CN101135680A - 光诱导介电泳辅助单细胞介电谱自动测试装置及测试方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置，该光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置包括光诱导介电泳芯片(100)、机器视觉装置(200)、视觉伺服装置(300)和虚拟电极直写装置(400)；光诱导介电泳芯片(100)放置于支撑装置(130)上，用于放置单细胞悬浮液，所述光诱导介电泳芯片(100)为三层汉堡结构，所述三层汉堡结构自上而下依次为导电玻璃层(101)，微通道(102)，光电导芯片(103)；在导电玻璃层(101)上分别设有进口(111)和出口(112)；本发明可以实现大规模的并行操控，全自动进样，测试以及分离，所以能实现活性单细胞的大规模并行操控，实现细胞的高通量，全自动进样、测试以及分离。

Description

光诱导介电泳辅助单细胞介电谱自动测试装置及测试方法

技术领域

本发明涉及单细胞介电谱测试装置及测试方法，尤其及电旋转的单细胞介电谱测试装置及测试方法。

背景技术

细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单元。人们要了解生命活动的规律，必须以研究细胞为基础，考察细胞的结构和功能，探索生命活动的规律。

恶性肿瘤也叫癌症(cancer)是目前危害人类健康最严重的一类疾病。在美国，恶性肿瘤的死亡率仅次于心血管疾病而居第二位。据我国2006年卫生事业发展情况统计公报，城市地区居民死因第一位为恶性肿瘤，其次为脑血管病、心脏病。

若能在单细胞水平发现癌细胞，及时进行早期治疗，将使癌症不再成为不治之症。事实上，癌症肿瘤形成前，病人血液中已存在少量的异常细胞。对一些疾病如白血病(leukemia)，血细胞的变化更是直接的指标。传统细胞研究主要是对细胞群体进行分析，然而细胞群体分析获得的统计平均结果，抹杀了单细胞之间的差异，使生物学及医学等多领域的发展受到限制，不利于癌症的早期诊断。因此，在单细胞尺度对单个活性细胞的多个参数进行实时分析很有必要。目前已建立的可适应单细胞检测的方法有形态学和非形态学方法两类。形态学方法有免疫细胞化学(immunocytochemistry)和免疫荧光技术(immunofluorescence technique)两种；非形态学方法有流式细胞术(flow cytometry)、逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)以及免疫-磁分离技术(immuno-magnetic separation)等。应用形态学方法和非形态学方法，其结果常显现相当大的差异，说明这些技术方法尚不标准和规范化，有待进一步完善。

传统单细胞分析技术存在以下不足：1)在细胞准备过程中引入许多不可控的人为因素，影响了细胞分析的精度；2)在分析过程中需要添加昂贵的生化试剂对目标细胞进行标定，破坏了细胞的微环境，不适合活性细胞分析；3)相关设备体积庞大且价格不菲，并对人员及测试环境要求较高，不适合野外使用或个人化、家用化。为解决上述传统单细胞分析技术的不足，微全分析系统的概念被引入了生物医学分析领域。基于微全分析系统概念的单细胞分析芯片以其微型化、集成化和便携化方面的巨大优势在高通量药物筛选，癌症早期诊断、快速检测等领域具有巨大的潜力，而缺乏行之有效的单细胞操控、表征及分离技术是制约其发展的技术瓶颈。在不损伤细胞活性、不改变细胞周围微环境的条件下实时监测单细胞的本征特性参数，并以此实现细胞表征、识别与分类，这是许多科技工作者孜孜以求的目标，而基于电旋转(electrorotation)的单细胞介电频谱测试技术可实现上述物理量的测量并基于细胞介电谱特性可实现细胞分离。

根据Maxwell-Wagnar界面极化理论可知，细胞在外加交流电场条件下将会被动的产生极化(polarization)，引起细胞的介电弛豫(dielectric dispersion)现象。在频域测量细胞的介电常数ε和电导率σ能够反映细胞的介电弛豫的特征和细胞频域被动特性(或称介电特性)。对细胞频域被动特性的研究已成为细胞电生理学和细胞生物物理学的研究热点内容之一。由于不同频域段的讯号反应细胞不同结构的信息，对频域电特性的研究有助于人们了解细胞极化的界面性质及细胞导电和绝缘特性，验证生物细胞的数学模型和物理模型的正确性，深入认识和了解细胞的结构和功能。影响细胞介电特性的因素很多，如：细胞的体积、细胞膜的面积、内质网，细胞核的大小，细胞质的离子浓度及迁移率，细胞膜表面电荷和细胞膜跨膜蛋白以及细胞外部环境等，细胞在形态学上的不同以及细胞内部的变化均导致其介电特性的变化，因此，细胞介电特性相当于细胞的“指纹”，可鉴别其类型，因此被称为“介电表征”。在一定频域范围内癌细胞与正常细胞的介电表征有非常大的差异。细胞在宽频域交流电场条件下，由低频到高频其介电常数ε有五个基本的介电弛豫特征构成了生物细胞的介电谱(dielectric spectrum)。其中，α色散和β色散较为重要。一般细胞表面带负电荷，电荷密度的大小取决于细胞的种类。由于细胞表面负电荷与溶液中正离子的切向力作用，产生了α色散。α色散出现在低频区，正常细胞与异常细胞表面荷电不同，导致了α色散差异性。因此，α色散可用于临床诊断。细胞膜的磷脂双分子层结构在电场中类似于一个电容器的性质，因此，出现β色散。β色散对于细胞分析的一个应用是肿瘤组织的识别和细胞生物量的分析。细胞数越大，β色散越大，这是因为死细胞对于β色散有很大贡献。β色散与细胞膜的完整性和活性有关。因此，β色散在细胞生物分析中有重要应用。

研究细胞介电特性的方法很多，如交流阻抗测量法，电旋转测量法，介电谱法(Dielectrospectroscopy Method)，介电泳法(Dielectrophoresis Method)以及微小吸管法(Micropipet Method)等，其中电旋转测量法作为一种非破坏性技术，以其电极结构简单，便于小型化和集成，易于实现自动控制与分离等优势获得广泛应用并已实现商品化，如德国的evotec technologies，中国的博奥等均持有相关专利及商品化测试芯片。但是目前的测试芯片及其测试方法并不理想，如在测量细胞介电属性时，很难同时捕获与旋转单细胞，且细胞贴近槽道基面，受到底面摩擦力的干扰，测量精度低，不适合高通量的单细胞并行测量，自动化程度低，细胞的进样和分离也比较困难，采用双层四分电极虽然可以抑制细胞在竖直方向的逃逸，但细胞所处的范围仍然很多，旋转的同时还在平动，故细胞旋转稳定性差，不便于测量。采用光镊固定细胞，而电旋转旋转细胞，虽然可以实现细胞的定轴转动，悬浮测量以及细胞的进样和分离，但也有一定的局限性。首先，光镊需要强汇聚激光束不适合细胞的长时间捕获(不能大于5分钟)，易于造成细胞的光损伤，且光捕获所需激光束会造成细胞周围流体温度局部升高，形成对流，进而影响细胞的电旋转测量精度。其次，光镊的捕获范围有限(<1μm)不适合微米或亚微米尺度细胞的捕获。再次，光镊移动范围很小，不适合单细胞的大规模并行捕获与操控，无法同时实现细胞进样、测试、分离。最后，光镊的引进使得整个测试系统的成本急剧上升，不易于推广和使用。针对上述问题，本光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱测试技术在继承传统电旋转测试技术优点的基础上，本发明提出利用光诱导介电泳来代替传统的光镊以实现活性单细胞的大规模并行操控，并结合机器视觉、模式识别技及路径规划技术实现细胞的高通量，全自动进样、测试以及分离。

发明内容

技术问题：本发明提供一种光诱导介电泳辅助单细胞介电谱自动测试装置及测试方法，以解决现有技术中不能实现活性单细胞的大规模并行操控；不能实现细胞的高通量、全自动进样、测试及分离的缺陷。

技术方案：为达到上述技术目的，本发明采用的技术方案是：该光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置包括光诱导介电泳芯片、机器视觉装置、视觉伺服装置和虚拟电极直写装置；光诱导介电泳芯片放置于支撑装置上，用于放置单细胞悬浮液，所述光诱导介电泳芯片为三层汉堡结构，所述三层汉堡结构自上而下依次为导电玻璃层，微通道，光电导芯片；在导电玻璃层上分别设有进口和出口；光电导芯片自下而上依次为导电玻璃衬底、n⁺型光电导层、本征光电导层、绝缘层；电旋转电极制作在绝缘层上；所述光诱导介电泳芯片的微通道空腔依次分为进样区、测试区和排布区；机器视觉装置位于光诱导介电泳芯片上方，机器视觉装置用于获取单细胞实时图像序列并将所述单细胞实时图像序列转换为数字图像信号；视觉伺服装置的信号输入端与机器视觉装置的信号输出端连接，该视觉伺服装置用于对所述单细胞实时图像序列中细胞进行定位，提取所述单细胞实时图像序列中的图像中单细胞的特征，得到所述单细胞的位置坐标，并对所述单细胞进行分类编码，根据得到的所述单细胞的位置坐标，生成该单细胞的虚拟电极图案；将所述生成的虚拟电极图案进行路径规划，按所述路径规划路线运动，虚拟电极运动带动所述单细胞运动，实时监控所述单细胞的运动，并反馈校正虚拟电极图案运动，从而获取并测试所述运送至测试区的单细胞的介电频谱；虚拟电极直写装置的信号输入端与图像处理装置的信号输出端相连，将经过视觉伺服装置处理的图像投影到光诱导介电泳芯片的光电导层上。

优选的，机器视觉装置包括位于光诱导介电泳芯片上方的观测物镜，该观测物镜用于观测放置在光诱导介电泳芯片上的单细胞悬浮液；位于观测物镜上方的电荷耦合装置，该电荷耦合装置用于获取通过观测物镜观测到的所述单细胞实时图像，将所述单细胞实时图像转换为电信号；观测物镜和电荷耦合装置的轴线分别垂直于光诱导介电泳芯片；与电荷耦合装置的电信号输出端相连的图像采集转换单元，图像采集转换单元用于采集电荷耦合装置输出的电信号并将所述电信号转换成数字图像信号。

优选的，视觉伺服装置包括视觉定位模块，用于将机器视觉装置获取的所述单细胞实时图像序列中的细胞进行定位；特征提取与分类编码模块，用于提取定位后的所述单细胞实时图像中细胞的特征，得到所述单细胞的位置坐标，并对所述单细胞进行分类编码；虚拟电极图案生成模块，用于根据得到的所述单细胞的位置坐标，生成该单细胞的虚拟电极图案图像；路径规划与实时重构模块，用于将生成的所述虚拟电极图案进行路径规划，按规划路线运动；视觉追踪模块，用于实时监控所述单细胞的运动，并反馈校正虚拟电极图案运动；介电频谱自动测试模块，用于获取运送至测试区的的单细胞的介电频谱。

优选的，虚拟电极直写装置包括驱动电路板、数字微镜芯片、驱动光源、准直光路单元、狭窄光路单元和操作物镜；驱动电路板的信号输入端与视觉伺服装置的信号输出端相连，驱动光源将光照射在数字微镜芯片上，驱动电路板此时控制数字微镜芯片，利用几何光学将所述虚拟电极图案经位于数字微镜芯片下方的准直光路单元、狭窄光路单元、操作物镜将所述虚拟电极图案投影到光诱导介电泳芯片的光电导层上；准直光路单元用于将发散光会聚成平行光；狭窄光路单元用于将大直径平行光束缩为小直径平行光束；准直光路单元与缩放光路单元共光轴，所述光轴垂直于数字微镜芯片的表面；位于光诱导介电泳芯片下方的操作物镜的光轴垂直于光诱导介电泳芯片光电导芯片。

优选的，光电导芯片依次包括氧化锡铟玻璃衬底、n⁺型氢化非晶硅层、本征态氢化非晶硅层和氮化硅层。

优选的，电旋转电极为氧化锡铟透明薄膜材料。

一种用于光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置的测试方法，其特征在于，

步骤1：通过机器视觉装置获取置于光诱导介电泳芯片微通道中的被刺单细胞的初始图像序列；通过视觉伺服装置中的视觉定位模块将所述图像序列的被测单细胞定位；通过视觉伺服装置中的特征提取与分类编码模块获取所述图像序列中的被测单细胞的位置坐标，并对所述被测单细胞进行分类编码；通过视觉伺服装置中的虚拟电极图案生成模块生成捕获被测单细胞的虚拟电极图案；通过视觉伺服装置中的路径规划和实时重构模块，规划所述虚拟电极图案的运动路径，使所述被测单细胞按规划路径运动；通过视觉伺服装置中的介电频谱自动测试模块测试输运至光诱导介电泳芯片的电旋转电极内测试区的被测单细胞介电频谱；

步骤2：通过视觉伺服装置中的视觉定位模块将所述被测单细胞的初始图像序列的被测单细胞定位；

步骤3：通过视觉伺服装置中的特征提取与分类编码模块获取所述被测单细胞的初始图像序列中被测单细胞的位置坐标，并对所述被测单细胞进行分类编码；

步骤4：通过视觉伺服装置中的虚拟电极图案生成模块用于生成捕获所述被测单细胞的虚拟电极图案；

步骤5：将所述虚拟电极图案通过虚拟电极直写装置投影到光诱导介电泳芯片的本征光电导层上；

步骤6：在光诱导介电泳芯片的导电玻璃层和导电玻璃衬底接波形发生器，在所述微通道内形成一个电场，本征光导层的光导材料在亮暗态下的电导率不同，形成不同的分压，从而使得微通道内的电场是非均匀的，在非均匀电场的作用下，形成介电泳力，利用产生的光诱导介电泳操纵力捕获被测单细胞；

步骤7：所述虚拟电极图案运动带动了相应捕获的单细胞运动，将被测单细胞输运至测试区后，在电旋转电场和光诱导介电泳力的共同作用下，被测单细胞定轴转动；

步骤8：通过调整波形发生器来变换频率，通过视觉伺服装置中介电频谱自动测试模块，完成被测单细胞的介电频谱测试，获得被测单细胞的介电特性；

步骤9：完成测试的单细胞，根据测得的介电特性，从测试区输运至排布区进行分类排布。

有益效果：本发明提供的光诱导介电泳辅助单细胞介电谱自动测试装置及测试方法基于机器视觉技术，是通过光学装置非接触地接受和处理细胞在芯片中真实运动和旋转的图像；通过对图像进行数字化处理，选取模板进行模板匹配，获得细胞的运动位置坐标的信息，进而实时校正和控制虚拟电极图案的运动，从而实现细胞的运动；通过对图像进行数字化处理，根据像素分布和亮度等信息，进行单细胞旋转速度的判别，进而根据判别的结果评价细胞的介电特性。与同类基于机器视觉的非接触测试法比较，本发明提供的光诱导介电泳辅助单细胞介电谱自动测试装置及测试方法主要是利用了光诱导介电泳的特性，光诱导介电泳操控的优势在于虚拟电极图案是由投影的图案决定的，因此可根据实际操控环境中，各单细胞的位置，实时重构电极，完成单细胞的捕获，捕获的各单细胞之间是相对独立，因此可以实现大规模的并行操控，全自动进样，测试以及分离，所以能实现活性单细胞的大规模并行操控，实现细胞的高通量，全自动进样、测试以及分离，从而为单细胞分析提供了较广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明提供的光诱导介电泳辅助单细胞介电谱自动测试装置结构示意图；

图2为本发明提供的光诱导介电泳辅助单细胞介电谱自动测试装置中的光诱导介电泳芯片的结构示意图；

图3是本发明提供的光诱导介电泳辅助单细胞介电谱自动测试装置中的光诱导介电泳芯片的俯视图；

图4为本发明提供的用于光诱导介电泳辅助单细胞介电谱自动测试装置的测试方法流程图。

具体实施方式

本发明提供一套完整的适用于单细胞介电谱测试的装置和方法，本光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试方法基于机器视觉技术对细胞运动速度和旋转速度的测量，是通过对细胞运动过程中每一时刻的图像进行采集和数字化处理得到的。本光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试方法主要是基于光诱导介电泳力实现单细胞并行捕获、进样、定位、定轴旋转以及最终分离，通过对微芯片基片上的两对微电极上施加强度相等、相邻相位差均为90度的交流电压信号形成旋转电场使得细胞在旋转电场作用下发生旋转，并基于机器视觉、模式识别及路径规划技术实现细胞的形态学识别与多细胞运动轨迹实时追踪，光诱导介电泳虚拟电极模式的实时重构与路径规划以及细胞旋转测量的自动记录与实时图像处理。

本发明提供的光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置，该光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置包括如图1所示，光诱导介电泳芯片100、机器视觉装置200、视觉伺服装置300和虚拟电极直写装置400；光诱导介电泳芯片100放置于支撑装置130上，用于放置单细胞悬浮液，所述光诱导介电泳芯片100为三层汉堡结构，如图2所示，所述三层汉堡结构自上而下依次为导电玻璃层101，微通道102，光电导芯片103；在导电玻璃层101上分别设有进口111和出口112；光电导芯片103自下而上依次为导电玻璃衬底125、n⁺型光电导层122、本征光电导层123、绝缘层124；电旋转电极121制作在绝缘层124上；所述光诱导介电泳芯片100的微通道102空腔依次分为进样区、测试区和排布区；导电玻璃衬底125可以为氧化锡铟玻璃衬底、n⁺型光电导层122可以为n⁺型氢化非晶硅层、本征光电导层123可以为本征态氢化非晶硅层和绝缘层124可以为氮化硅层124；电旋转电极121为氧化锡铟透明薄膜材料；微通道102的材料可为聚二甲基硅氧烷或SU-8光刻胶。波形发生器140信号输出端分别接光诱导介电泳芯片的导电玻璃层101和光电导芯片103的导电玻璃衬底125。

在测试区中，氮化硅表层上安装有四相位电旋转电极121，待测试的液体经注射泵由进口111注入，依次经过进样区，测试区和排列区。芯片光导材料选择氢化非晶硅，明暗光导率相差三个量级以上，电旋转电极选用ITO透明薄膜材料制作，以便于投影光线穿透，无遮挡，实验时须将光诱导介电泳芯片置于显微镜载物台上进行。

机器视觉装置200位于光诱导介电泳芯片100上方，机器视觉装置200用于获取单细胞实时图像序列并将所述单细胞实时图像序列转换为数字图像信号；视觉伺服装置300的信号输入端与机器视觉装置200的信号输出端连接，该视觉伺服装置300用于对所述单细胞实时图像序列中细胞进行定位，提取所述单细胞实时图像序列中的图像中单细胞的特征，得到所述单细胞的位置坐标，并对所述单细胞进行分类编码，根据得到的所述单细胞的位置坐标，生成该单细胞的虚拟电极图案；将所述生成的虚拟电极图案进行路径规划，按所述路径规划路线运动，虚拟电极运动带动所述单细胞运动，实时监控所述单细胞的运动，并反馈校正虚拟电极图案运动，从而获取并测试所述运送至测试区的单细胞的介电频谱；虚拟电极直写装置400的信号输入端与图像处理装置300的信号输出端相连，将经过视觉伺服装置300处理的图像投影到光诱导介电泳芯片100的光电导层123上。

机器视觉装置200包括位于光诱导介电泳芯片100上方的观测物镜201，该观测物镜201用于观测放置在光诱导介电泳芯片100上的单细胞悬浮液；位于观测物镜201上方的电荷耦合装置202，该电荷耦合装置202用于获取通过观测物镜201观测到的所述单细胞实时图像，将所述单细胞实时图像转换为电信号；观测物镜201和电荷耦合装置202的轴线分别垂直于光诱导介电泳芯片100；与电荷耦合装置202的电信号输出端相连的图像采集转换单元203，图像采集转换单元203用于采集电荷耦合装置202输出的电信号并将所述电信号转换成数字图像信号。

选用显微镜的上光路光源照明，将光诱导介电泳芯片100放在显微镜载物台上，调节焦距，使得图像上突出单细胞轮廓；单细胞随捕获电极运动或在测试区电旋转电场作用下旋转同时，单细胞运动或旋转的图像通过观测物镜上方的CCD摄像机201成像在CCD感光面上，再由CCD传感器转化为电信号；最后由图像采集转换单元203完成对CCD摄像机201输出的视频信号的采集和数字化转换任务，以供视觉伺服装置300进一步的处理。

视觉伺服装置300包括视觉定位模块，用于将机器视觉装置200获取的所述单细胞实时图像序列中的细胞进行定位；特征提取与分类编码模块，用于提取定位后的所述单细胞实时图像中细胞的特征，得到所述单细胞的位置坐标，并对所述单细胞进行分类编码；虚拟电极图案生成模块，用于根据得到的所述单细胞的位置坐标，生成该单细胞的虚拟电极图案图像；路径规划与实时重构模块，用于将生成的所述虚拟电极图案进行路径规划，按规划路线运动；视觉追踪模块，用于实时监控所述单细胞的运动，并反馈校正虚拟电极图案运动；介电频谱自动测试模块，用于获取运送至测试区的的单细胞的介电频谱。

视觉伺服装置300包含了一台高性能PC机301和图像处理支持软件302。

PC机301配置为超线程技术的高性能计算机。图像处理支持软件302是基于图像化编程语言编写的实时图像采集和处理程序，该程序具有交互式界面，通过对机器视觉装置采集所得的图像进行数字化处理后，进一步获得细胞的电旋转速度。图像处理支持软件302可以实时地采集并显示细胞测试各阶段的图像，并通过这些图像来测量和记录细胞各个时刻的旋转速度，用户可以设置程序的采集间隔，细胞的整个运动过程同时可以记录为视频动画文件。图像处理支持软件302同时控制着虚拟电极图案绘制程序的运行。计算机的显卡的模拟信号输出端接数字微镜装置驱动板信号接入口，驱动板根据传说过来的信号控制微镜的翻转，从而控制是否反射光线，从而决定了图案。

虚拟电极直写装置400包括驱动电路板401、数字微镜芯片402、驱动光源407、准直光路单元403、狭窄光路单元404和操作物镜406；驱动电路板401的信号输入端与视觉伺服装置300的信号输出端相连，驱动光源407将光照射在数字微镜芯片402上，驱动电路板401此时控制数字微镜芯片402，利用几何光学将所述虚拟电极图案经位于数字微镜芯片402下方的准直光路单元403、狭窄光路单元404、操作物镜406将所述虚拟电极图案投影到光诱导介电泳芯片100的光电导层123上；准直光路单元403用于将发散光会聚成平行光；狭窄光路单元404用于将大直径平行光束缩为小直径平行光束；准直光路单元403与缩放光路单元404共光轴，所述光轴垂直于数字微镜芯片402的表面；位于光诱导介电泳芯片100下方的操作物镜406的光轴垂直于光诱导介电泳芯片100光电导芯片103。虚拟电极直写装置400中在狭窄光路单元404和操作物镜406只觉安还可以包括反射棱镜405。

DMD驱动板401和DMD芯片401由商品化DLP投影仪改造而来。虚拟电极直写装置400中，需保证准直光路单元403和狭窄光路单元404共光轴，该光轴垂直于DMD芯片401表面，操作物镜406的光轴需垂直于光诱导介电泳芯片1基底面。数字微镜芯片402上面密密麻麻地排列着80万～100万面微镜(跟分辨率有关，800*600还是1024*768)，每个微镜可以独立向正负方向翻转10度，并可以每秒钟翻转65000次，光源通过这些微镜反射到屏幕上直接形成图像。准直光路单元403将发散的光收缩成平行光，减少光损失，提高投影光路的质量。

本发明提供的用于本发明提供的光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置的测试方法，包括如下步骤：

步骤1：如图3所示，通过机器视觉装置200获取置于光诱导介电泳芯片100微通道中的被刺单细胞的初始图像序列；通过视觉伺服装置300中的视觉定位模块将所述图像序列的被测单细胞定位；通过视觉伺服装置300中的特征提取与分类编码模块获取所述图像序列中的被测单细胞的位置坐标，并对所述被测单细胞进行分类编码；通过视觉伺服装置300中的虚拟电极图案生成模块生成捕获被测单细胞的虚拟电极图案；通过视觉伺服装置300中的路径规划和实时重构模块，规划所述虚拟电极图案的运动路径，使所述被测单细胞按规划路径运动；通过视觉伺服装置300中的介电频谱自动测试模块测试输运至光诱导介电泳芯片100的电旋转电极121内测试区的被测单细胞介电频谱；

步骤2：通过视觉伺服装置300中的视觉定位模块将所述被测单细胞的初始图像序列的被测单细胞定位；

步骤3：通过视觉伺服装置300中的特征提取与分类编码模块获取所述被测单细胞的初始图像序列中被测单细胞的位置坐标，并对所述被测单细胞进行分类编码；

步骤4：通过视觉伺服装置300中的虚拟电极图案生成模块用于生成捕获所述被测单细胞的虚拟电极图案；

步骤5：将所述虚拟电极图案通过虚拟电极直写装置400投影到光诱导介电泳芯片100的本征光电导层123上；

步骤6：在光诱导介电泳芯片的导电玻璃层101和导电玻璃衬底125接波形发生器140，在所述微通道102内形成一个电场，本征光导层123的光导材料在亮暗态下的电导率不同，形成不同的分压，从而是的微通道内的电场是非均匀的，在非均匀电场的作用下，形成介电泳力，利用产生的光诱导介电泳操纵力捕获被测单细胞；

步骤7：所述虚拟电极图案运动带动了相应捕获的单细胞运动，将被测单细胞输运至测试区后，在电旋转电场和光诱导介电泳力的共同作用下，被测单细胞定轴转动；

步骤8：通过调整波形发生器150来变换频率，通过视觉伺服装置300中介电频谱自动测试模块，完成被测单细胞的介电频谱测试，获得被测单细胞的介电特性。

步骤9：完成测试的单细胞，根据测得的介电特性，从测试区输运至排布区进行分类排布。

含有待测试细胞的溶液由光诱导介电泳芯片的进口进入微通道，机器视觉装置获得初始图像，图像处理支持软件对初始图像进行图像预处理、图像分割、特征提取，进而获得各细胞的坐标位置，将获得坐标位置信息传递给虚拟电极图案绘图软件(可以用Flash软件或Micro Office PowerPoint二次开发而得)，将绘制的图像通过显卡的模拟信号输出口接入数字微镜装置驱动电路板的信号接入口，驱动光源射出的光线经数字微镜芯片反射，经过准直光路、缩放光路、操纵物镜，形成的虚拟电极图案投影到光导层上。利用光敏材料氢化非晶硅的特性，亮暗态下的电导率不同，在间隔层空间中产生非均匀电场，进而产生介电泳操纵力，捕获细胞。虚拟电极图案的移动，带动了细胞运动。在运动过程中，上方电荷耦合装置实时采集运动图像信息，图像处理支持软件对输运过程实时监控；在细胞进入测试区后，在电旋转电极产生的旋转电场和光诱导介电泳的作用下，做定轴转动。通过机器视觉装置可以获得图片序列，通过图像支持软件处理，可以到细胞在该频率下的介电属性，然后改变频率，进行同样的测试。最终得到细胞的介电频谱。根据所测得的介电参数利用光诱导介电泳，从测试区输运至排列区。

以上的显微镜可以选用Nikon ECLIPSE 50i型号，CCD摄像机可以选用Nikon DXM1200F型号，操纵物镜可以选用CFILU Plan Epi 10X型号，波形发生器可以选用Agilent 33250A型号。

Claims (7)

1.一种光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置，其特征在于，该光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置包括光诱导介电泳芯片(100)、机器视觉装置(200)、视觉伺服装置(300)和虚拟电极直写装置(400)；光诱导介电泳芯片(100)放置于支撑装置(130)上，用于放置单细胞悬浮液，所述光诱导介电泳芯片(100)为三层汉堡结构，所述三层汉堡结构自上而下依次为导电玻璃层(101)，微通道(102)，光电导芯片(103)；在导电玻璃层(101)上分别设有进(111)和出口(112)；光电导芯片(103)自下而上依次为导电玻璃衬底(125)、n⁺型光电导层(122)、本征光电导层(123)、绝缘层(124)；电旋转电极(121)制作在绝缘层(124)上；所述光诱导介电泳芯片(100)的微通道(102)空腔依次分为进样区、测试区和排布区；机器视觉装置(200)位于光诱导介电泳芯片(100)上方，机器视觉装置(200)用于获取单细胞实时图像序列并将所述单细胞实时图像序列转换为数字图像信号；视觉伺服装置(300)的信号输入端与机器视觉装置(200)的信号输出端连接，该视觉伺服装置(300)用于对所述单细胞实时图像序列中细胞进行定位，提取所述单细胞实时图像序列中的图像中单细胞的特征，得到所述单细胞的位置坐标，并对所述单细胞进行分类编码，根据得到的所述单细胞的位置坐标，生成该单细胞的虚拟电极图案；将所述生成的虚拟电极图案进行路径规划，按所述路径规划路线运动，虚拟电极运动带动所述单细胞运动，实时监控所述单细胞的运动，并反馈校正虚拟电极图案运动，从而获取并测试所述运送至测试区的单细胞的介电频谱；虚拟电极直写装置(400)的信号输入端与图像处理装置(300)的信号输出端相连，将经过视觉伺服装置(300)处理的图像投影到光诱导介电泳芯片(100)的光电导层(123)上。

2.如权利要求1所述的光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置，其特征在于，机器视觉装置(200)包括位于光诱导介电泳芯片(100)上方的观测物镜(201)，该观测物镜(201)用于观测放置在光诱导介电泳芯片(100)上的单细胞悬浮液；位于观测物镜(201)上方的电荷耦合装置(202)，该电荷耦合装置(202)用于获取通过观测物镜(201)观测到的所述单细胞实时图像，将所述单细胞实时图像转换为电信号；观测物镜(201)和电荷耦合装置(202)的轴线分别垂直于光诱导介电泳芯片(100)；与电荷耦合装置(202)的电信号输出端相连的图像采集转换单元(203)，图像采集转换单元(203)用于采集电荷耦合装置(202)输出的电信号并将所述电信号转换成数字图像信号。

3.如权利要求1所述的光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置，其特征在于，视觉伺服装置(300)包括视觉定位模块，用于将机器视觉装置(200)获取的所述单细胞实时图像序列中的细胞进行定位；特征提取与分类编码模块，用于提取定位后的所述单细胞实时图像中细胞的特征，得到所述单细胞的位置坐标，并对所述单细胞进行分类编码；虚拟电极图案生成模块，用于根据得到的所述单细胞的位置坐标，生成该单细胞的虚拟电极图案图像；路径规划与实时重构模块，用于将生成的所述虚拟电极图案进行路径规划，按规划路线运动；视觉追踪模块，用于实时监控所述单细胞的运动，并反馈校正虚拟电极图案运动；介电频谱自动测试模块，用于获取运送至测试区的的单细胞的介电频谱。

4.如权利要求1所述的光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置，其特征在于，虚拟电极直写装置(400)包括驱动电路板(401)、数字微镜芯片(402)、驱动光源(407)、准直光路单元(403)、狭窄光路单元(404)和操作物镜(406)；驱动电路板(401)的信号输入端与视觉伺服装置(300)的信号输出端相连，驱动光源(407)将光照射在数字微镜芯片(402)上，驱动电路板(401)此时控制数字微镜芯片(402)，利用几何光学将所述虚拟电极图案经位于数字微镜芯片(402)下方的准直光路单元(403)、狭窄光路单元(404)、操作物镜(406)将所述虚拟电极图案投影到光诱导介电泳芯片(100)的光电导层(123)上；准直光路单元(403)用于将发散光会聚成平行光；狭窄光路单元(404)用于将大直径平行光束缩为小直径平行光束；准直光路单元(403)与缩放光路单元(404)共光轴，所述光轴垂直于数字微镜芯片(402)的表面；位于光诱导介电泳芯片(100)下方的操作物镜(406)的光轴垂直于光诱导介电泳芯片(100)光电导芯片(103)。

5.如权利要求1所述的光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置，其特征在于，光电导芯片(103)依次包括氧化锡铟玻璃衬底(125)、n⁺型氢化非晶硅层(122)、本征态氢化非晶硅层(123)和氮化硅层(124)。

6.如权利要求1所述的光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置，其特征在于，电旋转电极(121)为氧化锡铟透明薄膜材料。

7.一种用于如权利要求1所述的光诱导介电泳辅助的单细胞介电谱自动测试装置的测试方法，其特征在于，

步骤1：通过机器视觉装置(200)获取置于光诱导介电泳芯片(100)微通道中的被刺单细胞的初始图像序列；通过视觉伺服装置(300)中的视觉定位模块将所述图像序列的被测单细胞定位；通过视觉伺服装置(300)中的特征提取与分类编码模块获取所述图像序列中的被测单细胞的位置坐标，并对所述被测单细胞进行分类编码；通过视觉伺服装置(300)中的虚拟电极图案生成模块生成捕获被测单细胞的虚拟电极图案；通过视觉伺服装置(300)中的路径规划和实时重构模块，规划所述虚拟电极图案的运动路径，使所述被测单细胞按规划路径运动；通过视觉伺服装置(300)中的介电频谱自动测试模块测试输运至光诱导介电泳芯片(100)的电旋转电极(121)内测试区的被测单细胞介电频谱；

步骤2：通过视觉伺服装置(300)中的视觉定位模块将所述被测单细胞的初始图像序列的被测单细胞定位；

步骤3：通过视觉伺服装置(300)中的特征提取与分类编码模块获取所述被测单细胞的初始图像序列中被测单细胞的位置坐标，并对所述被测单细胞进行分类编码；

步骤4：通过视觉伺服装置(300)中的虚拟电极图案生成模块用于生成捕获所述被测单细胞的虚拟电极图案；

步骤5：将所述虚拟电极图案通过虚拟电极直写装置(400)投影到光诱导介电泳芯片(100)的本征光电导层(123)上；

步骤6：在光诱导介电泳芯片的导电玻璃层(101)和导电玻璃衬底(125)接波形发生器(140)，在所述微通道(102)内形成一个电场，本征光导层(123)的光导材料在亮暗态下的电导率不同，形成不同的分压，从而使得微通道内的电场是非均匀的，在非均匀电场的作用下，形成介电泳力，利用产生的光诱导介电泳操纵力捕获被测单细胞；

步骤7：所述虚拟电极图案运动带动了相应捕获的单细胞运动，将被测单细胞输运至测试区后，在电旋转电场和光诱导介电泳力的共同作用下，被测单细胞定轴转动；

步骤8：通过调整波形发生器(150)来变换频率，通过视觉伺服装置(300)中介电频谱自动测试模块，完成被测单细胞的介电频谱测试，获得被测单细胞的介电特性；

步骤9：完成测试的单细胞，根据测得的介电特性，从测试区输运至排布区进行分类排布。

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