CN101180311A - 抑制转谷氨酰胺酶的肽 - Google Patents

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Abstract

本文公开的是对转谷氨酰胺酶具有抑制活性的转谷氨酰胺酶肽抑制剂，和包含一种转谷氨酰胺酶肽抑制剂作为活性成分的药学组合物。抑制剂或组合物可用于预防和治疗由异常转谷氨酰胺酶活化所引起的多种疾病，所述疾病包括炎性疾病和癌症。本文也公开了治疗各种炎性疾病和癌症的方法，和制备能抑制转谷氨酰胺酶的突变体肽的方法。

Description

抑制转谷氨酰胺酶的肽
技术领域
[01]本发明涉及转谷氨酰胺酶肽抑制剂。更具体而言，本发明涉及转谷氨酰胺酶特异性肽抑制剂，其抑制转谷氨酰胺酶介导的I-κBα聚合，因此有效地预防和治疗由转谷氨酰胺酶活化引起的疾病。本发明也涉及包含一种或多种转谷氨酰胺酶肽抑制剂作为活性成分的药学组合物，以及涉及使用该组合物预防和治疗由于转谷氨酰胺酶活化所引起的疾病的方法。
背景技术
[02]转谷氨酰胺酶是保护性酶，其在正常条件下是造成对组织受损应答的血凝固的原因。然而，这些酶也被报道：在缺乏其表达水平调控的多种疾病的病理机制中，起关键作用(Soo-Youl Kim：New TargetAgainst Inflammatory Diseases：Transglutaminase 2.ArchivumImmunologiae & Therapiae Experimentalis 52，332-337，2004.Soo-YoulKim.Transglutaminase 2 in inflammation.Front Biosci.11，3026-3035，2006)。特别地，当多种炎性疾病发生时，转谷氨酰胺酶的表达增加，所述炎性疾病包括类风湿性关节炎、糖尿病、炎性肌炎、动脉粥样坏死、中风、肝硬化、乳腺癌、阿尔茨海默氏病、帕金森病、杭廷顿舞蹈病、脑炎、腹部疾病等。当癌症开始转移或改变成化学抗性或抗辐射性时，也观察到转谷氨酰胺酶和NF-κB表达水平的增加(Soo-YoulKim.Transglutaminase 2 in inflammation.Front Biosci.11，3026-3035，2006)。
[03]癌症中转谷氨酰胺酶和化学抗性的关系，至今仍保持不清楚。然而，当转谷氨酰胺酶表达在化学抗性的乳腺癌细胞中被抑制时，癌细胞变得高度容易受到化学药品影响，并最后死亡(Antonyak et al.，Augmentation of tissue transglutaminase expression and activation byepidermal growth factor inhibit doxorubicin-induced apoptosis in humanbreast cancer cells.J Biol Chem.2004 Oct 1；279(40)：41461-7.；Dae-SeokKim et al.Reversal of Drug Resistance in Breast Cancer Cells byTransglutaminase 2 Inhibition and NF-B Inactivation.Cancer Res.2006.66，10936-10943)。
[04]也因为负责活化转谷氨酰胺酶的病原机制被在分子水平阐述清楚，所以存在令人信服的抑制转谷氨酰胺酶活性的原因(Key ChungPark，Kyung Cheon Chung，Yoon-Seong Kim，Jongmin Lee，Tong H.Joh，and Soo-Youl Kim.Transglutaminase 2 induces nitric oxide synthesis inBV-2 microglia.Biochem.Biophys.Res.Commun.323，1055-1062，2004；Jongmin Lee，Yoon-Seong Kim，Dong-Hee Choi，Moon S.Bang，TayR.Han，Tong H.Joh，and Soo-Youl Kim.Transglutaminase 2 inducesNF-κB activation via a novel pathway in BV-2 microglia.J.Biol.Chem.279，53725-53735，2004；Dae-Seok Kim et al.Reversal of Drug Resistancein Breast Cancer Cells by Transglutaminase 2 Inhibition and NuclearFactor-KB Inactivation.Cancer Res.2006.Cancer Res.2006.66，10936-10943)。
[05]发炎很大程度上归因于NF-κB的活化。已知NF-κB通过信号转导途径中的激酶而活化。然而，也发现NF-κB可独立于激酶而被活化，从而使激酶抑制剂的功能无效(Tergaonkar et al.，I-kappaBkinase-independent I-B degradation pathway：functional NF-kappaBactivity and implications for cancer therapy.Mol Cell Biol.2003Nov；23(22)：8070-83.)。
[06]在本发明人进行的先前的研究中，报导了：转谷氨酰胺酶独立于激酶(IKK、NAK)的活化，通过诱导I-κB的交联而活化NF-κB(Jongmin Lee，et al.Transglutaminase 2 induces NF-κB activation via anovel pathway in BV-2 microglia.J.Biol.Chem.279，53725-53735，2004)。转谷氨酰胺酶是钙依赖性酶，其仅在细胞内钙水平升高的情况下可以活化NF-κB。
[07]一旦发炎，转录因子NF-κB的活化不但导致了包括转谷氨酰胺酶的炎性因子的表达水平升高，而且导致了其抑制剂I-κB的表达水平升高。持续NF-κB活化在正常条件下被I-κB抑制，但是在慢性炎性疾病中NF-κB继续活化。有趣地，TNF-α或LPS(脂多糖)诱导的NF-κB活化引起了转谷氨酰胺酶表达。因此，在炎性细胞中异常活化的转谷氨酰胺酶预期直接活化NF-κB或进一步保持活化的NF-κB，从而在炎症持续中起重要作用(图1)。此外，这种恶性循环可以是癌症转移和化学抗性的主要原因(Jongmin Lee，et al.Transglutaminase 2 inducesNF-kB activation via a novel pathway in BV-2 microglia.J.Biol.Chem.279，53725-53735，2004)。
[08]因此，转谷氨酰胺酶抑制剂可以在中断NF-κB持续循环中起关键作用，本发明人提出的类固醇取代效应(steroid-substituting effect)正是基于此点(Sohn，J.，Kim，T.-I.，Yoon，Y.-H.，and Kim，S.-Y.：Transglutaminase Inhibitor：A New Anti-Inflammatory Approach inAllergic Conjunctivitis.J.Clin.Invest.111，121-8，2003)。
[09]已知胺化合物抑制转谷氨酰胺酶活性。代表性的TGase抑制剂是胱胺(Nature Genetics 18，111-117，1998；Nature Medicine 8，143-149，2002)和腐胺。除了胺化合物，其它化学抑制剂，例如单丹酰尸胺(J.Med.Chem.15，674-675，1972)、w-二苄基氨基烷基胺(J.Med.Chem.18，278-284，1975)、3-卤素-4，5-二氢异噁唑(Mol.Pharmacol.35，701-706，1989)和2-[(2-氧丙基)硫]咪唑鎓盐衍生物(Blood，75，1455-1459，1990)也被发展，但是报道其有毒性以致于在体内非特异性抑制其它酶。
[10]因此，需要安全并且有效的转谷氨酰胺酶特异性抑制剂。近来，Sohn等已经成功地从重组肽中，得到与用于豚鼠模型中豚草过敏性结膜炎炎症的类固醇药物相同的效果(Sohn，J.，Kim，T.-I.，Yoon，Y.-H.，and Kim，S.-Y.：Transglutaminase Inhibitor：A New Anti-InflammatoryApproach in Allergic Conjunctivitis.J.Clin.Invest.111，121-8，2003)。考虑到这点，使用抗炎蛋白(PLA2抑制剂)或抑弹性蛋白酶蛋白(非常强的转谷氨酰胺酶底物，Nara，K.，et al.1994.Elastase inhibitor elafin is anew type of proteinase inhibitor which has a transglutaminase-mediatedanchoring sequence termed“cementoin”.J Biochem(Tokyo).115：441-448)-衍生的合成肽，该合成肽模拟转谷氨酰胺酶催化位点。
[11]基于前述，本发明人进行了精深而完整的研究，导致了本发明，其允许本发明人鉴定涉及转谷氨酰胺酶诱导的I-κBα聚合的谷氨酰胺和赖氨酸残基的位置，并且使得本发明人发现，含有这些残基的I-κBα-来源的肽或其同系物，抑制转谷氨酰胺酶诱导的I-κBα的聚合，因此可作为转谷氨酰胺酶抑制剂。
发明内容
[12]因此，本发明的一个目标是提供抑制转谷氨酰胺酶的肽，其包括I-κBα源片段或其突变体。
[13]本发明的另一个目标是提供抑制转谷氨酰胺酶的组合物，其包括所述肽作为活性成分。
[14]本发明的进一步的目标是提供抑制转谷氨酰胺酶的方法，其包括施用所述肽。
[15]本发明的更进一步的目标是提供制备所述肽的突变体的方法，所述突变体对转谷氨酰胺酶介导的I-κBα聚合具有抑制活性，所述方法包括在所述肽氨基酸序列中取代、缺失或插入至少一个氨基酸残基。
附图简述
[16]通过下面结合附图进行的详细描述，本发明的上面的和其它的目标、特征和优势将被更清楚地理解，其中：
[17]图1是如此示意图，其阐明了：在免疫细胞(NTHi，非典型流感嗜血杆菌；TLR，toll样受体；TNFR，肿瘤坏死因子-α受体；IKK，I-κB激酶；CKII，酪蛋白激酶II；TK，酪氨酸激酶；COX-2，环加氧酶-2；PLA2，可溶性磷酯酶A2；NO，一氧化氮)的活化过程中的转谷氨酰胺酶(transglutaminase)的作用；
[18]图2是转谷氨酰胺酶的酶反应的顺序，其中底物2提供了赖氨酸残基(酰基受体、胺供体)，用于和谷氨酰胺残基异形成异肽共价键[Nε-(γ-谷氨酰基)-L-赖氨酸(GGEL)]，并且GQCWVFA是位于转谷氨酰胺酶活化位点处的氨基酸序列。硫酯共价酶中间产物在反应中间被看到。基于“乒乓”动力学机制的这种酶反应，可以使用胺化合物(胺、二胺、多胺)代替赖氨酸残基作为酰基受体。
[19]图3示出了分离的I-κBα通过转谷氨酰胺酶的聚合，其在4-12％NuPAGE(Invitrogen)上进行鉴定；
[20]图4和图5示出了在转谷氨酰胺酶诱导的I-κBα交联后，水解消化I-κBα释放出的肽的MS分析，其中使用MALDI-TOF确定肽质量；
[21]图6示出了I-κBα的氨基酸序列，其中红色字符表示转谷氨酰胺酶的结合位点；
图7和8示出了转谷氨酰胺酶介导的I-κBα的聚合，其通过使用合成肽处理而被拯救(rescue)；和
[22]图9是代表了I-κBα中的多种功能结构域和氨基酸残基的示意图。在I-κBα的N-末端区域，发现两个遍在蛋白化位点、两个丝氨酸磷酸化位点和一个酪氨酸磷酸化位点。C-末端区域包括PEST序列和富含QL(谷氨酰胺和亮氨酸)的区域。五个锚蛋白重复序列用带阴影的方框所表示，并且交联位点被用黑体字符在上面的图中指出。
本发明的最佳实施方式
[23]依照一个方面，本发明涉及抑制转谷氨酰胺酶活性的I-κBα来源的肽。
[24]转谷氨酰胺酶(Transglutaminase(TGase))属于Ca2+-依赖型酶家族，其催化在肽结合赖氨酸和谷氨酰胺残基之间形成Nε-(γ-L-谷氨酰基)-L-赖氨酸异肽键(图2)。已知：Nε-(γ-L-谷氨酰基)-L-赖氨酸的交联，稳定了在上皮、凋亡和细胞外基质形成中起屏障功能的细胞内和细胞外蛋白。TGase通常在许多不同的组织中以低水平进行表达，并且TGase不适合在多种病理条件下活化。特别地，炎性疾病和癌症引起TGase表达的增加。在本发明人先前进行的研究中，已经证明TGase诱导的免疫应答机制是基于转谷氨酰胺酶诱导I-κBα聚合并因而活化NF-κB的能力(Jongmin Lee，et al.Transglutaminase 2 induces NF-kBactivation via a novel pathway in BV-2 microglia.J.Biol.Chem.279，53725-53735，2004)。根据本发明，提供了转谷氨酰胺酶特异性肽抑制剂，用来抑制转谷氨酰胺酶活化机制中的I-κBα的聚合(Park S.-S.，et al.Transglutaminase 2 mediates polymer formation of I-kappa B alpha throughC-terminal glutamine cluster.J Biol Chem.2006 Sep 20；[Epub ahead ofprint].)。
[25]如本文使用的，术语“肽”指经酰胺键(或肽键)连接在一起的氨基酸的聚合物。根据本发明的肽，是抑制转谷氨酰胺酶诱导的I-κBα的聚合的转谷氨酰胺酶特异性抑制剂。
[26]在更多的细节中，作为转谷氨酰胺酶抑制剂的本发明的肽，源自I-κBα的SEQ ID NO.：1的氨基酸序列，其具体为：(i)由氨基酸位置11到30的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含赖氨酸21和赖氨酸22，(ii)由氨基酸位置81到100的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含赖氨酸87，(iii)由氨基酸位置151到200的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含赖氨酸177，(iv)由氨基酸位置261到290的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含谷氨酰胺266到268或谷氨酰胺271，或(v)由氨基酸位置301到317的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含谷氨酰胺313(Park S.-S.，et al.Transglutaminase 2 mediates polymer formation ofI-B through C-terminal glutamine cluster.J Biol Chem.2006，281，34965-72)。
[27]在本发明的实施方式中，分离的I-κBα在存在转谷氨酰胺酶的情况下被诱导聚合，以便确定转谷氨酰胺酶诱导的聚合发生的I-κBα位点。使用蛋白酶将I-κBα聚合物消化完全，并且使用MALDI-TOF质谱仪(4700 Proteomics Analyzer，Applied Biosystems)分析该肽消化物。MALDI-TOF质谱仪上的数据揭示，在位置21、22、87和177的赖氨酸残基和在位置266-268、271和313的谷氨酰胺残基，在转谷氨酰胺酶介导的I-κBα的交联被优选使用。
[28]从在转谷氨酰胺酶介导的I-κBα聚合中涉及的氨基酸残基上的信息，本领域技术人员可很容易合成包含聚合诱导残基的多种肽，以致其表现出对转谷氨酰胺酶的抑制活性(Park S.-S.，et al.Transglutaminase 2 mediates polymer formation of I-kappa Balpha throughC-terminal glutamine cluster.(J Biol Chem.2006，281，34965-72))。
[29]在本发明的另一个实施方式中，在赖氨酸和谷氨酰胺残基基础上合成肽，以便具有下列氨基酸序列：SEQ ID NO.：2的RDGLKKERLL、SEQ ID NO.：3的IHEEKALTM、SEQ ID NO.：4的HSILKATNY、SEQ ID NO.：5的ILKAT、SEQ ID NO.：6的GVLTQSCTT、SEQ ID NO.：7的ENLQMLP、SEQ ID NO.：8的VFGGQRLTL、SEQ ID NO.：9的TRIQQQLGQLTL、10的RIQQQLG和SEQ ID NO.：11的LGQLT，并且发现该肽抑制转谷氨酰胺酶介导的I-κBα的聚合。
[30]进一步，根据本发明的肽的突变体处于本发明的范围内。如本文使用的术语“突变体”指具有如此氨基酸序列的肽，其通过至少一个氨基酸残基的缺失、插入或非保守或保守的取代或它们的组合，使其不同于源自I-κBα氨基酸序列的天然氨基酸序列。
[31]在本发明的进一步的实施方式中，具有SEQ ID NO.：12的RIQEELG、SEQ ID NO.：13的RIEQELG和SEQ ID NO.：14的RIEEQLG氨基酸序列的突变体被发现抑制了转谷氨酰胺酶介导的I-κBα的聚合(transglutaminase-mediated I-κBα polymerization)。
[32]本发明的肽可以具有L-构型或D-构型，或者可以是它们的消旋体。进一步，本发明的肽可以根据目的进行修饰，例如在特定的原子或原子团上具有羟基和/或甲基取代基的衍生物、用酰胺或酯基取代C-末端羧基的衍生物、或用氢取代N-末端氨基的衍生物。
[33]另外，本发明的肽可以包含靶向信号、标志、标记的残基或适于增加其稳定性的附加氨基酸序列。也可以加入促进将肽引入细胞的细胞可渗透肽。
[34]本发明的肽也可根据本领域众所周知的多种技术进行制备，这些技术包括化学合成、无细胞蛋白质合成或基因重组。
[35]盐是本发明的肽的可能形式。本发明的肽可与酸形成盐，所述酸例如无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸或硫酸)、有机羧酸(乙酸、卤代乙酸例如三氟乙酸、丙酸、马来酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或水杨酸)和有机磺酸(甲磺酸或对甲苯磺酸)，其包括糖酸(糖醛酸、半乳糖醛酸、葡糖酸或抗坏血酸)、酸性多糖(透明质酸、硫酸软骨素或arginic acid)或者磺酸酯(硫酸软骨素)。
[36]依照本发明，转谷氨酰胺酶肽抑制剂有效地预防和治疗由转谷氨酰胺酶不恰当活化引起的所有疾病。优选地，本发明的肽可用于预防或治疗不恰当的转谷氨酰胺酶活化引起的炎性疾病或癌症。
[37]依照另一个方面，本发明涉及包含至少一种本发明的肽的转谷氨酰胺酶抑制组合物。
[38]术语“炎性疾病(inflammatory disease)”指通过对抗机体状态(物理、化学和生物状态)的有害影响而产生的机体的防御应答或炎性应答引起的任何疾病或紊乱，其伴随着红斑、水肿、触痛、发热和/或机能障碍综合症。本发明的组合物可用于预防和治疗转谷氨酰胺酶过量表达诱导的所有炎性疾病。转谷氨酰胺酶活化引起的炎性疾病的实例包括变性关节炎(类风湿性关节炎)、糖尿病、自身免疫性肌炎(炎性肌炎)、动脉粥样硬化、中风、肝硬化、乳腺癌、阿尔茨海默氏病、帕金森病、杭廷顿舞蹈病、脑炎和腹部疾病。
[39]至于癌症，一旦转移或开始化学抗性或抗辐射性，可发现转谷氨酰胺酶的表达水平的明显增加。因此，抑制转谷氨酰胺酶成为预防和治疗癌症以及炎性疾病的关键。可施用本发明的转谷氨酰胺酶肽抑制剂进行治疗和预防的癌症的具体实例，包括但不限于大肠癌、小肠癌、直肠癌、肛门癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、子宫癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、甲状腺癌、前列腺癌、白血病、皮肤癌、结肠癌、脑瘤、膀胱癌、卵巢癌、胆囊癌等。
[40]如本文使用的术语“预防(prevention)”或“预防(prophylaxis)”指所有这样的行为：通过施用本发明的组合物抑制或延缓(restrain orretard)转谷氨酰胺酶活化引起的任何疾病的发生。如本文使用的术语“治疗”指所有这样的行为：通过施用本发明的组合物，转谷氨酰胺酶活化引起的任何疾病已有所好转或者已有利地减轻。
[41]本发明的组合物可被运用到，由于转谷氨酰胺酶的活化而遭受炎性疾病或癌症的哺乳动物，这些哺乳动物包括牛、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗、和猫，以及人。
[42]包含至少一种本发明肽的组合物可被单独使用，或者与其它化合物联合使用，所述化合物例如糖链、脂类、核酸、其它肽或蛋白质。例如，可以与本发明的肽一起使用的脂类的实例如下：二棕榈酸磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine(DPPC))、棕榈酰油基磷脂酰甘油酯(palmitoyloleyphosphatidylglycerol(POPG))、磷脂酰甘油酯(phosphatidylglycerol(PG))、C18饱和脂肪酸、C16不饱和脂肪酸和C18不饱和脂肪酸。
[43]依照给药途径，本发明的组合物可配制成包含药学上可接受载体的多种剂型。适当的剂型在本领域是众所周知的，其可以包括帮助肽渗透入或运动入细胞的典型的添加剂。
[44]包含依照本发明作为活性成分的肽的组合物可被用于普通的医药制剂中。非口服剂型可以是无菌水溶液、非水溶液、悬浮液、乳剂或冻干制剂。适合本发明的组合物的口服剂型的实例包括片剂、含片、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆或糯米纸囊剂。注射剂可被制备成例如单剂针剂型或多剂针剂型。
[45]本发明的药学上的组合物也可包括药学上可接受的赋型剂。例如适合用于口服给药的赋形剂，其包括结合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、染料和/或香料。注射剂可包含添加剂，例如缓冲剂、防腐剂、疼痛缓解剂、增溶剂、等渗剂(isotonics)和稳定剂的组合。对于局部给药，可以使用基质、赋形剂、润滑剂和防腐剂。
[46]任选地，本发明的组合物可包含编码本发明肽的核酸序列，其可作为模板用来在细胞内表达肽。
[47]依照进一步的方面，本发明涉及抑制转谷氨酰胺酶的方法，其包括施用一种或多种所述肽或所述组合物。
[48]优选地，提供了预防和治疗免疫疾病的方法，该方法的特征是施用本发明的一种或多种肽的组合物，以便抑制转谷氨酰胺酶介导的I-κBα的聚合。
[49]在本发明的实施方式中，用于抑制转谷氨酰胺酶的方法通过将本发明的一种或多种肽或组合物经过适当的途径投药给患者而实现。投药可使用但不限于腹腔内的、静脉内的、肌肉内的、皮下的、皮内的、口服的、局部的、鼻内的、肺内的或直肠的途径。对于口服给药，肽可优选地使用适当的物质进行包衣，或者肽可配制到制剂中，以便不会在胃被消化或溶解。本发明的药学上的组合物也可借助于将活性成分输送进入靶细胞的方法进行投药。优选地是静脉内注射、皮下注射、皮内注射或滴注。注射剂制剂可基于水溶液，例如生理盐水或格林氏溶液(Ringer’ssolution)，或基于非水溶液，例如植物油、高级脂肪酸酯(例如油酸乙酯等)和醇(例如乙醇、苯甲醇、丙二醇或丙三醇)，并且注射剂制剂可包括药学上可接受的载体，例如抗菌稳定剂(例如抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、BHA、维生素E、EDTA等)、乳化剂、pH调节缓冲液、和/或抗菌防腐剂(例如硝酸苯汞、乙基汞硫代水杨酸钠、苯扎氯铵、苯酚、甲酚、苯甲醇等)。
[50]在本发明优选的实施方式中，用于抑制转谷氨酰胺酶的方法通过以治疗有效量施用本发明的肽或组合物得以实现。对患者的治疗有效量可依照本领域众所周知的多种因素进行改变，这些因素包括疾病种类、患者的生理状况——例如年龄、体重、健康状态、性别、药物敏感性等——、给药途径、给药频率和给药时间、治疗时间周期、剂型、一起使用的其它药物等。
[51]依照更进一步的方面，本发明涉及制备所述肽突变体衍生物的方法，所述突变体衍生物仍抑制转谷氨酰胺酶介导的I-κBα聚合，所述方法包括在所述肽的氨基酸序列中取代、缺失或插入一个或多个氨基酸残基。
[52]在本发明的实施方式中，已经发现I-κBα源的转谷氨酰胺酶突变体具有对转谷氨酰胺酶的抑制活性。
[53]根据下面的实施例，可以更好的理解本发明，提出这些实施例是为了进行说明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1：转谷氨酰胺酶作用于I-κBα的交联位点
通过转谷氨酰胺酶的I-κBα聚合
[54]人I-κBα在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中大量表达，并且在使用前进行纯化。将人I-κBα基因亚克隆到pET-30EK/LIC载体，携带该载体的E.coli BL21，在37℃下，在存在100ppm卡那霉素的LB培养基中培养。当培养基达到0.2-0.3的OD时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)0.2-1.0mM，然后诱导I-κBα表达3-12小时。在离心后，超声处理细胞沉淀，由于N-末端的组氨酸标记，使用Ni-NTA树脂初步分离出I-κBα。通过使用肠激酶进行消化和通过与Ni-NTA树脂再次结合，N-末端的组氨酸标记被完全分离，以便提供完整的I-κBα。对于在体外聚合，将10微克纯化的I-κBα和1mU的转谷氨酰胺酶(豚鼠肝，Sigma)一起温育在包含pH7.5的50mM Tris-HCl和10mM CaCl2的反应混合物中。使用4-12％的NuPAGE凝胶电泳(Invirtrogen)分析聚合作用(图3)。因此，使用离心过滤设备(Centricon，分子量截留值(M.W.cut-off)100kDa，Millipore)分离I-κBα聚合物。如图3中所见，磷酸化位点都被修饰的完整I-κBα和突变体I-κBα，通过转谷氨酰胺酶被聚合成高分子量的聚合物。作为钙-依赖性酶，转谷氨酰胺酶在存在EDTA的情况下被抑制。
I-κBα聚合体的水解
[55]为了变性，纯化的I-κBα聚合体(10微克)，在55℃下，温育在4M含有10mM的二硫酚苏糖醇的尿素中过夜，使用100mM的NH4HCO3将尿素的浓度稀释到1M。使用胰蛋白酶(Promega)或内切蛋白酶Glu-C(V8，Roche)，在37℃下过夜消化该聚合体。
MALDI-TOF MS分析
[56]使用MALDI-TOF质谱仪(4700Proteomics Analyzer，AppliedBiosystems)确定消化的肽的质量(图4和图5)。使用Zip-Tips C18(Millipore)将样品脱盐，在正好位于质量分析靶(mass analysis target)上的基质溶液(CHCA的1∶1v/v 0.1％TFA/CAN溶液)中洗脱样品，并且干燥样品。在阳离子反射模式中施行分析，使用得自4700Cal Mix(Applied Biosystems)的标准样品在50ppm容许下，校准测量的质谱。使用的标准样品如下：脱-精氨酸1-缓激肽(Mr 904.4681)、血管紧张素1(Mr 1296.6853)、谷氨酸1-血纤肽B(Mr 1570.6774)、ACTH 1-17中间叶促皮质样肽(clip)(Mr 2093.0867)、ACTH 18-39中间叶促皮质样肽(Mr 2465.1989)和ACTH7-38中间叶促皮质样肽(Mr 3657.9294)。Data Explorer软件(Applied Biosystem)被用于处理数据。在除去了对应于角蛋白和蛋白酶本身的峰之后，测量的峰与理论上可能的肽的峰相符合。对于这点，在100ppm容许，使用Paw程序(Genomic Solutions)。
实施例2：使用I-κBα聚合体的Glu-C消化液进行蛋白分析
竞争测定
[57]I-κBα(2微克)与0.5mU的TGase一起温育在包含pH7.5的50mM Tris和10mM CaCl2的反应缓冲液中，并且该缓冲液中含有或不含有表1中的肽(2nmol)，以便观察到I-κBα交联。表1中的肽在Peptron Inc合成。在37℃下温育10分钟后，通过SDS-PAGE分离反应物，并且通过Coomassie染色使其可视化。使用Adobe Photoshop软件测量带的强度(图7和图8)。
[58]如图7和图8所见，特别包含N-末端谷氨酰胺簇(Q255-Q268)、赖氨酸177或谷氨酰胺313的肽是优秀的竞争剂，赖氨酸残基21和22竞争性抑制酶。
表1
用于竞争测定的合成肽
  名字   氨基酸序列   分子量(Mo)
  PK-1   RDGLKKERLL   17-26   1226.7456
  PK-2   IHEEKALTM   83-91   1070.5430
  PK-3   HSILKATNY   173-181   1045.5556
  PK-4   ILKAT   175-179   544.3584
  PQ-1   GVLTQSCTT   161-169   908.4273
  PQ-2   ENLQMLP   275-281   843.4160
  PQ-3   VFGGQRLTL   309-317   989.5658
  PQ-4   TRIQQQLGQLTL   263-274   1397.7990
  PQ-5   RIQQQLG   264-270   841.4770
  PQ-6   RIQEELG   843.4450
  PQ-7   RIEQELG   843.4450
  PQ-8   RIEEQLG   843.4450
  PQ-9   LGQLT   269-273   530.3064
工业实用性
[59]作为迄今描述的转谷氨酰胺酶抑制剂，根据本发明的肽或包含所述肽之一的药学组合物，在预防和治疗转谷氨酰胺酶异常活化引起的疾病中是非常有用的，特别在预防和治疗炎性疾病和癌症中是非常有用的。
[60]本发明已经以说明性的方式进行了描述，应该理解，使用的术语拟为描述的类型，而不是限制的类型。按照上面的教导，本发明的许多修改和变化是可行的。因此，应该理解，除了具体描述的本发明，在所附权利要求范围内本发明也是可行的。
序列表
<110>国立癌中心
<120>抑制转谷氨酰胺酶的肽
<160>14
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>317
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Met Phe Gln Ala Ala Glu Arg Pro Gln Glu Trp Ala Met Glu Gly Pro
1                 5                  10                  15
Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Leu Asp Asp Arg His Asp Ser
             20                  25                  30
Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gln Met Val Lys Glu
         35                  40                  45
Leu Gln Glu Ile Arg Leu Glu Pro Gln Glu Val Pro Arg Gly Ser Glu
     50                  55                  60
Pro Trp Lys Gln Gln Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu
 65                  70                  75                  80
Ala Ile Ile His Glu Glu Lys Ala Leu Thr Met Glu Val Ile Arg Gln
                 85                  90                  95
Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gln Asn Asn Leu Gln Gln
            100                 105                 110
Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Asn Gln Pro Glu Ile Ala Glu
        115                 120                 125
Ala Leu Leu Gly Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly
    130                 135                 140
Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gln Gly Cys Leu Ala Ser Val
145                 150                 155                 160
Gly Val Leu Thr Gln Ser Cys Thr Thr Pro His Leu His Ser Ile Leu
                165                 170                 175
Lys Ala Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser Ile
            180                 185                 190
His Gly Tyr Leu Gly Ile Val Glu Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Asp
        195                 200                 205
Val Asn Ala Gln Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala
    210                 215                 220
Val Asp Leu Gln Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly
225                 230                 235                 240
Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gln Gly Tyr Ser Pro Tyr Gln Leu
                245                 250                 255
Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg Ile Gln Gln Gln Leu Gly Gln Leu
            260                 265                 270
Thr Leu Glu Asn Leu Gln Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser
        275                 280                 285
Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro
    290                 295                 300
Tyr Asp Asp Cys Val Phe Gly Gly Gln Arg Leu Thr Leu
 305                 310                 315
<210>2
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PK-1
<400>2
Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Leu
  1               5                  10
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PK-2
<400>3
Ile His Glu Glu Lys Ala Leu Thr Met
  1               5
<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PK-3
<400>4
His Ser Ile Leu Lys Ala Thr Asn Tyr
  1               5
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PK-4
<400>5
Ile Leu Lys Ala Thr
  1               5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PQ-1
<400>6
Gly Val Leu Thr Gln Ser Cys Thr Thr
  1               5
<210>7
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PQ-2
<400>7
Glu Asn Leu Gln Met Leu Pro
  1               5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PQ-3
<400>8
Val Phe Gly Gly Gln Arg Leu Thr Leu
  1               5
<210>9
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PQ-4
<400>9
Thr Arg Ile Gln Gln Gln Leu Gly Gln Leu Thr Leu
  1               5                  10
<210>10
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PQ-5
<400>10
Arg Ile Gln Gln Gln Leu Gly
  1               5
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PQ-9
<400>11
Leu Gly Gln Leu Thr
  1               5
<210>12
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PQ-6
<400>12
Arg Ile Gln Glu Glu Leu Gly
  1               5
<210>13
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PQ-7
<400>13
Arg Ile Glu Gln Glu Leu Gly
  1               5
<210>14
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PQ-8
<400>14
Arg Ile Glu Glu Gln Leu Gly
  1               5

Claims (7)

1.转谷氨酰胺酶肽抑制剂，其对转谷氨酰胺酶具有抑制活性，并且其源自I-κBα的SEQ ID NO.：1的氨基酸序列，其包括：
(i)由氨基酸位置11到30的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含赖氨酸21和赖氨酸22；
(ii)由氨基酸位置81到100的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含赖氨酸87；
(iii)由氨基酸位置151到200的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含赖氨酸177；
(iv)由氨基酸位置261到290的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含谷氨酰胺266到268或谷氨酰胺271；或
(v)由氨基酸位置301到317的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含谷氨酰胺313。
2.根据权利要求1所述的转谷氨酰胺酶肽抑制剂，其中所述抑制剂包括至少一种选自SEQ ID NO.：2到14的氨基酸序列。
3.用于抑制转谷氨酰胺酶的药学组合物，其包括权利要求1所述的转谷氨酰胺酶肽抑制剂作为活性成分。
4.根据权利要求3所述的药学组合物，其中所述药学组合物对转谷氨酰胺酶具有抑制活性，并且所述药学组合物有效地预防和治疗炎性疾病或癌症。
5.用于抑制转谷氨酰胺酶的方法，其包括使用至少一种权利要求1所述的转谷氨酰胺酶肽抑制剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述方法被用于预防和治疗炎性疾病或癌症。
7.用于制备对转谷氨酰胺酶介导的I-κBα的聚合具有抑制活性的突变体肽的方法，其包括在权利要求1所述的转谷氨酰胺酶肽抑制剂的氨基酸序列中取代、缺失或插入至少一个氨基酸残基。
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