CN101182498A - 一种磷脂酶d的生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种磷脂酶D的生产方法，涉及发酵领域。本发明采用固态发酵的方法生产磷脂酶D，以小麦、麸皮、豆饼粉和麦糟为固态基质，并添加磷酸二氢钾、七水硫酸镁、葡萄糖等物质，通过固态发酵生产磷脂酶D。采用肉桂链轮丝菌进行发酵，接种量为固体培养基总质量的5％～10％(体积质量比)，发酵初始水份为56％～68％；发酵初始pH 6.8～7.2，发酵过程品温25～32℃，发酵时间72～120小时。本发明具有单位基质酶活水平高，发酵周期短，生产成本低等优点，为实际大规模应用提供了便利条件。
Description
技术领域
一种磷脂酶D的生产方法，涉及发酵领域。具体的说是采用固态发酵的方法生产磷脂酶D，以小麦、麸皮、豆饼粉和麦糟为固态基质，并添加磷酸二氢钾、七水硫酸镁、葡萄糖等物质，通过固态发酵生产磷脂酶D。
背景技术
磷脂作为一种生物活性物质，有着独特的理化性质和营养价值，在世界范围内的食品、保健品、医药以及饲料行业已被广泛使用。磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)是磷脂家族中的一员，近20年来国内外的动物试验及临床应用，表明PS对改善记忆和认知能力、防治老年痴呆症、抑郁症及缓解精神压力都有显著疗效。
目前大规模生产磷脂酰丝氨酸的重要性不仅仅在于其生物学及工业化应用潜力，同时也与其在保健、营养品方面的逐渐应用有关。然而无论从自然界分离提取或化学合成法生产磷脂酰丝氨酸都十分复杂，目前研究人员正寻求利用酶特别是磷脂酶D进行酶法转化来定向合成磷脂酰丝氨酸，如专利申请文献1～3。[专利申请文献1：公开号CN155288A；专利申请文献2：公开号CN1897919A；专利申请文献3：公开号CN1468314A]
磷脂酶D(Phospholipase D，PLD；EC 3111414)首先发现于植物中(如卷心菜、花生等作物)，之后在微生物(链霉菌、大肠杆菌、沙门氏菌等)和哺乳动物细胞中均有发现。它不但可以水解卵磷脂生成磷酸脂和胆碱，通过打断其磷酸酯键完成反应，而且当有分子作为亲核供体时，磷脂酶D能催化转酯反应。同时，来自微生物界的磷脂酶D相对于来自植物界的有更强大的转酯能力，底物特异性低。其中又以源自链霉菌属的磷脂酶D的转酯能力尤为突出。
但是，目前采用液体发酵产酶水平低、发酵周期长(一般要接近7天)、生产成本高等缺点给实际应用带来了很多困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种磷脂酶D的生产方法，用固态发酵，具有单位基质酶活高，发酵周期短，生产成本低等特点，为大规模应用提供了便利条件。
本发明的技术方案：一种磷脂酶D的生产方法，以小麦、麸皮、豆饼粉和麦糟为固态基质，并添加磷酸二氢钾、七水硫酸镁和葡萄糖，通过固态发酵生产磷脂酶D；
以肉桂链轮丝菌AS 4.1084为出发菌株；该菌株详见中国科学院典型培养物保藏委员会菌种目录网页http://www.ctcccas.ac.cn/，本申请人亦可向公众提供。
固态基质：以麦糟为基本质量单位，小麦、麸皮、豆饼粉添加比例为：小麦添加麦糟质量的2％～5％，麸皮添加麦糟质量的5％～10％，豆饼粉添加麦糟质量的3％～8％；固态基质按常规加水进行蒸煮备用；
磷酸二氢钾的添加量为固态基质和水总质量的0.1％～0.4％，七水硫酸镁的添加量为固态基质和水总质量的0.03％～0.075％，葡萄糖的添加量为固态基质和水总质量的0.4％～1％；
固态发酵条件：接种量为：菌株的种子培养液与固态培养基总质量的体积质量比为5％～10％，发酵初始水份为56％～68％；发酵初始pH 6.8～7.2，发酵过程品温25～32℃，发酵时间72～120小时。
所述的磷脂酶D的生产方法，麦糟改用麦糟、玉米芯、干玉米秸秆中的任意一种或几种的组合物替代。
所述的磷脂酶D的生产方法，麦糟、玉米芯、干玉米秸秆需粉碎，粉碎的细度为1～3cm。
本发明所述的肉桂链轮丝菌AS 4.1084购自中国科学院典型培养物保藏委员会。
本发明所述方法中其它没有具体描述的部分均采用本技术领域公知的或已公开报道的方法。在本发明所进行的描述中，如无特别说明均为质量百分比。
本发明的有益效果：1)固态发酵是一种传统的发酵方法，由于固态发酵水分少，每克基质的体积小，这将带来一系列的好处：如a、要处理的废水量很少；b、产品浓缩在基质里，往往不要过滤浓缩就可以使用；c、即使要萃取制成酶制剂，所需的溶剂量较少；d、成品储藏所需的场地较少；
2)同液体发酵相比具有单位基质酶活水平高，发酵周期短，生产成本低等特点，为实际大规模应用提供了便利条件。
具体实施方案
实施例1磷脂酶D酶活测定
步骤一：随机均匀的取10g固体发酵物，加入50mL纯净水，振荡摇匀，在20℃条件下浸泡1h，离心分离得到含磷脂酶D的浸出液。同时，另外再随机均匀的取10g固体发酵物，测定其中的绝干物质含量。
步骤二：30mL 0.1mol/L醋酸钠缓冲液(用NaOH调pH值至7.5)中含有0.15mol/L丝氨酸、5mmol/L氯化钙，同时加入1mL浸出液，与15mL含有0.75mmol卵磷脂的氯仿混合，在30℃下以200转每分钟的速度混合得到均匀的乳状液进行反应。反应6小时后，停止转动，双液相静止分层。提取1mL有机相，经挥发后，剩余物经氯仿洗涤2次，最后溶解于50μL氯仿中，HPLC法分析产物生成量。采用的流动相为乙腈∶甲醇∶85％磷酸＝100∶10∶0.8，检测波长206nm，进样量15μL，流速为110mL/min，利用外标法(以磷脂酰丝氨酸标准品为外标物)计算底物卵磷脂的转化率。
磷脂酶D的酶活定义为：每小时转化1μmol大豆卵磷脂所需要的酶量(mg)。
步骤三：将步骤二测定得到的浸出液中磷脂酶D的酶活进一步换算成固态发酵基质中每克绝干物质磷脂酶D的酶活。
实施例2固态发酵生产磷脂酶D
麦糟粉碎细度为2cm，小麦、麸皮、豆饼粉的粉碎细度为0.55cm。取麦糟500g，小麦粉15g，麸皮40g，豆饼粉30g混和，并加入水825g，在加水的同时加入磷酸二氢钾3.5g、七水硫酸镁0.7g、葡萄糖8.4g；肉桂链轮丝菌的接种量为固体培养基总质量的8％(体积质量比)，发酵初始水份为61.7％；发酵初始pH7.0，发酵过程品温28℃，发酵时间96小时。获得的磷脂酶D酶活为每克绝干物料4210单位。
实施例3固态发酵生产磷脂酶D
麦糟粉碎细度为2cm，小麦、麸皮、豆饼粉的粉碎细度为0.55cm。取麦糟500g，小麦粉10g，麸皮25g，豆饼粉15g混和，并加入水900g，在加水的同时加入磷酸二氢钾1.45g、七水硫酸镁0.435g、葡萄糖5.8g；肉桂链轮丝菌的接种量为固体培养基总质量的10％(体积质量比)，发酵初始水份为68.0％；发酵初始pH6.8，发酵过程品温32℃，发酵时间72小时。获得的磷脂酶D酶活为每克绝干物料3618单位。
实施例4固态发酵生产磷脂酶D
麦糟粉碎细度为2cm，小麦、麸皮、豆饼粉的粉碎细度为0.55cm。取麦糟500g，小麦粉25g，麸皮50g，豆饼粉40g混和，并加入水615g，在加水的同时加入磷酸二氢钾4.92g、七水硫酸镁0.922g、葡萄糖12.3g；肉桂链轮丝菌的接种量为固体培养基总质量的5％(体积质量比)，发酵初始水份为56.0％；发酵初始pH7.2，发酵过程品温25℃，发酵时间120小时。获得的磷脂酶D酶活为每克绝干物料3779单位。
实施例5固态发酵生产磷脂酶D
麦糟粉碎细度为3cm，小麦、麸皮、豆饼粉的粉碎细度为0.45cm。取麦糟500g，小麦粉20g，麸皮30g，豆饼粉35g混和，并加入水850g，在加水的同时加入磷酸二氢钾3.6g、七水硫酸镁0.79g、葡萄糖11.4g；肉桂链轮丝菌的接种量为固体培养基总质量的7.5％(体积质量比)，发酵初始水份为65.1％；发酵初始pH7.0，发酵过程品温30℃，发酵时间90小时。获得的磷脂酶D酶活为每克绝干物料4108单位。
实施例6固态发酵生产磷脂酶D
麦糟粉碎细度为1cm，小麦、麸皮、豆饼粉的粉碎细度为0.75cm。取麦糟500g，小麦粉20g，麸皮35g，豆饼粉35g混和，并加入水775g，在加水的同时加入磷酸二氢钾2.8g、七水硫酸镁0.82g、葡萄糖6.8g；肉桂链轮丝菌的接种量为固体培养基总质量的6％(体积质量比)，发酵初始水份为60.5％；发酵初始pH7.1，发酵过程品温28℃，发酵时间108小时。获得的磷脂酶D酶活为每克绝干物料3964单位。
实施例7固态发酵生产磷脂酶D
麦糟粉碎细度为1cm，玉米芯粉碎细度为2cm，干玉米秸秆粉碎细度为3cm；小麦、麸皮、豆饼粉的粉碎细度为0.65cm。取麦糟100g，玉米芯300g，干玉米秸秆100g，小麦粉22.5g，麸皮37.5g，豆饼粉35g混和，并加入水725g，在加水的同时加入磷酸二氢钾3.9g、七水硫酸镁0.9g、葡萄糖11.5g；肉桂链轮丝菌的接种量为固体培养基总质量的9％(体积质量比)，发酵初始水份为62.0％；发酵初始pH6.9，发酵过程品温31℃，发酵时间84小时。获得的磷脂酶D酶活为获得的磷脂酶D酶活为每克绝干物料4059单位。
实施例8固态发酵生产磷脂酶D
麦糟粉碎细度为2.5cm，玉米芯粉碎细度为2cm，小麦、麸皮、豆饼粉的粉碎细度为0.60cm。取麦糟250g，玉米芯250g，小麦粉20g，麸皮37g，豆饼粉28g混和，并加入水700g，在加水的同时加入磷酸二氢钾2.8g、七水硫酸镁0.81g、葡萄糖7.0g；肉桂链轮丝菌的接种量为固体培养基总质量的5.5％(体积质量比)，发酵初始水份为59.5％；发酵初始pH7.0，发酵过程品温26℃，发酵时间112小时。获得的磷脂酶D酶活为获得的磷脂酶D酶活为每克绝干物料3874单位。
实施例9固态发酵生产磷脂酶D
玉米芯粉碎细度为2cm，其余同实施例1，获得的磷脂酶D酶活为获得的磷脂酶D酶活为每克绝干物料4186单位。
实施例10固态发酵生产磷脂酶D
玉米芯粉碎细度为1.5cm，其余同实施例7，获得的磷脂酶D酶活为获得的磷脂酶D酶活为每克绝干物料4102单位。
实施例11固态发酵生产磷脂酶D
干玉米秸秆碎细度为2cm，其余同实施例1，获得的磷脂酶D酶活为获得的磷脂酶D酶活为每克绝干物料4121单位。
实施例12固态发酵生产磷脂酶D
玉米芯粉碎细度为1.5cm，干玉米秸秆碎细度为2cm，其余同实施例8，获得的磷脂酶D酶活为获得的磷脂酶D酶活为每克绝干物料3911单位。
以上实施方案，对本领域技术人员很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种磷脂酶D的生产方法，其特征在于以小麦、麸皮、豆饼粉和麦糟为固态基质，并添加磷酸二氢钾、七水硫酸镁和葡萄糖，通过固态发酵生产磷脂酶D；
以肉桂链轮丝菌AS 4.1084为出发菌株；
固态基质：以麦糟为基本质量单位，小麦、麸皮、豆饼粉添加比例为：小麦添加麦糟质量的2％～5％，麸皮添加麦糟质量的5％～10％，豆饼粉添加麦糟质量的3％～8％；固态基质按常规加水进行蒸煮备用；
磷酸二氢钾的添加量为固态基质和水总质量的0.1％～0.4％，七水硫酸镁的添加量为固态基质和水总质量的0.03％～0.075％，葡萄糖的添加量为固态基质和水总质量的0.4％～1％；
固态发酵条件：接种量为：菌株的种子培养液与固态培养基总质量的体积质量比为5％～10％，发酵初始水份为56％～68％；发酵初始pH 6.8～7.2，发酵过程品温25～32℃，发酵时间72～120小时。
2.根据权利要求1所述的磷脂酶D的生产方法，其特征在于麦糟改用麦糟、玉米芯、干玉米秸秆中的任意一种或几种的组合物替代。
3.根据权利要求2所述的磷脂酶D的生产方法，其特征在于麦糟、玉米芯、干玉米秸秆需粉碎，粉碎的细度为1～3cm。
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