CN101165194A - 一种黑麦1rs染色体特异的est-sts标记引物2、筛选方法及用途 - Google Patents
一种黑麦1rs染色体特异的est-sts标记引物2、筛选方法及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种黑麦1RS染色体特异的EST－STS标记引物2，其特征在于：该标记引物是根据小麦第一部分同源群的EST序列一BE443401为模板设计而得到的，其序列为：STSWE3F：5’－GCATCTGCCAACACTCTCAA－3’，STSWE3R：5’－ACGGCAGCATGTAGAGACAA－3’。引物STSWE3扩增出的两条大小为1680bp和1750bp的特异片段位于黑麦1RS染色体上。本发明的标记引物不仅拓宽了小麦EST的使用范围，同时为深人研究普通小麦远缘杂种材料提供了新的工具，利用普通PCR技术就可以进行，不需要其他繁琐的程序，可以简单、快速地鉴定黑麦1RS染色体。
Description
技术领域
本发明涉及一种黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2、筛选方法及用途，属于基因分子标记研究领域。
背景技术
小麦是世界上重要的粮食作物之一，在生产中常常受到各种病害的威胁，造成产量或品质的下降。小麦的近缘物种黑麦，具有抗病、高产、耐瘠等许多优良性状。研究表明黑麦1RS染色体上有抗白粉病、抗条锈病、抗叶锈病、抗杆锈病、抗麦二叉蚜等众多抗性基因，还有提高产量和适应性的基因。通过远缘杂交和染色体操作技术，可将黑麦1RS染色体上的这些有益基因导入至普通小麦。
黑麦1RS染色体或染色体片段导入普通小麦后，需要对其进行鉴定，才可有效利用1RS上的外源优异基因。建立在DNA序列基础上的分子标记，特别是以PCR为基础的分子标记，以其准确、快捷、不受植物生长时期限制等优点而被广泛运用。Ko Jong-Min等筛选出了两个黑麦基因组特异的RAPD(Random amplified polymorphicDNA，随机扩增的多态性DNA)标记，并获得了两个克隆pSc10C和pSc20H，原位杂交结果显示它们分布于所有黑麦染色体上(参考文献：Jong-Min Ko，Geum-Sook Do，Duck-Yong Suh，et al.2002.Identification and chromosomal orgnization of two rye genome-specifiRAPD products useful as introgression markers in wheat.Genome，45：157-164)。然而RAPD标记稳定性较差，难以在育种中有效利用。M.Cristina Katto等根据pSc20H克隆设计了可以鉴定黑麦染色体片段的以PCR为基础的标记(参考文献：M.Cristina Katto，Takashi R.Endo，Shuhei Nasuda.2004.A PCR-based marker for targeting for small ryesegments in wheat background.Genes Genet.Syst.，79.p.245-250)。刘成等筛选到黑麦特异的RAPD标记，并将其转化为SCAR标记(参考文献：刘成，李光蓉，杨足君，冯娟，周建平，任正隆.2006.黑麦基因组特异DNA片段的分离与SCAR标记的建立.西北植物学报，26(12)：2434-2438)。然而这些标记对黑麦全基因组均有扩增，不是1R或1RS染色体特异的，从而无法将黑麦的1R染色体与2R～7R染色体区分开。Koebner等根据黑麦与小麦rRNA基因间隔区序列差异，合成了黑麦1R染色体特异引物NOR-R1，可以鉴定1RS染色体，但对不含有1R染色体上核仁组织区的重组材料用引物NOR-R1将无法鉴定(参考文献：Koebner R.M.D.1995.Generation of PCR-based markersfor the detection of rye chromatin in wheat background.Theor ApplGenet，90：740-745)。
EST(expressed sequence tag，表达序列标签)是指从不同组织来源的cDNA文库中随机挑选克隆，并对其3’端或5’端进行单轮测序所获得的短cDNA序列(参考文献：Adams M D，Kelley J M，Gocayne JD，Dubnick M，Polymeropoulos M H.1991.Complementary DNAsequencing：expressed sequence tags and human genome project.Science，252：1651-1656)。由于EST标记直接来源于cDNA，其保守性较高，特别是在亲缘物种之间具有相对的保守性，所以根据EST所开发的STS标记(Site tagged sequence，位点标签序列，即直接在EST序列两端设计引物)在物种之间具有较好的通用性(参考文献：LaRota M，Sorrells M E.2004.Comparative DNA sequence analysis of mappedwheat ESTs reveals the complexity of genome relationships betweenwheat and rice.Funct Integr Genomics，4：34-46)。比较基因组学研究表明普通小麦及其近缘物种之间存在共线性，因此可以利用小麦上已开发的EST序列来研究小麦的亲缘物种。
发明内容
本发明利用黑麦属(Secale)与小麦属(Triticum)同属于小麦亚族(Triticinae)，理论上它们具有较高的共线性关系，定位于小麦第一部分同源群上的EST序列很可能也存在于黑麦1R染色体的相应部位，因此设计以PCR为基础的标记，转化成STS引物，筛选黑麦1RS染色体特异的分子标记，以快速检测和追踪导入普通小麦背景中的黑麦1RS染色体。
本发明的技术方案是通过如下手段实现的：这种黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2，其特征在于：该标记引物是根据小麦第一部分同源群的EST序列-BE443401为模板设计而得到的，其序列为：
STSWE3：F：5’-GCATCTGCCAACACTCTCAA-3’，
R：5’-ACGGCAGCATGTAGAGACAA-3’。
所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2，其特征在于：引物STSWE3扩增出的两条大小为1680bp和1750bp的特异片段位于黑麦1RS染色体上。
所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2的筛选方法，其特征包括如下步骤：
a、引物的设计与合成：根据小麦第一部分同源群的EST序列，选取35个碱基数大于300bp的EST序列进行下载，利用PrimerPremier 5.0软件设计了35对引物，条件为退火温度50-60℃，引物的长度18-22bp，GC％含量为40-60％，预期扩增产物300-600bp；合成的引物用超纯水溶解至20μmol L-1作为母液于-20℃冰箱保存，使用前吸取部分母液用10mM Tris-HCl与1mM EDTA稀释至2μmol/L作为工作液待用；
b、黑麦染色体特异标记引物的筛选：利用步骤a设计合成的35对EST-STS引物，分别对普通小麦中国春；小麦近缘物种帝国黑麦、簇毛麦、大麦和鹅观草的基因组DNA进行多态性扩增分析，结果引物STSWE3(序列为STSWE3F：5’-GCATCTGCCAACACTCTCAA-3’和STSWE3R：5’-ACGGCAGCATGTAGAGACAA-3’)在帝国黑麦中扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，从而筛选出黑麦染色体组特异的EST-STS标记引物；
c、黑麦1R染色体特异标记引物的筛选：利用步骤b中筛选到的多态性EST-STS引物，分别对普通小麦中国春和一整套中国春-帝国黑麦的二体附加系进行扩增分析，结果在帝国黑麦与中国春-帝国黑麦1R二体异附加系中分别扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，确定黑麦1R染色体特异标记引物；
d、黑麦1RS染色体特异标记引物的筛选：利用步骤b中筛选到的多态性EST-STS引物，分别对普通小麦小偃6号、帝国黑麦、普通小麦铭贤169和小麦/黑麦1BL/1RS易位系洛夫林10、洛夫林13进行扩增分析，结果洛夫林10、洛夫林13和帝国黑麦能扩增大小为1680bp和1750bp的特异带，确定黑麦1RS染色体特异标记引物STSWE3。
所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物的筛选方法，步骤b所述扩增分析包括：在体积为0.2mL的Eppendof管中依次加入约10～20ng的模板DNA，1×PCR buffer，1.5mmol L-1MgCl2，200mmol L-1dNTP，左右引物终浓度各为0.2μmol L-1，0.5U Taq DNA聚合酶，最后用无菌蒸馏水补充反应体系至10μL；然后将有上述反应液的Eppendof管放置在PE2700基因扩增仪上进行扩增反应；扩增反应程序为：先94℃预变性3分；再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分20秒，循环32次；72℃延伸10分；最后10℃保存；
扩增反应结束后对PCR扩增产物进行电泳检测，结果引物STSWE3在帝国黑麦中扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，而无黑麦基因组的中国春、大麦、簇毛麦和鹅观草没有扩增出这两条带，确定STSWE3就是黑麦染色体组特异的标记。
所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2的筛选方法，所述PCR扩增产物进行电泳检测步骤为：在PCR扩增产物中加入指示剂2μL，混匀，取其中3μL用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150～180V，电泳1.5h后，用银染法进行染色，最后将染色后的胶在凝胶成像仪上观测照相。
所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2的用途，其特征在于：使用标记引物扩增分析1RS易位材料，能够同时扩增出两条大小为1680bp和1750bp特异带的材料，即可确定含有黑麦1RS染色体。
本发明与已有技术相比较的优点是：
1、本发明的黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物不仅拓宽了小麦EST的使用范围，同时为深入研究普通小麦远缘杂种材料提供了新的工具。
2、本发明的黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物利用普通PCR技术就可以进行，不需要其他繁琐的程序，可以简单、快速地鉴定黑麦1RS染色体。
3、本发明的黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物与模板的结合能力较强，虽然本研究所使用的退火温度为55℃，但退火温度在51-58℃均能较好地扩增出目标片段，实验条件要求比较宽松。
4、本发明的黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物序列位于小麦1BS染色体中部区域，根据比较基因组学的原理，该标记也应该位于1RS染色体中部区域，因此可以结合其它1RS染色体的特异标记鉴定涉及1RS不同断点的材料。
附图说明
图1：BE443401的序列以及本发明STSWE3的正向引物和反向引物的反向互补序列在EST序列上的位置。
图2：用本发明设计合成的35对EST-STS引物分别对普通小麦中国春；小麦近缘物种帝国黑麦、簇毛麦、大麦和鹅观草的基因组DNA进行多态性扩增分析，结果只有引物STSWE3在帝国黑麦中扩增出大小为1680bp和1750bp的带，而中国春、大麦、簇毛麦和鹅观草没有扩增出这两条带，说明STSWE3是黑麦染色体组特异的标记。
图3：用普通小麦中国春、帝国黑麦及一整套中国春-帝国黑麦1R～7R二体异附加系共9个材料的DNA为模板，用本发明的引物STSWE3进行PCR扩增，结果显示只有附加1R染色体的材料能扩增出与帝国黑麦一样的大小为1680bp和1750bp的特异带，而对照中国春和2R～7R异附加系没有扩增出这两条特异带，说明这两条带位于黑麦1R染色体上。
图4：用普通小麦小偃6号、帝国黑麦、普通小麦铭贤169、小麦/黑麦1BL/1RS易位系洛夫林10和洛夫林13共5个材料的DNA为模板，用本发明的引物STSWE3进行PCR扩增，结果显示只有洛夫林10和洛夫林13能扩增出与帝国黑麦一样的大小为1680bp和1750bp的特异带，说明这两条带位于黑麦1RS染色体上。
图5：用普通小麦小偃6号与“德国白粒”黑麦杂交后代选育的11个材料的DNA为模板，用本发明的引物STSWE3进行PCR扩增，其中4个含有1RS染色体的后代材料均扩增出1680bp和1750bp的特异带，7个不含有黑麦1RS染色体的材料没有扩增出相应的特异带。图示1～11为小偃6号与“德国白粒”黑麦杂交后代材料，M为分子量标记DL2000。
具体实施方式
实施例1、引物的设计与筛选
1、EST序列的获得：根据美国农业部网站(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)发布的小麦表达序列标签(EST)数据库，查找定位于小麦第一部分同源群不同物理区段的EST及其序列，选取35个保守性比较强的且碱基数大于300bp的EST序列进行下载。附图1是其中一个EST-BE443401的碱基序列。
2、引物的设计与合成：将步骤1中下载的EST序列，利用PrimerPremier 5.0软件对其进行引物的设计，共设计了35对引物。引物设计的条件为退火温度50-60℃，引物的长度18-22bp，GC％含量(鸟嘌Guanine和胞嘧啶Cytosine占碱基总数的比例)为40-60％，预期扩增产物300-600bp。设计的引物由上海联合基因有限公司合成。
3、引物的稀释：将步骤2中合成的引物，用超纯水溶解至20μmolL-1作为母液于-20℃冰箱保存，使用前吸取部分母液用1×TE(10mMTris-HCl与1mM EDTA PH＝8.0)稀释至2μmol L-1作为工作液待用。
4、黑麦特异标记的筛选：如果某个引物在黑麦中扩增出与其他供试材料有差异的带，那么这个引物就是筛选出的黑麦染色体组的特异的引物。
利用步骤3中稀释好的35对EST-STS引物，分别对普通小麦中国春；小麦近缘物种帝国黑麦、簇毛麦、大麦和鹅观草的基因组DNA进行多态性扩增分析，具体扩增如下：在体积为0.2mL的Eppendof管中依次加入约10～20ng的模板DNA，1×PCR buffer，1.5mmol L-1MgCl2，200mmol L-1 dNTP，左右引物终浓度各为0.2μmol L-1，0.5U TaqDNA聚合酶，最后用无菌蒸馏水补充反应体系至10μL。然后将有上述反应液的Eppendof管放置在PE2700基因扩增仪上进行扩增反应。扩增反应程序为：先94℃预变性3分；再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分20秒，循环32次；72℃延伸10分；最后10℃保存。
PCR扩增产物检测方法为：在PCR扩增产物中加入指示剂(0.25％溴酚蓝、0.25％甲基绿、40％蔗糖，水余量)2μL，混匀，取其中3μL用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(聚丙烯酰胺∶N，N′-甲叉双丙烯酰胺＝39∶1)电泳检测，电泳电压为150～180V，电泳1.5h左右后，用银染法进行染色，最后将染色后的胶在凝胶成像仪上观测照相。结果引物 STSWE3(序列为：STSWE3F：5’-GCATCTGCCAACACTCTCAA-3’和STSWE3R：5’-ACGGCAGCATGTAGAGACAA-3’)在帝国黑麦中扩增出大小为1680bp和1750bp的带，而中国春、大麦、簇毛麦和鹅观草没有扩增出这两条带，如图2所示，说明STSWE3就是黑麦染色体组特异的标记引物。
5、黑麦1RS染色体特异标记的筛选
利用步骤4筛选到的多态性EST-STS引物STSWE3，对中国春和一整套中国春-帝国黑麦的二体异附加系(公知公用，参考文献：Driscoll C J，Sears E R，1971.Individual additions of the chromosomesof“Imperial”rye to wheat.Agron Abstr，1971：6)进行PCR扩增反应，反应条件与扩增程序同步骤4。PCR扩增反应后对扩增产物进行电泳检测，检测方法同步骤4，检测后确定引物STSWE3在帝国黑麦及中国春-帝国黑麦1R二体异附加系中分别扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，而对照中国春与中国春-帝国黑麦2R～7R二体异附加系均没有扩增出这两条相应的特异带，如图3所示，说明这个标记为黑麦1R染色体特异标记。
然后利用引物STSWE3扩增普通小麦小偃6号、帝国黑麦、普通小麦铭贤169、小麦/黑麦1BL/1RS易位系洛夫林10和洛夫林13，反应条件与扩增程序同步骤4。PCR扩增反应后对扩增产物用进行电泳检测，检测方法同步骤4，结果显示只有1BL/1RS易位系洛夫林10、1BL/1RS易位系洛夫林13和帝国黑麦能扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，如图4所示，说明这两个扩增位点位于黑麦1RS染色体上，引物STSWE3为黑麦1RS染色体的特异标记。因其扩增出两条特异带，故命名为黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2。
实施例2、本发明的标记引物在1RS易位材料中的检测应用
利用实施例1中筛选到的黑麦1RS染色体特异的标记引物STSWE3，扩增小偃6号和“德国白粒”黑麦(S.cereale L.cv german white)杂交的部分后代材料，反应条件与扩增程序同步骤4，扩增反应后对扩增产物进行检测，检测方法同步骤4，结果在供试的11个材料中，4个材料扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，即可确定含有黑麦1RS染色体。其它7个材料没有扩增出这两条相应的特异带，即可确定其不含有黑麦1RS染色体，如图5所示。此结果与基因组原位杂交鉴定结果一致。
本发明列举的实施旨在更进一步地阐明这种黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物、筛选方法及用途。而不对本发明的范围构成任何限制。
Claims (6)
1.一种黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2，其特征在于：该标记引物是根据小麦第一部分同源群的EST序列-BE443401为模板设计而得到的，其序列为：
STSWE3：F：5’-GCATCTGCCAACACTCTCAA-3’，
R：5’-ACGGCAGCATGTAGAGACAA-3’。
2.根据权利要求1所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物，其特征在于：引物STSWE3扩增出两条的大小为1680bp和1750bp的特异片段位于黑麦1RS染色体上。
3.根据权利要求1所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2的筛选方法，其特征包括如下步骤：
a、引物的设计与合成：根据小麦第一部分同源群的EST序列，选取35个碱基数大于300bp的EST序列进行下载，利用PrimerPremier 5.0软件设计了35对引物，条件为退火温度50-60℃，引物的长度18-22bp，GC％含量为40-60％，预期扩增产物300-600bp；合成的引物用超纯水溶解至20μmol L-1作为母液于-20℃冰箱中保存，使用前吸取部分母液用10mM Tris-HCl与1mM EDTA稀释到2μmol/L作为工作液待用；
b、黑麦染色体特异标记引物的筛选：利用步骤a设计合成的35对EST-STS引物，分别对普通小麦中国春；小麦近缘物种帝国黑麦、簇毛麦、大麦和鹅观草的基因组DNA进行多态性扩增分析，结果引物STSWE3(序列为：STSWE3F：5’-GCATCTGCCAACACTCTCAA-3’和STSWE3R：5’-ACGGCAGCATGTAGAGACAA-3’)在帝国黑麦中扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，从而筛选出黑麦染色体组特异的EST-STS标记引物；
c、黑麦1R染色体特异标记引物的筛选：利用步骤b中筛选到的多态性EST-STS引物，分别对中国春和一整套中国春-帝国黑麦的二体附加系进行扩增分析，结果在帝国黑麦及中国春-帝国黑麦1R二体异附加系中分别扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，确定黑麦1R染色体特异标记引物；
d、黑麦1RS染色体特异标记引物的筛选：利用步骤b中筛选到的多态性EST-STS引物，分别对普通小麦小偃6号、帝国黑麦、普通小麦铭贤169和小麦/黑麦1BL/1RS易位系洛夫林10、洛夫林13进行扩增分析，结果洛夫林10、洛夫林13和帝国黑麦能扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，确定黑麦1RS染色体特异标记引物STSWE3。
4.根据权利要求1所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2的筛选方法，其特征在于：步骤b所述扩增分析包括：在体积为0.2mL的Eppendof管中依次加入约10～20ng的模板DNA，1×PCR buffer，1.5mmol L-1 MgCl2，200mmol L-1 dNTP，左右引物终浓度各为0.2μmolL-1，0.5U Taq DNA聚合酶，最后用无菌蒸馏水补充反应体系至10μL；然后将有上述反应液的Eppendof管放置在PE2700基因扩增仪上进行扩增反应；扩增反应程序为：先94℃预变性3分；再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分20秒，循环32次；72℃延伸10分；最后10℃保存；
扩增反应结束后对PCR扩增产物进行电泳检测，结果引物STSWE3在帝国黑麦中扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，而无黑麦基因组的中国春、大麦、簇毛麦和鹅观草没有扩增出这两条带，确定STSWE3就是黑麦染色体组特异的标记。
5.根据权利要求4所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2的筛选方法，其特征在于：所述PCR扩增产物进行电泳检测步骤为：在PCR扩增产物中加入指示剂2μL，混匀，取其中3μL用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150～180V，电泳1.5h后，用银染法进行染色，最后将染色后的胶于凝胶成像仪上观测照相。
6.根据权利要求1所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2的用途，其特征在于：使用标记引物扩增分析1RS易位材料，能够同时扩增出两条大小为1680bp和1750bp特异带的材料，即可确定含有黑麦1RS染色体。
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