CN101177679B

CN101177679B - 一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化细菌制备方法

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Publication number: CN101177679B
Application number: CN2006101342054A
Authority: CN
Inventors: 苏丹; 李培军; 鞠京丽
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2006-11-08
Filing date: 2006-11-08
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2026-11-08
Also published as: CN101177679A

Abstract

本发明涉及细胞固定化技术，具体地说是一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化细菌制备方法，以0.25～1.00mm红砖粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土或焦炭粉为载体材料，灭菌后，接入菌液，然后增殖培养，制得所需固定化颗粒。按照本发明配方制得的固定化生物产品对高分子量多环芳烃污染土壤具有良好的修复效果，是一种可信赖的新型环保生物产品。

Description

一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化细菌制备方法

技术领域

本发明涉及细胞固定化技术，具体地说是一种用于多环芳烃(PAHs)污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，其是以红砖粉、焦炭粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土等材料为载体的吸附固定化微生物工艺。

背景技术

多环芳烃(PAHs)在环境中普遍存在，由于该类化合物的辛醇-水分配系数高，水溶性差，常被吸附于土壤颗粒上。因此，土壤就成为PAHs的主要载体。多环芳烃在自然界中的积累会对人类以及整个自然界造成极大的危害，一些多环芳烃进入人体和动物体内后，会产生致癌、致畸、致突变的后果。因此，有关PAHs污染土壤的修复技术倍受关注。尽快开发出安全、高效、实用性强的多环芳烃污染土壤修复技术，是科研工作者面临的艰巨而紧迫的任务。

近年来，发展起来的微生物修复技术为PAHs的降解提供了较好的途径，但也存在一些缺陷，如单位体积内有效降解菌浓度低、反应启动慢、与土著菌竞争处于劣势、抗毒性侵害能力差、对环境条件敏感，加入到修复现场环境中的微生物可能由于竞争或难以适应环境而导致作用结果与实验结果有较大出入，使得不能很好的应用于原位污染土壤修复。因此，亟需开发更高效更适合于原位多环芳烃污染土壤修复的新型生物技术，而微生物固定化技术可以克服这些缺点和弊端。

所谓固定化技术，是利用化学或物理的手段，将游离的细胞(微生物)或酶定位于限定的空间区域使其保持活性并能反复使用的一种基本技术。其优点是可以大幅度提高参加反应的微生物浓度，固定化后的微生物耐环境冲击性增强，根据需要可选择适宜的微生物，可降低二次污染等优点。尽管固定化技术已经广泛应用于修复污染的流体介质(如废水)和半流体介质(如泥浆)，但在修复污染的非流体介质(如土壤)中应用该技术还未见成功的实例。因而被广泛用于修复受污染的流体介质(如废水)和半流体介质(如泥浆)环境中，但将固定化微生物用于降解非流体介质(如土壤)中有机污染物的研究，国内外尚未见报道。主要原因是因为非流体介质本身所具有的复杂性和特殊性给该技术提出了许多不同于在流体介质中应用固定化技术时所面临的科学问题，如固定化微生物颗粒的载体如何选择，如何克服在非流体介质中固定化颗粒的不可回收性，如何克服污染物浓度的非均质性对固定化颗粒造成的冲击；如果提高固定化颗粒的机械强度以抵抗环境胁迫造成的物理损伤。

本发明在确定适宜的载体材料和固定化工艺的基础上提出了一种用于修复多环芳烃污染土壤的固定化颗粒制备方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种用于修复多环芳烃污染土壤的固定化颗粒制备方法。本发明以红砖粉、焦炭粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土等为载体材料，采用吸附固定化方法，对高效降解多环芳烃的菌株进行固定化，将制得的固定化微生物应用于多环芳烃污染土壤的修复，结果表明：按照该配方制得的固定化生物产品对高分子量多环芳烃污染土壤具有良好的修复效果，是一种可信赖的新型环保生物产品。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化细菌制备方法，以0.25～1.00mm红砖粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土或焦炭粉为载体材料，灭菌后，接入菌液，然后增殖培养，制得所需固定化颗粒。

所述红砖粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土或焦炭粉在作为载体以前需要经过浸润处理，具体处理过程为：将过筛后的红砖粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土或焦炭粉按照0.5～1.5ml/g比例加自来水或增殖培养基浸润12～24h。

所述菌为芽孢杆菌，培养温度为25～30℃；

种子培养基可为：牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl0.5％，pH7.0～7.2；或为葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH₄NO₃0.1％，MgSO₄7H₂O0.02％，KCl0.02％，pH7.0^-7.2；

增殖培养基为牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl0.5％，pH7.0^-7.2；或为葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH₂PO₄0.05％，MgSO₄7H₂O0.025％，(NH₄)₂HPO₄0.2％，pH7.0^-7.2。

所述接入菌液和增殖培养地过程为，按照载体重量2～4％的量加入细菌菌液，25-28℃恒温培养箱中培养，每天按1ml/g～2ml/g载体的量补加增殖培养基。

本发明具有如下优点：

1、本发明通过优化载体材料，吸附固定化技术，制备的固定化颗粒为微生物提供了更适合的微环境，与土著菌的竞争力增强，对环境中毒物的抗性增加，可以在不良环境中仍然发挥高效降解菌对多环芳烃的降解作用；经过浸润处理后再灭菌使得载体灭菌更彻底，单位体积内适宜微生物生长的环境更大，提高了固定化效率扩散传质性能优异，为微生物提供了良好的生活环境，从而提高了固定化效率；该固定化方法简单易行，适宜原位土壤大规模修复。

2、本发明所采用载体为红砖粉、焦炭粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土等材料，他们对提高固定化微生物去除土壤中多环芳烃有促进作用。这些材料具有不同程度的隔热、耐冻、吸水等优异性能，可为微生物提供在更佳的微环境。此外，泥炭土主要组分是木质素和纤维素，具有近乎95％的多孔结构以及值为200m²/g的特定表面积，为微生物提供优良的微环境，有利的屏蔽了外界土著菌的干扰，使固定化微生物很好的发挥对多环芳烃降解作用；高分子量多环芳烃一般以共代谢的方式被降解，泥炭土除作为微生物载体外，组分中的木质素和纤维素还可为微生物提供初级共代谢底物，诱导微生物产生降解多环芳烃所必需的酶类，从而实现对高分子量多环芳烃的共代谢降解。

3、固定化颗粒对环境的耐性得到显著增强，固定化细菌适应更低的环境温度，在5～35℃范围内均能保持较好的活性，固定化细菌对pH变化呈惰性，在pH＝5～8范围内，固定化细菌的活性没有发生明显的改变。

4、该载体及其固定化工艺可用于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、动胶杆菌属(Zoogloea sp.)、微球菌(Micrococcus sp.)等多菌种的固定化，具有一定的广谱适用性。

5、固定化细菌对受芘(PYR)或苯并[a]芘(BaP)等高分子量多环芳烃污染土壤的修复中具有明显的修复效果，在投粒比为2％～10％、修复时间为42d的条件下，土壤中PYR去除率最高可达20.3～60.4％，而对BaP的去除率为24～41.3％，较游离菌提高20％。

6、本发明所用载体材料价格便宜，成本低，来源广泛，通气性良好，无毒，不会造成土壤的二次污染，亦可增加土壤肥力。

具体实施方案

下面通过实例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

(1)固定化细菌液体培养

在装有种子培养基(葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH₄NO₃0.1％，MgSO₄7H₂O0.02％，KCl0.02％，pH6.5)的三角瓶中接种芽孢杆菌，置于28～30℃恒温摇床中培养12h。

(2)固定化载体预处理

将过1.00mm筛后的红砖粉按照0.5～1.5ml/g比例加自来水浸润12～24h，121℃高温蒸汽灭菌90min，备用。

(3)固定化颗粒制备

取细菌菌悬液，均匀地加入无菌载体表面，接种量2％，密封后放入28℃恒温培养箱中避光培养，每天按1ml/g载体的量补加增殖培养基(葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH₂PO₄0.05％，MgSO₄·7H₂O0.025％，(NH₄)₂HPO₄0.2％，pH7.0～7.2)，3d后便制得固定化细菌颗粒。

经上述步骤制得的固定化颗粒周期短，单位体积细胞密度大，5.4×10⁶个/g较游离细胞密度增加了2个数量级。

(4)对受多环芳烃污染土壤修复的效果

将制备好的固定化颗粒按土壤重量2％的投粒比，投入受多环芳烃污染的土壤中，42d后，土壤中PYR的去除率为32％；土壤中BaP的去除率为21％。在整个降解过程中，固定化颗粒的降解速度快，42d后固定化颗粒仍然具有85％以上的活性。

实施例2

与实施例1不同处在于：载体预处理时，将过0.25mm筛后的粉煤灰按照1.5ml/g比例加自来水浸润12h，121℃高温蒸汽灭菌90min，备用。

将制备好的固定化颗粒按土壤重量6％投粒比，投入受多环芳烃污染的土壤中，42d后，土壤中PYR的去除率为42％；土壤中BaP的去除率为36％。在整个降解过程中，固定化颗粒的降解速度快，42d后固定化颗粒仍然具有90％以上的活性。

实施例3

与实施例1不同处在于将过1mm筛后的蛭石按照0.5ml/g比例加自来水浸润24h，121℃高温蒸汽灭菌90min，备用。

将制备好的固定化颗粒按土壤重量6％投粒比，投入受多环芳烃污染的土壤中，42d后，土壤中PYR的去除率为51％；土壤中BaP的去除率为39％。在整个降解过程中，固定化颗粒的降解速度快，42d后固定化颗粒仍然具有90％以上的活性。

实施例4

与实施例1不同处在于将过0.75mm筛后的泥炭土按照1.0ml/g比例加自来水浸润18h，121℃高温蒸汽灭菌90min，备用。

将制备好的固定化颗粒按6％投粒比，投入受多环芳烃污染的土壤中，42d后，土壤中PYR的去除率为62％；土壤中BaP的去除率为47％。在整个降解过程中，固定化颗粒的降解速度快，42d后固定化颗粒仍然具有90％以上的活性。

实施例5

与实施例1不同处在于将过0.50mm筛后的硅藻土按照2ml/g比例加自来水浸润15h，121℃高温蒸汽灭菌90min，备用。

将制备好的固定化颗粒按6％投粒比，投入受多环芳烃污染的土壤中，42d后，土壤中PYR的去除率为21％；土壤中BaP的去除率为13％。在整个降解过程中，固定化颗粒的降解速度快，42d后固定化颗粒仍然具有90％以上的活性。

实施例6

与实施例4不同处之一在于：细菌斜面培养制备时，在牛肉膏蛋白栋基础培养基(0.3％牛肉膏，1.0％蛋白栋，0.5％NaCl，1.5-2.0％琼脂，pH7.0-7.2)的试管中分别接入动胶杆菌(Zoogloea sp.)、微球菌(Microbacterium sp.)置于28-30℃培养箱中培养48h。

按照以上步骤制得的固定化颗粒机械强度达到42.13kg/cm²，将制得的固定化颗粒在摇床上增殖培养后，用于土壤中PAHs污染的修复，当土壤中初始PYR/BaP浓度为50mg/kg时，投粒比10％，修复42d，动胶杆菌(Zoogloea sp.)对PYR的去除率为31.4％，对BaP去除率为21.9％；微球菌(Microbacterium sp.)对PYR的去除率为30.7％，对BaP去除率为25.7％。而且在4℃冰箱中经过365d的保存后，增殖培养后的固定化粒子活性保持均在85％以上。

Claims

1.一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化细菌制备方法，其特征在于：以0.25～1.00mm红砖粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土或焦炭粉为载体材料，灭菌后，接入菌液，然后增殖培养，制得所需固定化颗粒；

2.按照权利要求1所述固定化细菌制备方法，其特征在于：所述菌为芽孢杆菌，培养温度为25～30℃；

种子培养基为：牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，pH 7.0～7.2；或为葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH₄NO₃ 0.1％，MgSO₄ 7H₂O 0.02％，KCl 0.02％，pH 7.0～7.2；

增殖培养基为牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，pH 7.0～7.2；或为葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH₂PO₄ 0.05％，MgSO₄ 7H₂O 0.025％，(NH₄)₂HPO₄ 0.2％，pH 7.0～7.2。

3.按照权利要求1所述固定化细菌制备方法，其特征在于：所述接入菌液和增殖培养的过程为，按照载体重量2～4％的量加入细菌菌液，25-28℃恒温培养箱中培养，每天按1ml/g～2ml/g载体的量补加增殖培养基。