CN101153279A

CN101153279A - 重组人甲状旁腺素(1～84肽)的生产方法

Info

Publication number: CN101153279A
Application number: CNA2006101167680A
Authority: CN
Inventors: 黄阳滨; 孙九如; 张翊; 任军; 张继岗; 梁光军; 邱燕
Original assignee: Shanghai Newsummit Biopharma Co Ltd
Current assignee: Shanghai Newsummit Biopharma Co Ltd
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2006-09-29
Publication date: 2008-04-02

Abstract

本发明提供了一种重组人甲状旁腺素(1～84肽)的核甘酸序列，高效生产重组人甲状旁腺素(1～84肽)的生产方法，以及有关的工程细胞构建、表达和纯化的工艺。优化后的重组人甲状旁腺素蛋白基因，非常适合在原核细胞表达，同时通过发酵与纯化工艺优化，提高了表达量，具有高表达、高稳定的优点。本发明可高效、简便、低成本地获得重组人甲状旁腺素纯品。

Description

重组人甲状旁腺素(1～84肽)的生产方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组人甲状旁腺素(1～84肽)的方法，包括有关的基因的优化、工程菌的构建、重组人甲状旁腺素(1～84肽)的表达和纯化工艺。

背景技术

PTH的基本生理作用是刺激破骨细胞骨吸收，使钙、磷从骨骼中释放，促进肾小管对钙重吸收、抑制磷回吸收，增加25-(OH)D3在肾脏转化为1，25-(OH)2D3，促进肠道对钙、磷的重吸收。研究表明，PTH能直接增加破骨细胞数目，增加破骨细胞皱折缘，提高破骨细胞活性，促进骨吸收。然而PTH并非直接作用于破骨细胞，它通过作用于成骨细胞，刺激其释放破骨细胞刺激因子，促进骨吸收，还促进成骨细胞产生蛋白酶及氧自由基产生，改变骨骼微环境，活化破骨细胞。低浓度PTH能够刺激大鼠成骨细胞增殖、促进骨合成代谢。PTH诱导骨形成的作用与胰岛素样生长因子-I、-II(IGF-I、-II)和β转化生长因子(TGF-β)有关。PTH还能短暂而迅速地促进c-fos等早期反应基因表达，c-fos基因对于PTH调节成骨细胞功能与分化具有重要作用。

甲状旁腺素是由甲状旁腺主细胞合成和分泌的一种单链多肽激素，成熟PTH含84个氨基酸残基，分子量约为9500，分子中不含半胱氨酸和酪氨酸，是维持血钙恒定的主要激素。人血浆中PTH有三种存在形式，除了完整的激素外，还包括分子量约7000和4500两种降解产物。

目前hPTH(1～84)、(1～38)及(1～34)片段已被应用于临床研究，PTH(1～84)及PTH(1～34)已进入III期临床药理研究阶段，有望最早上市。目前已有的PTH制剂价格昂贵，需注射给药，限制了其长期应用，开发经济、方便的PTH制剂十分必要。

生物工程技术的兴起及发展使得生物大分子的体外表达成为可能。PTH基因序列的阐明也为建立体外高效表达体系的研究奠定了基础。Born等(1987)将preproPTH基因导人到大肠杆菌中进行了表达，发现prepro序列不能提高PTH的分泌表达，可能是由于原核生物对真核生物的prepro序列不能识别。随后，Born等将目光转向酵母，然而天然蛋白质在酵母细胞中表达很不稳定，另外一个问题是酵母细胞不易破碎。因此，preproPTH基因在酵母中表达产量较大肠杆菌体系没有明显的提高。Rabbani等(1988)将人工合成的PTH基因在大肠杆菌中表达，产物不均一，包括了PTH(8-84)，PTH(3-84)，fMet-PTH和完整PTH。为了提高目标产物的稳定性，人们想到用融合蛋白形式。Hogset等(1990)采用金黄色葡萄球菌蛋白A的启动子和信号肽序列在大肠杆菌中表达PTH，产物分泌到培养基中，分离纯化方法简单迅速。酵母6因子表达系统也是比较理想的融合蛋白表达体系，即用外源基因代替α因子的编码序列，外源蛋白会与α因子引导肽形成融合蛋白。在一系列与膜相关的蛋白运输和分泌过程中，融合蛋白在KEX2基因产物类胰蛋白酶和STE13基因产物二肽氨肽酶作用下生成具有正确高级结构的外源蛋白。这些外源蛋白或直接分泌到培养基中或在细胞周质空间积累。采用α因子表达系统在啤酒酵母中表达PTH，也出现产物不均一现象，除了完整PTH，还有两个不同的糖基化形式。Sung等(1991)改造了PTH基因的核苷酸组成，利用简并密码使PTH(1～5)区域富含腺嘌呤，使表达产量有很大提高。Paulsen等(1995)用生物反应器培养细菌，以β-半乳糖苷酶-hPTH融合蛋白方式表达产生hPTH，并建立了大规模纯化方法，这使hPTH大规模生产方面取得较大的进展。

尽管人们采用不同的表达体系以提高PTH的表达量，但由于其分子内无二硫键，本身不稳定，以及mRNA的不稳定，PTH的表达量都比较低。因此，迫切需要开发新的高效生产重组hPTH的方法，本发明采用了大肠杆菌表达系统表达hPTH，通过对hPTH基因的优化，并考虑到PTH基因较小，构建含有优化的hPTH基因的融合表达载体，并获得了高水平的表达菌株；通过控制发酵条件，达到了较高融合蛋白表达率；在此基础上对可溶表达的rhPTH的纯化进行了大量的摸索和研究后，得到了高纯度、高得率、可供动物实验的rhPTH蛋白。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的生产重组人甲状旁腺素(1～84肽)的方法。

本发明的另一目的就是提供优化的重组人甲状旁腺素(1～84肽)的编码序列和用于该方法的表达载体及工程菌株。

在本发明的第一方面，就是提供了一种优化的编码重组人甲状旁腺素(1～84肽)的氨基酸序列，其特征在于，所述的重组人甲状旁腺素(1～84肽)序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；较佳地，编码所述的重组人甲状旁腺素(1～84肽)的DNA序列为SEQ IDNO：1所示核苷酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，含有权利要求1所述的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的表达载体是pThioHisA，该载体提供了一个融合蛋白-硫氧还蛋白(HP-Thioredoxin)。

在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的表达载体。

在另一优选例中，所述的工程细胞是大肠杆菌BL21(DE3)，是多个蛋白酶的基因缺陷菌株，基因型为hsdSgal(λcIts857 ind1Sam7nim5lacUV5-T7基因)，非常适合外源基因的高效表达。

在本发明的第四方面，提供了一种生产重组人甲状旁腺素(1～84肽)的方法，该方法包括步骤：

a)在适合的表达条件下，培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出人甲状旁腺素(1～84肽)蛋白；较佳地，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞BL21(DE3)。

b)分离纯化出表达的人甲状旁腺素(1～84肽)融合蛋白。

在本发明的第五方面，融合蛋白经EK酶切后，经进一步纯化获得目的蛋白人甲状旁腺素(1～84肽)。

在本发明的另一优选例中，所述的步骤(a)的培养条件包括：

培养分为培养阶段和诱导阶段，培养阶段培养菌液浓度达到OD600为5.0左右，诱导时间为3～4hr，发酵及诱导温度保持在37℃，微量元素的量为0.1-2ml/L，诱导期的pH值为7.0，诱导期IPTG浓度在0.1-1mg/L。

在本发明的另一优选例中，诱导过程还可以添加酪蛋白水解物(CA)、蛋白胨(peptone)、奶粉、精氨酸等作为保护剂。

在本发明的另一优选例中，所述的步骤(b)包括步骤：

v)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除上清，获得发酵后菌体；

vi)对发酵沉淀进行压榨破菌、收集压榨上清；

vii)层析纯化，所述的层析选自：阴离子交换层析、金属螯和亲和层析、阳离子交换层析及其组合。

viii)采用肠激酶EK酶切后，经进一步纯化获得目的蛋白。

在本发明的另一优选例中，压榨上清经Q-Sepharose F.F.层析、Ni螯和亲和层析、SP-Sepharose F.F.层析、EK酶切、再经SP-Sepharose F.F.层析进一步纯化以后得到纯度大于98％、得率在20％以上的纯品。

附图说明

图1.hPTH(1～84肽)理论序列与hPTH(1～84肽)优化序列的同源性比较。Query：天然hPTH(1～84肽)基因序列；Sbjct：优化的hPTH(1～84肽)基因序列。

图2.pThioHisA/84aaPTH表达质粒的构建路线图。

图3.PTH(1～84aa)表达情况及表达定位研究。1.诱导前；2.诱导4h；3.诱导5h；4.超声上清；5.超声沉淀

具体实施方式

本发明人通过深入而广泛的研究，通过优化设计人甲状旁腺素(1～84肽)基因编码序列，并考虑到目的基因编码后的目的蛋白分子量较小，将优化后的人甲状旁腺素(1～84肽)编码序列构建入合适表达载体，转化宿主细胞，获得高表达菌株，并通过优化发酵、纯化工艺，实现了人甲状旁腺素(1～84肽)融合蛋白高效表达，并且表达出的人甲状旁腺素(1～84肽)保持生物学活性。在此基础上完成了本发明。

本发明根据人甲状旁腺素(1～84肽)天然氨基酸序列，按密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的条件下，优化其核苷酸序列，全基因合成经优化的重组人甲状旁腺素(1～84肽)蛋白的目的基因序列，将该基因克隆到pThiHisA中测序验证后，用分子克隆的常规方法，构建表达载体，转入大肠杆菌，通过施加抗生素筛选出表达工程细胞。试管筛选获得高表达工程细胞。摇瓶试验表明，诱导4小时后，目的蛋白占总蛋白30％以上，表达水平150mg/L以上。

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程。在本发明中，工程菌表达重组人甲状旁腺素(1～84肽)的发酵条件没有特别限制。可以采用本领域常规的发酵条件。例如，合适的培养基包括(但不限于)以下组成：

(i)氮源含有机氮源和无机氮源，其中有机氮源如蛋白胨、酵母提取粉，或二者的混合物，总浓度0.5-1％；无机氮源如氨水或(NH4)₂SO₄等铵盐，浓度为0.35-25％。

(ii)无机盐包括磷酸盐、Ca²⁺盐、Mg²⁺盐等。较佳地，磷酸盐缓冲体系浓度20-200mM，pH5-8；Mg²⁺盐0-5mM。

(iii)在培养基中添加维生素B1作为补充维生素，浓度1～1000PPM。

(iv)根据M9培养基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。

(v)碳源为葡萄糖，是单一碳源。较佳地，葡萄糖浓度为1.0％，补料中葡萄糖浓度为11.25％。

为大规模获得重组人甲状旁腺素(1～84肽)，需要在发酵罐中进行表达培养。本发明研究了中试发酵工艺，优化后的表达水平达到500mg/L。

在发酵表达后，对表达的重组人甲状旁腺素(1～84肽)蛋白进行分离。通常，发酵样品先离心获得发酵液后沉淀即菌体。然后压榨破菌经离心获得压榨上清，后经Q-Sepharose F.F.层析、Ni²⁺螯和亲和层析、SP-sepharose F.F.层析、EK酶切、再经SP-Sepharose F.F.层析进一步纯化等。

经不同层析过程比较，优化的纯化方法包括：

1.对发酵样品进行离心获得发酵后沉淀；

2.通过压榨获得压榨上清后经Q Sepharose F.F.层析、Ni²⁺螯和亲和层析、SP-sepharose F.F.层析、EK酶切、再经SP-Sepharose F.F.层析进一步纯化，纯品纯度98％以上，得率约120mg/L发酵液。

纯品的活性按细胞病变抑制法进行测定，结晶紫染色，用酶标仪测定OD₅₇₀值，最后以国际标淮品校正活性单位。生物活性检测目的蛋白比活性达2.5×10⁶U/mg。

纯化后重组人甲状旁腺素(1～84肽)可用常规技术制成各种剂型。

在本发明的一个实例中，构建了生产重组人人甲状旁腺素(1～84肽)的大肠杆菌表达工程细胞，IPTG诱导，高水平可溶表达。

在本发明的另一个实例中，经过发酵工艺的优化，进一步提高了重组人甲状旁腺素(1～84肽)的表达量。

在本发明的另一个实例中，由于蛋白可溶表达，菌体经压榨、离心获得压榨上清，再经一系列纯化步骤后可得到纯品120mg/L。

纯化后原液加入适当辅料，制成重组人甲状旁腺素(1～84肽)的注射用粉针剂。初步稳定性试验表明，该粉针剂稳定。

中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升发酵液可获得重组人甲状旁腺素(1～84肽)纯品120mg，适合产业化生产。

本发明的优点在于：

(1)选用的是大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，通过施加抗生素筛选出多拷贝转化细胞，进而筛选出高表达工程细胞。

(2)优化后的重组人甲状旁腺素(1～84肽)蛋白基因非常适合在大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中表达，具有高表达、高稳定的特点，而且以可溶形式表达。

(3)通过控制关键的发酵工艺条件，使表达水平达到500mg/L。

(4)由于蛋白是以可溶形式表达，确定了较佳的工艺路线，使可溶的目的蛋白能够折叠成结构正确的天然形式，经纯化能得到高纯度的IL-4蛋白，每升发酵罐培养液可获得120毫克以上、纯度大于98％重组人甲状旁腺素(1～84肽)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1表达质粒的构建和高表达工程菌株的获得

根据人甲状旁腺素(1～84肽)天然氨基酸序列，按密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的条件下，PCR方法合成重组人甲状旁腺素(1～84肽)蛋白的目的基因序列(SEQ’IDNO：1)，该优化的IL-4基因序列与天然的IL-4基因序列同源性为82％(见图1)。将该基因克隆到pThiHisA中并测序验证。

表达载体构建方法见图2。通过PCR扩增得到目的人甲状旁腺素(1～84肽)基因，用BamHI和EcoRI双酶切分别处理基因PTH(1～84肽)的PCR回收产物和质粒pThiHisA，酶切后回收相应的片段用T4DNA连接酶在16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上挑选抗性阳性的克隆，抽提质粒DNA，并进行质粒酶切鉴定。得到在pThiHisA中插入了IL-4基因的重组质粒pThiHisA/84aaPTH。

将构建好的表达质粒pThiHisA/PTH转化进入已制备好的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板，然后在转化平板上挑取单克隆，用碱裂解法抽提并检测质粒。将确证含有表达质粒pThiHisA/PTH的单克隆在含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上保存。

实施例2重组人甲状旁腺素(1～84肽)的表达及表达形式的确定

挑选一株确证好的表达工程菌BL21(DE3)/pThiHisA/PTH，用LB培养基进行培养及用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳检测是否有目的条带的出现，并分析其表达量。取一部分发酵后的菌液离心，重悬于pH 7.4，20mM PB，+2.5mM EDTA缓冲液，在冰浴下超声破菌，离心收集超声上清和超声沉淀，SDS-PAGE电泳检测，确定其表达形式。分析其超声上清和超声沉淀，目的蛋白绝大部分在沉淀中，表明目的蛋白是以可溶形式表达(见图3)。

实施例3重组人甲状旁腺素(1～84肽)的规模化发酵

取鉴定为阳性克隆的表达工程菌BL21(DE3)/pThiHisA/PTH，在含有50μg/mL氨苄青霉素LB培养14～16小时；再按3％接种量接种于LB中长至OD₆₀₀为1～3，作为二级种子液。配制改良M9发酵培养基2.96L(Glucose 1％，Yeast extract 0.5％，K₂HPO₄ 0.5％，KH₂PO₄ 0.35％，(NH₄)₂HPO₄ 0.35％，MgSO₄ 0.025％，CaCL₂ 0.1％)，倒入清洁过的发酵罐内，连罐高压灭菌后，冷却至30～40℃，将培养好的二级种子液按1.5％接种量接入发酵罐，37℃培养，并根据溶氧值不断调整通气流量和搅拌转速，控制溶氧40％以上。每小时取样测OD₆₀₀值。培养至OD₆₀₀达到5.0左右开始诱导，在发酵罐中加入IPTG至终浓度1mM进行诱导，诱导3.5小时收罐，发酵液于4200rpm，20分钟离心，收集沉淀称重。表达产物占菌体总蛋白的35％。见图4。

实施例4重组人甲状旁腺素(1～84肽)纯化

将发酵后的菌体按1∶10的比例重悬于pH 7.4，20mM PB，+2.5mM EDTA破菌缓冲液，在冰浴下压榨破菌，离心取上清，将破菌后上清过Q-Seharose fast flow离子交换层析柱，用O-1M NaCl缓冲液梯度洗脱，分管收集洗脱蛋白峰；将含有目的蛋白的洗脱液混合后过Ni2+螯合亲和层析，用含0.1-0.3M咪唑缓冲液进行洗脱，收集的洗脱峰再过SP-Sepharose fast flow离子交换层析柱。收集的融合蛋白溶液EK酶切、再经SP-Sepharose F.F.层析进一步纯化。经15％SDS-PAGE电泳检测纯化过程目的蛋白的纯度及含量(见图5)。

经过以上纯化工艺，最后可得蛋白纯品120mg/L。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本中请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海新生源生物医药研究有限公司

<120>重组人甲状旁腺素(1～84肽)的生产方法

<160>2

<210>1

<211>282

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<222>(1)..(282)

<223>优化的重组人甲状旁腺素(1～84肽)基因

<400>1

GGA TCC GAT GAC GAT GAC AAG TCT GTT AGT GAA ATC CAG CTG ATG CAC AAT CTG GGT AAA CAC CTG

AAC TCC ATG GAA AGG GTT GAA TGG CTG CGT AAG AAA CTG CAG GAC GTT CAC AAC TTC GTT GCT CTG

GGT GCT CCG.CTG GCT CCG AGG GAC GCT GGT TCC CAG AGG CCG CGT AAG AAG GAA GAC AAC GTT TTG

GTT GAA AGC CAC GAG AAG AGC CTG GGT GAA GCT GAC AAA GCT GAC GTT AAC GTT TTG ACC AAA GCT

AAA TCC CAG TAA GAA TTC

<210>2

<211>84

<212>PRT

<213>智人

<400>2

SVSEIQLMH NLGKHLNSME RVEWLRKKLQ DVHNFVALGA PLAPRDAGSQ RPRKKEDNVL VESHEKSLGE ADKADVNVLT

KAKSQ

Claims

1.一种编码重组人甲状旁腺素(1～84肽)的氨基酸序列，其特征在于，其编码序列如SEQID NO：2所示的氨基酸序列，较佳地，编码该氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的编码该重组人甲状旁腺素(1～84肽)氨基酸序列的DNA序列。较佳地，所述的表达载体是pThiHisA/PTH。

3.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求2所述的表达载体或权利要求1所述的编码该重组人甲状旁腺素(1～84肽)的DNA序列。

4.一种生产重组人甲状旁腺素(1～84肽)的方法，其特征在于，它包括步骤：

a)在适合的表达条件下，培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出重组人甲状旁腺素(1～84肽)蛋白；

b)分离纯化出表达的人甲状旁腺素(1～84肽)蛋白。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的宿主细胞是大肠杆菌。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中进行高密度悬浮培养。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)包括步骤：

i)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除上清，获得发酵后菌体；

ii)对发酵沉淀进行压榨破菌、收集压榨上清；

iii)层析纯化，所述的层析选自：阴离子交换层析、金属螯和亲和层析、阳离子交换层析及其组合。

iv)采用肠激酶EK酶切后，经进一步纯化获得目的蛋白。对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除上清，获得发酵后菌体。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的培养条件是：培养温度为30-40℃，更佳地34-38℃；磷酸盐缓冲体系浓度20-200mM，pH5-8；Mg²⁺盐0-5mM；碳源为葡萄糖，是单一碳源，较佳地，葡萄糖浓度为1.0％，补料中葡萄糖浓度为11.25％；添加维生素B1作为补充维生素，浓度1～1000PPM；微量元素可加0.1-2ml/L培液；诱导剂为IPTG浓度在0.1-1mg/L之间，诱导前OD600在0.5～20之间，更佳地在1～10之间；诱导时间0.5～10小时，更佳地为1～5小时。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的纯化条件是：先离心获得发酵液后沉淀即菌体。然后压榨破菌经离心获得压榨上清，后经Q-Sepharose F.F.层析、Ni²⁺螯和亲和层析、SP-sepharose F.F.层析、EK酶切、再经SP-Sepharose F.F.层析进一步纯化，获得纯度98％以上的纯品。