CN101182332A

CN101182332A - 具有抗肿瘤和影响线粒体功能的锰配合物及其制备方法

Info

Publication number: CN101182332A
Application number: CNA2007101922285A
Authority: CN
Inventors: 陈秋云; 黄娟; 高静; 郭文杰
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2027-12-21
Also published as: CN101182332B

Abstract

一种具有抗肿瘤和影响线粒体功能的锰配合物，其结构式为：将N－烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl₂按摩尔比1∶1溶于甲醇溶液中，控制在30－100℃；最佳反应温度为80℃，反应时间2－8小时，最佳反应时间为4小时，去甲醇获得淡黄色锰配合物。本发明的锰配合物对肿瘤细胞A549，Hela、HepG－2和Eca109生长均有强的抑制作用，能诱导肿瘤细胞凋亡；配合物以剂量的方式对抗Ca²⁺诱发的线粒体的肿胀功能。

Description

具有抗肿瘤和影响线粒体功能的锰配合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及具有抗肿瘤和影响细粒体功能锰配合物及其制备方法。

背景技术

癌症是严重危害人类健康的主要疾病之一，寻找高效低毒的抗肿瘤药一直是人类不懈奋斗的目标。合成和发现高效低毒的抗肿瘤药物，研究其作用机制以及在分子和细胞水平上研究癌症的起因，在医学、生物学和化学等学科领域有着重要的意义。最早的有关金属配合物在抗肿瘤活性中的报道可以追溯到16世纪，但直到20世纪60年代无机配合物顺铂的抗肿瘤活性被发现才引起人们对其他种类的非有机抑制细胞生长药的研究发生极大兴趣(Clarke M J，Zhu F，Frasca DR，Chem.Rev.，1999，99(9)：2511)。科学工作者在铂类抗肿瘤药物领域进行了大量研究工作，这些研究工作大多是围绕着经典铂类抗肿瘤药物即以顺铂为模式的二价铂类配合物进行的，已有四项铂类抗肿瘤专利报道(CN86106751抗肿瘤铂配合物及其制备和应用；CN 87104027新顺铂铬合物，其小鼠抗肿瘤组合物及其制备过程；中国专利CN 89106648.9铂-(IV)-二胺复合物；中国专利CN95103058.2新的抗肿瘤铂络合物，但铂类抗肿瘤药物具有毒副作用和交叉耐药性等缺点(杨宁，国际泌尿系统杂志，2006，26(6)，849)。顺铂剂量依赖的肾毒性限制了其临床治疗肿瘤的效果。随后许多非铂族金属的配合物，都显示对人和实验动物的肿瘤有效，如膦基-烃基VIII族金属络合物具有良好在抗肿瘤方面的应用(CN 92104058.X制备膦基-烃基VIII族金属络合物及含有这些络合物的抗肿瘤组合物方法其小鼠抗肿瘤组合物及其制备过程)。已报道的抗肿瘤配合物主要包括过渡金属钛、钒、铌、钼、铼、钌、铑、铱、铂以及铜和金等重金属元素配合物(Dreicer R.，Propert K.J.，Roth B.J.，et al，Cancer，1997，79(1)：110.曲平，何华，化学进展，2006，18(12)，1646。李风华，吴红星，林华宽，高等学校化学学报，2006，27(10)，1800)。而具有抗肿瘤和对抗Ca²⁺诱发的线粒体的肿胀功能的锰配合物未见报道。肝组织内线粒体丰富，由肝细胞制备的线粒体有一定的生物活性，可以反映化合物对线粒体的直接作用。线粒体肿胀是其中最直观的一个指标。钙离子诱导下，线粒体发生肿胀，是线粒体自我调控功能的表现之一。

对抗Ca²⁺诱发的线粒体肿胀的化合物在抗衰和治疗缺血再灌注损伤方面有广阔的应用前景(李毅，黄永青，郑民缨，杨海华，徐评议，刘焯霖，国际遗传学杂志，2007，30(3)，190)。我们发明的具有抗肿瘤活性和对抗Ca²⁺诱发的线粒体肿胀功能的锰配合物为高效低毒抗肿瘤药的研制开辟了一条新途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤和影响线粒体功能的锰配合物及其制备方法。

本发明用化学方法合成了一个新的锰配合物，并运用物理手段确定了配合物的结构。体外抗肿瘤活性测试研究了配合物对肿瘤细胞的影响，发现锰配合物对肿瘤细胞A549，Hela、HepG-2和Eca109生长均有强的抑制作用，能诱导肿瘤细胞凋亡；配合物以剂量的方式对抗Ca²⁺诱发的线粒体的肿胀功能。所以锰配合物成为新的具有抗肿瘤活性和治疗Ca²⁺诱发的线粒体的肿胀相关疾病的小分子药用先导物。

一种具有抗肿瘤和影响线粒体功能的锰配合物，其结构式为：

简写为：L₂Mn₂Cl₄，

其中L代表：

上述抗肿瘤和影响线粒体功能的锰配合物的制备方法，其特征在于：

将N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl₂按摩尔比1∶1溶于甲醇溶液中，控制在30-100℃；最佳反应温度为80℃，反应时间2-8小时，最佳反应时间为4小时，去甲醇获得淡黄色锰配合物：二(μ-氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)双锰(II)[L₂Mn₂Cl₄]。Yield：80％，分子式：C₃₀H₃₄Cl₄Mn₂N₆。元素分析：实测值C，49.40％；H，4.53％；N，11.46；Mn，14.21％；计算值C，49.34％；H，4.69％；N，11.51；Mn，14.19％。红外光谱数据(IR，cm-1)：2936，1615，1577，1498，1037，841，806，506。

锰配合物的制备路线如下：

“1Mn”代表1μmolMn-ENP配合物，“Ca²⁺”为钙离子，“Mn”代表只加药物而不加钙离子组，“BL”表示空白组，”Mn⁺Ca²⁺”表示先加不同浓度化合物孵育3min后再加钙离子。

本发明用化学方法合成了一个新的锰配合物，并运用物理手段确定了配合物的结构。研究了锰配合物体外抗肿瘤活性，MTT实验结果显示我们合成的锰配合物对肿瘤细胞A549，Hela、HepG-2和Eca109生长均有强的抑制作用，能诱导肿瘤细胞凋亡；配合物以剂量的方式对抗Ca²⁺诱发的线粒体的肿胀功能。所以锰配合物成为新的具有抗肿瘤活性和治疗Ca²⁺诱发的线粒体的肿胀相关疾病的小分子药用先导物。

附图说明

图1锰配合物对50μmolCa²⁺诱导的小鼠肝脏线粒体肿胀的影响

具体实施方式

1试剂和原料：

实验中所用试剂均为分析纯，除特别注明外，未经进一步处理。元素分析用Carlo-Erba-1106型元素分析仪测定，红外光谱用Fr-IR 169(固体用KBr压片)。

抗肿瘤试验试剂如下：(1)RPMI 1640培养基(RPMI 1640+10％小牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO₃ 2.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/l)。(2)高糖DMEM培养基(DMEM+10％小牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO₃ 2.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/l)。(3)MTT(美国Amresco公司产品)。

2、锰配合物的合成：

实施例1(最价反应条件举例)：将N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl₂按摩尔比1∶1溶于甲醇溶液中，控制反应温度为80℃，反应时间4小时，冷至室温，蒸去甲醇获得淡黄色锰配合物：二(μ-氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)双锰(II)[L₂Mn₂Cl₄]。Yield：80％。分子式：C₃₀H₃₄Cl₄Mn₂N₆。元素分析：实测值C，49.40％；H，4.53％；N，11.46；Mn，14.21％；计算值C，49.34％；H，4.69％；N，11.51；Mn，14.19％。红外光谱数据(IR，cm-1)2936，1615，1577，1498，1037，841，806，506。

实施例2：将N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl₂按摩尔比1∶2溶于甲醇溶液中，控制反应温度为80℃，反应时间4小时，冷至室温，蒸去甲醇获得淡黄色锰配合物：二(μ-氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)双锰(II)[L₂Mn₂Cl₄]。Yield：40％。

实施例3：将N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl₂按摩尔比1∶1溶于甲醇溶液中，控制反应温度为40℃，反应时间8小时，冷至室温，蒸去甲醇获得淡黄色锰配合物：二(μ-氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)双锰(II)[L₂Mn₂Cl₄]。Yield：62％。

3、抗肿瘤活性测定

筛选的细胞株有：人肝癌细胞株(A549，Hela、HepG-2和Eca109)。测定采用溴化四氮唑蓝(MTT)法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性溴化四氮唑蓝还原为难溶性的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

操作步骤如下：

3.1.1接种：取处于指数生长期，状态良好的细胞一瓶，加入适量胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，用含12％小牛血清的RPMI1640(或DMEM)培养液配成细胞悬液，计数，并将细胞密度调整稀释至2.2*10⁴/ml.取细胞悬液接种于96孔板上，180ul/孔(含肿瘤细胞4000/孔)。

3.1.2培养：将培养板转入恒温CO₂培养箱中，在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下培养24小时。

3.1.3加药：受试化合物先用DMSO或超纯水配制成0.1M浓度，再作4个稀释度，浓度依次为10^-4M，10^-5M，10^-6M，10^-7M。加入受试化合物，20ul/孔，培养48小时。每组设3个平行孔，并重复3次。

3.1.4染色：

3.1.4.1将MTT加入96孔板(贴壁细胞)中，20ul/孔，置于培养箱中孵育4小时，吸弃孔内上清液，加入DMSO100ul/孔，置平板摇床上震荡5分钟。

3.1.4.2将MTT加入96孔板中(悬浮细胞)，20ul/孔，置于培养箱中孵育4小时，再加入20％SDS 50ul/孔，置于培养箱中过夜。

3.1.5测定：酶标仪设定波长为570nm，参考波长为630nm，测定96孔板每孔吸光值，记录结果并计算细胞抑制率，以判断受试药物的抗肿瘤活性。

3.3数据处理：

3.3.1细胞抑制率的计算：

IC50的计算：根据中国药科大学新药筛选中心提供的IC50软件计算所得。

MTT法测试结果示于表1。

锰配合物体外抗肿瘤活性实验MTT法测试结果示于表1。

表1锰配合物对癌细胞抑制作用MTT实验数据

数据显示在100umol/L浓度锰配合物对肝癌细胞抑制率超过50％，对宫颈癌细胞和细胞肺癌抑制率分别为85％和90％。对宫颈癌细胞Hela和细胞肺癌A549半数抑制率需要的化合物浓度IC50分别为9和18umol/L，对肝癌细胞半数抑制率需要的化合物浓度为IC50为61umol/L。而化合物MnCl₂在小于100umol/L对肿瘤细胞的生长没有抑制作用。这说明我们合成的锰配合物[L₂Mn₂Cl₄]可作为抗癌药用先导物。

4化合物与线粒体作用实验：

肿胀程度根据线粒体悬液在波长为540nm处的吸光值的变化进行测定。制备的肝脏线粒体按0.5～1.0mg蛋白·ml^-1重悬于线粒体缓冲液(125mmol·L^-1sucrose，50mmol·L^-1 KCl，2mmol·L^-1 KH₂PO₄．5mmol·L^-1 succinate acid，5μmol·L^-1 rotenone，10mmol·L^-1 Hepes，pH7.4)中，加入50μmol·L^-1 Ca²⁺(30℃)。检测加入Ca²⁺后5min内吸光值的变化(ΔA)，ΔA值越大，表明线粒体肿胀度越高。在观察化合物作用的实验中，化合物先加入线粒体悬液中，孵育3min，加入Ca²⁺，每30S测一次吸光值。最后以时间为横坐标，ΔA 540nm为纵坐标作图。

锰配合物对50μmolCa²⁺诱导的小鼠肝脏线粒体肿胀的影响实验结果示于图2，由图2的结果可以看出：BL组的吸光值下降较小(0.075)，说明线粒体悬液较稳定，但仍有一些自发肿胀。50μmol·L^-1 Ca²⁺可以诱发线粒体明显肿胀，ΔA₅₄₀达0.32。50μmol·L^-1配合物预处理可以明显对抗50μmol·L^-1Ca²⁺诱发的线粒体肿胀(ΔA₅₄₀达0.062)、而80μmol·L^-1配合物几乎可以完全对抗Ca²⁺诱发的线粒体肿胀(ΔA₅₄₀与BL组接近)，100μmol·L^-1配合物甚至可以对抗线粒体悬液的自发肿胀。另外，浓度高于50μmol·L^-1的配合物单独作用时能够对抗线粒体悬液的自发肿胀。实验结果表明配合物以剂量依赖方式对抗Ca²⁺诱发的线粒体肿胀功能，直接影响线粒体的作用。

Claims

1.具有抗肿瘤和影响线粒体功能的锰配合物，其结构式为：

2.权利要求1所述的抗肿瘤和影响线粒体功能的锰配合物的制备方法，其特征在于：将N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl₂按摩尔比1∶1溶于甲醇溶液中，控制在30-100℃；反应2-8小时，去甲醇获得锰配合物：二(μ-氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)双锰(II)。

3.权利要求2所述的抗肿瘤和影响线粒体功能的锰配合物的制备方法，其特征在于：反应温度为80℃，反应时间为4小时。

4.权利要求1所述的具有抗肿瘤和影响线粒体功能的锰配合物在制备具有抗肿瘤活性和治疗Ca²⁺诱发的线粒体的肿胀相关疾病的小分子药用先导物的应用。