CN101138419A - 一种具有改善体力疲劳功能的保健食品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“一种具有改善体力疲劳功能的保健食品及其制备方法”，属于保健食品领域。本保健食品，主要由如下重量份的原料药制成：人参1－5份，刺五加6－10份，制淫羊藿1－5份。经过动物实验表明，本发明保健品可以明显缓解体力疲劳的功能，同时还能增强免疫力，用于易疲劳者和免疫力低下者，但不适用于少年儿童。

Description

一种具有改善体力疲劳功能的保健食品及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有改善体力疲劳功能的保健食品及其制备方法，属于保健食品领域。

背景技术

世界卫生组织认为：健康是一种身体、精神和交往上的完美状态，而不只是身体无病。根据这一定义，经过严格的统计学统计，人群中真正健康(第一状态)和患病者(第二状态)不足2/3，有1/3以上的人群处在健康和患病之间的过度状态，世界卫生组织称其为″第三状态″，国内常常称之为″亚健康″状态。″第三状态″状态处理得当，则身体可向健康转化；反之，则患病。因此，对亚健康状态的研究，是下个世纪生命科学研究的重要组成部分。

我们通常说患了疾病，但在古代″疾″与″病″含义不同。″疾″是指不易觉察的小病(疾)，如果不采取有效的措施，就会发展到可见的程度，便称为″病″。这种患疾的状态，现代科学叫″亚健康″或″第三状态″，在中医学中称″未病″。″未病″不是无病，也不是可见的大病，按中医观点而论是身体已经出现了阴阳、气血、脏腑营卫的不平衡状态。我们的祖先早就意识到，有了疾病除积极寻找除疾之法外，还积累了许多预防疾患的措施。《黄帝内经》有日：″圣人不治已病治未病，夫病已成而后药之，乱已成而后治之，譬犹渴而穿井，斗而铸兵，不亦晚乎？”由此可鲜明地看出我们的祖先已认识到对疾病应″未雨绸缨、防患未然″的重要。慢性疲劳综合征是美国疾病控制中心建议使用的一个疾病名称，是指健康人不明原因地出现严重的全身倦怠感，伴有低热、头痛、肌肉痛、抑郁、注意力不集中等精神症状，有时淋巴结肿大而影响正常生活的一种临床综合征。慢性疲劳综合征的病因目前尚不十分清楚。专家们初步研究认为与eb病毒的感染有关，专家们的研究仍在深入之中。

目前已经有很多的产品是关注与“亚健康”状态的，但就药品和保健品来讲，基本都是通过中医理论的“补肾壮阳”的手段，把一大堆中医认为的壮阳药堆积成一个复方，希望能同过“壮阳”的途径来改善人们的健康状况。这样一来，殊不知，中医对于疲劳的“疾”是有很多种分类的，不同的“疾”要分别对症下药，否则不能改善人体的疲劳状况，反而容易因治疗不当而延误病情。某些内服药包括传统的六味地黄丸、各种缓解体力疲劳的保健食品等，这些中药制剂的疗效、功能仍不能令人满意，甚至只是起到安慰剂的作用。因此，人们对效果更好的、真正具有缓解体力疲劳功能的保健食品，存在着大量的需求。

发明内容

本发明针对上述领域中的缺陷，提供一种更为有效的、具有缓解体力疲劳功能的保健食品，其组成均是经国家食品和药品监督管理局批准的可用于保健食品生产的药物，完全符合药食同源的理念标准，是一种绿色保健食品。

本发明的另外一个目的是提供了保健食品的制备方法。

一种具有改善体力疲劳功能的保健食品，主要由如下重量份的原料药制成：人参1-5份，刺五加6-10份，制淫羊藿1-5份。

优选：人参3份，刺五加9份，制淫羊藿3份。

其制备方法：1)按比例称取人参、刺五加2味原料药，用60％乙醇提取，回流3小时，提取两次，合并提取液真空浓缩得干浸膏1；

2)按比例称取制淫羊藿，用70％乙醇提取，回流3小时，将提取液真空浓缩得干浸膏2；

3)合并干浸膏1和干浸膏2，将其粉碎成200目粉，即为本发明的活性成分。

所述原料药中还含有菟丝子、韭菜子、车前子、茯苓、覆盆子。

其重量份为菟丝子2-8份、韭菜子2-8份、车前子1-5份、茯苓1-5份、覆盆子5-10份。

优选：菟丝子6份、韭菜子5份、车前子2份、茯苓3份、覆盆子8份。

其制备方法：1)按比例称取人参、刺五加2味原料，用60％乙醇提取，回流3小时，提取两次，合并提取液真空浓缩得干浸膏1；

2)按比例称取制淫羊藿，用70％乙醇提取，回流3小时，将提取液真空浓缩得干浸膏2；

3)按比例称取菟丝子、韭菜子、车前子、茯苓、覆盆子，用60％乙醇提取，回流3小时，提取两次，合并提取液真空浓缩得干浸膏3；

3)合并干浸膏1、2和3，将其粉碎成200目粉，即为本发明的活性成分。

所述浓缩后得到的干浸膏还需在50-60℃下干燥3小时。

所述保健食品的剂型软胶囊剂。

本发明人经过反复研究，并通过动物和临床试验的反复验证，终于找到了有更好效果的具有缓解体力疲劳功能的保健食品。本发明公开的具有改善体力疲劳功能的保健食品，其主要是由人参、刺五加、制淫羊藿按一定重量配比制备而成，其中以人参为君药，佐以刺五加、淫羊藿等。上述几种原料经过乙醇-水溶液提取得到的活性成分，经反复实验证实：人参可提高思维和机体活动能力，不但能加强神经系统的兴奋作用，也能增强其抑制过程，使抑制趋于集中，分化完全从而使兴奋和抑制两种神经过程得以平衡，提高人的智力和体力的劳动效率。同时，人体剧烈运动时，会产生过多的自由基，氧自由基可与细胞膜多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，导致细胞结构和功能的破坏。人参不仅能抑制羟自由基，也能抑制阴离子自由基，防止运动后自由基对肝组织的损伤，加快对疲劳的消除作用。用体外产生氧自由基方法，发现人参提取物可直接抑制红细胞中的的脂质过氧化作用。而且，大剂量运动易导致人体自由基清除能力下降。人参提取物在脂相和液相媒质中均能通过螯合某些金属离子，如Fe2+、Fe2+、Cu2+等可以清除自由基，有效地减轻脂质过氧化对DNA链及蛋白质分子的氧化损伤。人参皂甙促进组织对糖的利用，加速糖的氧化分解以供给充分的能量。在应激条件下则相对抑制糖原分解，使有效地利用脂肪酸为能量来源，起到节省肌糖原的作用。研究人参对大鼠游泳时白肌糖原含量的影响，结果表明人参制剂组的大鼠在游泳1h和3h后，白肌糖原虽然下降，但仍比对照组高，其下降率分别为39％和115％，人参组肝糖原一直保持较高水平，而对照组游泳1.5h减少38％、游泳3h减少58％。进一步实验证明，人参制剂使游泳30～60min大鼠的血糖显著升高。血清中糖酵解产物丙酮酸水平，人参组虽也升高，但其升高率远低于对照组。由此可见，人参能够使运动时的动物更有效的利用脂肪酸作为能量的来源，减少糖酵解和乳酸的堆积，这对增强耐力及抗疲劳十分有利。

刺五加药理作用是多样性的，如根的提取物对中枢神经系统有兴奋和抑制作用，有抗疲劳、抗应激、增强适应性、抗菌、防辐射、调节白细胞免疫及抗癌作用。服用刺五加制剂可降低定量负荷运动后的血乳酸值，增加机体有氧供能能力，有助于消除运动中积累的乳酸，促进运动后乳酸水平恢复正常，从而提高机体耐乳酸能力。刺五加制剂可使持续恒定负荷运动时脂肪对运动供能增加，可大量节省肌糖原，发挥抗疲劳作用。肌糖原的耗竭与疲劳密切相关，先期对脂肪的充分利用可以节省肌糖原，增加机体对肌糖原和肝糖原的贮备，通过调节机体的代谢，加强机体的适应能力，从而提高运动能力刺五加可使每搏摄氧量增加，有氧运动时较少的心脏跳动次数就可以维持同样强度负荷下机体对氧气的需求，可以发挥抗疲劳作用。而且由于有氧供能能力水平增高，相对无氧代谢比例减少，所负氧债较少，消除运动中积累的乳酸能力增加，这就促进了乳酸水平的恢复。试验表明对照组在力竭性运动后，血清LDH活力显著高于不运动组，服药组在力竭性运动后LDH活力有所上升，但与不运动组相比无显著差异；同时在力竭性运动中，服药组的LDH活力变化显著低于对照组。

淫羊藿来源于小檗科多年生植物淫羊藿属(Epimedium)的多种植物，为传统的补虚壮阳中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效。淫羊藿的有效成分均可抑制心肌收缩力，并能明显降低外周阻力，使左室输出量增加，减少心脏负荷，增加外周器官的灌注。实验研究证明，淫羊藿总黄酮能抑制兔离体右心房肌的肌力和心率，此作用无M受体激动效应和钙拮抗作用，能使异丙肾上腺素对心房肌的正性频率作用的量效曲线平行右移，具有对抗异丙肾上腺素加快大鼠心率的作用。实验还表明淫羊藿总黄酮是一种选择性肾上腺素岛受体阻断剂。淫羊藿煎剂对毒毛旋花子苷K及肾上腺素产生的豚鼠实验性心律不齐虽不能完全对抗，但可明显缩短心律不齐的持续时间，改善由于体力疲劳所带来的脑缺血和脑缺氧等不良影响。本发明采用的是淫羊藿的炮制品，其制备方法见药典，淫羊藿饮片经加热炮制后其活性成分淫羊藿苷均有不同程度的下降，说明加热可能促使淫羊藿苷分解，但有报道淫羊藿经油炙后其对性机能的作用明显增强，提示淫羊藿苷可能不是淫羊藿中唯一助阳成分。其有效活性部位总黄酮经炮制后对其含量影响不大，提示在加工炮制过程中，可能部分苷产生分解或转化为其他黄酮类成分，因而其总有效组分变化不大人参属五加科植物人参(Panax ginseng)C.A.Mey.的根。亦名鬼盖(《本经》)、血参(《吴普本草》)、孩儿参(《本草纲目》)。栽培的称“园参”，播种在山林野生状态下自然生长的又称林下参，习称“籽海”。园参经晒干或烘干，称“生晒参”蒸制后干燥，称“红参”。味甘、微苦，性温。归脾、肺经。功能：大补元气、固脱生津、安神。主治：劳伤虚损、食少、倦怠、反胃吐食、大便滑泄、虚咳喘促、自汗暴脱、惊悸、健忘、眩晕头痛、阳痿、尿频、消渴、妇女崩漏、小儿慢惊及久虚不复，一切气血津液不足之证。人参中含有多种生理活性成分，其中人参皂苷是人参中主要功效成分。我们试验中采用20％乙醇提取物制成的人参和西洋参粉剂，研究了二者在抗缺氧、抗疲劳、抗低温应激反应方面的异同。结果表明：西洋参在抗缺氧、抗低温应激反应方面优于人参；人参在抗疲劳方面强于西洋参。以人参冲剂对小鼠抗疲劳保健功能的观察，也发现人参可明显提高小鼠抗疲劳能力。

从人参中提取有效成分人参总皂苷(TSPG)，测定它对小白鼠密闭缺氧存活时间、血红蛋白含量、小白鼠不同组织中乳酸含量以及L-乳酸脱氢酶活性的影响，分析其耐缺氧效应，为预防或降低高原反应发生率，提高高原部队的战斗力提供科学依据。结果表明：人参总皂苷可以显著延长小鼠的耐缺氧时间。以添加人参提取物的饲料饲喂小鼠，然后进行密闭缺氧实验和游泳抗疲劳实验，结果显示：人参提取物可明显延长小鼠存活时间和持续、力竭游泳时间，从而表明人参可有效提高小鼠的耐缺氧能力和抗疲劳能力。

刺五加为五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干燥根及茎。春、秋二季采挖，洗净，干燥。益气健脾，补肾安神。用于脾肾阳虚，体虚乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多梦。刺五加中含刺五加苷A(eleutheroside)、刺五加苷B(紫丁香苷syringin)、刺五加苷B1(6，8-二甲氧基香豆素-7-葡萄糖苷)、刺五加苷F(乙基半乳糖苷)、刺五加苷D和E(为二种不同构型的紫丁香树脂酚的葡萄糖苷)等。此外，尚含多糖及1-芝麻脂素(1-sesamin)。

我们通过研究刺五加总苷抗疲劳作用机制来测试刺五加的缓解体力疲劳功能。以竭力游泳时间为指标测定小鼠运动耐力；利用乳酸脱氢酶(LDH)活力及血乳酸(LAC)、血尿素氮(BUN)、肌糖原和肝糖原试剂盒检测上述各项生化指标，观察刺五加总苷不同剂量的抗疲劳作用及其作用机制。结果表明，刺五加总苷各剂量组均能显著延长小鼠负重游泳时间(P＜0.05或P＜0.01)，提高小鼠运动耐力；显著提高游泳后小鼠血清LDH活力以及小鼠体内肌糖原和肝糖原的储备量(P＜0.05或P＜0.01)，显著降低小鼠全血LAC和血清BUN的含量(P＜0.05或P＜0.01)。所以刺五加总苷在增强肌体运动耐力，抵抗疲劳产生和加速疲劳消除等方面具有显著作用，这就是其抗疲劳的主要作用机制。

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿Epimedium grandiflorum Morr、心叶淫羊藿Epimediumbrevicornum、或箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc.)的茎叶。亦名仙灵脾《雷公炮炙论》等。味辛、甘，性温。入肝、肾经。功能：补肾壮阳、祛风除湿。主治：阳痿不举、小便淋沥、筋骨挛急、半身不遂、腰膝无力、风湿痹痛、四肢不仁。制淫羊藿为淫羊藿的炮制品，采用炒制法。淫羊藿的叶和茎中含淫羊藿苷(icariin)、淫羊藿次苷(icariside)、去氧甲基淫羊藿苷(des-O-methylicariin)、β-去水淫羊藿素(β-anhy-edoicaritin)、淫羊藿糖苷(epime-doside)A、B、C、D、E。

为了达到更好的效果，本发明药物中还加入菟丝子、韭菜子、车前子、茯苓、覆盆子。

菟丝子是一种名贵的药用植物，属旋花科一年生寄生草本植物，多寄生于豆科、菊科、藜科等植物；现在的植物学通常把茎叶和果实统称为菟丝子。在古代菟丝子为补阳类药材，其味“辛、甘、平、无毒”，据《本草纲目》记载：菟丝子果实具有以下药用价值：续绝伤，补不足益气力，肥健人，养肌强阴，坚筋骨，主茎中寒，精白出，溺有余沥，口苦燥渴，寒血为积，久服明目轻身延年，治男女虚冷，添精益髓，经现代医学临床证明：菟丝予对精子的运动能力和膜功能有促进作用，可提高动物的免疫系统功能，具有抗氧化和抗突变作用，还有明显促进神经生长的作用。

韭菜子为百合科植物非菜Allium tuberosum Rottl.的种子【化学成分】：含硫化物、甙类、维生素C等。【性味】性温，味辛、甘。【功能主治】：补肝肾，暖腰膝，助阳，固精。用于阳痿、遗精、遗尿小便频数、腰膝酸软、冷痛、白带过多。

车前子为车前科植物前Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressa Willd.的干燥成熟种子。【性味与归经】甘，微寒。归肝、肾、肺、小肠经。【功能与主治】清热利尿，渗湿通淋，明目，祛痰。用于水肿胀满，热淋涩痛，暑湿泄泻，目赤肿痛，痰热咳嗽。

茯苓，又名云苓、松苓、茯灵，为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，多寄生于马尾松或赤松的根部。主要含B-茯苓聚糖、茯苓酸、卵磷脂及甾醇等。[药性]甘、淡、平、归肺、胃、肾经。[药效]败毒抗癌、利水化饮、健脾宁心。利水渗湿，健脾，化痰，宁心安神。[药理]1：利尿作用。2：镇静作用，茯苓煎剂对小鼠腹腔注射，可以抑制自发活动，并能对抗咖啡因所致小鼠兴奋过度，对巴比妥的麻醉有协同作用。3：心血管系统乙醇提取物使心肌收缩力加强，心率增加。4：消化系统茯苓对于四氯化碳所引起的小鼠肝损伤，有明显的保护作用。5：抗肿瘤作用茯苓多糖对小鼠肉瘤有抑制作用，其作用与胸腺有关，可激活局部补体。(1)在体内具抗癌活性，并能促进人体的免疫功能；所含茯苓聚糖对肉瘤S-180的抑制效率可达96.88％。(2)浸剂对正常兔作腹腔注射有利尿作用；乙醚或乙醇提取物能使离体蛙心收缩加强，对家兔血糖则先使升高而后降低。(3)茯神煎剂对小鼠有镇静作用，茯苓的镇静作用次于茯神。

覆盆子，别名种田泡、翁扭、牛奶母。来源：为蔷薇科植物华东覆盆子Rubus chingii Hu的果实。化学成分含有机酸、糖类、逆没食子酸(ellagic acid)、B-谷甾醇等。性味性温，味甘、酸。功能主治益肾，固精，缩尿。用于肾虚遗尿、小便频数、阳痿早泄、遗精滑精。

菟丝子、韭菜子、车前子、茯苓、覆盆子五味均为中华人民共和国卫生部颁布的“食药同源”物品，无毒副作用，且有一定的补益作用。

菟丝子属旋花科一年生寄生草本植物，多寄生于豆科、菊科、藜科等植物。据《本草纲目》记载：菟丝子果实具有以下药用价值：续绝伤，补不足益气力，肥健人，养肌强阴，坚筋骨，主茎中寒，精白出，溺有余沥，口苦燥渴，寒血为积，久服明目轻身延年，治男女虚冷，添精益髓，去腰痛膝冷。现代药理研究证实：菟丝子浸提物具有壮阳、调节内分泌，抗衰老等活性，经现代医学临床证明：菟丝予对精子的运动能力和膜功能有促进作用，可提高动物的免疫系统功能，具有抗氧化和抗突变作用，还有明显促进神经生长的作用。

车前子是车前草科植物车前或平车前的种子。车前草的根、叶和种子均可入药，《神农本草经》把它列为药中的上品。车前子性味甘寒.可利水、清热、明目、祛痰。中医常用它来治疗水肿胀满，热淋涩痛.暑湿泄泻，目赤肿痛痰热咳嗽等症。本方所采用车前子，以及后面所提及的“茯苓”均为了平抑阴阳，以防止人参、菟丝子等带来的火燥之功效。

本发明所用药物均采用乙醇-水溶液进行提取，回流的温度低于100℃，使药物中的有效成分不易因高温而发生变化，同时在浓缩时采用真空浓缩，即减压浓缩，使提取液中的有效成分不受高温影响，避免了某些对热不稳定的有效成分的破坏和损失，更好地保存了原料的营养成分和香气。浓缩后得到的干浸膏需在50-60℃下干燥3小时，才能彻底干燥。

经过动物实验表明，本发明保健品可以明显缓解体力疲劳的功能，同时还能增强免疫力，用于易疲劳者和免疫力低下者，但不适用于少年儿童。

本发明所制得的干浸膏活性组分可以加入制备不同剂型时所需的各种常规辅料，如崩解剂、润滑剂、粘合剂等，以常规的中药制剂方法制备成任何一种常用口服剂型，如丸剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液等，本发明采用软胶囊剂型，将干浸膏粉与食用玉米调和油1∶1.2混合均匀，并加入浸膏粉重量的2％的蜂蜡，装入胶囊。是因为考虑到现代人的生活节奏比较快，采用软胶囊制剂的优点就是：携带方便、吸收迅速，这是一种比较现代化的有一定技术含量的现代制剂类型。

具体实施方式

以下通过试验例来进一步阐述本发明所述功能性保健食品的有效效果，这些试验例包括了本发明功能性保健食品软胶囊(以下简称软胶囊)的功能学试验和安全性毒理学试验。

实施例1

原料配料：人参5000g，刺五加6000g，制淫羊藿1000g，菟丝子3000g、韭菜子6000g、车前子3000g、茯苓2000g、覆盆子8000g。

1)称取人参、刺五加2味原料药，用60％乙醇提取，用量以没过药物为准，回流3小时，倒入提取液，加入60％乙醇再提取一次，合并提取液真空浓缩得干浸膏1；

2)称取制淫羊藿，用70％乙醇提取，回流3小时，将提取液真空浓缩得干浸膏2；

3)称取菟丝子、韭菜子、车前子、茯苓、覆盆子用60％乙醇提取，回流3小时，倒入提取液，加入60％乙醇再提取一次，合并提取液真空浓缩得干浸膏3；

4)合并干浸膏1、干浸膏2和干浸膏3，于50-60℃干燥3小时，将其粉碎成200目粉，即为本发明的活性成分，共3420g，调合后，灌装入胶囊壳。

实施例2

原料配料：人参1000g，刺五加7000g，制淫羊藿5000g，菟丝子2000g、韭菜子8000g、车前子5000g、茯苓1000g、覆盆子5000g。

1)称取人参、刺五加2味原料药，用60％乙醇提取，用量以没过药物为准，回流3小时，倒入提取液，加入60％乙醇再提取一次，合并提取液真空浓缩得干浸膏1；

2)称取制淫羊藿，用70％乙醇提取，回流3小时，将提取液真空浓缩得干浸膏2；

3)称取菟丝子、韭菜子、车前子、茯苓、覆盆子用60％乙醇提取，回流3小时，倒入提取液，加入60％乙醇再提取一次，合并提取液真空浓缩得干浸膏3；

4)合并干浸膏1、干浸膏2和干浸膏3，于50-60℃干燥3小时，将其粉碎成200目粉，即为本发明的活性成分，共3420g，调合后，灌装入胶囊壳。

实施例3

原料配料：人参3000g，刺五加9000g，制淫羊藿3000g，菟丝子6000g、韭菜子5000g、车前子2000g、茯苓3000g、覆盆子8000g。

1)称取人参、刺五加2味原料药，用60％乙醇提取，用量以没过药物为准，回流3小时，倒入提取液，加入60％乙醇再提取一次，合并提取液真空浓缩得干浸膏1；

2)称取制淫羊藿，用70％乙醇提取，回流3小时，将提取液真空浓缩得干浸膏2；

3)称取菟丝子、韭菜子、车前子、茯苓、覆盆子用60％乙醇提取，回流3小时，倒入提取液，加入60％乙醇再提取一次，合并提取液真空浓缩得干浸膏3；

3)合并干浸膏1、干浸膏2和干浸膏3，于50-60℃干燥3小时，将其粉碎成200目粉，即为本发明的活性成分，共4012g，调合后，灌装入胶囊壳。

实施例4

原料配料：人参2000g，刺五加10000g，制淫羊藿2000g，菟丝子8000g、韭菜子2000g、车前子1000g、茯苓5000g、覆盆子10000g。

1)称取人参、刺五加2味原料药，用60％乙醇提取，用量以没过药物为准，回流3小时，倒入提取液，加入60％乙醇再提取一次，合并提取液真空浓缩得干浸膏1；

2)称取制淫羊藿，用70％乙醇提取，回流3小时，将提取液真空浓缩得干浸膏2；

3)称取菟丝子、韭菜子、车前子、茯苓、覆盆子用60％乙醇提取，回流3小时，倒入提取液，加入60％乙醇再提取一次，合并提取液真空浓缩得干浸膏3；

3)合并干浸膏1、干浸膏2和干浸膏3，于50-60℃干燥3小时，将其粉碎成200目粉，即为

本发明的活性成分，共4150g调合后，，灌装入胶囊壳。

实验例1：功能学试验得出缓解体力疲劳结果：(《保健食品检验与评价技术规范》中华人民共和国卫生部2003版)

1.1、材料

1.1.1试物：成人推荐量每日700mg/d。按成人60kg体重计，即12mg/(kg体重)。

1.1.2试验动物：清洁级BALB/c小鼠，雄性，200只，18～22g，购自湖北省实验动物研究中心，合格证号为医动字第2006-0806号。

1.1.3剂量选择：试验设三个剂量组：10倍人体摄入量[0.33g/(kg体重)]组、20倍人体摄入量[0.67g/(kg体重)]组和对照组。小鼠灌胃体积为0.2ml/10g体重。采用实施例3制得的胶囊剂。

1.1.4主要仪器与试剂：5mm直径打孔器、显微镜、微量血凝试验板、离心机、酶标仪、96孔培养板、5％CO₂培养箱、200目筛网、注射用墨汁、刀豆蛋白A(ConA)、MTT、DNFB、丙酮、麻油、脱毛剂、SPBS、生理盐水、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液、YAC-1细胞、Hanks液(pH7.2～7.4)、RPMI 1640完全培养液、乳酸锂、碘硝基氯化四氮唑(INT)、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、NAD、Tris-HCI缓冲液(pH8.2)1％NP40、台盼兰、1mol/L盐酸等。

1.2实验方法

1.2.1碳廓清实验和脏器/体重比值测定：实验部骤：小鼠称重后，按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁(100mL/kg)，注入墨汁后2、10min，分别从侧静脉丛取血20uL，并立即将其加到2mL0.1％Na₂CO₃溶液中。用721分光光度计在600nm处测光密度值(OD)，以Na₂CO₃溶液做空白对照。将小鼠处死，解剖动物，取出肝脏、脾脏、及胸腺，用滤纸吸干血迹后称重。

1.2.2迟发型变态反应(DTH)：小鼠连续灌胃30d后，每鼠腹部皮肤用脱毛剂进行脱毛处理，范围约3cm×3cm，后用DNFB溶液50uL均匀涂抹致敏；5d后，再用DNFB溶液10uL均匀涂抹于小鼠右耳两面，进行攻击；24h后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右两耳，用打孔器取下直径5mn的耳片称重。

1.2.3半数溶血值(HC50)的测定和抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)：小鼠连续灌胃30d后，每只腹腔注射2％(体积分数)SRBC的细胞悬液0.2mL进行免疫。5d后，取小鼠血及脾脏分别做半数溶血值(HC50)的测定和抗体生成细胞检测。

1.2.3.1半数溶血值(HC50)的测定：将小鼠摘除眼球取血于离心管中，放置约1h，使血清析出，2000r/min离心10min，收集血清。用生理盐水稀释血清(300倍)，将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10％(体积分数)SRBC0.5mL，补体1mL(用生理盐水按1∶10稀释)，另设不加血清的对照管(以生理盐水代替)，置37℃恒温水浴中保温15～30min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清液1mL，加都氏试剂3mL于试管内，同时取10％(体积分数)SRBC0.25mL加都氏试剂至4mL，于另一支试管内，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。

1.2.3.2抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)：取SRBC免疫5d后的小鼠脾脏，放在盛有Hanks液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，经200止筛网过滤，制成单细胞悬液。离心10min(1000r/min)，用Hanks液洗两次，将细胞悬浮于5mL RPMI 1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/mL。将表层培养基加热溶解后，与等量PH7.2～7.4、2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50uL10％SRBC，20UL脾细胞县液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，等琼脂凝固后，将玻片扣放在片架上，放入CO2培养箱中孵育1～1.5h后，计数溶血空斑数。

1.2.4小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)：小鼠连续灌胃30d后，每鼠腹腔注射2％鸡红细胞悬液1mL。30min后，颈椎脱臼处死动物，仰位固定于蜡板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，于37℃孵箱温育30min.孵毕，在生理盐水中漂洗，除去未贴片细胞.晾干，以1∶1丙酮甲溶液固定20min，4％(体积分数)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗凉干，于显微镜下计数巨噬细胞。

1.2.5ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验和小鼠NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)：小鼠连续灌胃30d后，颈椎脱臼处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，经200目筛网过滤，制成单细胞悬液，将细胞悬液分为两部分，分别于ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验和小鼠NK细胞活性测定。

1.2.5.1ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验：用Hanks液洗涤细胞悬液2次，每次离心10min(1000r/min)，然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，台盼兰染色计数活细胞数(在95％以上)，调整细胞浓度为3×106个/mL。将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75uLConA液，另一孔作为对照，置培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含血清的RRMI 1640培养液，同时加入MTT 50uL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板，每孔做3个平行孔，用酶标仪以570nm波长测定光密度值。

1.2.5.2小鼠NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)：试验前24h将靶细胞传代培养，应用前以Hanks液洗3次，用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。用Hanks液洗脾细胞悬液2次，每次离心10min(1000r/min)。弃上清液后，加入0.5mL灭菌水20S，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hanks液及8mLHanks液，离心10min(1000r/min)，用1mL完全培养基重悬，用1％冰醋酸稀释后计数，台盼兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为2×107个/mL。取靶细胞和效应细胞各100mL。uL(效靶比50∶1)，加入96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和1％NP40各100mL，上述各项均设三个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，然后将培养板离心(1500培养液各100mL、靶细胞最大释放孔加靶细胞和养板离心(1500r/min)5min，每孔吸取上清液100uL置96孔养板中，同时加入LDH基持液100uL，反应3min，每孔加入1mol/L的HCI 30uL，在酶标仪490nm处测定光密度值。实验数据统计：实验所得数据采用SAS软件进行分析。

1.3.结果

1.3.1本发明保健食品软胶囊对小鼠体重的影响，结果见表1至表5

表1碳廓清试验和脏器/体重试验前后动物体重记录

组别与剂量/[g(kg体重)]    动物数/只    体重/g    增重/g

                                  试验前    试验后

对照组                  10      18.5±1.3      22.1±1.2      3.6±0.3

0.33                    10      18.5±1.4      21.6±1.5      3.1±0.9

0.67                    10      18.6±1.4      22.0±1.4      3.4±0.9

1.00                    10      18.6±1.4      21.7±1.4      3.1±0.5

表2DTH试验前后动物体重记录

组别与剂量/[g(kg体重)]    动物数/只     体重/g                增重/g

                                        试验前     试验后

对照组                    10            18.5±1.4  22.1±1.5  3.6±1.0

0.33                      10            18.6±1.4  21.7±1.3  3.1±1.0

0.67                      10            18.7±1.3  22.0±1.6  3.3±1.0

1.00                      10            18.6±1.4  21.8±1.7  3.2±0.9

表3半数溶血值(HC50)试验和抗体生成细胞实验前后动物体重记录

组别与剂量/[g(kg体重)]    动物数/只    体重/g                增重/g

                                       试验前     试验后

对照组                    10           18.5±1.3  22.2±1.7  3.5±0.9

0.33                      10           18.6±1.4  22.0±1.8  3.6±1.0

0.67                      10           18.6±1.4  21.6±1.6  3.0±0.7

1.00                      10           18.7±1.3  21.8±1.5  3.1±0.8

表4吞噬试验前后动物体重记录

组别与剂量/[g(kg体重)]    动物数/只     体重/g                增重/g

                                        试验前     试验后

对照组                    10            18.6±1.4  21.9±1.8  3.3±0.6

0.33                      10            18.6±1.4  21.7±1.2  3.1±1.0

0.67                      10            18.6±1.4  21.9±1.2  3.2±0.7

1.00                      10            18.6±1.4  21.7±1.4  3.1±0.7

表5小鼠脾淋巴细胞转化试验和小鼠NK细胞活性实验前后动物体重记录

组别与剂量    动物数/只    体重/g                增重/g

/[g(kg体重)]               试验前     试验后

对照组            10       18.7±1.3  21.9±1.9  3.2±0.9

0.33              10       18.6±1.4  21.7±1.6  3.1±0.8

0.67              10       18.6±1.4  21.7±1.8  3.1±0.6

1.00              10       18.7±1.6  21.7±1.4  2.6±0.7

经方差分析，三个课题组与对照组之间各试验前、后，体重以及增重均无显著性差异，P＞0.05。

1.3.2本发明保健食品软胶囊对小鼠脏器/体重比的影响，结果见表6。

表6软胶囊对小鼠脏器/体重比的影响

组别与剂量/[g/(kg.体重)]    动物数/只    脾脏/体重比值/(mg/g)    胸腺/体重比值/(mg/g)

对照组                      10           4.97±0.56              1.56±0.31

0.33                        10           5.30±0.88              1.67±0.37

0.67                        10           5.21±0.65              1.66±0.30

1.00                        10           5.27±0.83              1.97±0.28※

注：※表明与对照组比较，P＜0.05

脾脏/体重比值经方差分析，F＝0.40，P＞0.05。胸腺/体重比值经方差分析，F＝3.20，P＜0.05。Q检验，人体推荐量的30倍剂量组与对照组比较，有显著性差异，P＜0.05。

1.3.3本发明保健食品软胶囊对小鼠细胞免疫功能[小鼠脾淋巴细胞转化实验以及小鼠迟发型变态反应(DTH)]的影响，见表7。

表7本发明保健食品软胶囊对小鼠免疫功能的影响

组别与剂量/[g/(kg.体重)]    动物数/只    ConA诱导脾淋巴细胞增殖    DNFB诱导    DTH

                                         CD差值                    耳肿程度/mg

对照组                      10           0.069±0.008              6.69±1.73

0.33                        10           0.079±0.013              7.13±0.98

0.67                        10           0.081±0.010              7.27±1.91

1.00                        10           0.082±0.009              8.87±1.74※

注：※表明与对照组比较P＜0.05

淋巴细胞增殖试验的OD差值经方差分析，F＝2.86，P＜0.05。Q检验，人体推荐量的三个剂量组与对照组比较，P＜0.05，有显著性差异。耳肿程度经方差分析，F＝3.42，P＜0.05。Q检验，人体推荐量的30倍剂量组与对照组比较，P＜0.05，有显著性差异。

1.3.4本发明保健食品软胶囊对小鼠体液免疫功能(抗体生成细胞测定以及小鼠半数溶血值测定)的影响，见表8。

表8本发明保健食品软胶囊对小鼠体液免疫功能的影响

组别与剂量/[g(kg体重)]   动物数/只     抗体生成细胞检测(溶血空斑数    半数溶血值(HC50)

                                       /106细胞

对照组                   10            264±60                        155.08±9.88

0.33                     10            356±66※                      159.02±7.83

0.67                     10            343±78※                      156.59±8.08

1.00                     10            348±54※                      169.56±11.23※※

注：※表明与对照组比较P＜0.05，※※表明与对照组相比较，P＜0.01

溶血空斑数经方差分析，F＝4.33，P＜0.05。Q检验，三个剂量组与对照组相比较，有显著性差异，P＜0.05；HC50经方差分析，F＝4.88，P＜0.01。Q检验，30倍剂量组与对照组相比较，有极显著性差异，P＜0.01。

1.3.5本发明保健食品软胶囊对小鼠单核-巨噬细胞功能(小鼠碳廓清试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力)的影响，见表9。

表9本发明保健食品软胶囊对小鼠单核-巨噬细胞功能的影响

组别与剂量    动物数/只    小鼠碳廓清试验    小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力

/[g(kg体重)]               吞噬指数          吞噬率/％                吞噬指数

对照组        10           3.72±0.42        23.1±4.8                0.35±0.05

0.33          10           3.65±0.48        28.6±6.1                0.40±0.05

0.67          10           4.01±0.32        27.8±5.6                0.40±0.05

1.00          10           4.19±0.45※      26.4±5.6                0.44±0.06※

注：※表明与对照组比较，P＜0.05

小鼠碳廓清试验吞噬指数经方差分析，F＝4.65，P＜0.05。Q检验30倍剂量组与对照组相比较，P＜0.05，有显著差异。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率经方差分析，F＝1.94，P＞0.05。吞噬指数经方差分析，F＝3.16，P＜0.05。Q检验，30倍剂量组与对照组相比较，P＜0.05，有显著差异。

1.3.6软胶囊对小鼠N K细胞活性的影响，见表10。

表10软胶囊对小鼠NK细胞活性的影响

组别与剂量/[g(kg体重)]    动物数/只    NK细胞活性/％

对照组                    10           27.29±7.76

0.33                      10           31.18±5.23

0.67                      10           34.08±8.81

1.00                      10           37.71±5.45※

注：※表明与对照组比较，P＜0.05

经方差分析，F＝4.14.P＜0.05。Q检验30倍剂量组与对照组相比较，P＜0.05，有显著差异。

1.4结论

(1)软胶囊三个剂量组均未见对动物体重及体重增长有明显的影响。

(2)软胶囊人体推荐量的30倍剂量组的胸腺/体重比值对照组比较，有显著性差异。

(3)小鼠细胞免疫功能试验表明，在脾淋巴细胞转化实现中，软胶囊人体推荐量的三个剂量组OD差值显著高于对照组，呈阳性结果；迟发型变态反应实验表明，耳肿程度与对照组比较，30倍剂量组差异显著，呈阳性结果。

(4)小鼠体液免疫功能实验表明，在抗体生成细胞实验中，与对照组相比，软胶囊三个剂量组脾细胞溶血空斑数显著升高，呈阳性结果；小鼠半数溶血值测定表明，30倍剂量组的HC50值与对照组比较有极显著差异，呈阳性结果。

(5)小鼠单核-巨噬细胞功能试验结果表明，在小鼠碳廓清试验中，软胶囊30倍剂量组的吞噬指数显著高于对照组，呈阳性结果；小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验表明，30倍剂量组的吞噬指数显著高于对照组，呈阳性结果。

(6)NK细胞活性测定实验表明，与对照组比较，软胶囊30倍剂量组NK细胞的活性显著升高，呈阳性结果。

根据《保健食品检验与评价技术规范》(中华人民共和国卫生部2003版)中有关“缓解体力疲劳的功能学评价方法，由以上结果判定该软胶囊具有缓解体力疲劳的功能和增强免疫力的功能。

实验例2：安全性毒理学试验结果：

2.1材料

2.1.1样品人体推荐摄入量为5.6g/(人、d)，相当于0.1k/(kg体重、d)(人体质量以60kg计).胶囊内容物为受试样品，用蒸馏水配制成所需尝试的灌胃液。采用实施例4制得的胶囊剂。

2.1.2试验动物ICR种小鼠，断乳SD大鼠，清洁级，由北京市医学动物实验中心提供.

动物合格证号：京医试0608.使用许可证号：BJVS 0805。

2.2方法

2.2.1急性毒性试验雌、雄小鼠各20只，18～22g。采用霍恩氏(Horm)法，按体重随机分为4组，每组雌、雄各5只，分别为1000mg/kg、4640mg/kg、10000mg/kg组.胶囊内容物为受试样品，用蒸馏水配制成所需浓度的灌胃液。具体配制方法如下：称取10.0g本发明软胶囊内容物，加蒸馏水定容至40mL，即0.5g/mL，此为高剂量组；其它三个剂量组以此类推配制。动物禁食(不禁饮水)16h后，以0.4mL/20g体重的容量灌胃给予受试物，然后观察7d。

2.2.2遗传毒性试验

2.2.2.1Ames试验T A97a、T A98、T A100、T A102标准菌株和S9来源于北京市疾病预防控制中心，经鉴定符合试验要求.采用常规平板掺入法，试验剂量分别设置为8ug/皿、40ug/皿、200ug/皿、1000ug/皿、5000ug/皿。具体配制方法如下：取样品5.00g加蒸馏水至100mL，为5000ug/皿剂量，取此液5mL加蒸馏水定容至25mL，为1000ug/皿剂量，以下三个剂量以此类推配制.样品溶液用无菌抽滤法除菌后，分别在顶层琼脂中加入0.1mL试验菌株增菌液、0.1mL受试物溶液用0.5mL S9混合液(需要代谢活化时)混合后倒入底层培养基平板上。同时做未处理对照，溶剂对照和阳性对照(T A97a[-S9]：500ug/皿阿的平；T A98[-S9]；6.0ug/皿正定毒素；T A100[-S9]和T A021[-S9]：1.0ug/皿甲基磺酸甲酯；T A97a[+S9]、T A98[+S9]及T A100[+S9]：10.0ug/皿2-氨基芴；T A102[+S9]：50.0ug/皿1.8-二羟基蒽醌).整套试验在相同条件下重复再次。

2.2.2.2骨髓细胞微核试验雌、雄小鼠各25只，25～30g。按体重随机分为5组，阴性对照组(蒸馏水)、本发明软胶囊2500mg/(kg体重/d)、500mg/(kg体重/d)、和10000mg/(kg体重/d)组，阳性对照[环磷酰胺40mg/(kg体重/d)]组，雌、雄各5只.以0.4mL/20g体重2次灌胃(间隔24h)，第二次灌胃后6h取胸骨制片镜检。

2.2.2.3小鼠精子畸形试验雄性小鼠25只，25～35g。按体重随机分为5级，阴性对照组(蒸馏水)、本发明软胶囊2500mg/(kg体重/d)、500mg/(kg体重/d)、和10000mg/(kg体重/d)组阳性对照[环磷酰胺40mg/(kg体重/d)]组，雌、雄各5只.以0.4mL/20g体重灌胃，连续5d，每天1次，于首次灌胃后第35d取双侧副睾制片镜检.

2.2.3 30天喂养试验

2.2.3.1动物及分组断乳SD大鼠80只，按体重随机分为4组，每组雌雄各10只.受试物经饮料掺入给予。设：正常对照组：给予全价营养配合饮料；本发明软胶囊三个剂量组，低剂量组：5.0g/(kg体重/d)(相当于推荐剂量的50倍)，即1kg饲料含本发明软胶囊50.0g；中剂量组：7.5g/(kg体重/d)(相当于推荐剂量的75倍)，即1kg饲料含本发明软胶囊75.0g；高剂量组：10.0g/(kg体重/d)(相当于推荐剂量的100倍)，即1kg饲料含本发明软胶囊100.0g。动物单笼饲养，自由摄水，连续观察30d，结果喂养.

2.2.3.2观察指标

2.2.3.2.1一般情况每天观察动物一次。

2.2.3.2.2体重生长状况每周称重一次。

2.2.3.2.3饲料消耗及利用率每周加饲料二次，称重记录；并记录散失的饲料量.

2.2.3.2.4血液学检查于试验第30d，股动脉取血进行血红蛋白测定，红细胞、白细胞、血小板、网织红细胞计数及白细胞分类测定。

2.2.3.2.5血液生化学检查于试验第30d，股动脉取血，分离血清，使用日立-7150全自动生化分析仪进行总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、肌酐(CR)、尿素氮(BUN)、胆固醇(T-CHE)及甘油三酯(TG)测定.

2.2.3.2.6脏器重量及病理组织学检查试验结束，大采用股动脉放血处死，立即解剖进行大体检查；称取肝、脾、双侧肾和睾丸，分别计算脏体比；以甲醛液固定肝、肾、胃、十二指肠、卵巢、睾丸。石蜡包埋切片，H.F染色进行病理组织学检查.

2.2.3.2.7数据统计处理方法实验所得数据用SAS6.12软件进行多组间的分析比较。

2.3结果

2.3.1急性毒性试验

本发明软胶囊急性毒性试验小鼠存活情况风表11小鼠经口LD50＞10.0g/(kg体重/d)。在观察期内动物活动、进食、行为等未见异常，根据LD50剂量分级标准，该样品属实际无毒级。

表11本发明保健食品软胶囊急性毒性试验小鼠戚情况

剂量/(mg/kg)    动物数          存活动物数

            ♀     ♂       ♀          ♂

1000        5      5        5           5

2150        5      5        5           5

4640        5      5        5           5

10000       5      5        5           5

2.3.2遗传毒性试验

2.3.2.1Ames试验

本发明软胶囊Ames试验结果见表12和表13。在本试验的各浓度下，无论是否加入S9混合液，回变菌落数均未大于自发回变数的2倍，并且未见剂量-反应关系。而各阳性对照组均显示强烈的诱变作用。根据Ames试验结果判断标准，本次试验测试的本发明软胶囊未见至突变作用。

表12本发明软胶囊第一次Ames试验结果

剂量/(ug/皿)    TA97    TA97a   TA98-    TA98+    TA100    TA100    TA102    TA102+

                -S9     +S9     S9       S9       -S9      +S9      -S9      S9

8               138±14 144±11 35±6    41±11   160±17  153±19  272±19  281±24

40              141±18 135±9  36±7    38±41   58±14   164±14  279±17  274±26

200             141±7  142±7  34±6    38±11   162±16  159±15  274±20  279±13

1000            137±11 145±17 33±7    40±9    157±10  162±18  282±23  285±19

5000            142±13 143±19 35±8    39±13   161±11  162±16  278±37  283±27

未处理对照      138±   140±11 36±13   34±7    146±    152±    282±    278±32

                12                                19       18       34

溶剂对照        137±   143±   35±7    37±6    153±    151±    276±    280±25

                16      14                        13       21       19

阳性对照        1158±  1306±  620±    2181±   1642±   1430±   2011±   816±69

                125     82      63       133      82       134      139

阳性对照：不加用S9：TA97a 500.0ug/皿阿的平；T A9 86.0ug/皿正定霉素；TA100及

TA1021.0ug/皿甲基磺酸甲酯；加用S9：TA97a、TA98、TA10010.0ug/皿2-氨基芴；

TA10250.0ug/皿1.8-二羟基蒽醌。

表13本发明软胶囊第二次Ames试验结果

剂量/(ug/  TA97-    TA97a+    TA98-    TA98+    TA100-    TA100+    TA102-    TA102+

皿)        S9       S9        S9       S9       S9        S9        S9        S9

8          146±14  151±17   38±10   37±12   151±16   156±18   270±23   284±6

40         148±19  145±19   41±10   42±9    159±12   157±15   273±24   279±23

200        144±8   146±19   36±7    38±7    152±23   160±16   265±23   273±11

1000       140±14  152±6    33±9    41±9    155±14   153±18   275±10   282±21

5000       143±15  140±12   42±9    39±7    149±16   161±14   266±7    273±11

未处理对照 137±15  142±9    45±13   42±6    147±15   152±11   265±34   260±22

溶剂对照   141±14  138±16   39±7    41±6    150±17   155±22   271±18   264±27

阳性对照   115±12  1306±82  583±45  2122±   1587±    1373±    2128±    840±60

                                       103      103       139       122

阳性对照物同第一次试验。

2.3.2.2骨髓细胞微核试验：试验结果见表14。试验组动物在各试验剂量下，嗜多染红细胞(PCE)微核出现率、PCE/成熟红细胞(RBC)与阴性对照组的差异均无显著性，而阳性对照组显示强烈的致突变作用。根据该试验结果，本次试验测试的本发明软胶囊在2500mg/(kg.体重)、5000mg/(kg.体重)、10000mg/(kg.体重)下未见致突变作用。

表14软胶囊参骨髓细胞微核发生率的影响

性别    剂量组     /    微    核                                  PCE/RBC

        mg/(kg.体重)    受检细胞数/个    微核数/个    微核率‰    观察PCE    数PCE/RBC

雄      2500            5×1000          7            1.4±0.89   5×200     0.95±0.05

        5000            5×1000          6            1.2±1.30   5×200     0.92±0.03

        10000           5×1000          9            1.8±0.84   5×200     0.94±0.04

        阴性对照        5×1000          7            1.4±0.55   5×200     0.95±0.02

        阳性对照        5×1000          118          23.6±3.05  5×200     0.81±0.04

雌      2500            5×1000          5            1.0±0.71   5×200     0.92±0.04

        5000            5×1000          6            1.2±0.84   5×200     0.93±0.04

        10000           5×1000          7            1.4±1.34   5×200     0.91±0.05

2.3.2.3小鼠精子畸形试验：试验结果见表15。阴性对照组的精子畸形率为1.76％，属于小鼠正常畸形范围内(正常畸变率为0.8％～3.4％)，阳性对照组(环磷酰胺组)的精子畸形率为6.20％，显示对雄性小鼠生殖细胞有强烈的遗传毒性。

试验3个剂量组的精子畸形率分别为1.84％、1.96％、1.82％。与阴性对照组的差异无显著性。说明未见软胶囊对小鼠精子有遗传毒性。

表15 本发明软胶囊对小鼠精子畸形率的影响

组别          剂量/[mg/(kg.体重)]    动物数/只    受检精子数    畸形率/％

本发明胶囊    2500                   5            5000          1.84±0.62

              5000                   5            5000          1.96±0.77

              10000                  5            5000          1.82±0.83

阴性对照      40                     5            5000          1.76±0.42

阳性对照      40                     5            5000          6.20±0.73

2.3.3 30天喂养试验

2.3.3.1一般情况：整个试验期间，动物毛色正常，未见行为异常，无死亡发生。

2.3.3.2 30天喂养动物体重情况见表16。各剂量组动物增生与对照组经单因素方差分析比较，差异无显著性(P＞0.05)。

表16 软胶囊30天喂养试验对大鼠体重(g)的影响

组别        第0天        第7天         第15天         第22天         第30天

♀对照组    75.5±3.9    111.6±8.9    142.1±14.3    168.9±16.1    190.7±16.9

♀低剂量组  76.7±4.4    112.2±10.2   138.7±13.1    163.1±15.0    187.1±19.3

♀中剂量组  76.4±3.2    113.2±7.5    144.4±9.9     172.6±12.2    199.4±15.9

♀高剂量组  76.0±4.2    110.5±9.7    141.8±10.2    169.8±13.0    193.5±17.2

♂对照组    76.9±4.0    127.4±9.6    173.0±12.5    214.1±14.9    250.3±18.8

♂低剂量组  75.8±4.4    130.4±8.9    174.8±13.8    216.6±17.1    254±17.5

♂中剂量组  76.3±4.0    133.1±0.2    178.3±10.4    222.1±14.7    261.0±19.7

♂高剂量组  75.0±4.1    129.5±9.2    175.5±10.5    216.8±11.2    253.2±17.7

1.3.3.3食物利用率：以大鼠增重g数/100g饮料计，结果见表17和表18。各剂量组食物利用率与同性别对照组经单因素方差分析比较，差异无显著性(P＞0.05)。

表17 软胶囊30天对大鼠食物利用率影响

组别       体重增加/g   进食量/g    食物利用率/％

♀对照组   115.2±13.8  524±48.0   22.0±1.5

♀低剂量组 110.4±15.1  509±42.1   21.6±1.9

♀中剂量组 123.0±13.3  547±38.5   22.5±1.3

♀高剂量组 117.5±15.6  528±50.3   22.2±2.0

♂对照组   173.4±16.7  582±39.8   29.8±2.2

♂低剂量组 179.0±15.8  586±52.3   30.6±1.5

♂中剂量组 184.7±18.0  603±49.1   30.7±1.8

♂高剂量组 179.2±15.1  566±46.8   31.6±2.1

表18    软胶囊对大鼠各周食物利用率的影响

组别       1周        2周        3周        4周

♀对照组   37.0±4.2  24.8±4.0  18.7±3.7  13.8±3.4

♀低剂量组 35.9±6.1  22.2±2.9  17.9±3.3  15.4±4.5

♀中剂量组 35.8±4.6  24.8±1.9  19.3±1.9  15.8±2.4

♀高剂量组  36.1±6.1   24.9±4.4   19.5±4.9  14.4±6.2

♂对照组    43.9±7.4   32.4±3.1   26.0±3.6  21.6±4.7

♂低剂量组  145.1±5.0  31.9±5.4   27.0±4.3  22.5±4.3

♂中剂量组  45.3±4.1   31.8±3.3   27.4±3.7  22.2±3.4

♂高剂量组  46.9±4.81  35.0±6.9   27.5±4.6  21.9±5.3

2.3.4血液学检查：试验未期血红蛋白、红细胞、白细胞、血小板、网织红细胞测定结果见表19。

表19 软胶囊30天喂养试验大鼠血液学检查结果

组别       血红蛋白/(g/L)    红细胞/(1012个/L)    白细胞/(109个/L)    血小板/(109个/L)

♀对照组   136.9±14.1       6.85±0.65           12.4±1.81          890.5±119.7

♀低剂量组 144.7±11.5       7.29±0.39           12.8±2.39          913.8±102.0

♀中剂量组 146.1±12.8       7.25±0.46           13.3±1.88          959.6±86.2

♀高剂量组 142.4±13.9       7.07±0.52           12.2±1.61          946.4±109.4

♂对照组   133.6±13.6       7.15±0.74           12.9±2.07          906.5±108.2

♂低剂量组 139.0±12.3       7.61±0.83           13.8±1.25          939.6±83.8

♂中剂量组 142.5±9.4        7.39±0.56           13.2±2.17          945.7±107.6

♂高剂量组 137.7±16.2       7.20±0.29           13.0±1.83          908.0±73.9

表20 软胶囊30天喂养试验大鼠血液学检查结果

组别       中性粒细胞    碱性粒细胞     酸性粒细胞    淋巴细胞

♀对照组   22.1±3.7     0.4±0.5       0.9±1.2      75.0±5.5

♂对照组   23.2±3.2     0.5±0.5       1.2±0.8      73.3±3.9

♀低剂量组 22.7±3.1     0.5±0.5       0.8±0.6      74.2±3.6

♂低剂量组 23.7±3.7     0.2±0.4       0.7±0.7      73.3±4.1

♀中剂量组 121.9±4.1    0.4±0.5       0.8±0.6      75.4±5.1

♂中剂量组 22.4±3.3     0.7±0.7       1.1±0.6      74.4±4.5

♀高剂量组 20.6±3.3     0.2±0.4       1.0±1.2      77.0±3.6

♂高剂量组 21.4±3.1     0.5±0.7       1.0±0.7      75.6±3.6

2.3.5血液生化检查：所测各组动物的血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、肌酐(CR)、尿素氮(BUN)、胆固醇(T-che)、及甘油三酯(TG)均在正常值范围内。见表21、表22

表21    软胶囊30天喂养试验大鼠血清生化测定结果

组别       TP/(g/L)     ALB/(g/L)      ALT/(u/L)     AST/(u/L)

♀对照组   64.9±8.7    33.6±4.5      46.1±4.5     129.6±19.3

♀低剂量组 68.6±5.6    35.1±3.5      54.3±6.8     138.6±26.6

♀中剂量组 65.5±7.5    34.2±4.3      48.6±9.1     141.7±22.9

♀高剂量组 65.1±6.7    33.1±3.8      12.2±1.61    150.3±24.4

♂对照组   68.2±10.5   34.1±5.0      12.9±2.07    136.4±29.2

♂低剂量组 66.6±9.5    34.3±4.6      13.8±1.25    140.3±23.4

♂中剂量组 69.9±5.1    35.4±3.4      13.2±2.17    152.0±28.3

♂高剂量组 68.1±5.7    35.2±3.2      13.0±1.83    154.5±30.7

表22 软胶囊30天喂养试验大鼠血清生化测定结果

组别        GLU/(mmol/L)    BUN/(mmol/L)    CR(umol/L)    T-che/(mmol/L)

♀对照组    6.18±0.49      6.03±0.39      53.9±8.7     1.65±0.38

♀低剂量组  6.34±0.71      5.99±0.80      54.8±10.6    1.72±0.20

♀中剂量组  6.42±0.65   5.90±0.46   56.5±9.2    1.64±0.38

♀高剂量组  6.22±0.78   6.01±0.53   54.2±7.1    1.67±0.35

♂对照组    6.29±0.59   5.97±0.31   58.0±11.2   1.75±0.32

♂低剂量组  6.45±0.67   6.02±0.78   56.4±10.7   1.68±0.35

♂中剂量组  6.47±0.79   5.74±0.51   52.5±14.1   1.77±0.32

♂高剂量组  6.61±0.41   5.80±0.65   52.9±9.3    1.64±0.41

2.3.6脏体比：本发明软胶囊对大鼠脏器绝对质量和脏体比的影响见表23、表24。各组的脏器绝对质量及其肝重/体重、脾重/体重、睾丸重/体重比与对照组比较未见异常。

表23 本发明软胶囊30天喂养试验对大鼠脏器绝对质量的影响

组别        肝           脾          肾          睾丸

♀对照组    7.77±0.96   0.69±0.22  1.48±0.18

♀低剂量组  8.10±1.41   0.64±0.19  1.55±0.32

♀中剂量组  8.04±0.78   0.73±0.17  1.60±0.27

♀高剂量组  7.96±0.97   0.65±0.20  1.65±0.20

♂对照组    9.75±1.21   0.72±0.15  1.78±0.35  2.54±0.21

♂低剂量组  10.37±1.36  0.80±0.24  1.91±0.24  2.61±0.48

♂中剂量组  10.43±1.12  0.82±0.18  1.92±0.50  2.72±0.31

♂高剂量组  10.08±1.67  0.84±0.25  2.03±0.47  2.67±0.26

表24 本发明软胶囊30天喂养试验对大鼠脏体比的影响

组别         肝/体       脾/体       肾/体       睾丸/体

♀对照组     4.07±0.23  0.36±0.11  0.78±0.12  -

♀低剂量组   4.30±0.36  0.34±0.10  0.83±0.15  -

♀中剂量组   4.03±0.21  0.37±0.08  0.80±0.11  -

♀高剂量组   4.11±0.26  0.33±0.09  0.86±0.12  -

♂对照组     3.89±0.35  0.29±0.06  0.71±0.11  1.02±0.08

♂低剂量组   4.07±0.47  0.31±0.10  0.75±0.11  10.2±0.15

♂中剂量组   4.11±0.58  0.31±0.06  0.74±0.19  1.04±0.07

♂高剂量组   3.97±0.46  0.33±0.09  0.80±0.15  1.06±0.11

2.3.7组织病理学检查：大体解剖时，对照组及本发明软胶囊低、中、高三个剂量组大鼠肝、肾、脾、胃、十二指肠、卵巢、睾丸在体观察未见异常，因此仅选高剂量组进行组织病理学检查。镜下可见对照组有3例大鼠(雌1例、雄2例)肝细胞呈轻度肿胀，高剂量组有2例大鼠(雌雄各1例)肝细胞呈轻度脂肪变性、1例雌性大鼠肝细胞呈轻度肿胀，肝窦轻度扩张充血；其余各例大鼠肝细胞未见变性坏死，肝小叶结构完整，肝窦未见明显扩张。肾脏组织病理学检查表明，对照组有3例大鼠(雌2例、雄1例)、高剂量组中2例雄性大鼠，肾间质可见灶性炎细胞浸润，其余各例大鼠未见肾小球细胞数明显增多，毛细血管管腔无扩张，肾小管上皮细胞无明显变性坏死，未见管型。脾脏组织病理学检查表明，对照组及试验组中各例大鼠外覆薄层结缔组织，脾脏红、白髓清楚，中央动脉居脾小体中央，脾小体与脾小梁均属正常。胃组织病理学检查结果显示，对照组有2例大鼠(雌雄各1例)、高剂量组有3例大鼠(雌1例、雄2例)，可见黏腊上皮细胞部分脱落，并有少量炎细胞浸润，其余大鼠胃各层结构清晰，黏膜上皮无变性坏死，黏膜下层固有腺体无萎缩、增生或化生，间质结缔组织血管无扩张充血，肌层结构完好，浆膜无炎性浸出物。十二指肠组织病理学检查表明，对照组有3例大鼠(雌1例、雄2例)、高剂量组有2例大鼠(雌雄各1例)，可见黏膜上皮细胞脱落，黏膜层有少量炎细胞浸润，其余各例各层结构清晰，黏膜上皮无脱落，黏膜下层未见炎细胞浸润，肌层结构完好。雄性成年鼠睾丸曲细精管对照组和高剂量组间比较未见明明差异。雌性成年鼠卵巢内可见不同发育阶段的卵泡及排卵后形成的黄体或白体，对照组和高剂量组间比较未见明显的病理差异。

以上组织病理学检查结果均在正常范围内，高剂量组与空白对照组比较未见明显生物学差异，提示试样品对肝、、肾、脾、胃、十二指肠、卵巢、睾丸无明显损伤作用。

2.4.结论

(1)本发明保健品软胶囊，雌、雄小鼠经口LD50＞10.0g/(kg.体重)。根据LD50剂量分级标准，该样品属实际无毒级。

(2)遗传毒性试验(Ames试验、骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验)的阴性试验结果表明，本发明保健品软胶囊未见遗传毒性作用。

(3)大鼠30d喂养试验结果表明，与对照组比较，本发明保健品软胶囊三个剂量组大鼠的一般情况、体重、食物利用率、血液学、血液生化学、脏体比及病理组织学检查均未见异常。

Claims (9)

1.一种具有改善体力疲劳功能的保健食品，主要由如下重量份的原料药制成：人参1-5份，刺五加6-10份，制淫羊藿1-5份。

2.根据权利要求1所述的保健食品，其中原料药的重量份为：人参3份，刺五加9份，制淫羊藿3份。

3.权利要求1或2所述的保健食品的制备方法：1)按比例称取人参、刺五加2味原料药，用60％乙醇提取，回流3小时，提取两次，合并提取液真空浓缩得干浸膏1；

2)按比例称取制淫羊藿，用70％乙醇提取，回流3小时，将提取液真空浓缩得干浸膏2；

3)合并干浸膏1和干浸膏2，将其粉碎成200目粉，即为本发明的活性成分。

4.根据权利要求1所述的保健食品，所述原料药中还含有菟丝子、韭菜子、车前子、茯苓、覆盆子。

5.根据权利要求4所述的保健食品，其原料药的重量份为：菟丝子2-8份、韭菜子2-8份、车前子1-5份、茯苓1-5份、覆盆子5-10份。

6.根据权利要求5所述的保健食品，其原料药的重量份为：菟丝子6份、韭菜子5份、车前子2份、茯苓3份、覆盆子8份。

7.权利要求5或6保健食品的制备方法：

1)按比例称取人参、刺五加2味原料，用60％乙醇提取，回流3小时，提取两次，合并提取液真空浓缩得干浸膏1；

2)按比例称取制淫羊藿，用70％乙醇提取，回流3小时，将提取液真空浓缩得干浸膏2；

3)按比例称取菟丝子、韭菜子、车前子、茯苓、覆盆子，用60％乙醇提取，回流3小时，提取两次，合并提取液真空浓缩得干浸膏3；

4)合并干浸膏1、2和3，将其粉碎成200目粉，即为本发明的活性成分。

8.根据权利要求7所述的制备方法，所述浓缩后得到的干浸膏还需在50-60℃下干燥3小时。

9.权利要求1、2、4、5或6所述保健食品，其剂型为软胶囊剂。