CN101142485A - 抗体-替代抗原系统用于检测分析物的用途 - Google Patents

抗体-替代抗原系统用于检测分析物的用途 Download PDF

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Abstract

用于标记蛋白质的组合物、方法和试剂盒及其在报告系统中检测、定量和/或表征分析物的用途。

Description

抗体-替代抗原系统用于检测分析物的用途
1.相关申请的交叉引用
本申请要求享有2005年3月15日提交的序列号为60/662,412的申请在35U.S.C.§119(e)下的权益，通过引用将其内容并入本文。
2.背景技术
在生物学和工业生产过程中，使用报告系统的测定是用于研究和检测分析物的重要工具。尽管已经开发了用于测定分析物的大量方法，但是仍然需要寻求新的、可以专门并方便地用于检测和表征广泛多样分析物的测定设计。基于蛋白质的报告系统的开发已经显著提高了生物分析物的检测技术。虽然取得了这些提高，但蛋白质的非特异性标记依然是限制该类测定的应用和灵敏度的问题。
3.发明内容
一方面，本文提供用于特异性标记感兴趣的蛋白质的标记分子。在感兴趣的分析物的结合位点附近对蛋白质进行标记。所述标记分子通常包括反应性部分、标记部分、靶部分和可裂解的链(cleavable tether)。对反应性部分进行选择，使其能够将标记部分连接于蛋白质。在一些实施方案中，反应性部分包括可与蛋白质上的官能团形成共价键的交联基团，所述蛋白质位于感兴趣的分析物结合位点附近。在一些实施方案中，反应性部分包括光反应性基团，该光反应性基团一经外部能源激活即能够与蛋白质上的官能团形成共价键。
标记部分可以是任何依据此处描述的各种组合物和方法进行运作的荧光实体。在一些实施方案中，荧光部分包括至少一种荧光染料。在一些实施方案中，荧光部分包括至少一种若丹明染料。在一些实施方案中，荧光部分包括两种或多种荧光染料，这些荧光染料相互之间通过例如荧光共振能量转移(“FRET”)而协同地起作用。
在一些实施方案中，标记部分可以是猝灭部分。猝灭部分可以是任何当紧邻信号分子的荧光部分时能够猝灭该信号分子荧光部分的荧光的部分，比如，以上猝灭通过下述所举例的方式进行：轨道重叠(形成基态的无荧光复合物)、碰撞猝灭、FRET或另外的机理或多种机理的组合。该猝灭部分自身可以具有荧光或者其可以无荧光。在一些实施方案中，所述猝灭部分包括荧光染料，该荧光染料与信号分子荧光部分有结构关联以使其在紧邻信号分子荧光部分时猝灭该荧光部分的荧光。在此类实施方案中，选择在可区别于荧光部分的波长处发射荧光的猝灭部分可以提供能够用来校正荧光信号的内部信号基准。
靶部分能够使标记分子结合至待标记的蛋白质。所述靶部分可以包括能够结合至待标记蛋白质上特定位置的任何有机或无机分子。可以包括所述靶部分的分子的非限制性实例包括抗原、分析物、酶底物、蛋白质、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、病毒、代谢物、过渡态类似物、辅因子、核苷酸、多核苷酸、抑制剂、药物、营养素、电解质、生长因子和其他能够结合至待标记的蛋白质的生物分子及非生物分子。
可裂解的链将靶部分与标记部分相连。所述可裂解的链包括至少一个可裂解的部分和一个或多个任选的连接体部分。所述可裂解的部分包括至少一个可以裂解的官能团以使该靶部分从蛋白质脱离。可以选择具有特定性质的任选的连接体部分。例如，根据应用，连接体部分可以为疏水或亲水性质、长的或短的、刚性、半刚性或柔韧的。在一些实施方案中，选择连接体部分来增加标记分子的溶解度。在其他实施方案中，选择连接体部分来提供具有特定长度的可裂解的链。
所述蛋白质可以是任何能够在紧邻分析物结合位点处被特异性标记且在其他位置基本上不被标记的蛋白质。适宜的蛋白质的实例包括但不限于抗体、酶、信号转导蛋白质和受体。
可以通过使蛋白质与标记分子接触而制备标记蛋白质，所述标记分子包括靶部分、标记部分、反应性部分和可裂解的链。靶部分、标记部分和反应性部分相互连接以使靶部分可以与蛋白质结合，并且反应性部分可以连接标记分子与蛋白质。加入能够激活反应性部分的物质以便在反应性部分和蛋白质之间形成共价键。可以通过诱导可裂解的链发生裂解而除去靶部分。可以在测定中使用所得的标记蛋白质来检测感兴趣的分析物。
另一方面，本文提供了可用于检测感兴趣的分析物(即，靶分析物)是否存在的的分析物报告系统。该分析物报告系统包括标记蛋白质和标记替代分析物。标记蛋白质可以与标记的替代分析物接触以形成替代分析物-标记蛋白质的复合物。在一些实施方案中，所述蛋白质包括荧光部分，以使当所述替代分析物一经被替代为靶分析物后可以检测到荧光部分的荧光增强。
在一些实施方案中，当替代分析物与蛋白质结合时，标记蛋白质的荧光被猝灭。这种猝灭可以通过多种不同的机理实现。在一些实施方案中，所述蛋白质和替代分析物包括当彼此紧邻时能够“自猝灭”的荧光部分。在其他实施方案中，可以在猝灭部分的帮助下实现猝灭。
在一些实施方案中，替代分析物和标记蛋白质可以包封于毫微囊、脂质体、微粒、脂肪微滴、小囊泡等等。在一些实施方案中，选择包含用以包封替代分析物和标记蛋白质的颗粒的膜的孔隙率来保留替代分析物-标记蛋白质复合物，并且同时允许靶分析物通过。因此，颗粒膜的孔隙率使其允许直径小于或等于0.5nm至5.0nm的成分通过。在一些实施方案中，颗粒的孔径小于或等于5.0nm。在一些实施方案中，颗粒的孔径小于或等于2.0nm。在一些实施方案中，颗粒的孔径小于或等于1.5nm。在一些实施方案中，颗粒的孔径小于或等于1.0nm。在一些实施方案中，颗粒的孔径小于或等于0.5nm。
还提供的是用于施行当前所教导的方法的试剂盒。例如，在一些实施方案中，试剂盒包括标记分子，所述标记分子包括靶部分、标记部分、反应性部分和可裂解的链。在其他实施方案中，试剂盒包括用于检测靶分析物存在的替代分析物-蛋白质复合物。在其他实施方案中，试剂盒包括包封的替代分析物-蛋白质复合物。当前所教导的这些特征和其他的特征在下文中阐述。
4.附图简述
图1A-E提供抗体标记流程的示例性实施方案，其利用了包括抗原部分、标记部分、可裂解的链和反应性部分的示例性标记分子；
图2A-C提供包封于细胞内的分析物报告系统的示例性实施方案；以及
图3提供分析物报告系统的示例性实施方案。
5.发明详述
应该理解，前述总体描述与下文的描述仅仅是示例和说明，并且不限于此处描述的组合物和方法。在本申请中，除非另有具体说明，否则所使用的单数包括复数。此外，除非另有说明，否则所使用的“或”指“和/或”。同样地，“包含”、“包括”不预期为限制性的。
5.2定义
如此处所用，下述术语和短语预期具有以下含义：
“抗体”具有其标准含义并且预期指全长抗体以及现有技术已知的抗体片段，包括：通过修饰完整抗体所产生的Fab、Fab2、单链抗体(如Fv)、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体等，或者使用重组DNA技术从头合成的那些抗体。
“检测”具有其标准的含义并且预期包括分析物的检测、测定和表征。
“蛋白质”具有其标准的含义并且预期指蛋白质、寡肽和肽、衍生物与类似物(包括含有非天然形成的氨基酸和氨基酸类似物以及肽模拟物结构的蛋白质)，并且包括使用重组技术(即通过重组核苷酸的表达)而制备的蛋白质。
“猝灭”具有其标准的含义并且预期指在不考虑获得荧光强度降低的机理的情况下，在特定波长处所测得的荧光基团或荧光部分的荧光强度的降低。作为具体例子，猝灭可以归因于分子碰撞、能量传递(如FRET)、光诱导电子转移(如PET)、荧光基团或荧光部分的荧光光谱(颜色)的变化或任何其他的机理(或多种机理的组合)。降低的量并不是关键所在而且其可以在较宽的范围内发生变动。唯一的要求是所述降低可以通过所使用的检测系统来检测。因此，如果荧光信号在特定波长处的荧光强度降低了任何可测量的量时，则该荧光信号“猝灭”。如果荧光信号在特定波长处的荧光强度降低了至少50％(例如降低50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)，则该荧光信号“基本上猝灭”。
5.3标记分子
除其他之外，此处所提供的是用于特异性标记蛋白质的组合物。该组合物通常包括标记分子，所述标记分子包括靶部分、标记部分、反应性部分和可裂解的链。靶部分能够将标记分子结合至感兴趣的蛋白质。反应性部分能够连接标记分子与蛋白质。可裂解的链能够发生裂解以便靶部分从标记分子释放。可以对标记分子进行设计以使该标记分子实际标记任何感兴趣的蛋白质，条件是该蛋白质包括至少一个能够与靶部分结合的结合域。可以被标记的适宜蛋白质的非限制性实例包括但不限于抗体、酶、信号转导蛋白质、受体以及所有前述物质的片段。
标记分子可用于特异性地标记感兴趣的蛋白质，并且通常包括靶部分、标记部分、反应性部分和可裂解的链。
5.3.1靶部分
在一些实施方案中，标记分子包括一种或多种靶部分。靶部分能够将标记分子结合至待标记的蛋白质。在多种实施方案中，使用了两个或多个靶部分，各靶部分可以相同或者部分或全部的靶部分均不相同。靶部分可以包括任何有机或无机分子，所述有机或无机分子能够结合待标记的蛋白质并且能够含有可裂解的靶点。可以包括靶部分的分子的非限制性实例包括抗原、分析物、酶底物、蛋白质、碳氢化合物、多糖、糖蛋白、激素、病毒、代谢物、过渡态类似物、辅因子、核苷酸、多核苷酸、抑制剂、药物、营养素、生长因子和其他能够结合待标记蛋白质并且能够包括可裂解的链的生物分子及非生物分子。
靶部分与蛋白质之间结合的特异性和强度部分地取决于相互作用的数目，所述作用包括弱的非共价键、氢键、离子相互作用、范德瓦而斯引力和有利的疏水作用。与靶部分结合的蛋白质区域(此处称为“靶点结合位点”)通常由蛋白质表面中通过氨基酸的特定排列而形成的腔组成。这些氨基酸可以属于多肽链的不同部分，所述多肽链当蛋白质折叠时集合在一起。蛋白质表面的分离区域可以为不同的靶提供结合位点。
可以直接测量任何两种分子相互结合的力量。例如，可以使用离解常数Kd来表示蛋白质对靶部分的亲合力。在一些实施方案中，靶部分和蛋白质可以具有约10-6或更低的Kd。在一些实施方案中，离解常数可以为约10-7或更低。在一些实施方案中，离解常数可以为约10-8或更低。在一些实施方案中，离解常数可以为约10-9或更低。在一些实施方案中，离解常数可以为约10-10或更低。在一些实施方案中，离解常数可以为约10-11或更低。
靶部分的组成可以部分地取决于待检测的底物的结构、用于检测靶分析物的蛋白质以及待标记的蛋白质。例如，假设待标记的蛋白质是抗体，则靶部分包括至少一个经由抗体识别的表位。如此处所用，术语“抗原”指能够在脊椎动物中诱发特异性抗体合成的物质。如此处所用，“表位”指抗原决定簇，如特殊的化学基团或者在抗原内特异性抗体与之结合的基团。
在一些实施方案中，靶部分包括含有针对cAMP的表位的抗原。
在一些实施方案中，例如，可以使用靶部分对酶进行标记，所述靶部分包括酶底物、酶底物能够结合所述酶的部分、辅因子、过渡态类似物或小分子比如药物。靶部分可以在任何部位结合酶，条件是标记部分紧邻活性位点但是却不干扰在活性位点处与底物的结合，并且分析物结合至相同的活性位点。
在一些实施方案中，待标记的蛋白质可以是受体。在这些实施方案中，靶部分可以包括配基、配基能够结合受体的部分或小分子。靶部分可以在任何部位结合受体，条件是标记部分紧邻配基结合位点但是却不干扰配基与受体的结合。
在一些实施方案中，待标记的蛋白质可以是信号转导蛋白质。在这些实施方案中，靶部分可以包括配基(ligan)、配基能够结合受体的部分或信号转导途径中所涉及的小分子。靶部分可以在任何部位结合信号转导蛋白质，条件是标记部分紧邻配基结合位点但是却不干扰配基与信号转导蛋白质的结合。
在一些实施方案中，靶部分包括cAMP，以及待标记的蛋白质包括cAMP抗体。
5.3.2标记部分
在一些实施方案中，标记分子包括一个或多个标记部分。在多种实施方案中，采用了两个或多个标记部分，各标记部分可以相同或者部分或全部的标记部分均不相同。
在一些实施方案中，标记部分包括荧光部分。所述荧光部分可以包括任何提供荧光信号并且可以依据此处描述的方法和原理使用的实体。通常，标记分子的荧光部分包括荧光染料，该荧光染料依次包括吸收第一波长光并且响应吸收事件而发射第二波长荧光的共振离域系统或芳环系统。许多这样的荧光染料分子为本领域所公知。例如，可以从任何种类的荧光化合物中选择荧光染料，所述荧光化合物的例子如呫吨、若丹明、荧光素、花青、酞菁、方酸菁(squaraines)、氟硼荧染料(bodipy dyes)、香豆素、恶嗪和碳焦宁(carbopyronines)。
在一些实施方案中，荧光部分包括呫吨染料。通常，呫吨染料经由下述三个主要特征进行表征：(1)呫吨母环；(2)环外的羟基或胺取代基；和(3)环外的氧或亚铵(imminium)取代基。尽管“延伸的”呫吨(其中呫吨母环包括与C5/C6或C3/C4中任一个或者同时与C5/C6和C3/C4两者稠合的苯并基团)也是已知的，但是环外的取代基通常位于呫吨母环的C3和C6碳。在这些延伸的呫吨中，特征环外取代基位于延伸的呫吨环的相应位置。
因此，如此处所用，“呫吨染料”通常包括下述母环中的一种：
Figure A20068000851000151
在上述描绘的母环中，A1是OH或NH2以及A2是O或NH2 +。当A1是OH并且A2是O时，母环为荧光素型的呫吨环。当A1是NH2并且A2是NH2 +时，母环为若丹明型的呫吨环。当A1是NH2并且A2是O时，母环为对甲氨基酚型的呫吨环。
A1和A2中的一个或两个氮(当存在时)和/或在C1、C2、C2″、C4、C4″、C5、C5″、C7″、C7和C8位的一个或多个碳原子可以独立地为多种相同或不同的取代基所取代。在一个实施方案中，典型的取代基包括但不限于-X、-Ra、-ORa、-SRa、-NRaRa、全卤代(C1-C6)烷基、-CX3、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、-NCO、-NCS、-NO、-NO2、-N3、-S(O)2O-、-S(O)2OH、-S(O)2Ra、-C(O)R、-C(O)X、-C(S)Ra、-C(S)X、-C(O)ORa、-C(O)O-、-C(S)ORa、-C(O)SRa、-C(S)SRa、-C(O)NRaRa、-C(S)NRaRa和-C(NR)NRaRa，其中每个X独立地为卤素(优选-F或-C1)并且每个Ra独立地为氢、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰(alkanyl)、(C1-C6)链烯基、(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、(C6-C26)芳烷基、(C5-C20)芳基芳基(arylaryl)、5-20元的杂芳基、6-26元的杂芳烷基、5-20元的杂芳基-杂芳基、羧基、乙酰基、磺酰基、亚磺酰基、砜、磷酸酯或膦酸酯。通常，优选不趋向于完全猝灭母环荧光的取代基，但是在一些实施方案中，猝灭取代基可能是想要的。趋向于猝灭呫吨母环的取代基包括重原子，比如-NO2、-Br和-I，和/或其他官能部分，比如NO2。
C1和C2取代基和/或C7和C8取代基可以连在一起以便形成取代或未取代的[1，3]丁二烯或(C5-C20)芳烯桥(aryleno bridges)。出于说明的目的，下面描述了示例性的包括稠合至C1/C2和C7/C8碳的未取代苯并桥的呫吨母环：
苯并或芳烯桥的一个或多个位置可以为多种不同的取代基基团所取代，比如先前在上文描述的用于结构(Ia)-(Ic)中C1-C8碳的取代基基团。在包括多种取代基的实施方案中，所述取代基可以全部相同，或者取代基相互之间可以部分或全部不同。
当A1是NH2和/或A2是NH2 +时，氮原子可以包括在涉及相邻碳原子的一个或两个桥中。桥连基团可以相同或不同，并且通常选自(C1-C12)烷基二基(alkyldiyl)、(C1-C12)烷烯(alkyleno)、2-12元的杂烷基二基和/或2-12元的杂烷烯桥。以下示出包括桥的非限制性示例母环，其中所述桥涉及环外氮：
Figure A20068000851000171
该母环还可以包括C9位的取代基。在一些实施方案中，C9取代基选自乙炔、低级(如，1至6个碳原子)烷酰、低级链烯基、氰基、芳基、苯基、杂芳基和任何前述基团的取代形式。在其中母环包括与C1/C2和C7/C8位稠合的苯并或芳烯桥(例如上述示出的环(Id)、(Ie)和(If))的实施方案中，C9碳优选为未取代的。
在一些实施方案中，C9取代基为取代或未取代的苯环，以使呫吨染料包括下述结构中的一种：
Figure A20068000851000181
3、4、5、6和7位的碳可以为多种不同的取代基团所取代，比如先前描述的有关碳C1-C8的取代基团。在一些实施方案中，C3位的碳为羧基(-COOH)或硫酸(-SO3H)基团或其阴离子所取代。此处将其中A1是OH而A2是O的式(IIa)、(IIb)和(IIc)的染料称为荧光素染料；此处将其中A1是NH2而A2是NH2 +的式(IIa)、(IIb)和(IIc)的染料称为若丹明染料；以及此处将其中A1是OH而A2是NH2 +(或者其中A1是NH2而A2是O)的式(IIa)、(IIb)和(IIc)的染料称为对甲氨基酚染料。
如上述结构所显示的，当呫吨环(或延伸的呫吨环)包括在荧光素、若丹明和对甲氨基酚染料中时，对其碳原子进行不同的编号。特别地，其碳原子编号包括撇号(primes)。尽管可以方便地提供上述用于荧光素、若丹明和对甲氨基酚染料的编号系统，但是应该理解的是可以采用其他的编号系统并且这些编号系统不预期为限制性的。还要理解的是尽管示出了染料的一种同分异构形式，但是所述染料也可以其他的同分异构形式存在，这些其他的同分异构形式包括(作为例子并非限制)其他的互变异构形式或几何形式。作为具体的例子，羧基若丹明和荧光素染料可以内酯形式存在。
在一些实施方案中，荧光部分包括若丹明染料。示例性的适宜的若丹明染料包括但不限于若丹明B、5-羧基若丹明、若丹明X(ROX)、4，7-二氯若丹明X(dROX)、若丹明6G(R6G)、4，7-二氯若丹明6G、若丹明110(R110)、4，7-二氯若丹明110(dR110)、四甲基若丹明(TAMRA)和4，7-二氯-四甲基若丹明(dTAMRA)。其他适宜的若丹明染料包括例如下述专利和文献中所描述的那些：美国专利第6,248,884、6,111,116、6,080,852、6,051,719、6,025,505、6,017,712、5,936,087、5,847,162、5,840,999、5,750,409、5,366,860、5,231,191和5,227,487号；PCT公布文本WO 97/36960和WO99/27020；Lee等人，NUCL.ACIDS RES.20：2471-2483(1992)；Arden-Jacob，NEUE LANWELLIGE XANTHEN-FARBSTOFFE FURFLUORESZENZSONDEN UND FARBSTOFF LASER，Verlag Shaker，德国(1993)；Sauer等人，J.FLUORESCENCE 5：247-261(1995)；Lee等人，NUCL.ACIDS RES.25：2816-2822(1997)；以及Rosenblum等人，NUCL.ACIDSRES.25：4500-4504(1997)。若丹明染料特别优选的亚类是4，7-二氯若丹明。在一个实施方案中，荧光部分包括4，7-二氯-邻羧基若丹明染料。
在一些实施方案中，荧光部分包括荧光素染料。示例性的适宜的荧光素包括但不限于下述专利中所描述的那些荧光素染料：美国专利第6,008,379、5,840,999、5,750,409、5,654,442、5,188,934、5,066,580、4,933,471、4,481,136和4,439,356号；PCT公布文本WO 99/16832以及EPO公布文本050684。荧光素染料的优选亚类是4，7-二氯荧光素。其他优选的荧光素染料包括但不限于5-羧基荧光素(5-FAM)和6-羧基荧光素(6-FAM)。在一个实施方案中，荧光素部分包括4，7-二氯-邻羧基荧光素染料。
在一些实施方案中，荧光部分可以包括花青，酞菁、方酸菁或氟硼荧染料，例如下述说明书及其中引用的参考文献中所描述的那些：美国专利第6,080,868、6,005,113、5,945,526、5,863,753、5,863,727、5,800,996和5,436,134号；以及PCT公布文本WO 96/04405。
在一些实施方案中，荧光部分可以包括染料网状物，该染料网状物经由例如FRET或另一种机理而彼此之间协同作用，从而产生较大的斯托克斯位移(Stoke′s shifts)。此类染料网状物通常包括荧光供体部分和荧光受体部分，并且可以包括起荧光受体和荧光供体这两种作用的另外部分。荧光供体和荧光受体部分可以包括任何前述的染料，条件是选择相互之间可以协同作用的染料。在具体的实施方案中，荧光部分包括含有荧光素染料的荧光供体部分和含有荧光素或若丹明染料的荧光受体部分。适宜的染料对或网状物的非限制性实例在美国专利第6,399,392、6,232,075、5,863,727和5,800,996号中描述。
在一些实施方案中，标记部分包括猝灭部分。猝灭部分可以是任何在紧邻荧光部分时能够猝灭该荧光部分荧光的部分，比如，以上猝灭通过下述所举例的方式进行：轨道重叠(形成基态的无荧光复合物)、碰撞猝灭、FRET或另外的机理或多种机理的组合。该猝灭部分自身可以具有荧光或者其可以无荧光。在一些实施方案中，所述猝灭部分包括具有与荧光部分的发射光谱充分重叠的吸收光谱的荧光染料，以使该猝灭部分在紧邻荧光部分时猝灭该荧光部分的荧光。
5.3.3反应性部分
在一些实施方案中，标记分子包括一个或多个反应性部分。可以使用反应性部分将标记部分连接至靶结合位点附近的蛋白质。反应性部分可以直接或者经由一个或多个任选的连接体间接地连接至标记部分。反应性部分可以包括能够与蛋白质上的相应反应性基团形成共价键的任何反应性基团。因此，反应性部分可以包括本领域已知的任何反应性基团，只要所述反应性基团与此处描述的方法和组合物相适合。在采用两个或多个反应性部分的实施方案中，各反应性部分可以相同或者部分或全部的反应性部分均不相同。
在一些实施方案中，反应性部分包括交联剂，即交联基团。交联剂的反应性、特异性以及溶解度特性为本领域所公知。对于选择合适交联剂的指导可以在Mattson等人，MOL BiOL REP.Apr；17(3)：167-83(1993)，Double-AgentsTM Cross-linking reagents(Double-AgentsTM交联试剂)，Selection Guide(选择指南)，Pierce Biotechnology Inc.，2003)中找到。还可以参见Wong，1993，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking(蛋白质结合与交联的化学)，CRC Press，Boca Raton。
在一些实施方案中，反应性部分包括可以通过与蛋白质上存在的互补基团形成共价键而用来将反应性部分连接至蛋白质的官能团。互补基团对能够形成共价键是公知的。在一些实施方案中，蛋白质包括亲核基团并且交联基团包括亲电基团。在其他实施方案中，交联基团包括亲核基团并且蛋白质包括亲电基团。用于使键对生物学和其他分析条件稳定的“互补”亲核基团与亲电基团(或其可以适当激活的前体)是公知的并且可以使用。
表1提供了适宜的互补亲核基团和亲电基团以及由其生成的键的实例。
  表1
  亲电基团   亲核基团   生成的共价键
  活化的酯*酰叠氮**酰卤酰卤   胺/苯胺胺/苯胺胺/苯胺醇/酚   氨甲酰氨甲酰氨甲酰酯
  酰腈酰腈醛醛或酮醛或酮烷基卤烷基卤烷基卤烷基卤烷基磺酸酯烷基磺酸酯烷基磺酸酯酐酐芳基卤芳基卤氮丙啶硼酸酯羧酸羧酸羧酸碳化亚胺重氮烷环氧化物卤代乙酰胺卤代三嗪卤代三嗪亚胺酯异氰酸酯异氰酸酯   醇/酚胺/苯胺胺/苯胺肼羟胺胺/苯胺羧酸硫醇醇/酚硫醇羧酸醇/酚醇/酚胺/苯胺硫醇胺硫醇乙二醇胺/苯胺醇肼羧酸羧酸硫醇硫醇胺/苯胺醇/酚胺/苯胺胺/苯胺醇/酚   酯氨甲酰亚胺腙肟烷基胺酯硫醚酯硫醚酯酯酯氨甲酰苯硫酚芳基胺硫醚硼酸酯氨甲酰酯酰肼N-酰基脲或酐酯硫醚硫醚氨基三嗪三嗪基酯脒脲尿烷
  异硫氰酸酯马来酰亚胺亚磷酰胺甲硅烷基卤化物硫酸酯硫酸酯硫酸酯硫酸酯磺酰基卤化物磺酰基卤化物重氮盐   胺/苯胺硫醇醇醇胺/苯胺硫醇羧酸醇胺/苯胺酚/醇芳基   硫脲硫醚磷酸酯甲硅烷基醚烷基胺硫醚酯酯磺酰胺磺酸酯偶氮
*如本领域所理解的，激活的酯通常具有式-C(O)Z，其中Z为优良的离去基团(如氧代琥珀酰亚胺基、氧硫代琥珀酰亚胺基、1-氧代苯并三唑基等)。
**酰叠氮可以重排至异氰酸酯。
在一些实施方案中，反应性部分包括含有光反应性基团的交联剂。光反应性基团具有至少一个一经外部能源激活即可与其他分子形成共价键的潜在的光反应性基团。参见，如美国专利第5,002,582号，通过引用将其内容并入本文。例如，光反应性基团一经暴露于适宜的光源即可被激活，从而与相邻的化学结构形成共价键，如脂肪族碳氢键。
例如，适宜的光反应性基团包括氮化物、重氮基、偶氮甲烷(diazirines)、芳族酮和醌。经激活的示例光反应性基团及其残基示于表2。
  表2
  光反应性基团   残基官能性
  芳基氮化物芳基氮化物叠氮甲酸酯磺酰基氮化物磷酰基氮化物   胺R-NH-R′胺R-CO-NH-R′氨基甲酸酯WO-CO-NH-R′磺酰胺R-SO2-NH-R′磺酰胺(RO)2PO-NH-R′
  重氮烷重氮酮重氮基乙酸酯β-酮-α-重氮基乙酸酯脂肪族偶氮偶氮甲烷烯酮光活化的酮   新的C-C键新的C-C键和酮新的C-C键和酯新的C-C键和β-酮新的C-C键新的C-C键新的C-C键新的C-C键和醇
在一些实施方案中，光反应性基团包括芳酮，比如苯乙酮、蒽醌、蒽酮和类蒽酮杂环(即蒽酮的杂环类似物，比如在10位具有N、O或S的那些)或其取代的(如，环取代)衍生物、二苯甲酮、马来酰亚胺二苯甲酮(benzophenone maleimido)、4-苯甲酰苯甲酸的琥珀酰亚胺基酯。
一些芳酮的官能团可以经历多个活化/失活/再活化循环。例如，二苯甲酮能够随单线态的初期形成而光化激活，其经历系间窜越至三线态。受激的三线态可以经由夺取氢原子(例如，从聚合包覆层)而插入碳氢键，从而形成自由基对。自由基对随后的折叠(collapse)导致形成新的碳碳键。假设未提供用于键合的反应键(如碳/氢)，则紫外线诱导的二苯甲酮基团的激活是可逆的并且该分子在能源移走后将返回基态能级。光反应性芳酮(如二苯甲酮和苯乙酮)可以经历水中的再活化并由此可以提供提高的连接效率。
在一些实施方案中，光反应性基团包括氮化物并且包括芳基氮化物(C6R5N3)，如苯基氮化物、4-氟-3-硝基苯基氮化物；酰基氮化物(-CO-N3)，如乙基叠氮基富马酸酯(ethyl azidofomiate)、苯基叠氮甲酸酯；磺酰氮化物(-SO2-N3)，如苯磺酰氮化物；以及磷酰基氮化物(RO)2PON3，如联苯磷酰基氮化物与二乙基磷酰基氮化物。
在一些实施方案中，光反应性基团包括重氮化合物并且包括：重氮烷(-CHN2)，如重氮甲烷和联苯重氮甲烷；重氮酮(-CO-CHN2)，如重氮苯乙酮和1-三氟甲基-1-重氮-2-戊酮；重氮醋酸酯(-CO-CN2-CO-O-)，如叔基α叠氮乙酸乙酯。
其他适宜的光反应性基团包括脂肪族偶氮化合物，如偶氮二异丁腈；偶氮甲烷(-CHN2)，如3-三氟甲基-3-苯基偶氮甲烷；以及烯酮(-CH＝C＝O)，如乙烯酮和二苯乙烯酮，并且光反应性基团包括醌，例子如蒽醌。
适宜的可活化的反应性部分的其他例子包括但不限于可以经由pH、热或电化学活化的分子，如过氧化物。
在一些实施方案中，反应性部分包括经由pH变化而活化的化学基团。经由pH变化而活化的化学基团是公知的并且可用于形成共价键(参见，例如，Double-AgentsTM Cross-linking reagents(Double-AgentsTM交联剂)，Selection Guide(选择指南)，Pierce Biotechnology Inc.，2003)。适宜的非限制性实例包括亚氨酸酯、马来酰亚胺基团、碘代乙酰基团和乙二醛。
亚氨酸酯在约pH 8-10时可与伯胺反应形成脒键。N-羟基琥珀酰亚胺-酯(NHS-酯)在生理pH时可与伯胺反应。蛋白质N末端上存在的可及α-胺基和赖氨酸残基上的
Figure A20068000851000251
胺与NHS-酯反应并形成酰胺键。当反应混合物的pH在6.5和7.5之间时，马来酰亚胺基团可以与巯基特异性地反应并形成稳定的硫醚键。在中性pH，马来酰亚胺与巯基的反应可以比与胺的反应快1,000倍，但是当pH＞8.5，该反应有利于伯胺。碘代乙酰基团在生理pH时可以与巯基反应。碘代乙酰基团与巯基的反应通过碘与硫醇的亲核取代而进行，从而形成稳定的硫醚键。在pH约为pH 6.9-7.0时，碘代乙酰基团可以与咪唑反应。乙二醛在弱碱性pH时可以靶向精氨酸。乙二醛是用来靶向精氨酸残基的胍基部分的有效化合物。在约pH 9时可存在与赖氨酸的交联反应。
在一些实施方案中，反应性部分包括可以经由热活化的化学基团。可以经由热活化的化学基团为本领域技术人员所公知。可以经由热活化的化学基团的适宜非限制性实例包括过氧化物(如苯甲酰过氧化物)以及偶氮基(如偶氮二异丁腈)。
在一些实施方案中，反应性部分包括可以经由电化学活化的化学基团。可以经由电化学活化的化学基团为本领域技术人员所公知。可以经由电化学活化的化学基团的适宜非限制性实例包括卤代苯甲基化合物(如α-溴甲苯)以及有机金属化合物(如苯基汞化合物)。
在一些实施方案中，连接体部分可以插入反应性基团之间以使蛋白质活性的空间位阻影响降至最低。连接体部分的化学组成并不是关键所在。可以使用允许所得到的标记蛋白质如此处所描述行使功能的任何类型的连接体。适宜的连接体部分在下文描述。
5.3.4可裂解的链
在一些实施方案中，标记分子包括可裂解的链。通常，可裂解的链将靶部分连接至标记部分。可裂解的链包括至少一个可裂解的部分和一个或多个任选的连接体部分。可裂解的部分包括至少一个可以被裂解以使靶部分从蛋白质脱离的官能团。任选的连接体部分通常包括一个或多个键合基团，所述键合基团可以用来影响标记分子的溶解度和/或起到将可裂解的链连接至靶部分与标记部分的功能。
可裂解的部分可以包括任何数目的官能团。例如，可裂解的部分可以包括官能团，当可裂解的链结合至标记蛋白质或者与标记蛋白质相互作用时，所述官能团可以经由所选择的裂解剂而发生裂解。作为另一个例子，可裂解的部分可以包括在所选择的裂解条件下或者经由选择的化学反应而发生裂解的官能团。因此，可裂解的部分可以包括可发生光解、化学、热或酶裂解的官能团。参见，例如美国专利第5,721,099号、美国专利公布第2004/0166529号，以及Greene等人，PROTECTIVE GROUPS INORGANIC SYNTHESIS(有机合成中的保护性基团)，第2版.Wiley，1991，和美国专利申请第10/828647号。
在一些实施方案中，可裂解的部分包括可经由氧化或酸而被卤素(如氟、溴或氯)裂解的甲硅烷基。
在其他实施方案中，可裂解的部分可以包括可以使用电磁辐射而使其发生裂解的对光不稳定的键，比如邻硝基苯甲基、7-硝基茚满基、2-硝基二苯甲基醚或酯等。
可裂解的部分的其他实例为本领域技术人员已知。例如，可用铈盐裂解的儿茶酚可以作为可裂解的部分而使用。可用臭氧、高锰酸盐或四氧化锇裂解的烯烃可以作为可裂解的部分而使用。可用单线态氧或者经由使用过氧化氢的酶催化氧化裂解所裂解的硫化物可以作为可裂解的部分而使用，其中所得的砜可经受消除作用。可在甲醇中用氧或溴裂解的呋喃可以作为可裂解的部分而使用。可用酸裂解的叔醇缩酮和缩醛可以作为可裂解的部分而使用。可用碱裂解的α和β取代的醚和酯可以作为可裂解的部分而使用，其中取代基为吸电子基团(如砜、亚砜、酮等)等。可通过酸性或温和的还原条件发生裂解的取代苯甲基醚或其衍生物(如二苯甲基醚、茚满基醚等)可以作为可裂解的部分而使用。
在一些实施方案中，使用了两个或多个可裂解的部分。在这些实施方案中，各可裂解的部分可以相同或者部分或全部的可裂解的部分均不相同。
在一些实施方案中，可裂解的链包括一个或多个任选的连接体部分。连接体部分可以包括能够将可裂解的部分连接至标记分子其他部分的任何键合基团。在多个实施方案中，采用了两个或多个连接体部分，各连接体部分可以相同或者部分或全部的连接体部分均不相同。
在一些实施方案中，连接体部分包括一个或多个(双)乙二醇基团。如同本领域技术人员所理解的，可以对含有连接体部分的氧乙烯单元的数目进行选择性地变动。例如，可以使用一个、两个、三个或多个氧乙烯单元以形成连接体部分。实际上，可以使用允许可裂解的链起此处所描述功能的相同或不同氧乙烯单元的任何组合。在具体的例子中，连接体部分可以包括从1至约5个相同或不同的低级氧乙烯单元(如，-(CH2)xCH2-)，其中x是范围从0至6的整数。连接体部分的化学组成并不是关键所在。可以使用任何类型的、允许所得到的标记分子起此处所描述功能的连接体部分。
可以选择具有特定的性质的连接体部分。例如，取决于特定的应用，连接体部分可以为疏水性质、亲水性质、长的或短的、刚性、半刚性或柔韧的。可以使用用于连接相同或不同的其他取代基的一个或多个取代基或者一个或多个连接基团对连接体部分进行任选地取代，从而提供能够将其他分子或物质结合或连接至标记分子的“多价”连接部分。但是，在某些实施方案中，连接体部分不包括这样的其他取代基或连接基团。
含有稳定键的多种连接体部分为本领域已知，并且包括(作为例子并不限于)烷基二基、取代的烷基二基、烷基烯酮(alkylenos)(如，烷酰酮(alkanos))、取代的烷基烯酮、杂烷基二基、取代的杂烷基二基、杂烷基烯酮(heteroalkylenos)、取代的杂烷基烯酮、无环的杂原子桥、芳基二基、取代的芳基二基、芳基芳基二基(arylaryldiyls)、取代的芳基芳基二基、芳基烷基二基、取代的芳基烷基二基、杂芳基二基、取代的杂芳基二基、杂芳基-杂芳基二基、取代的杂芳基-杂芳基二基、杂芳基烷基二基、取代的杂芳基烷基二基、杂芳基-杂烷基二基、取代的杂芳基-杂烷基二基，等等。因此，连接体部分可以包括单键、双键、三键或芳香族碳碳键、氮氮键、碳氮键、碳氧键、碳硫键以及此类键的组合，并且可以由此包括比如羰基、醚、硫醚、氨甲酰、氨磺酰、脲、尿烷、肼等官能度。在一些实施方案中，连接体部分具有1-20个选自C、N、O、P和S的非氢原子，并且主要由醚、硫醚、胺、酯、氨甲酰、氨磺酰、酰肼、芳香和杂芳香基团的任何组合组成。
选择具有适于特定应用的性能的连接体部分在本领域技术人员的能力范围之内。例如，当期望刚性的连接体部分时，连接体部分可以包括刚性的多肽(如聚脯氨酸)、刚性的多不饱和的烷基二基或芳基二基、二芳基二基、芳基芳基二基(arylarydiyl)、芳基烷基二基、杂芳基二基、二杂芳基二基、杂芳基烷基二基、杂芳基-杂芳基二基，等等。当期望柔韧的连接体部分时，连接体部分可以包括柔韧的多肽如多聚甘氨酸或者柔韧的饱和烷酰二基或杂烷酰二基。例如，亲水的连接体部分可以包括多元醇、聚醚(如聚烯基乙二醇)或聚电解质(如聚季铵)。例如，疏水的连接体部分可以包括烷基二基或芳基二基。
在一些实施方案中，连接体部分包括肽键。本领域技术人员应理解的是尽管可以方便的使用肽键，但是含有标记分子的不同部分也可以经由任何对标记分子使用的条件稳定的键而相互连接。
在一些实施方案中，可裂解的链包括下述结构：
Figure A20068000851000291
其中：
Y和/或X为氧原子，
R1和R2为烃；
L表示任选的连接体部分；以及
n为从0至5的整数。
在上述实施方案中，当Y或X为氧原子时，其他部分可以包括氧原子或碳原子。例如，当Y为氧原子时，X可以为碳原子。作为另一个例子，当X为氧原子时，Y可以为碳原子。在又一例子中，Y和X均可以为氧原子。
在一些实施方案中，可裂解的链包括下述结构：
Figure A20068000851000292
其中R1和R2为烃；
可裂解的链可以具有任何长度，条件是可裂解的部分一经裂解后，标记部分即位于紧邻分析物结合位点的、不妨碍靶结合的位置。选择具有适于特定应用的性能的可裂解的链在本领域技术人员的能力范围之内。例如，可以使用标记有包含不同长度可裂解链的标记分子的蛋白质来进行竞争性结合分析以确定可裂解的链的最佳长度，以便使标记部分基本上不妨碍靶结合。
在一些实施方案中，可裂解的链可以为5至约20埃。
包含所述标记分子的不同的部分能够以允许这些部分施行其各自功能的任何方式而相互连接。在一些实施方案中，靶部分、标记部分、反应性部分和可裂解的链相互之间可以直接连接，即，相互之间可以共价连接。在一些实施方案中，一个、一些或所有的部分相互之间均可间接连接，即，经由一个或多个任选的连接体而相互连接。可以使用任何先前描述的连接体来将不同的部分进行相互连接。
在一些实施方案中，可裂解的链可以直接连接至靶部分。在一些实施方案中，可裂解的链可以经由任选的连接体间接地连接至靶部分。在一些实施方案中，可裂解的链直接连接至标记部分。在一些实施方案中，可裂解的链经由任选的连接体间接地连接至标记部分。在一些实施方案中，可裂解的链直接连接至反应性部分。在一些实施方案中，可裂解的链经由任选的连接体间接地连接至反应性部分。
在一些实施方案中，靶部分、标记部分、反应性部分和可裂解的链相互之间可以经由多价的连接体连接。多价的连接体可以是任何具有两个、三个、四个或更多连接位点、适合将其他分子和部分连接其中的分子，或者是可以适当地活化以将其他分子和部分连接其中的分子。例如，与反应性(或可活化的)连接基团相连的连接体的骨架可以为直链、支链或环状的饱和或不饱和烷基、单环或多环芳基或芳基烷基。连接体不必限于碳和氢原子。事实上，连接体可以包括单、双、三或芳香族的碳碳键、碳氮键、氮氮键、碳氧键、碳硫键、磷氧键及其组合，并且可以由此包括下述官能度：如羰基、醚、硫醚、氨甲酰、氨磺酰、脲、尿烷、肼，等等。
在多价连接体上的官能团可以是能够形成共价键的互补反应性基团对的任何成员。在一些实施方案中，含有多官能连接体的每个反应性基团为亲电基团或亲核基团，其能够与互补的亲核基团或亲电基团反应形成对生物测定条件稳定的共价键。
多价连接体上的反应性基团可以全部相同，或者部分或全部不同。在一些实施方案中，选择具有不同化学反应性的反应性基团以促进此处描述的不同部分选择性地连接至连接体。
在一些实施方案中，多价的连接体可以是三官能的连接体。在一些实施方案中，三官能的连接体是氨基酸，其可以为α氨基酸、β氨基酸、γ氨基酸或其他类型的包括具有适宜反应性官能团的侧链的氨基酸。适宜氨基酸的具体实例包括但不限于赖氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、高丝氨酸和1，3-二氨基丁酸。这些氨基酸可以为D构型或L构型，或者可以构成其外消旋混合物或其他混合物。
在一些实施方案中，标记分子包括下述结构：
TM-(L1)n-CT-(L2)n-LM-(L3)n-RM
其中：
TM表示靶部分；
CT表示可裂解的链；
LM表示标记部分；
RM表示反应性部分；
L1-L3表示任选的连接体，以及
n为从0至5的整数
L1、L2和L3可以包括任何上述讨论的任选的连接体。在一些实施方案中，连接体可以相同。在一些实施方案中，连接体可以不同。在一些实施方案中，一些连接体可以相同而其他的连接体可以不同。
在一些实施方案中，标记分子包括下述结构：
Figure A20068000851000311
其中：
TM表示含有cAMP抗原的靶部分；
CT表示可裂解的链，其包括可裂解的甲硅烷基部分和两个任选的烷基连接体；
LM表示含有羧基荧光素染料(FAM)的标记部分；RM表示光活性反应性部分；以及
L1-L3表示任选的连接体。
5.3.5特异性标记的蛋白质
此外，此处提供的是能够结合感兴趣的靶分析物的蛋白质，所述蛋白质可以在紧邻靶点分析物结合位点处进行特异性标记并且在其他位置基本上不进行标记。所述蛋白质可以是依据此处描述的各种组合和方法进行操作的任何蛋白质或其片段。例如，在一些实施方案中，蛋白质可以是能够结合含有表位的目标抗原的抗体。在其他实施方案中，蛋白质可以是能够结合目标底物的酶。在又一实施方案中，蛋白质可以是能够结合目标配基的受体。在又一实施方案中，蛋白质可以是能够结合目标配基的信号转导蛋白质。
可以使用一个或多个标记部分对蛋白质进行特异性标记。任何前述的标记部分可以包括在蛋白质上。在采用了两个或多个标记部分的实施方案中，每个标记部分可以相同或者部分或全部的标记部分均不相同。例如，在一些实施方案中，蛋白质可以包括荧光部分。荧光部分可以包括任何提供荧光信号并可依据此处描述的方法和原理使用的实体。在一些实施方案中，蛋白质包括能够猝灭荧光部分荧光的猝灭部分。
标记部分与靶结合位点之间的精确距离并不是关键所在并可以在较宽的范围内变动。唯一必要的是标记部分与目标结合位点的距离需足够远，以使其基本上不阻断分析物和替代分析物结合至蛋白质上的结合位点。在一些实施方案中，标记部分与结合位点的距离可以为约3至50埃。在一些实施方案中，标记部分与结合位点的距离可以为约5至30埃。在一些实施方案中，标记部分与结合位点的距离可以为约5至20埃。
制备标记蛋白质的方法通常包括将蛋白质与标记分子接触，所述标记分子包括靶部分、标记部分、反应性部分和可裂解的链。靶部分、标记部分和反应性部分相互连接以使靶部分可以结合蛋白质，并且反应性部分可以连接标记部分与蛋白质。加入能够活化反应性部分的试剂以在反应性部分和蛋白质之间形成共价键。可以通过下述方式使靶部分脱离蛋白质：a)经由上述适宜的试剂或条件诱导可裂解的链发生裂解，以及b)提供有效地将靶部分从蛋白质附近移走的条件，如通过稀释、或者通过加入替代分析物或分析物。
图1示出使用标记分子110制备功能性标记抗体100的方法的示例性实施方案。图1A示出抗体100与标记分子110接触，所述标记分子110包括抗原部分AgM、标记部分LM、反应性部分RM以及与所述抗原部分AgM连接的可裂解的链CT。如同本领域技术人员所理解的，图1所提供的标记分子110中示出的各种部分的排列仅仅是为了举例，并且所述各种部分可以任何允许其施行各自功能的方式相互连接。图1B示出抗体100与标记分子110接触。图1C示出活化反应性部分*RM以在活化的反应性部分＊RM和抗体100之间形成共价键。图1D示出裂解可裂解的链＊CT。图1E示出继可裂解的链裂解之后的裂解产物，比如标记的抗体和抗原部分AgM。
在一些实施方案中，该方法进一步包括从含有靶部分的裂解产物分离标记蛋白质。从裂解产物分离蛋白质的方法为本领域技术人员已知。
通常，适合进行标记的蛋白质包括至少一个针对靶分析物的结合域以及能够与反应性部分反应的反应性基团。适宜的蛋白质、标记部分、反应性部分和可裂解的链的非限制性实例在上文描述。
5.3.6替代分析物-标记蛋白质的复合物
除了其他的物质之外，此处还提供的是用于分析物检测报告系统的替代分析物-蛋白质复合物。所述替代分析物-蛋白质的复合物包括标记的蛋白质和标记的替代分析物。图2A示出示例性的替代分析物-蛋白质复合物，其中替代分析物是和标记的蛋白质(即抗体)络合的替代抗原。在图2A中，使用荧光部分F对抗体进行标记以及使用猝灭部分Q对替代抗原sA进行标记。标记F的抗体和替代抗原sA形成了替代抗原-抗体复合物，其中定位猝灭部分Q使其能够猝灭抗体上荧光部分F的荧光。替代抗原-抗体复合物能够在通过抗原A竞争性地结合至抗体并置换替代抗原sA而引起的复合物解离后，产生可检测的荧光增强。
替代分析物可以是任何标记的有机或无机分子，其能够与感兴趣的靶(即分析物)竞争结合标记的蛋白质，并且能够包括可任选地连接至淬灭部分或荧光部分的连接体。可以包括替代分析物的适宜分子的非限制性实例包括抗原、酶底物、蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、病毒、代谢物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、营养素、电解质、生长因子和其他能够结合标记蛋白质的生物分子及非生物分子。
在一些实施方案中，替代分析物包括cAMP。
替代分析物包括一个或多个标记部分。任何前述的标记部分可用于标记替代分析物。在采用了两个或多个标记部分的实施方案中，每个标记部分可以相同，或者部分或全部的标记部分均不相同。
在一些实施方案中，标记的蛋白质包括荧光部分并且替代分析物包括猝灭部分。当替代分析物结合至标记蛋白质时可以猝灭荧光部分的荧光信号。靶分析物与标记蛋白质的结合可以置换替代分析物并减少或消除猝灭效应，从而产生可检测的荧光增强。
在一些实施方案中，标记蛋白质包括猝灭部分并且替代分析物包括荧光部分。当替代分析物结合至标记蛋白质时可以猝灭荧光部分的荧光信号。靶分析物与标记蛋白质的结合可以置换替代分析物并减少或消除猝灭效应，从而产生可检测的荧光增强。
在一些实施方案中，替代分析物-蛋白质复合物被包封在颗粒中。包封的替代分析物-蛋白质复合物可用于检测细胞内的分析物分子，以提高替代分析物-蛋白质复合物的局部浓度和/或将替代分析物-蛋白质复合物与其他物质分开，否则所述物质将裂解或灭活替代分析物-蛋白质复合物。
替代分析物-蛋白质复合物可以包封在下述物质中：毫微囊、脂质体、微粒、脂肪微滴、小囊泡等等。用于包封替代分析物-蛋白质复合物的颗粒可以是可渗透的、半渗透的或不可渗透的。在一些实施方案中，替代分析物-蛋白质复合物可包封在直径为从10至1000纳米的半渗透毫微囊中。在一些实施方案中，选择包含用以包封替代分析物和标记蛋白质颗粒的膜的孔隙率来保留替代分析物-标记蛋白质的复合物，并且同时允许靶分析物通过。因此，颗粒膜的孔隙率为允许直径小于或等于0.5nm至5.0nm的成分通过。在一些实施方案中，颗粒的孔径小于或等于5.0nm。在一些实施方案中，颗粒的孔径小于或等于2.0nm。在一些实施方案中，颗粒的孔径小于或等于1.5nm。在一些实施方案中，颗粒的孔径小于或等于1.0nm。在一些实施方案中，颗粒的孔径小于或等于0.5nm。
在一些实施方案中，毫微囊的膜包括交联的水溶性烯类聚合物或共聚物。适宜类型的烯类聚合物或共聚物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚-N，N-二甲基丙烯酰胺和聚羟基乙基甲基丙烯酸。
可以设计毫微囊的孔径以保留替代分析物-蛋白质的复合物、标记蛋白质和/或标记蛋白质-靶分析物的复合物并允许替代分析物或靶分析物通过毫微囊。例如，在一些实施方案中，毫微囊对于靶分析物和/或替代分析物是可渗透的并且对于标记抗体或其片段是不可渗透的。在一些实施方案中，毫微囊对于靶分析物和/或替代分析物是可渗透的并且对于标记的酶或其片段是不可渗透的。在一些实施方案中，毫微囊对于靶分析物和/或替代分析物是可渗透的并且对于受体或其片段是不可渗透的。
在一些实施方案中，靶部分可以连接至毫微囊，并且用于例如靶向毫微囊至特定的细胞或采集的细胞。如此处所用，“靶部分”包括任何的化学部分，所述化学部分能够结合至或以其他方式转运通过特定类型的膜和/或细胞、组织或器官中的细胞器。将该组合物引导至特定细胞的多种物质为本领域已知(参见，例如，Gotten等人，Methods Enzym，217：618，1993)以及美国专利第6,692,911、6,835,393号)。适宜靶部分的非限制性实例包括蛋白质(比如胰岛素、EGF或转铁蛋白)、外源凝集素、抗体及片段、碳水化合物、脂质、寡核苷酸、DNA、RNA或小分子和药物。有用的靶部分的另外的例子包括但决不限制于：转染剂，如Pro-Ject(PierceBiotechnology)；病毒肽片段，如transportans；形成孔的毒素，如链球菌溶血素O、疏水性的酯；聚阳离子，如多聚赖氨酸、脱唾液酸糖蛋白(asiaglycoproteins)和白喉毒素。
在一些实施方案中，将替代分析物-蛋白质的复合物或标记蛋白质固定于或连接于底物，如载体(solid support)或固体表面。载体可以是本领域普通技术人员已知的、可以在此处描述的分析系统中使用的任何材料。通常，该载体响应于所选择的检测系统(比如，当使用荧光体作为标记时的荧光)。适宜的载体包括诸如金的金属表面、玻璃和改性或功能化的玻璃、玻璃纤维、特氟隆、陶瓷、云母、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯和苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚酰亚胺、聚碳酸酯、聚氨酯、TeflonTM及其衍生物等等)、GETEK(聚丙烯氧化物和玻璃纤维的混合物)等，多糖、尼龙或硝化纤维、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃和多种其他的聚合物。在一些实施方案中，载体比如微孔板和珠(本文有时候称为微球)可以允许高通量的筛选。所述珠的成分将根据用途而改变。适宜的珠成分包括在肽、核酸以及有机部分的合成中使用的那些成分，其包括但不限于塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁性材料、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、胶乳或交联的右旋糖酐(如琼脂糖、纤维素、尼龙、交联的胶束和特氟隆均可使用)。
将分子偶联至载体的方法为本领域已知并且已广泛地用于制备亲和层析柱、ELISA测定板、载体结合的肽以及药物候选物文库和多核苷酸阵列。参见，例如，Sigel等人，FEBS LETT.147：45-48(1982)。可以使用不同的化学物质和方法中的任何一种来固定替代分析物或标记的蛋白质。替代分析物或标记蛋白质可以通过共价和/或非共价的相互作用而牢固地连接于固体底物。例如，替代分析物或标记蛋白质可以经由交联剂而共价地安置于载体的表面，所述交联剂的例子如戊二醛、硼氢化物或其他二官能剂。替代分析物或标记蛋白质还可以经由烷基氨-连接基团或聚合物连接体共价连接至底物。偶联的方法应基本上不影响靶和替代分析物或标记蛋白质之间的结合特异性和/或亲合力。
5.3.7测定
此处还提供的是用于检测样品中靶分析物存在或不存在的测定。待测样品可以是使用者所选择的任何适宜的样品。该样品可以是天然的或人工制造的。例如，该样品可以为血液样品、组织样品、细胞样品、口腔样品、皮肤样品、尿样品、水样品或土壤样品。该样品可以来自活体，比如真核生物、原核生物、哺乳动物、人、酵母或细菌。该样品可以为细胞、组织或器官。该样品可以在接触本发明教导的替代分析物-蛋白质的复合物或标记蛋白质之前，通过本领域已知的任何方法进行处理。例如，该样品可以经受细胞溶解步骤、沉淀步骤、柱色谱法步骤、加热步骤等。
所述测定包括将样品与含有此处描述的替代分析物-蛋白质的复合物或标记蛋白质的“报告系统”接触。在一些实施方案中，报告系统可以被包封。在其他实施方案中，报告系统可以连接于载体。
图3示出示例性的报告系统，其包括一个或多个替代分析物-蛋白质的复合物，每个替代分析物-蛋白质的复合物包括标记蛋白质(“报告物标记的抗体”)和替代分析物(“猝灭物标记的抗原”)，该替代分析物-蛋白质的复合物被包封在靶部分(“细胞膜转运物质”)可以连接的半渗透囊(中空壳)中。可以使用靶部分将包括报告系统的囊引入感兴趣的细胞中。如图3所示，替代分析物与标记抗体的结合猝灭了来自“报告物”的信号。图3中描绘的“报告物”可以包括此处描述的任何标记部分。进入囊中的一个或多个靶分析物可以置换一个或多个替代分析物，从而产生可测量的增强的荧光并且表明靶分析物存在。
所述测定通常包括将报告系统与含有一个或多个感兴趣的靶分析物的样品接触。在采用了两个或多个靶分析物的实施方案中，各标记蛋白质包括的报告系统可以相同，或者部分或全部的标记蛋白质均不相同。
此处教导的测定通常包括缓冲液的使用，比如在Sigma-Aldrich产品目录(2003)的“Biological Buffers(生物缓冲液)”部分中所描述的缓冲液。示例性的缓冲液包括磷酸钠、醋酸钠、PBS、MES、MOPS、HEPES、Tris(Trizma)、N，N-二羟乙基甘氨酸、TAPS、CAPS等。所述缓冲液以足够产生并维持期望pH和/或离子强度的量存在。可以根据结合活性的pH依赖性来选择结合缓冲液的pH。例如，pH可以为2至12、4至11、或6至10。所述缓冲液还可以含有结合所需的任何必要的辅因子或物质。此类辅因子和/或物质的身份和浓度将取决于特定的分析系统并且对于本领域技术人员是显而易见的。报告系统中存在的标记蛋白质的浓度可以完全改变。例如，测定缓冲液可以包括从约10-10至10-3的标记蛋白质。在一些实施方案中，测定缓冲液包括从约1pM至1μM的标记蛋白质。假设使用了多种不同类型的标记蛋白质，则每种标记蛋白质可以上述浓度范围包括在测定缓冲液中。
所述测定通常不需要存在清洁剂或其他的组分。通常，期望避免在反应化合物中使用高浓度的、能不利地影响反应产物荧光性能或者干扰靶分析物检测的组分。
可以使用常规的方法和仪器来监控荧光信号。例如，可以在实时持续监控状态使用本发明教导的替代分析物-蛋白质复合物，以使使用者快速地确定样品中是否存在分析物，并且(任选地)确定分析物的量或活性。在一些实施方案中，可以在至少两个不同的时间点测量荧光信号。在一些实施方案中，可以持续地或者在几个选定的时间点监测信号。可选地，在终点实施方案(其中所述信号是在一定的时间之后测量的)中测量荧光信号，并且将该信号与对照信号(无分析物的样品)、阈值信号或标准曲线进行对比。
产生的荧光信号的量并不是关键所在并且可以在较宽的范围内变动。唯一需要的是可以通过所使用的检测系统测量荧光。在一些实施方案中，替代分析物-蛋白质复合物一经解离即可产生比背景信号强至少2倍的荧光信号。在一些实施方案中，替代分析物-蛋白质复合物一经解离即可产生比背景信号强至少3倍的荧光信号。在一些实施方案中，替代分析物-蛋白质复合物一经解离即可产生比背景信号强至少4倍的荧光信号。在一些实施方案中，替代分析物-蛋白质复合物一经解离即可产生比背景信号强至少5倍的荧光信号。在一些实施方案中，替代分析物-蛋白质复合物一经解离即可产生比背景信号强2至10倍的荧光信号。
5.3.8试剂盒
还提供的是用于施行本发明教导的方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括含有靶部分、标记部分、反应性部分和可裂解的链的标记分子。在一些实施方案中，试剂盒包括用于制备促进蛋白质标记的反应混合物的缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒可进一步包括用于活化反应性部分和/或裂解可裂解的链的化学物质。这些其他的组分可以相互分开地提供或者以干燥形式或液体形式混合在一起。
在一些实施方案中，试剂盒包括用于检测靶分析物存在或不存在的替代分析物-蛋白质复合物。在一些实施方案中，试剂盒包括包封的替代分析物-蛋白质复合物。在一些实施方案中，试剂盒包括与载体连接的替代分析物-蛋白质复合物。在一些实施方案中，试剂盒包括与载体连接的替代分析物。在一些实施方案中，试剂盒包括与载体连接的标记蛋白质。
本文提及的所有出版物和专利申请通过引用结合入本文，如同具体单独说明每篇出版物或专利申请通过引用结合入本文。此处使用的章节标题仅用于组织内容的目的并且不应解释为以任何方式限制所描述的主题。尽管结合不同的实施方案描述了本教导，但是本教导不预期限于这样的实施方案。相反，如本领域技术人员所理解的，本教导包括各种改变、调整和等同替代。

Claims (62)

1.一种用于特异性标记蛋白质的标记分子，其包括：
(a)靶部分；
(b)标记部分；
(c)可活化的反应性部分；和
(d)连接所述靶部分至所述分子的可裂解的链，其中所述靶部分、标记部分和反应性部分相互连接以使所述靶部分可以结合所述蛋白质并且使所述反应性部分可以交联所述标记分子至所述蛋白质。
2.根据权利要求1所述的标记分子，其中所述蛋白质为抗体并且所述靶部分为抗原，所述抗原包括由所述抗体识别的表位。
3.根据权利要求2所述的标记分子，其具有下述结构：
TM-(L)n-CT-(L)n-LM-(L)n-RM
其中：
TM表示所述靶部分；
CT表示所述可裂解的链；
LM表示所述标记部分；
RM表示所述反应性部分；
L表示任选的连接体部分；以及
n为0至5的整数。
4.根据权利要求3所述的标记分子，其中所述标记部分包括荧光部分。
5.根据权利要求4所述的标记分子，其中所述荧光部分包括呫吨染料。
6.根据权利要求5所述的标记分子，其中所述呫吨染料选自荧光素染料和若丹明染料。
7.根据权利要求3所述的标记分子，其中所述标记部分包括猝灭部分。
8.根据权利要求7所述的标记分子，其中所述猝灭部分能够猝灭荧光部分的荧光。
9.根据权利要求3所述的标记分子，其中所述反应性部分是可特异性活化的。
10.根据权利要求9所述的标记分子，其中所述反应性部分为光活化的。
11.根据权利要求10所述的标记分子，其中所述反应性部分包括二苯甲酮。
12.根据权利要求3所述的标记分子，其中所述反应性部分经由所述连接体部分连接至所述标记部分。
13.根据权利要求12所述的标记分子，其中所述连接体部分包括一个或多个氮原子。
14.根据权利要求3所述的标记分子，其中所述可裂解的链包括与一个或多个连接体部分连接的裂解部分，所述裂解部分包括可以被化学裂解剂裂解的键。
15.根据权利要求14所述的标记分子，其中所述化学裂解剂为氟化物。
16.根据权利要求14所述的标记分子，其中所述可裂解的链具有下述结构：
(TE)nCM(TE)n
其中：
CM表示所述裂解部分；
TE表示任选的链单元；以及
n为0至5的整数。
17.根据权利要求16所述的标记分子，其中所述链单元是相同的。
18.根据权利要求16所述的标记分子，其中所述链单元是不同的。
19.根据权利要求16所述的标记分子，其中所述链单元包括具有2至25个碳原子的、取代或未取代的、饱和或不饱和的烃。
20.根据权利要求16所述的标记分子，其中所述链单元包括具有2至10个碳原子的、取代或未取代的、饱和或不饱和的烃。
21.根据权利要求19或20所述的标记分子，其中所述链单元为直链、支链或环状的饱和或不饱和的烷基。
22.根据权利要求21所述的标记分子，其中所述链单元为完全饱和的n-烷基。
23.根据权利要求19或20所述的标记分子，其进一步包括取代或未取代的杂原子。
24.根据权利要求16所述的标记分子，其中所述可裂解的部分包括下述结构：
其中：
R1和R2为烃；
TE表示任选的链单元；以及
n为0至5的整数。
25.根据权利要求1所述的标记分子，其中所述标记部分、反应性部分和靶部分经由多价的连接体相互连接。
26.一种能够结合分析物的蛋白质，其在紧邻所述分析物的结合位点被一个或多个标记部分特异性地标记，所述蛋白质在其他位置基本上是未标记的。
27.根据权利要求26所述的蛋白质，其为能够结合含有表位的抗原的抗体。
28.根据权利要求26所述的蛋白质，其中所述蛋白质由荧光部分标记。
29.根据权利要求28所述的蛋白质，其中所述荧光部分包括呫吨染料。
30.根据权利要求29所述的蛋白质，其中所述呫吨染料选自荧光素染料和若丹明染料。
31.根据权利要求26所述的蛋白质，其中所述标记部分包括猝灭部分。
32.根据权利要求31所述的蛋白质，其中所述猝灭部分能够猝灭荧光部分的荧光。
33.根据权利要求26所述的蛋白质，其结合至包括猝灭部分的替代抗原。
34.根据权利要求26所述的蛋白质，其结合至包括荧光部分的替代抗原。
35.根据权利要求33或34所述的蛋白质，其是被包封的。
36.根据权利要求33或34所述的蛋白质，其被包封在半渗透的毫微囊中。
37.根据权利要求36所述的蛋白质，其中所述毫微囊能透过所述分析物的分子并且不能透过所述抗体。
38.根据权利要求36所述的蛋白质，其中所述毫微囊的直径为10纳米至1000纳米。
39.根据权利要求36所述的蛋白质，其中所述毫微囊包括交联的水溶性烯类聚合物或共聚物。
40.根据权利要求36所述的蛋白质，其中所述毫微囊进一步包括细胞膜靶向部分。
41.根据权利要求26所述的蛋白质，其连接至载体。
42.根据权利要求27所述的蛋白质，其中所述抗体连接至载体。
43.根据权利要求33或34所述的蛋白质，其中所述替代抗原连接至载体。
44.一种制备感兴趣的标记蛋白质的方法，其包括：
(a)将所述蛋白质与标记分子接触，所述标记分子包括靶部分、标记部分、反应性部分以及与所述靶部分连接的可裂解的链，其中所述靶部分、标记部分和反应性部分相互连接，以便在所述蛋白质结合所述靶部分的条件下，使所述靶部分可以结合所述蛋白质并且使所述反应性部分可以将所述分子连接至所述蛋白质；
(b)活化所述反应性部分以便在所述反应性部分与所述蛋白质之间形成共价键；
(c)裂解所述可裂解的链；和
(d)从所述标记蛋白质的复合物除去所述裂解的靶部分。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述蛋白质为抗体并且所述靶部分为含有识别所述抗体的表位的抗原。
46.根据权利要求44所述的方法，其进一步包括从含有所述靶部分的裂解产物分离所述标记的抗体。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述标记部分包括荧光部分。
48.根据权利要求47所述的方法，其进一步包括将所述抗体与含有猝灭部分的替代抗原接触。
49.根据权利要求44所述的方法，其中所述标记部分包括猝灭部分。
50.根据权利要求49所述的方法，其进一步包括将所述抗体与含有荧光部分的替代抗原接触。
51.一种检测样品中靶分析物分子存在或不存在的方法，其包括：将所述样品与替代分析物-蛋白质复合物接触，所述复合物包括报告系统，所述报告系统在所述复合物解离时即能够产生可检测的比背景信号强至少3倍荧光信号，其中所述可检测的荧光信号的存在表明所述靶分析物存在于所述样品中。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述替代分析物-蛋白质复合物为含有替代抗原和抗体的替代抗原-抗体复合物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述替代抗原包括猝灭部分，且所述抗体包括荧光部分。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述替代抗原包括荧光部分，且所述抗体包括猝灭部分。
55.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述替代抗原-抗体复合物是被包封的。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述替代抗原-抗体复合物被包封在毫微囊中，所述毫微囊具有阻止所述复合物扩散出所述毫微囊并允许所述靶分析物分子扩散入所述毫微囊的渗透性。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述样品为活细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述毫微囊被定位于细胞膜。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述毫微囊被定位于细胞器。
60.根据权利要求56所述的方法，其中所述样品为组织或器官。
61.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述替代抗原-抗体复合物连接至载体。
62.一种根据权利要求1-61任一项所述的蛋白质的片段。
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