CN101173287B

CN101173287B - 一组与aba合成相关的提高水稻耐旱性基因的克隆和应用

Info

Publication number: CN101173287B
Application number: CN2007101759141A
Authority: CN
Inventors: 王喜萍; 孟秀萍; 黄晓翠; 刘春霞; 辛莉; 谢莹; 夏勉
Original assignee: WEIMINGKAITUO AGRO-BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd BEIJING
Current assignee: Weiminghu Rural Agricultural Biotechnology co company
Priority date: 2007-10-16
Filing date: 2007-10-16
Publication date: 2010-08-18
Anticipated expiration: 2027-10-16
Also published as: CN101173287A

Abstract

本发明公开了一组来源于水稻的与耐旱性相关的OsNCEDs基因，编码的蛋白质具有下述氨基酸序列之一：1)序列表中的SEQ ID NO：1、3或5；2)将序列表中SEQID NO：1、3或5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且所衍生的蛋白质具有调控植物耐旱性的功能。实验证明，用本发明的基因转化水稻可显著提高水稻对干旱胁迫的耐受性。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐旱机制的研究，以及提高植物的耐旱性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的耐旱基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一组与ABA合成相关的提高水稻耐旱性基因的克隆和应用

技术领域

本发明涉及与ABA合成相关的转录因子，特别是利用基因工程方法操纵来源水稻的OsNCEDs基因的表达，从而调控植物体内ABA的水平，应用于培育耐旱性提高的植物。

背景技术

植物激素是由植物的部分器官(或组织)合成而转移到另一器官(或组织)，并专一地影响其生理过程的极微量的非营养性物质。植物生长发育受营养、内源激素和生长环境调控。

植物激素主要有五类，即生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯。植物激素作为植物体内的痕量信号分子几乎参与了调控植物生长发育的每一过程，既包括调控植物自身的生长发育，又通过与植物所生存的外部环境互相作用调节其对环境的适应。植物激素对于调节植物的各种生长发育过程和对环境的应答具有十分重要的意义(许智宏，李家洋.中国植物激素研究：过去、现在和未来.植物学通报，2006，23(5)：433-442.)。

植物的生长与环境因素密不可分，植物抗环境胁迫的研究一直是各国科学家关注的研究热点。常见的外界胁迫主要是自然界所造成的，包括干旱、盐、极端的温度、pH值及光照过强或者过弱等。近年的研究表明环境胁迫是限制植物生长发育的重要因素，植物抵抗逆境的能力受多基因控制(Allen GJ，Kuchitsu K，Chu SP，Murata Y，Schroeder JI.Arabidopsisabil-1 and abi2-1 phosphatase mutations reduce abscisic acid induced cytoplasmic calcium risesin guard cells.Plant Cell，1999，11：1785-1798.)。

在对植物激素调控作用的研究中，脱落酸(Abscisic acid，ABA)作为一种重要的胁迫激素受到人们的广泛关注，因为ABA与种子休眠，特别是与植物的抗逆生理有着重要的关系(Hagenbeek D，Quatrano RS，Rock CD.Trivalent ions activate abscisic acid induciblepromoters through an ABIl-dependent pathway in rice protoplasts.Plant Physiol，2000，123：1553-1560；Xiong LM，Ishitani M，Lee H，Zhu JK.The Arabidopsis LOS5/ABA3 locusencodes a molybdenum cofactor sulfurase and modulates cold stress andosmoticstress-responsive gene expression.Plant Cell，2001a，13：2063-2083)。

ABA是20世纪60年代植物学家从棉花落果，马铃薯及枫、桦等叶中分离出来的植物激素。它存在于植物的叶、休眠芽、成熟种子中，通常在衰老的器官或组织中的含量比在幼嫩部分中的多。它在植物胚胎发育、种子萌发、成熟与休眠、果实成熟以及植物对逆境胁迫的响应等许多方面具有广泛的生理效应(Zeevaart JAD.Abscisic acid metabolism and itsregulation.Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones，1999，189-207)，对植物的生长发育起着重要作用。ABA是十五碳化合物，一般是在叶绿体和其他质体中合成，它有促进离层产生的作用，因而与花、果实和叶的脱落有关。ABA的另一重要作用是抑制生长。生物体各种过程常常是促进和抑制两个过程平衡的结果。在自然环境严酷的情况下只有停止生长，进入休民，再加上一些有保护功能的形态结构的作用，植物才能渡过不良的环境。

ABA不仅可以作为胞间信号物质介导植株整体的抗逆反应(Sauter A，Davies WJ，Hartung W.The long-distance abscisic acid signal in the droughted plant：the fate of the hormoneon its way from root to shoot.J Ex p Bot.，2001，52(363)：1991-60)，而且作为细胞逆境信号物质直接介导许多抗逆基因表达(Leung J，Giraudat J.Abscisic acid signal transduction.Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，1998，49：199-222)。逆境下植物启动ABA合成系统，合成大量的ABA，促进气孔关闭，抑制气孔开放(Tardieu F，Simonneau T.Variability among speicesof stomatal controlunder fluctuating soil water status and evaporative demand：modelingisohydric and anisohydric behaviours.J Exp Bot，1998，49：419-432.)；促进水分吸收，并减少水分运输的质外体途径，增加共质体途径水流(Steudle E.Water uptake by roots：effects ofwater deficit.J Ex pBot，2000，51(350)：1531-1542)，增强植株抵抗逆境的能力(Morillon R，Chrispeels MJ.The role of ABA and the transpiration stream in the regulation of the osmoticwater permeability ofleafcells.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(24)：14138-14143)，因而在基因工程与农业生产中具有潜在的应用价值。

高等植物ABA生物合成一般有两条途径：C₁₅直接途径和C₄₀间接途径。C₁₅直接途径是以甲瓦龙酸(MVA)为前体，经C₁₅的法呢焦磷酸(FPP)直接形成C₁₅ ABA；C₄₀间接途径是经由类胡萝卜素的氧化裂解间接形成ABA。近十多年来，大量ABA缺失突变体的发现以及同位素示踪技术(Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K.Gene expression and signal transductioninwater-stress response.PlantPhysiology，1997，115：327-334.)的研究证明，C₄₀的间接途径是高等植物ABA生物合成的主要途径，即是由类胡萝卜素(C₄₀)裂解生成ABA(MilborrowBV.The pathway of biosynthesis of abscisic acid in vascular plant：a review of the present stateof knowledge of ABA biosynthesis.J Exp Bot，2001，52：1145-1164)。

(1)异戊烯基焦磷酸(IPP)的生物合成

IPP的生物合成有两个途径，分别在细胞质和质体中进行。细胞质内以甲瓦龙酸(MVA)为前体。已知MVA在植物中作为类胡萝卜素及其它一些四萜的前体，但后来发现阻碍MVA合成的甲瓦龙酸素(Mevinolin)并不影响类胡萝卜素的合成。CO₂在光下很快进入到叶四萜中，但却极慢地进入到胞质合成的类固醇中(McCaskill D，Croteau R.Monoterpene andsesquiterpene biosynthesis inglandular trichomes of peppermint (Mentha×piperata)relyexclusivelyon plastid derived isopentenyl diphosphate.Planta，1995，197：1135-1146；LeretoF，Ciccioli V，Cecinato A，Branaleoni E，Frattoni M，Fabozzi C，Tricoli D.Evidence ofphotosynthetic origin of monoterpenes emitted by Quercus idex L.leaves by 13C labeling.PlantPhysiol.，1996，110：1371-1322.)。因而IPP生物合成可能与MVA途径无关。Rohmer等(1999)认为IPP生物合成是在叶绿体中以甲基赤藓糖磷酸(MEP)途径合成的。首先以丙酮酸及硫胺素焦磷酸(TPP)为前体，在3-磷酸甘油醛(GAP)参与下合成5-磷酸脱氧木酮糖，进而在胞苷三磷酸(CTP)参与下形成IPP(Rohmer M.The discover of a mevalonateindependent pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria algae and higher plants.Nat ProRep.，1999，16：565-574；Rohdich F，Wungsintaweekul J，Fellermieier M，Sagner S，Herz S，KisK，Eisenreich W，Bacher A，Zenk M.5’-triphosphate-dependent biosynthesis of isoprenoids YgbPprotein of Eschericha coli catalyses the formation of 4-diphosphocytidyl-2-Cmethylerthritol.ProNatl Acad Sci USA，1999，16：11758-11763)。以MVA为前体生成的IPP要借助载体作用通过质体膜渗入到质体内(Soler E，Clastre M，Bantiquies B，Marigo G.Ambid C.Uptake ofisopentenyl diphosphate by plasited from Vitis vinifera L.cell suspensions.Planta，1993，191：324-329)。

(2)黄质醛(XAN)的生物合成

无论是细胞质中由MVA合成后进入到质体中的IPP，还是由质体自身合成的IPP都可转化形成XAN。IPP经法呢焦磷酸(FPP)合成玉米黄质(Zeaxanthin)。在玉米突变体vp2、vp5、vp7、vp9中已发现其突变是与玉米黄质形成相关的(杨洪强、接玉玲，高等植物脱落酸的生物合成及其调控.植物生理学通讯，2001，37(5)：457-462.)。由玉米黄质环化形成环氧玉米黄质由环氧玉米黄质环化酶(ZE)催化，紫黄质及新黄质可在9-顺环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)作用下氧化裂解形成黄质醛(Xanthoxin)。

(3)ABA的合成

当由NCED催化产生黄质醛之后，黄质醛便转移到细胞质中，经过两步催化反应形成ABA。在植物中存在三种可能的ABA合成途径(Seo M，Koshiba T.Complex regulation ofABA biosynthesis in plants.Trends in Plant Science，2002，7(1)：41-48)。三种途径的主要区别是从视黄醛到ABA的合成过程，其中途径(1)被证明在ABA的生物合成中起主要作用。

在途径(1)中，黄质醛首先被短链脱氢/还原酶(short chain dehydrogenase/reductase，SDR)还原成脱落醛(abscisic aldehyde，ABAId)，ABAId然后被ABA-醛氧化酶(AAO)氧化为ABA，这种醛氧化酶需要钼因子的激活。现已鉴定该途径失活的多种突变体，如拟南芥aba2(Schwartz SH，Le′on-Kloosterziel KM，Koornneef M，Zeevaart JAD.Biochemicalcharacterization of the aba2 and aba3 mutants in Arabidopsis thaliana.Plant Physiol，1997a，114：161-166.)和ginl(Leydecker MT，Moureaux T，Kraepiel Y.Molybdenum cofactor mutants，specially impaired in xanthoxin dehydrogenase activity and abscisic acid biosynthesis，simultaneously overexpress nitrate redutase.Plant Physiol.，1995，107：1427-1431.)，这些突变体不能催化黄质醛生成ABAId，但是可以将ABAId转换成ABA，这说明突变体缺失了短链脱氢/还原酶(SDR)，经克隆鉴定发现，这些突变体对应的基因都是与短链脱氢/还原酶相关的基因。番茄sitiens突变体是醛氧化酶(AO)缺失(Taylor IB.The wilty tomato mutants flaccaand sitiens are impaired in the oxidation of ABA-aldehyde to ABA.Plant Cell Environ，1988，11：739-745.)，它不能将ABAId氧化成ABA。拟南芥aba3(Schwartz SH，Le′on-Kloosterziel KM，Koornneef M，Zeevaart JAD.Biochemical characterization of the aba2and aba3 mutants inArabidopsis thaliana.Plant Physiol，1997a，114：161-166.)、烟草abal以及番茄flacca突变体(Taylor IB.The wilty tomato mutants flacca and sitiens are impaired in theoxidation ofABA-aldehyde to ABA.Plant Cell Environ，1988，11：739-745.)均呈现番茄sitiens的表型，研究发现AtABA3编码钼辅因子硫化酶(molybdenum cofactor sulfurase)(Xiong LM，Ishitani M，Lee H，Zhu JK.The Arabidopsis LOS5/ABA3 locus encodes a molybdenum cofactorsulfurase and modulates cold stress andosmotic stress-responsive gene expression.Plant Cell，2001a，13：2063-2083；Bittner F，Oreb M，Mendel RR.ABA3 is a molybdenum cofactorsulfurase required for activation of aldehyde oxidase and xanthine dehydrogenase in Arabidopsisthaliana.J Boil Chem.，2001，276：40381-40384.)，说明醛氧化酶是依赖于钼辅因子的氧化酶。

在途径(2)中，黄质醛通过黄质酸转变成ABA。从化学结构上看，黄质酸是容易转化成ABA的化合物，但是参与该途径的基因还未被克隆(Seo M，Koshiba T.Complex regulationof ABA biosynthesis in plants.Trends in Plant Science，2002，7(1)：41-48.)。番茄flacca突变体虽然缺失醛氧化酶的活性，但仍能检测到少量14C标记的黄质醛转变成ABA，说明可能存在另外的途径形成ABA。

在途径(3)中，黄质醛首先被短链脱氢/还原酶(SDR)还原成脱落醛，脱落醛被还原成脱落醇，脱落醇再氧化成ABA。

(4)ABA的降解途径

植物体内ABA含量的升高会诱使ABA的分解代谢加速。如在烟草中过量表达PvNCED1基因导致ABA降解产物红花菜豆酸的累积(Qin X，Zeevaart JAD.Overexpression of a9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene in Nicotiana plumbaginifolia increases abscisic acidand phaseic acid levels and enhances drought tolerance.Plant Physiol，2002，128：544-551)。目前，ABA在植物体内主要有3条分解代谢途径：8’-位甲基的羟基化代谢途径，9’-位甲基的羟基化代谢途径和ABA的酯化降解途径(CutlerAJ，Krochko JE.Formation and breakdown ofABA.Trends Plant Sci，1999，4：472-478；Zhou R，Cutler AJ，Ambrose SJ.A new abscisic acidcatabolic pathway.Plant physiol.，2004，134：361-369)。

在ABA生物合成中，除外界环境条件起诱导外，植物体内的一些因素如酶及辅酶因子也起着更为重要的调节作用。对ABA生物合成起关键作用的反应存在于由八氢番茄红素以后的步骤。其次，一些与异戊烯基焦磷酸(IPP)合成有关的酶，某些异构酶和特定的辅因子如钼辅因子(MoCo)及钼辅因子硫化酶(MCSU)等以及细胞膜类固醇都可能调节ABA的生物合成(Xiong LM，Ishitani M，Lee H，Zhu JK.The Arabidopsis LOS5/ABA3 locusencodes a molybdenum cofactor sulfurase and modulates cold stress andosmoticstress-responsive gene expression.Plant Cell，2001a，13：2063-2083)。

在酶调节生物合成方面，参与中期反应的玉米黄质环氧化酶(ZEP)、9-顺环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)和后期反应的醛氧化酶(AO)可能是关键的调控酶，在ABA的生物合成中起着主要的调控作用(Seo M，KoshibaT.Complex regulation of ABA biosynthesis inplants.Trends in Plant Science，2002，7(1)：41-48；Sagi M，Fluhr R，Lips SH.Aldehyde oxidaseand xanthine dehydrogenasein a flacca tomato mutant with deficient abscisic and wiltyphenotype.Plant Physiol.，1999，120：571-577)。

NCED的作用是转运到质体中催化C₄₀的9-顺新黄质和9-顺紫黄质发生裂解形成ABA的前体物质黄质醛(C₁₅)和一个C₂₅化合物，NCED催化底物11和12位C间的双键发生氧化裂解(Schwartz SH，Le′on-Kloosterziel KM，Koornneef M，Zeevaart JAD.Biochemicalcharacterization of the aba2 and aba3 mutants in Arabidopsis thaliana.Plant Physiol，1997a，114：161-166)。大量的实验结果证实，该步反应是催化ABA生物合成的关键步骤，反应发生在质体中。

Iuchi等(2000)从与豇豆脱水反应有关的cDNA中分离得到了一个9-顺环氧类胡萝卜素双加氧酶的同源cDNA片段(Iuchi S，Kobayashi M，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.Astress-inducible gene for 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase involved in abscisic acidbiosynthesis under water stress in drought-tolerant cowpea.Plant Physiol.，2000，123：553-562)。其编码的蛋白(vuNCED)用GST融合显示其能催化9-顺环氧类胡萝卜素裂解。用sGFP(合成的绿色荧光蛋白)融合实验发现vuNCED蛋白N-末端序列可起到转运肽的作用，能将vuNCED转运至质体内。在鳄梨中，Tacqueline等已分离得到了三个NCED同源cDNA，并发现其中的PaNCED1及PaNCED3与果实成熟中ABA的合成有关。PaNCED1及PaNCED3都在其N-末端具有转运肽，类似于玉米、豇豆中的NCED，能从胞质转运进入质体中起作用(Chernys JT，Zeevaart JAD.Characterization of the 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase genefamily and the regulation of abscisic acid biosynthesis in avocado.Plant Physiol，2000，124：343-353)。目前的研究表明，NCED是在胞质内合成后在转运肽引导下进入质体后再进行催化叶绿醇的氧化裂解的。

随后在拟南芥(Neill SJ，Burnett EC，Desikan R，Hancock JT.Cloning of a wilt responsivecDNA from an Arabidopsis thaliana suspension culture cDNA library that encodes a putative9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase.J.Exp.Bot.，1998，49：1893-1894)、大豆(Qin X，ZeevaartJAD.The 9-cis-epoxycarotenoid cleavage reaction is the key regulatory step of abscisic acidbiosynthesis in water-stressed bean.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96：15354-15361)、番茄(Burbidge A，Grieve TM，Jackson A，Thompson A，McCarty DR，Taylor IB.Characterizationof the ABA-deficient tomato mutant notabilis and its relationship with maize Vp14.Plant J，1999，17(4)：427-431)和葡萄(Soar CJ，Speirs J，Maffei SM，Loveys BR.Gradients in stomatalconductance，xylem sap ABA and bulk leaf ABA along canes of Vitis viniferacv Shiraz：biochemical and molecular biological evidence indicating their source.Functional Plant Biology，2004，31：659-669)中均克隆了NCED基因。Tan等(2003)系统分析了拟南芥基因组中NCED基因家族的表达模式，发现AtNCEDs基因的表达有组织和发育特异性，且不同的AtNCEDs蛋白与叶绿体膜有着不同的结合能力，表明植物体内ABA的生物合成在转录、转录后和翻译后等各水平上受NCED基因表达的时空特异性调控(Tan BC，Joseph LM，Deng WT，Liu L，Li QB，Cline K，McCarty DR.Molecular characterization of the Arabidopsis9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene family.The Plant Journal，2003，35：44-56)。

NCED的基因是一多基因家族。VP14、PaNCED1和PaNCED2等都是9-顺环氧类胡萝卜素双加氧酶家族中的成员(Chernys JT，Zeevaart JAD.Characterization of the9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene family and the regulation of abscisic acid biosynthesisin avocado.Plant Physiol，2000，124：343-353)。在玉米、大豆、拟南芥、番茄及鳄梨中NCED的氨基酸序列60％同源(Burbidge A，Grieve TM，Jackson A，Thompson A，McCarty DR，TaylorIB.Characterization of the ABA-deficient tomato mutant notabilis and its relationship withmaize Vp14.Plant J，1999，17(4)：427-431)。

最早从玉米突变体中发现的玉米VP14基因(即NCED)的诱导表达与ABA水平的增加成平行关系，认为干早诱导的ABA合成受NCED活性的调控(Schwartz SH，Le′on-Kloosterziel KM，Koornneef M，Zeevaart JAD.Biochemical characterization of the aba2and aba3 mutants in Arabidopsis thaliana.Plant Physiol，1997a，114：161-166)。Cheng等(2002)报道在Landsberg遗传背景下的拟南芥中，ABA可诱导AtNCED3基因表达，除此以外，干旱和盐胁迫处理后，ABA缺乏型突变体los5，和los6中AtNCED3转录水平与野生型幼苗相比明显降低，表明在渗透胁迫中AtNCED3的完全激活需要ABA(Xiong LM，Lee H，Ishitani M，Zhu JK.Regulation of osmotic stress responsive gene expression by the LOS6/ABA1 locus inArabidopsis.J Biol Chem，2002，277：8588-8596)。这些结果表明ABA生物合成的正反馈调节作用存在，但干早诱导的NCED基因表达的反馈调节机制有待进一步研究。

NCED在果实成熟、萎蔫、缺水等过程或条件下对植物中ABA的合成起着关键的调节作用。萎蔫过程中VP14的表达与ABA水平的升高成平行关系。鳄梨中NCED组织特异性表达，对其蛋白活性研究发现果实成熟过程中ABA的变化与NCED的表达也是一致的。豇豆在干旱环境中编码ZEP的VuABA2基因并不表达，但VuNCED1基因却高度表达。在海棠根系中脂氧化酶(LOX)活性与ABA的积累一致，用LOX的专一抑制剂去甲愈创木酸(MDGA)抑制LOX活性，结果发现胁迫诱导的ABA被阻断(杨洪强、贾文锁、张大鹏，水分胁迫下湖北海棠根系脂养合酶活性与ABA积累的关系.植物学报，2000年03期)。NCED为LOX的同工酶或同类酶，同样可裂解C₄₀类胡萝卜素。因此，NCED是ABA生物合成中最关键的酶。

综上所述，脱落酸(ABA)作为一种调控生长发育的激素，对植物胚胎发育、种子休眠、果实成熟和抗逆性等多种生理过程起着重要的调控作用。干旱条件下，ABA的累积是以ABA合成酶基因的调控为基础的。ABA在植物响应水分胁迫中的作用，ABA参与了气孔活动的调控。在干旱条件下，植物体内的ABA含量增高，ABA促进了开放的气孔关闭和抑制了关闭的气孔开放，最终结果是关闭气孔，从而降低了植物水分的蒸发(Mishra G，Zhang W，Deng F，Zhao J，Wang X.A bifurcating pathway directs abscisic acid effects onstomatal closure and opening in Arabidopsis.Science，2006，312：264-266)。9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED)是高等植物ABA生物合成途径中的关键酶。NCED基因受逆境胁迫诱导，导致逆境ABA的积累。研究NCED基因的克隆、表达、调控ABA的生物合成是提高植物抗逆性的重要途径。

生物节水是抗旱节水的一个重要途径，只有提高作物自身的水分利用效率才有可能取得节水农业的新突破。利用现代的分子遗传转基因技术，可以将不同物种间的抗旱节水基因进行转移，培育出新的抗旱节水、高产优质的生物新品种，这就是生物节水研究的重要方向。目前我国在作物的水分利用效率生理遗传育种及分子生物学等方面的研究还很薄弱，因此，在作物抗旱节水基因工程的很多方面还有待大力加强，这对我国节水农业和可持续农业的深入发展有着重要意义。

干旱(水分胁迫)是影响植物生长发育的主要逆境因子，能诱导许多参与逆境响应基因的表达。目前，水分胁迫及其信号转导机制虽然在拟南芥中已有广泛研究(Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K.Gene expression and signal transduction in water-stress response.PlantPhysiology，1997，115：327-334)，但相关工作在单子叶植物中的系统研究还很有限，尤其对农作物开展的研究相对较少，特别是农作物响应干早信号与其NCED基因表达和ABA水平之间的关系及其机制仍有待阐明。

此外，环境中的非生物胁迫严重影响植物的生长和发育，造成农作物的减产，是限制农作物和其他经济作物产量的重要因素之一，因而培育耐逆的作物品种是农业的主要目标之一。水稻是世界上最重要的粮食作物，也是单子叶植物的模式植物，它为全球近一半的人口提供食物。然而，干旱、高盐和低温等逆境胁迫，每年都会在全世界范围内造成水稻大面积的减产，全球约有40％的水稻种植区受到不同程度的环境胁迫。随着全球人口的不断增加和可耕种面积的逐年减少，提高水稻产量成为全球所共同面临的一个紧迫的挑战，而减少逆境胁迫所造成的产量损失，就能够在很大程度上缓解粮食危机。

发明内容

本发明的目的是提供一组水稻中与耐旱相关的OsNCEDs基因。

本发明所提供的与耐旱性相关的OsNCEDs基因，来源于稻属水稻(Oryza sativa L.)，编码的蛋白质具有下述氨基酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)序列表中的SEQ ID NO：3；

3)序列表中的SEQ ID NO：5；

4)将序列表中SEQ ID NO：1、3或5的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且所衍生的蛋白质具有调控植物耐旱性的功能。

序列表中的SEQ IDNO：1由608个氨基酸残基组成，其中，自氨基端第108-601位氨基酸残基为RPE65保守区，将具有该氨基酸残基序列的蛋白命名为OsNCED3；序列表中的SEQ ID NO：3由582个氨基酸残基组成，其中，自氨基端第76-575位氨基酸残基为RPE65保守区，将具有该氨基酸残基序列的蛋白命名为OsNCED4；序列表中的SEQ ID NO：5由613个氨基酸残基组成，其中，自氨基端第110-606位氨基酸残基为RPE65保守区，将具有该氨基酸残基序列的蛋白命名为OsNCED5；所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

本发明来源于水稻的与耐旱性相关的OsNCEDs基因，可以具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列；

3)序列表中SEQ ID NO：6的DNA序列；

4)与序列表中SEQ ID NO：2、4或6限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有调控植物耐旱性功能的蛋白质；

5)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2、4或6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在O.1×SSC(或0.1×SSPE)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。其中，0.1×SSC为20×SSC的稀释液，20×SSC的配方为：3mol/L NaCl(175g/L)，0.3mol/L柠檬酸三钠·2H₂O(88g/L)，用1mol/LHCl调至pH7.0。

序列表中的SEQ ID NO：2由1827个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-1827位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质，其中，自5’端第322-1803位碱基编码RPE65保守区，将具有该核苷酸序列的基因命名为OsNCED3；序列表中的SEQID NO：4由1749个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-1749位碱基，编码具有序列表中SEQ IDNO：3的氨基酸序列的蛋白质，其中，自5’端第226-1725位碱基编码RPE65保守区，将具有该核苷酸序列的基因命名为OsNCED4；序列表中的SEQ ID NO：6由1842个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-1842位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸序列的蛋白质，其中，自5’端第328-1818位碱基编码RPE65保守区，将具有该核苷酸序列的基因命名为OsNCED5。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增OsNCED3、OsNCED4、OsNEDE5中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐旱性的方法。

本发明所提供的提高植物耐旱性的方法，是将本发明与耐旱性功能相关的基因(例如：OsNCED3、OsNCED4、OsNEDE5或与这些基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列)导入植物组织、细胞或器官，使植物耐旱性获得提高。

在上述提高植物耐旱性的方法中，本发明水稻与耐旱性相关基因(OsNCED3、OsNCED4、OsNEDE5)既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列；与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组基因序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

编码本发明水稻与耐旱性相关基因(OsNCED3、OsNCED4、OsNEDE5)或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如Gateway^TW系列载体(如pH2GW7等)、pBin系列载体(如pBin 19等)、pBI系列载体(如pBI 101等)、pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA 1301等)、per8、pX6或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pENTER-TOPO、pUC系列载体或pBluescript系列载体等。

使用编码本发明水稻与耐旱性相关基因(OsNCED3、OsNCED4、OsNEDE5)或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型(ABA、干旱、盐碱或化学诱导等)启动子：所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，玉米Ubiquitin启动子或水稻actin1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子、维管特异性表达启动子、种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2S1启动子(GenBank号：NM_118848.2，GI：30687489)和NapinA(GenBank号：M64633.1，GI：349405)启动子等；所述诱导型启动子可为受低温、干旱、ABA、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子。上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以包含ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

其中，以pH2GW7(购自inVitrogen公司)为出发载体，构建的含有本发明水稻与耐旱性相关的OsNCEDs基因的植物表达载体为pH2GW7 Vector-OsNCED3、pH2GW7Vector-OsNCED4、pH2GW7 Vector-OsNCED5。

携带有编码本发明水稻与耐旱性相关的基因(OsNCED3、OsNCED4、OsNEDE5)或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

此外，通过将转化有编码本发明水稻与耐旱性相关基因(OsNCED3、OsNCED4、OsNEDE5)或与所述基因具有90％以上同源性且编码功能相同蛋白的DNA序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。此外，还可对该转基因植株进行扩繁，可使转基因植物的抗逆性进一步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包括无性繁殖和/或种子繁殖。

本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、马铃薯或牧草等双子叶植物，也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。

本发明提供了一组来源于水稻与ABA合成相关的可提高耐旱性的OsNCEDs家族基因。实验证明，将本发明的基因转化水稻可显著提高水稻对干旱胁迫的耐受性，且对水稻的正常生长和经济性状没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物逆境耐受性机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的抗逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为来自水稻的与耐旱性相关OsNCEDs基因的结构域的同源性比对结果。

图2为来自水稻的与耐旱性相关的OsNCEDs基因与已知的拟南芥的AtNCED3的进化树(以RPE65结构域的保守性为依据)。

图3为OsNCED3-pH2GW7、OsNCED3-pHORD、OsNCED4-pH2GW7和OsNCED5-pHORD T1代转基因水稻不同株系耐旱苗比例图。

图4为经干旱胁迫的OsNCED3-pH2GW7、OsNCED3-pHORD、OsNCED4-pH2GW7和OsNCED5-pHORD T1代转基因耐旱植株与野生型植株的对比照。

图5为OsNCED3-pH2GW7、OsNCED3-pHORD、OsNCED4-pH2GW7和OsNCED5-pHORD T2代转基因水稻不同株系耐旱苗比例图。

图6为经干旱胁迫的OsNCED3-pH2GW7、OsNCED3-pHORD、OsNCED4-pH2GW7和OsNCED5-pHORD T2代转基因耐旱植株与野生型植株的对比照。

图7为OsNCED3-pH2GW7、OsNCED4-pH2GW7转基因水稻和非转基因水稻种子萌发的时间关系图。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。

实施例1、耐旱基因OsNCEDs的获得

1、基因序列的获得

我们以拟南芥AtNCED3的cDNA序列为基础在水稻基因组数据库中做blast分析。发现了与AtNCED3序列高度同源的3个OsNCEDs基因，分别命名为OsNCED3(AY838899)、OsNCED4(AY838900)、OsNCED5(AY838901)。

2、OsNCED3、OsNCED4和OsNCED5的PCR扩增及序列分析

以水稻中花11号(Oryza sativa“ZhonghuaNO.11”)的总DNA为模板，采用PCR方法扩增OsNCED3、OsNCED4、OsNCED5，引物序列如下：

(1)按OsNCED3的CDS序列设计引物：

OsNCED3-F 5’-CACCACAAAATGGCGACGATCACGACG-3’

OsNCED3-R 5’-GGCCTGGGTGGTGAGCTC-3’

(2)按OsNCED4的CDS序列设计引物：

OsNCED4-F 5’-CACCACAAAATGGCGTCCTCCGCGCCTT-3’

OsNCED4-R 5’-AGCTTGTCGCTGCAGCTCGTT-3’

(3)按OsNCED5的CDS序列设计引物：

OsNCED5-F 5’CACCACAAAATGCCGACCACCTTCACGCC-3’

OsNCED5-R 5’-GGCCTGCGTGGCGAGCT-3’

25μl PCR反应体系为：上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，Taq酶0.5μl，10×dNTPs1μl，10×buffer(Mg²⁺)2.5μl，H₂O 18μl。

PCR反应条件为预热94℃预变性2min、然后94℃变性30s、60℃退火40s、72℃延伸90s，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了大小分别为1827bp，1749bp，1842bp的DNA片段，与预期结果相符。

回收并纯化上述片段，将其分别连接入载体pENTER-TOPO(Invitrogen公司)中，再将连接产物分别用CaCl₂法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，挑选阳性单菌落加入到5mL含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提质粒，得到含有目的片段的重组质粒，分别命名为pENTER-TOPOVector-OsNCED3、pENTER-TOPO Vector-OsNCED4和pENTER-TOPO Vector-OsNCED5对上述质粒进行测序，测序结果表明获得了序列正确的OsNCED3、OsNCED4和OsNCED5。其中，OsNCED3具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列，由1827个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-1827位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质，其中，自5’端第322-1803位碱基编码RPE65保守区，与AtNCED3(GenBank号：NP_188062)的氨基酸序列具有79％的一致性，与玉米的ZmVP14分别有90％的同源性；OsNCED4具有序列表中SEQ ID NO：4的核苷酸序列，由1749个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-1749位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质，其中，自5’端第226-1725位碱基编码RPE65保守区，与AtNCED3(GenBank号：NP_188062)的氨基酸序列具有80％的一致性，与玉米的ZmVP14分别有80％的同源性；OsNCED5具有序列表中SEQ ID NO：6的核苷酸序列，由1842个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-1842位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸序列的蛋白质，其中，自5’端第328-1818位碱基编码RPE65保守区，与AtNCED3(GenBank号：NP_188062)的氨基酸序列具有80％的一致性，与玉米的ZmVP14分别有83％的同源性；对OsNCED3、OsNCED4和OsNCED5编码的氨基酸序列进行序列比对分析，结果如图1所示，比对结果表明上述各基因编码氨基酸序列具有79.3％的一致性，归为同一类NCEDs基因。同时，根据序列比对结果建立了OsNCEDs(GenBank号AAW21319，AAW21320，AAW21321)与已知的拟南芥的AtNCED基因的进化树，如图2所示，表明本发明来源于水稻的与抗旱性相关的NCED基因与已知的拟南芥的AtNCED基因具有较高的同源性，氨基酸一致性可达79％以上。

实施例2、水稻中耐旱相关OsNCEDs基因的转基因水稻的获得

用农杆菌介导法将实施例1获得的与耐旱性相关的基因OsNCED3、OsNCED4和OsNCED5分别转化水稻，具体方法如下：

1)pHORD载体的构建：

将pH2GW7载体(Invitrogen公司的Gateway^TM vector载体，含CaMV 35S组成型启动子)中的CaMV 35S组成型启动子换成拟南芥rd29A诱导型启动子(Narusaka Y， Nakashima K，Shinwari ZK，Sakuma Y，Furihata T，Abe H，Narusaka M，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K.Interaction between two cis-acting elements，ABRE and DRE，inABA-dependent expression of Arabidopsis rd29A gene in response to dehydration andhigh-salinity stresses.Plant Journal，2003，34(2)：137-48.)。具体方法：以拟南芥基因组DNA为模板，用rd29A-F1(5’CACCGAGCTCATTTTCGTTCTTGACATCATTCA-3’，含Sac I酶切位点)和rd29A-R1(5’GGACTAGTGATTGTTTTCTAGTTTGCATATTTG-3’，含Spe I酶切位点)引物扩增rd29A启动子片段(Prd29A)获得488bp片段，并克隆至pGEM-T载体(购自Promega公司)，获得质粒pGEM-T Easy-Prd29A(3503bp)；用限制性内切酶Sac I和Spe I双酶切pGEM-T Easy-Prd29A，通过琼脂糖凝胶电泳回收474bp的片段，并将该片段连接到Sac I和Spe I双酶切后的pH2GW7载体上，获得诱导型植物表达载体pHORD(10087bp)。

2)转化农杆菌

通过LR反应将实施例1中构建的重组质粒pENTER-TOPO Vector-OsNCED3、pENTER-TOPO Vector-OsNCED4和pENTER-TOPO Vector-OsNCED5分别重组到表达载体pH2GW7和表达载体pHORD上，LR反应体系为2μl缓冲液，2μl(150-300ng)线性化的pH2GW7(或pHORD)质粒DNA，2μl(100-300ng)pENTER-TOPO Vector-OsNCED3、pENTER-TOPO Vector-OsNCED4或pENTER-TOPO Vector-OsNCED5质粒DNA，2μlH2O，再加入2μl LR Clonase，LR反应条件为25℃水浴保温1-3h，加入1μl 2U/μl蛋白酶K，37℃水浴10min。然后，通过热激法将上述重组载体转化大肠杆菌(E.coli)DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，挑选阳性单菌落加入到5mL含50mg/L的壮观霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提取质粒，用限制性内切酶EcoRI进行酶切鉴定，经酶切获得了大小分别为1827bp、1749bp和1842bp的酶切产物，与预期结果相符，再在实施例1中引物的引导下进行PCR鉴定，鉴定结果表明获得了分别含有OsNCED3、OsNCED4和OsNCED5的重组植物表达载体，分别命名为OsNCED3-pH2GW7、OsNCED3-pHORD、OsNCED4-pH2GW7和OsNCED5-pHORD，随后将上述重组载体分别转化农杆菌AGL0菌株(中国科学院遗传所赠送)。

3)侵染水稻愈伤组织

挑取步骤2)获得的阳性重组农杆菌的单菌落接种于含壮观霉素50mg/L和利福平50mg/L的20mL YEB液体培养基中，在28℃、150rpm下振荡培养2-3天，再于4℃、5000rpm离心3分钟，去上清，将菌体沉淀重悬于含0.1mmol/L乙酰丁香酮的AA培养基(Co(NO₃)₂·6H₂O 0.15mg/L，CaCl₂ 110mg/L，MgSO₄ 122mg/L，KI 3.75mg/L，NaH₂PO₄·H₂O150mg/L，Na₂-EDTA 0.01mM，FeSO₄·7H₂O 139mg/L，KCl 2.95g/L，MnSO₄·4H₂O 84.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 6.25mg/L，H₃BO₃ 5mg/L，Gly 37.5mg/L，CuSO₄ 0.005mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O1.25mg/L，盐酸硫胺素VB₁ 5mg/L，烟酸5mg/L，盐酸吡哆醇VB₆ 5mg/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L-Gln 87.6mg/L，L-Asp 26.6mg/L，蔗糖20g/L)中，在28℃下避光振荡培养1-2小时至OD₆₀₀＝0.6-0.9。挑选按常规植物组织培养方法获得的水稻中花11的生长状态良好、颗粒状愈伤组织浸入上述分别转化有OsNCED3-pH2GW7、OsNCED3-pHORD、OsNCED4-pH2GW7和OsNCED5-pHORD的重组农杆菌培养液中摇动20分钟后，静置30分钟，取出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织接种于N₆共培养基(N₆培养基+10g/L葡萄糖+1mg/L乙酰丁香酮+2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)2mg/L)上培养，其中N₆基本培养基的配方为(NH₄)₂SO₄ 0.46g/L，KNO₃ 2.83g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MgSO₄ 0.092g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，Na₂-EDTA 0.15g/L，FeSO₄·7H₂O 0.11g/L，MnSO₄·4H₂O0.44g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.17g/L，H₃BO₃ 0.14g/L，CoCl₂·6H₂O 0.0005g/L，CuSO₄·5H₂O0.0005g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.005g/L，盐酸硫胺素VB₁ 0.01g/L，烟酸0.001g/L，盐酸吡哆醇VB₆ 0.001g/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L-Pro 0.5g/L，蔗糖30g/L，琼脂10g/L，pH5.8。2-3天后，将愈伤组织放入广口瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，然后在含500mg/L头孢霉素的无菌水中浸泡30-60分钟，最后再用无菌水冲洗1遍，置于无菌滤纸上晾干，最后转入筛选培养基(N₆基本培养基+2，4-D 2mg/L+头孢霉素250mg/L)筛选。

4)阳性转基因水稻的获得

将侵染后的水稻愈伤组织于N₆共培养基中共培养3-5天后，转至含30mg/L潮霉素和400mg/L头饱霉素的N₆固体培养基(N₆大量元素+B₅微量元素+B₅有机成分+300mg/L水解酪蛋白+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+7-8g/L琼脂，pH5.8)上筛选3周，再转入含50mg/L潮霉素和200mg/L头饱霉素的N₆固体培养基上筛选4周，随后将抗性愈伤组织转入预分化培养基(N₆培养基+1mg/L奈乙酸+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤+5mg/L脱落酸)，光照培养3周，再转入分化培养基(N₆培养基+1mg/L奈乙酸+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤)上进行分化，将生长出的再生植株在壮苗培养基(1/2MS无机盐+0.5mg/L奈乙酸+0.25mg/L多效唑)上进行生根培养后移至温室中，在28℃、15小时/天的光照下培养1个月后取植株叶片，按常规方法提取总DNA，在正向引物5’ACTCACCGCGACGTCTGT-3’和反向引物5’TTCCTTTGCCCTCGGACG-3’的引导下，PCR扩增潮霉素磷酸转移酶基因，经扩增获得1009bp DNA片段的为阳性转基因植株，检测结果表明用上述方法获得了分别转化有OsNCED3-pH2GW7，OsNCED3-pHORD，OsNCED4-pH2GW7和OsNCED5-pHORD的转基因水稻。

实施例3、转基因T1代水稻植株的遗传分析和分子鉴定

取实施例2收获的OsNCED3-pH2GW7、OsNCED3-pHORD、OsNCED4-pH2GW7和OsNCED5-pHORD T1代转基因水稻的种子，用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以未转基因水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3∶1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的OsNCED3-pH2GW7、OsNCED3-pHORD、OsNCED4-pH2GW7和OsNCED5-pHORD转基因株系。

选取生长期为15天的单位点插入的转基因株系的植株，用Trizol试剂提取各植株总RNA，使用申能博彩公司的反转录试剂盒并参照试剂盒说明以总RNA(1μg)为模板反转录合成其cDNA，再以合成的cDNA为模板，以水稻actin1基因(GenBank号：P13362)为内源参照，利用相应的基因特异性引物，对转基因植株内源表达的OsNCED3、OsNCED4和OsNCED5的表达水平进行半定量RT-PCR分析，检测目标基因是否过表达，以野生型水稻为对照(CK)，引物序列如下：

OsNCED3-RT-F：5′-CGCCAGGATATGCTCACA-3′

OsNCED3-RT-R：5′-AGGACATTCGCCACAAAC-3′；

OsNCED4-RT-F：5′-ATCGTGGTCATCGGCTCCT-3′

OsNCED4-RT-R：5′-AACTTCTCCGCCGTGCC-3′；

OsNCED5-RT-F：5′-AGAAGAAGGATGGGCTGA-3′

OsNCED5-RT-R：5′-GCAGTCTCGGTGAAGCG-3′；

检测水稻actin1基因的引物：

ACTIN-F：5′-TCCGTGACATCAAGGAAAAG-3′；

ACTIN-R：5′GATATCAACATCGCACTTCATG-3′。

25μl RT-PCR反应体系为：上、下游引物各0.5μl，cDNA 1μl，Taq酶0.3μl，dNTPs 0.5μl，10×PCR缓冲液2.5μl，H₂O 20.2μl。RT-PCR反应条件为95℃5min预热，然后94℃ 1min，55℃40s，72℃1min，30个循环，最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明OsNCED3、OsNCED4和OsNCED5在各自的转基因植株内均获得高水平表达。

实施例4、转基因T1代植株耐旱性鉴定

收获OsNCED3-pH2GW7、OsNCED3-pHORD、OsNCED4-pH2GW7和OsNCED5-pHORD T1代转基因水稻种子。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以未转基因水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，获得具有单位点插入的OsNCED3-pH2GW7、OsNCED3-pHORD、OsNCED4-pH2GW7和OsNCED5-pHORD转基因株系，并进行Southern印记分析，进一步鉴定外源插入基因的拷贝数。每个基因选择5个不同的单拷贝转基因株系，继续培养10天后对其转基因阳性苗进行干旱处理，同时设未转基因的水稻中花11植株作对照。将水稻幼苗种入装箱的土壤中，采用蛭石∶营养土比例为3∶1的混合土，土壤的含水量限定为55-65％之间(采用烘干法测量土壤含水量，根据土壤烘干前后土壤重量的差值计算土壤的含水量)。从处理即日起不再浇水，采用重复干旱法，即当同一培养箱中约50％的幼苗表现出萎蔫时结束第一次干旱，复水约7天，使苗恢复生长，再进行第二次干旱处理，直至绝大多数的未转基因水稻苗的叶片干枯、茎杆脱水弯曲、死亡，而各转基因株系的生长状态良好，叶片稍下垂，茎杆直立，停止筛选，复水培养。此过程大约需要20-30天。在正常的复水培养条件下恢复生长2周后统计各转基因株系的成活苗数，计算耐旱苗比例，结果如图3所示(横坐标为不同的转基因株系编号，纵坐标为耐旱苗百分比)，与野生型(WT)对照植株相比，OsNCED3-pH2GW7、OsNCED3-pHORD、OsNCED4-pH2GW7和OsNCED5-pHORD转基因水稻T1代植株对干旱胁迫的耐受性均明显提高。OsNCED3-pH2GW7、OsNCED3-pHORD、OsNCED4-pH2GW7和OsNCED5-pHORD转基因水稻T1代经耐旱处理后的植株与经耐旱处理后的未转基因对照植株如图4所示，每张照片中WT为未转基因对照植株，右边的三盆为不同编号的转基因株系。筛选出的转基因耐旱苗在大田中继续生长获得T2代种子。

实施例5、转基因T2代植株耐旱性鉴定

选取在T1代的耐旱性筛选中有抗旱功能的转基因水稻株系，收获种子(T2代种子)，对其T2代转基因苗进行进一步耐旱性实验鉴定。每个转基因株系选择3个T2代编号(要求转入基因为纯合体)，每个T2代编号至少培养100株苗，培养至15天时开始进行干旱处理。将水稻幼苗植入装箱的土壤中，采用蛭石∶营养土比例为3∶1的混合土，土壤的含水量限定为55-65％之间(采用烘干法测量土壤含水量，根据土壤烘干前后土壤重量的差值计算土壤的含水量)。从处理即日起不再浇水，采用重复干旱法，即当同一培养箱中50％的幼苗表现出萎蔫时停止第一次干旱，复水约7天，使苗恢复生长，再进行第二次干旱处理，直至绝大多数的未转基因水稻苗的叶片干枯、茎杆脱水弯曲、死亡，而各转基因株系的生长状态良好，叶片稍下垂，茎杆直立，停止筛选，复水培养。此过程大约需要20-30天。在正常的复水培养条件下恢复生长2周后统计各转基因株系的成活苗数，计算耐旱苗比例(结果如图5所示)，非转基因的中花11作为对照(WT)基本上全部萎蔫，而转基因植株则表现出较强的抵抗干旱的能力。OsNCED3-pH2GW7、OsNCED3-pHORD、OsNCED4-pH2GW7和OsNCED5-pHORD转基因水稻T2代经耐旱处理后的植株与经耐旱处理后的未转基因对照植株(WT)如图6所示，每张照片中左边的三株苗为未转基因的对照植株，右边的三株苗为本发明的转基因耐旱植株。筛选出的转基因耐旱苗在大田中继续生长。

实施例6、OsNCEDs转基因水稻的种子萌发过程发生延迟

将OsNCED3-pH2GW7和OsNCED4-pH2GW7转基因水稻分别选取6个株系的T1代转基因水稻种子，每个株系取200粒种子，用无菌水浸泡，使其发芽，同时设非转基因中花11水稻种子400粒作为对照株系，其中200粒和转基因水稻种子一样用无菌水发芽(H₂O-CK)，另外200粒种子用含ABA浓度为1mg/L的无菌水发芽(ABA-CK)。记录开始发苗的时间，并每隔24h分别计数各个转基因株系和对照已经萌发的种子的数量。通过连续的观察并计数，我们发现培养时间在48h左右的时候所有的种子均未发芽；到72h时H₂O-CK的种子有接近5％的发芽率，转基因水稻的种子和ABA-CK的种子均未发芽；96h的时候H₂O-CK有近50％的种子发芽，转基因水稻的种子和ABA-CK的种子开始有约5％的种子发芽。因此可以看出，转基因水稻种子的萌发明显延迟于非转基因水稻的萌发时间，结果如图7所示。同时，此表型类似施加了外源ABA时的非转基因水稻的萌发时间。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>北京未名凯拓农业生物技术有限公司

<120>一组与ABA合成相关的提高水稻耐旱性基因的克隆和应用

<130>JSP070225

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>608

<212>PRT

<213>水稻中花11(Oryza sativa L.)

<400>1

Met Ala Thr Ile Thr Thr Pro Gly Tyr Ala His Ile Gln Arg Gln His

1 5 10 15

Gly Arg Cys Ser Thr Thr Ala Gly Arg Arg Gly Ala Ser Asn Ser Val

20 25 30

Arg Phe Ser Ala Arg Ala Val Ser Ser Val Pro His Ala Ala Ala Ala

35 40 45

Ser Ser Ala Pro Ala Phe Leu Pro Val Pro Phe Val Pro Gly Ala Asp

50 55 60

Ala Pro Ser Pro Ser Gly Lys Ser Ala Ile Gly Val Pro Lys Ala Pro

65 70 75 80

Arg Lys Gly Glu Glu Gly Lys Arg Leu Asn Phe Phe Gln Arg Ala Ala

85 90 95

Ala Met Ala Leu Asp Ala Phe Glu Glu Gly Phe Val Ala Asn Val Leu

100 105 110

Glu Arg Pro His Gly Leu Pro Ser Thr Ala Asp Pro Ala Val Gln Ile

115 120 125

Ala Gly Asn Phe Ala Pro Val Gly Glu Thr Pro Pro Ala Arg Ala Leu

130 135 140

Pro Val Ser Gly Arg Ile Pro Pro Phe Ile Asn Gly Val Tyr Ala Arg

145 150 155 160

Asn Gly Ala Asn Pro His Phe Asp Pro Val Ala Gly His His Leu Phe

165 170 175

Asp Gly Asp Gly Met Val His Ala Val Arg Ile Arg Asn Gly Ala Ala

180 185 190

Glu Ser Tyr Ala Cys Arg Phe Thr Glu Thr Ala Arg Leu Arg Gln Glu

195 200 205

Arg Ala Met Gly Arg Pro Met Phe Pro Lys Ala Ile Gly Glu Leu His

210 215 220

Gly His Ser Gly Ile Ala Arg Leu Ala Leu Phe Tyr Ala Arg Ala Ala

225 230 235 240

Cys Gly Leu Leu Asp Pro Ser His Gly Thr Gly Val Ala Asn Ala Gly

245 250 255

Leu Ile Tyr Phe Asn Gly Arg Leu Leu Ala Met Ser Glu Asp Asp Leu

260 265 270

Pro Tyr Gln Val Arg Val Thr Ala Asp Gly Asp Leu Glu Thr Val Gly

275 280 285

Arg Tyr Asp Phe Asp Gly Gln Leu Gly Cys Ala Met Ile Ala His Pro

290 295 300

Lys Leu Asp Pro Ala Thr Gly Glu Leu His Ala Leu Ser Tyr Asp Val

305 310 315 320

Ile Lys Lys Pro Tyr Leu Lys Tyr Phe Tyr Phe Ala Pro Asp Gly Thr

325 330 335

Lys Ser Ala Asp Val Glu Ile Pro Leu Asp Gln Pro Thr Met Ile His

340 345 350

Asp Phe Ala Ile Thr Glu Asn Tyr Val Val Val Pro Asp His Gln Val

355 360 365

Val Phe Lys Leu Gln Glu Met Leu Arg Gly Gly Ser Pro Val Val Leu

370 375 380

Asp Lys Glu Lys Thr Ser Arg Phe Gly Val Leu Pro Lys His Ala Ala

385 390 395 400

Asp Ala Ser Glu Met Val Trp Val Asp Val Pro Asp Cys Phe Cys Phe

405 410 415

His Leu Trp Asn Ala Trp Glu Glu Ala Asp Thr Asp Glu Val Val Val

420 425 430

Ile Gly Ser Cys Met Thr Pro Ala Asp Ser Ile Phe Asn Glu Ser Asp

435 440 445

Asp Arg Leu Glu Ser Val Leu Thr Glu Ile Arg Leu Asn Thr Arg Thr

450 455 460

Gly Glu Ser Thr Arg Arg Ala Ile Leu Pro Pro Ser Ser Gln Val Asn

465 470 475 480

Leu Glu Val Gly Met Val Asn Arg Asn Leu Leu Gly Arg Lys Thr Arg

485 490 495

Tyr Ala Tyr Leu Ala Val Ala Glu Pro Trp Pro Lys Val Ser Gly Phe

500 505 510

Ala Lys Val Asp Leu Ala Thr Gly Glu Leu Thr Lys Phe Glu Tyr Gly

515 520 525

Glu Gly Arg Phe Gly Gly Glu Pro Cys Phe Val Pro Met Asp Ala Ala

530 535 540

Ala Ala Thr Pro Arg Gly Glu Asp Asp Gly Tyr Ile Lau Ser Phe Val

545 550 555 560

His Asp Glu Arg Ala Gly Thr Ser Glu Leu Leu Val Val Asn Ala Ala

565 570 575

Asp Met Arg Leu Glu Ala Thr Val Gln Leu Pro Ser Arg Val Pro Tyr

580 585 590

Gly Phe His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Asp Glu Leu Thr Thr Gln Ala

595 600 605

<210>2

<211>1827

<212>DNA

<213>水稻中花11(Oryza sativaL.)

<400>2

atggcgacga tcacgacgcc aggatatgct cacatacaga ggcagcacgg caggtgctcg 60

acgacggcgg gaaggcgtgg ggcgtccaat tcggtgagat tctccgcgcg cgcggttagc 120

tccgtgccgc acgcggcggc ggcgtcatcg gcgccggcgt tcctgccggt gccgttcgtg 180

cctggggccg acgcgccgtc gccgtcgggg aagagtgcca ttggcgtccc gaaggcgccg 240

aggaaggggg aggaggggaa gaggctcaac ttcttccagc gcgccgcggc gatggcgctc 300

gacgcgttcg aggaggggtt tgtggcgaat gtcctcgagc gcccgcacgg gctgccgagc 360

acggccgacc ccgcggtgca gatcgccggc aacttcgcgc cggtcggtga gacgccgccc 420

gcgcgcgcgc tgccggtgtc ggggcgcatc ccgcccttca tcaacggcgt ctacgcgcgc 480

aacggcgcca acccgcactt cgaccccgtc gccgggcacc acctgttcga cggcgatggc 540

atggtgcacg ccgtcaggat acgcaacggc gccgccgagt cgtacgcgtg ccggttcacg 600

gagaccgcgc ggctgcggca ggagcgcgcg atggggcggc ccatgttccc caaggccatt 660

ggggagctcc atggccactc cggcatcgcg cgccttgctc tgttctacgc gcgcgccgcc 720

tgcggcctcc tcgacccgtc gcacggcacc ggcgtcgcca acgccggcct cgtctacttc 780

aacggcaggc tcctcgccat gtcggaggac gacctcccct accaggtgtg cgtcaccgcc 840

gacgacgacc tcgagaccgt cggccgctac gacttcgacg ggcagctcgg ctgcgccatg 900

atcgcgcacc ccaagctcga cccggccacc ggcgagctcc acgcgctcag ctacgacgtg 960

atcaagaagc cgtacctcaa gtacttctac ttcgcgcccg acggcaccaa gtcggccgac 1020

gtcgagatcc cgctcgacca gcccaccatg atccacgact tcgccatcac cgagaactac 1080

gtggtggtgc ccgaccacca ggtggtgttc aagctccagg agatgctccg cggcggctcg 1140

cccgtggtgc tcgacaagga gaagacgtcg cggttcgggg tgctccccaa gcacgccgcg 1200

gacgcgtcgg agatggtgtg ggtggacgtc ccggactgct tctgcttcca cctctggaac 1260

gcgtgggagg aggcggacac cgacgaggtg gtggtgatcg gctcgtgcat gacccccgcc 1320

gactccatct tcaacgagtc cgacgaccgc ctcgagagcg tcctcaccga gatccgcctc 1380

aacacccgca ccggcgagcc gacgcggtgc gccatcctgc cgccgtcgag ccaggtcaac 1440

ctcgaggtgg gcatggtcaa ccgcaacctc ctcggccgca agacgcggta cgcctacctc 1500

gccgtggccg agccgtggcc caaggtgtcg ggcttcgcca aggtggacct cgccacgggt 1560

gagctcacca agttcgagta cggcgagggc cggttcggcg gcgagccctg cttcgtcccc 1620

atggacgccg ccgccgccac gccccgcggc gaggacgacg gctacatcct gtccttcgtc 1680

cacgacgagc gcgccgggac ctccgagctc ctcgtcgtca atgccgccga catgcgcctt 1740

gaggccaccg tgcagctgcc gtcccgcgtg ccgtacggct tccacggcac gttcatcacc 1800

ggcgacgagc tcaccaccca ggcctga 1827

<210>3

<211>582

<212>PRT

<213>水稻中花11(Oryza sativa L.)

<400>3

Met Ala Ser Ser Ala Pro Ser Ala Pro Gly Leu Ala Pro Val Ala Lys

1 5 10 15

Pro Pro Pro Pro Pro Ser Lys Val Lys Val Ala Thr Ala Thr Val Pro

20 25 30

Thr Asn Gly Lys Ile Lys Gln Gly Ala Arg Pro Met Arg Val Ser Ala

35 40 45

Pro Pro Val Glu Pro Arg Arg Arg Met Asn Pro Leu Gln Arg Leu Ala

50 55 60

Ala Ala Ala Ile Asp Ala Val Glu Glu Gly Leu Val Ala Gly Leu Leu

65 70 75 80

Glu Arg Gly His Ala Leu Pro Arg Thr Ala Asp Pro Ala Val Gln Ile

85 90 95

Ala Gly Asn Tyr Ala Pro Val Gly Glu Arg Pro Pro Val Arg Gly Leu

100 105 110

Pro Val Ser Gly Arg Leu Pro Ala Cys Leu Asp Gly Val Tyr Val Arg

115 120 125

Asn Gly Ala Asn Pro Leu His Ala Pro Arg Ala Gly His His Leu Phe

130 135 140

Asp Gly Asp Gly Met Leu His Ala Val Arg Leu Ala Gly Gly Arg Ala

145 150 155 160

Glu Ser Tyr Ala Cys Arg Phe Thr Glu Thr Ala Arg Leu Arg Gln Glu

165 170 175

Arg Glu Met Gly Arg Pro Val Phe Pro Lys Ala Ile Gly Glu Leu His

180 185 190

Gly His Ser Gly Val Ala Arg Leu Leu Leu Phe Gly Ser Arg Ala Leu

195 200 205

Cys Gly Val Leu Asp Ala Ser Arg Gly Ile Gly Val Ala Asn Ala Gly

210 215 220

Leu Val Tyr His Asp Gly Arg Leu Leu Ala Met Ser Glu Asp Asp Leu

225 230 235 240

Pro Tyr His Val Arg Val Thr His Asp Gly Asp Leu Glu Thr Val Gly

245 250 255

Arg Tyr Asp Phe His Gly Gln Leu Asp Ala Asp Gly Thr Met Ile Ala

260 265 270

His Pro Lys Leu Asp Pro Val Thr Gly Glu Leu Phe Ala Leu Ser Tyr

275 280 285

Asn Val Val Ser Lys Pro Tyr Leu Lys Tyr Phe Tyr Phe Thr Ala Asp

290 295 300

Gly Arg Lys Ser Arg Asp Val Asp Ile Pro Val Gly Ala Pro Thr Met

305 310 315 320

Ile His Asp Phe Ala Val Thr Glu Asn Tyr Ala Val Val Pro Asp Gln

325 330 335

Gln Ile Val Phe Lys Leu Gln Glu Met Val Arg Gly Gly Ser Pro Val

340 345 350

Val Tyr Asp Arg Glu Lys Ala Ser Arg Phe Gly Val Leu Pro Lys Arg

355 360 365

Ala Ala Asp Ala Ser Glu Leu Arg Trp Val Glu Val pro Gly Cys Phe

370 375 380

Cys Phe His Leu Trp Asn Ala Trp Glu Asp Asp Ala Thr Gly Glu Ile

385 390 395 400

Val Val Ile Gly Ser Cys Met Thr Pro Pro Asp Ala Val Phe Asn Glu

405 410 415

Pro Ser Gln Ser Pro Glu Glu Glu Ser Phe Arg Ser Val Leu Ser Glu

420 425 430

Ile Arg Leu Asp Pro Arg Thr Gly Val Ser Arg Arg Arg Asp Val Leu

435 440 445

Arg Asp Ala Ala Glu Gln Val Asn Leu Glu Ala Gly Met Val Asn Arg

450 455 460

Gln Leu Leu Gly Arg Lys Thr Arg Tyr Ala Tyr Leu Ala Ile Ala Glu

465 470 475 480

Pro Trp Pro Arg Val Ser Gly Phe Ala Lys Val Asp Leu Glu Ser Gly

485 490 495

Thr Ala Glu Lys Phe Ile Tyr Gly Glu Gly Arg Tyr Gly Gly Glu Pro

500 505 510

Cys Phe Val Pro Arg Ala Gly Ala Ala Ala Glu Asp Asp Gly His Val

515 520 525

Leu Cys Phe Val His Asp Glu Glu Arg Gly Thr Ser Glu Leu Val Val

530 535 540

Val Asp Ala Gly Ser Glu Ala Met Glu Glu Val Ala Ala Val Lys Leu

545 550 555 560

Pro Gly Arg Val Pro Tyr Gly Leu His Gly Thr Phe Ile Gly Ala Asn

565 570 575

Glu Leu Gln Arg Gln Ala

580

<210>4

<211>1749

<212>DNA

<213>水稻中花11(Oryza sativa L.)

<400>4

atggcgtcct ccgcgccttc cgcccccggc ctcgcgccgg tcgccaagcc gccgccgccg 60

ccgtccaagg tgaaggtggc gacagcaacc gtgccaacca atggcaagat caageagggt 120

gcgaggccaa tgcgtgtctc ggcgccgccg gtggagccgc ggcggcggat gaacccgctc 180

cagcggctgg cggcggcggc gattgacgcc gtggaggaag gcctcgtcgc cgggttgctc 240

gagcgggggc acgcgctgcc gcgcaccgct gatccggccg tgcagatcgc cgggaactac 300

gcgcccgtcg gggagcgccc gccggtgagg gggctgccgg tgtccggccg cctcccggcg 360

tgcctcgacg gggtgtacgt ccgcaacggc gccaacccgc tccacgcgcc gcgcgccggg 420

caccacctgt tcgacggcga cgggatgctg cacgccgtgc ggctcgccgg ggggcgcgcc 480

gagtcgtacg cgtgccggtt cacggagacg gcgcggctgc ggcaggagcg ggagatggga 540

cgccccgtgt tccccaaggc catcggcgag ctccacggcc actccggcgt tgcgcggctt 600

ctgctgttcg gctcgcgcgc gctctgcggc gtgctcgacg cgtcccgggg catcggcgtc 660

gccaacgccg gcctcgtcta ccacgacggc cgcctcctcg ccatgtccga ggacgacctc 720

ccctaccacg tccgtgtcac ccacgacggc gacctcgaga ccgtcgggag gtacgacttc 780

catgggcagc tcgacgccga cggcaccatg atcgcgcacc ccaagctcga cccggtcacc 840

ggcgagctct tcgcgctcag ctacaatgtc gtgtccaagc cgtacctcaa gtacttctac 900

ttcaccgccg acggccgcaa gtcccgagac gtcgacatcc ccgtcggcgc gccgacgatg 960

atccacgact tcgccgtcac cgagaactat gccgtcgtcc ccgaccagca gatcgtgttc 1020

aagctccagg agatggtgcg cggcggctcg ccggtggtat acgacaggga gaaggcgtcg 1080

cggttcggcg tgctcccgaa gcgcgccgcc gacgcgtcgg agctccggtg ggtggaggtc 1140

cccggctgct tctgcttcca cctctggaac gcgtgggagg acgacgccac cggcgagatc 1200

gtggtcatcg gctcctgcat gacgccgccg gacgccgtgt tcaacgagcc gtcgcagtcg 1260

ccggaggagg agagcttccg cagcgtgctc tccgagatcc gcctcgaccc gcgcaccggc 1320

gtgtcgcggc ggcgcgacgt gctgcgcgac gccgccgagc aggtgaacct cgaggccggc 1380

atggtgaacc ggcagctgct cggccggaag acgcggtacg cctacctcgc catcgccgag 1440

ccatggccga gggtgtcggg cttcgccaag gtggacctcg agagcggcac ggcggagaag 1500

ttcatctacg gcgaggggag gtacggcggc gagccatgct tcgttccgcg cgccggcgcc 1560

gcggcggagg acgacggcea cgtgctgtgc ttcgtccacg acgaggagcg cggcacgtcg 1620

gagctggtgg tggtggacgc cggcggcgag gcgatggagg aggtcgcggc cgtgaagctg 1680

ccggggcgcg tgccgtacgg attgcacggc accttcattg gcgccaacga gctgcagcga 1740

caagcttag 1749

<210>5

<211>613

<212>PRT

<213>水稻中花11(Oryza sativa L.)

<400>5

Met Pro Thr Thr Phe Thr Pro Asn Ser Pro Ala Ser Ser Cys Ser Ile

1 5 10 15

His His Arg Ala Ser Pro Ser Arg Gly Ala Arg Asn Ser Val Arg Phe

20 25 30

Thr Arg Pro Arg Ala Ala Ala Ala Ala Thr Asn Ser Val Leu Ser Ala

35 40 45

Pro Ser Ser Val Pro Pro Ala Tyr Val Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro

50 55 60

Thr Lys Met Phe Pro Glu Ala Gly Asp Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala

65 70 75 80

Ala Arg Arg Cys Gly Lys Lys Lys Asp Gly Leu Asn Phe Phe Gln Arg

85 90 95

Ala Ala Ala Val Ala Leu Asp Ala Phe Glu Glu Gly Phe Ile Thr Asn

100 105 110

Val Leu Glu Arg Pro His Ala Leu Pro Arg Thr Ala Asp Pro Ala Val

115 120 125

Gln Ile Ala Gly Asn Phe Ala Pro Val Gly Glu Gln Pro Pro Val Arg

130 135 140

Ser Leu Pro Val Ser Gly Arg Ile Pro Pro Phe Ile Asn Gly Val Tyr

145 150 155 160

Ala Arg Asn Gly Ala Asn Pro His Phe Glu Pro Thr Ala Gly His His

165 170 175

Leu Phe Asp Gly Asp Gly Met Val His Ala Val Arg Ile Arg Asn Gly

180 185 190

Ala Ala Glu Ser Tyr Ala Cys Arg Phe Thr Glu Thr Ala Arg Leu Gly

195 200 205

Gln Glu Arg Ala Leu Gly Arg Ala Val Phe Pro Lys Ala Ile Gly Glu

210 215 220

Leu His Gly His Ser Gly Ile Ala Arg Leu Ala Leu Phe Tyr Ala Arg

225 230 235 240

Gly Leu Cys Gly Leu Val Asp Pro Ser His Gly Thr Gly Val Ala Asn

245 250 255

Ala Gly Leu Val Tyr Phe Asn Gly Arg Leu Leu Ala Met Ser Glu Asp

260 265 270

Asp Leu Pro Tyr Gln Val Arg Val Thr Ala Asp Gly Asp Leu Glu Thr

275 280 285

Val Gly Arg Tyr Asp Phe Asp Gly Gln Leu Gly Cys Ala Met Ile Ala

290 295 300

His Pro Lys Leu Asp Pro Val Ser Gly Glu Leu Phe Ala Leu Ser Tyr

305 310 315 320

Asp Val Ile Lys Lys Pro Tyr Leu Lys Tyr Phe Tyr Phe Asp Ala Asp

325 330 335

Gly Thr Lys Ser Pro Asp Val Glu Ile Glu Leu Glu Gln Pro Thr Met

340 345 350

Ile His Asp phe Ala Ile Thr Glu Asn Phe Val Val Val Pro Asp His

355 360 365

Gln Val Val Phe Lys Leu Gly Glu Met Phe Arg Gly Gly Ser Pro Val

370 375 380

Val Leu Asp Arg Glu Lys Thr Ser Arg Phe Gly Val Leu Pro Lys His

385 390 395 400

Ala Thr Ser Ser Leu Glu Met Val Trp Val Asp Val Pro Asp Cys Phe

405 410 415

Cys Phe His Leu Trp Asn Ala Trp Glu Glu Ala Glu Ser Gly Glu Val

420 425 430

Val Val Val Gly Ser Cys Met Thr Pro Ala Asp Ser Ile Phe Asn Glu

435 440 445

Ser Asp Glu His Leu Glu Ser Val Leu Thr Glu Ile Arg Leu Asn Thr

450 455 460

Arg Thr Gly Glu Ser Thr Arg Arg Ala Val Leu Pro Pro Ala Ala Gln

465 470 475 480

Val Asn Leu Glu Val Gly Met Val Asn Arg Ala Met Leu Gly Arg Lys

485 490 495

Thr Arg Tyr Ala Tyr Leu Ala Val Ala Glu Pro Trp Pro Lys Val Ser

500 505 510

Gly Phe Ala Lys Val Asp Leu Ala Thr Gly Glu Leu Thr Lys Phe Glu

515 520 525

Tyr Gly Glu Gly Arg Phe Gly Gly Glu Pro Cys Phe Val Pro Met Gly

530 535 540

Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ser Pro Ala Arg Gly Glu Asp Asp Gly Tyr

545 550 555 560

Ile Leu Ser Phe Val Arg Asp Glu Ala Ala Gly Thr Ser Glu Leu Leu

565 570 575

Val Val Asn Ala Ala Asp Met Arg Leu Glu Ala Thr Val Gln Leu Pro

580 585 590

Ser Arg Val Pro Tyr Gly Phe His Gly Thr Phe Ile Asn Ala Gly Glu

595 600 605

Leu Ala Thr Gln A1a

610

<210>6

<211>1842

<212>DNA

<213>水稻中花11(Oryza sativa L.)

<400>6

atgccgacca ccttcacgcc caattccccc gcctcctcgt gttccataca ccaccgcgcc 60

tccccgtcga ggggtgcccg caattcggtg cggttcacgc gcccgcgcgc cgccgccgcg 120

gcgacgaact cggtgctcag cgcgccgtcg tccgtgccgc ccgcgtacgt gccgccgccg 180

ccgccgccgc cgaccaagat gttcccggag gcgggcgacg cggcggcggc caaggctgcg 240

gcgaggaggt gtggcaagaa gaaggatggg ctgaacttct tccagcgcgc ggcggcggtg 300

gcgctcgacg cgttcgagga agggttcatc acgaatgtgc tggagaggcc gcacgcgctg 360

ccgcggacgg ccgacccggc ggtgcagatc gccgggaact tcgcgccggt gggggagcag 420

ccgccggtgc ggtcgctccc ggtgtccggc cgcatcccgc ccttcatcaa tggcgtctac 480

gcccgcaacg gcgccaaccc gcacttcgag cccaccgcgg gccaccacct gttcgacggc 540

gacggcatgg tccacgccgt ccgcatccgc aacggcgccg ccgagtccta cgcctgccgc 600

ttcaccgaga ctgcgcgcct cggccaggag cgcgccctcg gccgcgccgt cttccccaag 660

gccatcggcg agctccatgg ccactccggc atcgcccgcc tcgccctctt ctacgcgcgg 720

gggctctgcg gcctcgtcga cccgtcgcac ggcaccggcg tcgccaacgc cggcctcgtc 780

tacttcaacg gccgcctcct cgccatgtcc gaggacgacc tcccgtacca ggtccgcgtc 840

accgccgacg gcgacctcga gacggtgggg cgctacgact tcgacggcca gctcggctgc 900

gccatgatcg cccaccccaa gctcgacccg gtctccggcg agctcttcgc cctcagctac 960

gacgtgatca agaagccata cctgaaatac ttctacttcg acgccgatgg caccaagtca 1020

cccgacgtcg agatcgagct tgagcagccg acgatgatcc acgacttcgc catcaccgag 1080

aacttcgtgg tggtacccga ccaccaggtg gtgttcaagc tcggcgagat gttccgcggc 1140

ggctcgccgg tggtgctcga cagggagaag acgtcgcggt tcggcgtgct ccccaagcac 1200

gcgacgagct cgttggagat ggtgtgggtc gacgtccccg actgcttctg cttccacctg 1260

tggaatgcgt gggaggaggc cgagtccggc gaggtggtgg tggtgggatc ctgcatgacg 1320

cccgccgact ccatcttcaa cgagtcggac gaacacctcg agagcgtgct caccgagatc 1380

cgcctcaaca cgcgcaccgg cgagtccacc cgccgcgccg tgctgccgcc ggcggcgcag 1440

gtgaacctcg aggtcggcat ggtgaaccgc gccatgctcg gccggaagac gaggtacgcc 1500

tacctcgccg tcgccgagcc gtggcccaag gtgtccggct tcgccaaggt ggacctcgcc 1560

accggcgagc tcaccaagtt cgagtacggc gagggccggt tcggcggcga gccgtgcttc 1620

gtgcccatgg gcggcgccgg cgccgccgcg tccccggcgc gcggcgagga cgacggctac 1680

atcctctcct tcgtccgcga cgaggccgcg ggcacatccg agctcctcgt cgtgaacgcc 1740

gccgacatga ggctggaggc caccgtccag ctgccgtcgc gcgtccccta cggcttccac 1800

ggcaccttca tcaacgccgg cgagctcgcc acgcaggcct ag 1842

Claims

1.与脱落酸合成相关的OsNCED基因在培育耐旱性植物中的应用，所述OsNCED基因来源于水稻，编码序列表中SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将所述OsNCED基因导入植物组织、细胞或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到耐旱性提高的转基因植物。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述OsNCED基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：4所示。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述OsNCED基因通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：用于构建所述植物表达载体的出发载体是一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体，或者是可在原核生物中复制的载体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述出发载体是pH2GW7或pHORD载体，所述pHORD载体是用拟南芥rd29A诱导型启动子取代pH2GW7载体中的CaMV 35S组成型启动子而得到的载体。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：用所述OsNCED基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：用所述OsNCED基因构建植物表达载体时添加翻译增强子和/或转录增强子。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在所述植物表达载体中加入选择性标记基因，所述选择性标记基因是可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶的基因、发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或抗化学试剂标记基因。