沉积法中。该方法在小于10-5Torr的高真空条件下进行，使用金属或多种化合物中的一种作为覆层材料。该方法应用于光学元件如透镜、镜子等、各种各样的电气元件和塑料元件中，但仅仅用于表面固化。当高能粒子与目标材料碰撞时，原子或分子从目标材料弹射出来，这个现象称为溅射。在溅射中，目标材料和基底分别形成阳极和阴极，然后在氩气氛中将约10-2 Torr的高压施加在阳极和阴极之间，结果，阳极周围的氩气电离为Ar+，然后Ar+与阳极碰撞。通过离子轰击弹射出来的分子或原子结合于基底即阴极，形成薄膜。溅射的例子包括DC溅射、RF溅射、偏置溅射(bias sputtering)、磁控溅射等等，并且特别地，磁控溅射为高速溅射方法，在多个领域均受到偏爱。通过PVD离子电镀法，可以获得具有最佳粘着力和微米(μm)以上厚度的硬膜，这样该方法也可应用于例如工具或模型(mold)等领域。
在ALD方法中，利用化学粘附特性将分子吸收到薄片表面中然后取代。由于吸收和取代是交替进行的，因而一层层的超细层沉积是可能的，氧化物和金属薄膜可以尽可能薄地堆叠。同时，与利用化学气相淀积(CVD)法相比，可以在更低温度(小于500℃)下形成良好的薄膜，因此ALD法适合于芯片系统(System-on-Chip，SoC)的制造。
在溶胶-凝胶法中，通过金属卤化物或醇盐的水解反应制备具有胶体形式的金属氧化物。溶胶-凝胶法是制备二氧化钛(TiO2)涂层溶液的代表性方法。所制备的二氧化钛的物理特性如颗粒大小、晶体特性等受所使用的醇盐种类、反应条件(温度、pH、反应物之间的摩尔比)等的影响。
在根据本发明当前实施方案的方法中，细胞或病毒结合于固体支持物的工艺和核酸洗脱工艺可以在静态或流体条件下进行。可以在静态条件下，也可以在流体条件下将细胞或病毒与固体支持物接触。也就是说，通过在流体控制系统中使含细胞或病毒的溶液流动而将细胞或病毒与固体支持物接触。在流体控制系统中，固体支持物可以具有平面形式，但也可以具有与更多的细胞或病毒结合的柱状结构，此柱状结构增加了固体支持物与细胞或病毒接触的机会。
在根据本发明当前实施方案的方法中，可以额外包括从固体支持物洗脱核酸，然后检测洗脱的核酸的工艺。可以用电泳法、核苷酸测序、限制酶分析等检测洗脱的核酸。
在根据本发明当前实施方案的方法中，可以额外包括从固体支持物洗脱核酸，然后扩增洗脱的核酸的工艺。当洗脱的核酸的量太少而不可能直接检测时，用PCR法扩增洗脱的核酸，以使核酸可以很容易检测。
在根据本发明当前实施方案的方法中，核酸扩增工艺可以无需去除核酸洗脱缓冲液而进行。核酸洗脱缓冲液具有非常类似于用于核酸扩增的缓冲液的组成，因此在洗脱缓冲液中洗脱的核酸可以直接扩增而无需去除洗脱缓冲液。
在根据本发明当前实施方案的方法中，激光可以是脉冲激光或连续波激光。脉冲激光应当具有大于1mJ/脉冲的输出，连续波激光应当具有大于10mW的输出。优选脉冲激光的输出大于3mJ/脉冲，连续波激光的输出大于100mW。当脉冲激光的输出小于1mJ/脉冲和连续波激光的输出小于10mW时，激光不能传输足够的能量以破裂细胞，这可能是个问题。
在根据本发明当前实施方案的方法中，可以产生大于400nm波长范围内的激光，优选在750nm-1,300nm范围内。当激光具有小于400nm的波长范围时，DNA可能变性或被破坏，同时也可以产生至少一种波长范围内的激光，即激光可以具有上述波长范围内的一种波长，也可以具有超过两种的不同波长。
根据本发明的另一实施方案，提供了以下芯片，其中增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物顺序沉积在固体支持物上。
根据本发明当前的实施方案，设置所述芯片以在所述芯片中实施细胞或病毒裂解和核酸纯化工艺。在所述芯片中，首先沉积增强细胞裂解的金属氧化物，其中通过照射激光束来增强细胞裂解，然后沉积可以与细胞或病毒和核酸结合的金属氧化物。因此，在单个芯片中，细胞或病毒被裂解，随后可以从所裂解的细胞或病毒纯化核酸。
所述固体支持物优选可以具有大的表面积以便更多的金属氧化物沉积在其上。对于平面支持物如玻璃或薄片，可以处理其表面使之具有柱状结构以增加表面积。因此，固体支持物可以具有平面或柱状结构。
在根据本发明当前实施方案的芯片中，能够与细胞或病毒和核酸结合的金属氧化物或增强细胞裂解的金属氧化物可以是Al2O3、TiO2、Ta2O3、Fe2O3、Fe3O4、或HfO2等等，但不限于这些。优选能够与细胞或病毒和核酸结合的金属氧化物是Al2O3，且增强细胞裂解的金属氧化物是Fe2O3。
根据本发明的另一实施方案，破裂细胞并纯化核酸的装置包括包含芯片的单个小室，在所述芯片中，增强细胞裂解的金属氧化物，和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物顺序沉积在固体支持物上；还包括产生激光的部件。
根据本发明当前实施方案的用于破裂细胞和纯化核酸的装置包括与细胞或病毒和核酸结合并洗脱核酸的芯片，以及提供激光以破裂结合于芯片的细胞或病毒的产生激光的部件。在所述装置中，破裂细胞或病毒并纯化核酸在单个小室中进行。
在根据本发明当前实施方案的装置中，固体支持物可以是玻璃载片、硅片、磁珠、聚苯乙烯、膜、金属板，等等，但不限于这些。所述固体支持物可以是其上能够沉积金属氧化物的任何材料，但应当是不溶于水的。当所述固体支持物可溶于水时，在核酸纯化后很难从核酸溶液分离固体支持物。同时，固体支持物可以具有大的表面积以便能够在其上沉积大量的金属氧化物。对于平面支持材料如玻璃或薄片，可以将其表面处理为具有柱状结构以增加表面积。因此，固体支持物可以具有平面或柱状结构。
在根据本发明当前实施方案的装置中，能够与细胞或病毒和核酸结合的金属氧化物或增强细胞裂解的金属氧化物可以是但不限于Al2O3、TiO2、Ta2O3、Fe2O3、Fe3O4、或HfO2等。优选能够与细胞或病毒和核酸结合的金属氧化物是Al2O3，且增强细胞裂解的金属氧化物是Fe2O3。
在根据本发明当前实施方案的装置中，激光可以是脉冲激光或连续波激光。脉冲激光应当具有大于1mJ/脉冲的输出，连续波激光应当具有大于10mW的输出。优选脉冲激光的输出大于3mJ/脉冲，连续波激光的输出大于100mW。当脉冲激光的输出小于1mJ/脉冲和连续波激光的输出小于10mW时，激光不能传输足够的能量以破裂细胞，这可能是个问题。
在根据本发明当前实施方案的装置中，可以产生大于400nm波长范围内的激光，优选在750nm-1,300nm范围内。当激光在小于400nm的波长范围时，DNA可能变性或被破坏，同时也可以产生至少一种波长范围内的激光，即激光可以具有上述波长范围内的一种波长，也可以具有超过两种的不同波长。
以下将参考下述的实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅仅用于说明性目的，而不意味着限制本发明的范围。
实施例
实施例1：其上沉积金属氧化物的芯片的制造
通过等离子体辅助沉积(PAD)的PVD法并通过ALD制造其上沉积金属氧化物的芯片。首先通过光刻技术和干蚀刻形成柱状物。现在详细描述这些方法。采用旋涂法以4000 RPM用正性光刻胶(型号：AZ1512)涂覆4-英寸薄片40秒，然后95℃烘烤1.5分钟。在光刻机(aligner)(型号：EV620)中，向正性光刻胶涂覆的薄片照射I-line紫外光(波长：365nm)4.5秒，然后用显影剂(型号：AZ MIF 300)去除暴露于紫外光的正性光刻胶，形成柱状样式(pillarpattern)。用干蚀刻器(型号：ICP-STS)将所获得的具有柱状样式的薄片干蚀刻至100μm的深度，最终形成长方体柱状物，每个长方体柱状物具有25μm×25μm×100μm(宽×长×高)的尺寸。采用等离子体辅助沉积法(PAD，型号：APS1104)将用作细胞裂解增强层的Fe2O3金属氧化物在长方体柱状物表面上沉积至300nm深度。随后，用阳极结合装置(anodic binding apparatus)(型号：TPS-1000)在370℃同时施加700V电压的条件下，将具有1mm直径小孔的玻璃板偶联到具有所述柱状物的芯片。然后用ALD装置(原子层沉积，型号：MOOHAN)在400℃下将用作细胞结合和基因结合层的金属氧化物Al2O3在芯片上沉积至100埃米的深度，制成所述芯片。
图3A示例芯片的上部、中部和下部，在所述芯片上沉积有用作细胞裂解增强层的金属氧化物，图3B为在上述各个位置拍摄的所述芯片的一系列场致发射-扫描电子显微镜(FE-SEM)图像。由图3B可以看到，形成了直至柱状物内部的具有100μm深度的Fe2O3沉积膜，因此认为增强细胞裂解的金属氧化物的沉积是令人满意的。
实施例2：用芯片进行细胞结合
测定在流体控制系统中细胞是否结合于根据本发明实施方案的芯片。首先，将用滤纸(孔径6μm，Whatman)过滤的唾液和大肠杆菌BL21(StratagenCat.200133)细胞的混合物用作含细胞的样品。用注射泵(HARVARD，PHD2000)将1∶1的样品(细胞浓度：OD600＝0.001)和结合缓冲液(100mM磷酸盐缓冲液，pH4)的680μl混合物以400μl/min的流速注射到所述芯片，然后大肠杆菌细胞结合到所述芯片。
图4为一系列FE-SEM图像，其显示根据不同类型芯片的大肠杆菌细胞的结合效率。图4中，Fe2O3/Al2O3芯片使用Fe2O3作为增强细胞裂解的金属氧化物，使用Al2O3作为能够与细胞结合的金属氧化物。图4中，Al2O3芯片只使用Al2O3作为金属氧化物，对照使用Fe2O3/Al2O3芯片，不含大肠杆菌细胞的结合缓冲液由其中通过。在所述芯片中，使用平板培养法分析大肠杆菌的结合效率，即通过将通过芯片之前和之后的溶液在包含大肠杆菌生长培养基的petri培养皿中平板接种(plating)来测定结合效率。用LIVE/DEAD
Figure A20061016363500131
BacLightTM细菌生存力试剂盒(Molecular probe制造)测定细胞是否结合于根据本发明的芯片。用包括于LIVE/DEAD
Figure A20061016363500132
BacLightTM细菌生存力试剂盒中的Cyto9核酸染料将活细胞染成绿色，用PI(碘化丙锭)染料将死亡细胞染成红色。
由图4可以看到，在Cyto9/PI染色情况下，活的大肠杆菌与Fe2O3/Al2O3芯片和Al2O3芯片结合，因此显示所期望的绿色图像，而由于不存在细胞因而对照芯片不显示绿色图像。同样，大肠杆菌与Fe2O3/Al2O3芯片和Al2O3芯片的结合效率约为80％，因此认为大肠杆菌有效地结合于所述芯片。
实施例3：用芯片裂解细胞
通过向结合于实施例2所述芯片的细胞照射激光束来进行细胞裂解测试。向Fe2O3/Al2O3芯片、Al2O3芯片和对照芯片照射2W激光束40秒以裂解细胞。细胞裂解后，用LIVE/DEAD
Figure A20061016363500141
BacLightTM细菌生存力试剂盒进行染色。图5为FE-SEM图像，其显示根据不同类型芯片的大肠杆菌细胞裂解。由图5可以看到，与Al2O3芯片的红色相比，Fe2O3/Al2O3芯片具有更高的红色强度，由于不存在细胞，因而对照芯片不显示红色图像。因此，可以看到能够有效地裂解结合于根据本发明实施方案的芯片的细胞，同时，与不使用增强细胞裂解的金属氧化物(本实施例中为Fe2O3)相比，当使用增强细胞裂解的金属氧化物(本实施例中为Fe2O3)时可以更为有效地进行细胞裂解。
实施例4：用芯片纯化核酸
实施了纯化核酸的试验，所述核酸由实施例3中裂解的细胞所释放。为了去除杂质，用注射泵(HARVARD，PHD2000)以100μl/min的流速向芯片注射冲洗缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，pH4)，所述杂质不包括由激光辐照裂解的细胞溶解产物中的大肠杆菌基因组DNA。随后，为了洗脱冲洗过的核酸，用注射泵(HARVARD，PHD2000)以1000μl/min的流速向芯片注射核酸洗脱缓冲液(50mM Na2SO4，pH10)。
图6是显示依据冲洗缓冲液和核酸洗脱缓冲液的大肠杆菌基因组DNA(gDNA)洗脱效率的图表。图6中，W1和W2分别表示冲洗缓冲液的25μl级分，E1至E6分别表示核酸洗脱缓冲液的25μl级分。同样，洗脱效率指各个级分的大肠杆菌基因组DNA相对于大肠杆菌基因组DNA全部洗脱量的洗脱量。由图6可以看到，就Fe2O3/Al2O3芯片和Al2O3芯片来说，在冲洗缓冲液中大肠杆菌基因组DNA几乎不被洗脱，而在核酸洗脱缓冲液中大多数大肠杆菌基因组DNAs被洗脱。因此，可以看到，当使用根据本发明实施方案的方法时，在单个小室中裂解细胞后可以有效地纯化核酸。
实施例5：用芯片富集细胞
用根据本发明实施方案的芯片测定细胞富集的效果。使用根据实施例4从大肠杆菌纯化大肠杆菌基因组DNA的方法，量化相对于输入的大肠杆菌浓度的纯化的大肠杆菌基因组DNAs。实施测定细胞富集的方法以便在Eppendorf试管中根据大肠杆菌细胞浓度通过激光裂解大肠杆菌，然后用picogreen定量DNA。基于此，绘制了裂解后洗脱的DNA相对于细胞浓度的定量曲线，然后将从根据本发明实施方案的芯片得到的洗脱DNA的量转换为细胞浓度以计算富集效率。
图7为洗脱DNA相对于输入的大肠杆菌细胞浓度的定量曲线图。由图7可以看到，输入的大肠杆菌细胞浓度几乎与洗脱的大肠杆菌基因组DNA的量成正比。用图7的定量曲线将大肠杆菌基因组DNA转换为细胞浓度，结果如表1所示，其中所述大肠杆菌基因组DNA用根据本发明实施方案的芯片纯化。
表1
  Fe2O3/Al2O3芯片   Al2O3芯片
  输入细胞浓度(OD)   0.001   0.001
  输出细胞浓度(OD)   0.014   0.016
  富集率   14倍   16倍
由表1可以看到，当使用根据本发明实施方案的芯片时，大肠杆菌细胞被富集高达14倍至16倍。因此，当由具有非常低的细胞浓度的试样检测核酸时，可以有效地使用根据本发明实施方案的方法。
实施例6：用芯片纯化的核酸的PCR扩增
用根据本发明实施方案的芯片纯化的核酸实施PCR。在本领域技术人员已知的标准条件下实施PCR。用根据实施例4的从大肠杆菌细胞纯化大肠杆菌基因组DNA的方法测定了相对于输入大肠杆菌细胞浓度的纯化的大肠杆菌基因组DNA PCR扩增产物。实施测定细胞富集的方法以便在Eppendorf试管中根据大肠杆菌细胞浓度由激光裂解大肠杆菌细胞，然后PCR扩增大肠杆菌基因组DNA并用Labship定量。基于此，绘制了裂解后PCR产物相对于细胞浓度的定量曲线，然后将PCR产物的量转换为细胞浓度以计算富集效率。
图8为PCR产物相对于输入大肠杆菌细胞浓度的定量曲线图。由图8可以看到，输入的大肠杆菌的细胞浓度几乎与PCR产物的量成正比。用图8的定量曲线将PCR产物转换为细胞浓度，所述PCR产物使用根据本发明实施方案的芯片，结果如表2所示。
表2
  Fe2O3/Al2O3芯片   Al2O3芯片
  输入细胞浓度(OD)   0.001   0.001
  PCR产物的量(ng)   0.88   0.65
  输出细胞浓度(OD)   0.005   0.003
  富集率   5倍   3倍
由表2可以看到，当使用根据本发明实施方案的芯片时，大肠杆菌细胞被浓缩高达3倍至5倍。上述结果显示了与表1细胞富集结果的差异，但认为这是量化DNA的方法的差异。
根据本发明，通过开发可以在单个小室中进行细胞富集、细胞裂解和核酸纯化的芯片，可以实现芯片实验室的集成化，所述三个工艺可以在一个芯片中进行，因此可以减少制造芯片的成本。
虽然已经详细地展示了本发明并参考其示例性实施方案描述了本发明，但本领域普通技术人员会了解，在不脱离权利要求书限定的本发明的精神和范围的前提下，可以做出多种形式上和细节上的改变。

Claims (24)

1.在一个芯片中破裂细胞或病毒并纯化核酸的方法，所述方法包括：
向芯片照射激光束，在所述芯片中，增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物顺序沉积在固体支持物上。
2.用单个小室破裂细胞或病毒并纯化核酸的方法，所述方法包括：
将增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物顺序沉积在固体支持物上；
将含细胞或含病毒的溶液加到固体支持物上，以用结合细胞或病毒和核酸的沉积的金属氧化物结合细胞或病毒，其中增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物沉积在所述固体支持物上；
通过照射激光束破裂结合于结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物的细胞或病毒，以用结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物结合核酸；
用冲洗缓冲液冲洗未结合于结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物的试样；以及
通过添加核酸洗脱缓冲液洗脱结合于结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物的核酸。
3.权利要求2的方法，其中所述增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物选自Al2O3、TiO2、Ta2O3、Fe2O3、Fe3O4和HfO2。
4.权利要求2的方法，其中所述增强细胞裂解的金属氧化物是Fe2O3，所述结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物是Al2O3。
5.权利要求2的方法，其中所述固体支持物选自玻璃载片、硅片、磁珠、聚苯乙烯、膜和金属板。
6.权利要求2的方法，其中含细胞或含病毒的溶液和冲洗缓冲液具有3-10的pH。
7.权利要求2的方法，其中所述含细胞或含病毒的溶液、冲洗缓冲液和核酸洗脱缓冲液选自磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐和Tris。
8.权利要求2的方法，其中所述含细胞或含病毒的溶液和冲洗缓冲液具有10-1,000mM的浓度。
9.权利要求2的方法，其中核酸洗脱缓冲液具有8-10的pH。
10.权利要求2的方法，其中核酸洗脱缓冲液具有10-100mM的浓度。
11.权利要求2的方法，其进一步包括从固体支持物洗脱核酸后，检测或扩增洗脱的核酸。
12.权利要求11的方法，其中核酸的扩增在不去除核酸洗脱缓冲液的情况下进行。
13.权利要求2的方法，其中所述激光是脉冲激光或连续波激光。
14.权利要求13的方法，其中脉冲激光具有超过1mJ/脉冲的输出，且连续波激光具有超过10mW的输出。
15.芯片，其中增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物顺序沉积在固体支持物上。
16.权利要求15的芯片，其中所述固体支持物具有平面或柱状结构。
17.权利要求15的芯片，其中所述增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物选自Al2O3、TiO2、Ta2O3、Fe2O3、Fe3O4和HfO2。
18.权利要求17的芯片，其中所述增强细胞裂解的金属氧化物是Fe2O3，所述结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物是Al2O3。
19.用单个小室破裂细胞并纯化核酸的装置，所述装置包括：
芯片，其中增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物顺序沉积在固体支持物上；和
产生激光的部件。
20.权利要求19的装置，其中所述固体支持物具有平面或柱状结构。
21.权利要求19的装置，其中所述增强细胞裂解的金属氧化物、和结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物选自Al2O3、TiO2、TaO3、Fe2O3、Fe3O4和HfO2。
22.权利要求20的装置，其中所述增强细胞裂解的金属氧化物是Fe2O3，所述结合细胞或病毒和核酸的金属氧化物是Al2O3。
23.权利要求19的装置，其中所述激光是脉冲激光或连续波激光。
24.权利要求23的装置，其中脉冲激光具有大于1mJ/脉冲的输出，连续波激光具有大于10mW的输出。
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