CN105486867A - 基于光诱导介电泳机械力的免标记细胞电特性获取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于光诱导介电泳机械力的免标记细胞电特性获取方法，包括：将入射光投影到光电子镊芯片下表面；信号发生器发出交流电压的频率，作用于光电子镊芯片的导电层；细胞开始远离入射光运动；增加外加交流电压的频率，当某细胞静止时，此时的频率为该细胞的交越频率；继续增加外加交流电压的频率，该细胞朝入射光处运动；当所有细胞均进入入射光范围内，关闭入射光及外加交流电压；得到各细胞的交越频率和直径的关系；根据细胞膜电容与细胞直径的关系，得到各细胞膜电容。本发明无需制备特异性结构的金属微电极；可实时获取单个或多个细胞的电特性参数；无需利用抗体对细胞进行标识，具有自动化、批量化及吞吐量高的优点。

Description

基于光诱导介电泳机械力的免标记细胞电特性获取方法

技术领域

本发明涉及光、机、电耦合机器人技术在生命科学中的应用，具体地说是一种基于光诱导介电泳机械力的无损、免标记细胞电特性获取方法。

背景技术

细胞膜电容与细胞自身电生理特性密切相关，细胞膜电容的变化反映细胞膜厚度、细胞膜组成成分以及细胞自身尺寸发生的变化，而细胞膜厚度及成分与细胞种类、状态、形态密切相关，因此检测细胞膜电容不仅可以区分不同种类的细胞，也可以区分不同状态的细胞，如癌变与正常细胞、不同种类的细胞、穿孔的细胞与正常细胞、分化与未分化的干细胞、处于不同生长周期的细胞等。然而目前对于细胞膜电容特性的检测均缺乏有效的手段，且无法实现单个细胞膜电容的获取。为实现细胞信息的实时获取，就需要发展可实现细胞电生理特征的实时、个性化无损获取的新方法。目前，具有免标记且高吞吐量特性的细胞电特性实时获取方法，尚未报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种基于光诱导介电泳机械力的无损免标记癌细胞电特性获取方法，为癌细胞的早期个性化诊疗提供技术手段。

本发明采用的技术方案是：基于光诱导介电泳机械力的免标记细胞电特性获取方法，包括以下步骤：

将入射光投影到光电子镊芯片下表面；信号发生器发出交流电压至光电子镊芯片的导电层；

细胞开始远离入射光运动；增加外加交流电压的频率，当某细胞静止时，此时的频率为该细胞的交越频率；继续增加交流电压的频率，该细胞朝入射光处运动；当所有细胞均进入入射光范围内，关闭入射光及外加交流电压；得到各细胞的交越频率和直径的关系；

根据细胞膜电容与细胞直径的关系，得到各细胞膜电容。

所述入射光为光斑型图案。

所述交流电压的频率为20kHz～55kHz。

所述根据细胞膜电容与细胞直径的关系，得到各细胞膜电容通过下式得到：

$f_{\mathrm{crossover}}=\frac{\sqrt{2}{\mathrm{\σ}}_m}{2\mathrm{\πR}{C}_m}$

其中，f_crossover为细胞的交越频率，R为细胞半径，C_m为细胞膜电容，σ_m为溶液电导率。

本发明的优点与积极效果为：

1.本发明无需制备特异性结构的金属微电极；可实时获取单个或多个细胞的电特性参数。

2.本发明可实现数字化、机器人化的癌细胞电参数获取。

3.本发明无需利用抗体对细胞进行标识。

4.本发明具有自动化、批量化及吞吐量高的优点。

5.本发明依据细胞自身电生理特性与其在光诱导电场中极化的偶联关系，可实现利用光诱导介电泳机械力实时获取细胞的膜电容特性。

附图说明

图1为本发明的细胞电特性获取系统结构示意图。

图2为淋巴瘤B细胞交越频率获取实验过程图；

其中，(a)为当外加频率为从20kHz到55kHz时的细胞运动图；(b)为当频率升高至57kHz时的细胞运动图；(c)为升高频率至60kHz时的细胞运动图；(d)为当频率为64kHz时的细胞运动图；(e)为当频率升高至75kHz时的细胞运动图；(f)为关闭入射光及外加交流电压时，细胞的最终位置。

图3为淋巴瘤B细胞交越频率分布图。

图4为淋巴瘤B细胞膜电容分布图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详述。

本发明是将光机电自动化技术融入生命科学，利用计算机产生并控制的数字化可编程入射光，经投影仪投射于光电子镊芯片从而激发诱导产生空间虚拟非均匀电场；该非均匀电场与悬浮于芯片中的细胞相互作用而产生光诱导介电泳机械力；由于不同频率的外加交流电压会引起细胞平移行为特征的不同，同时不同种类的细胞在电场作用下其极化机制也不同，因此，借助于外加交流电压频率的变化，利用光诱导介电泳机械力，可实现细胞电特性参数的无损、免标记、个性化获取。

在不同频率的外加交流电压下，光诱导介电泳机械力作用于癌细胞时，癌细胞产生不同的平移行为，即被入射光吸引或排斥。本发明以淋巴瘤B细胞为例，具体如下：

处于光诱导非均匀电场中的细胞，由于被非均匀电场极化而产生可控性运动的行为称为介电泳机械力，光电子镊芯片中的细胞受到的介电泳力称为光诱导介电泳机械力，对于细胞，其表达式为:

$F_{\mathrm{DEP}}=2\mathrm{\π}{R}^3{\mathrm{\ϵ}}_m\mathrm{Re}\left[K\left(\mathrm{\ω}\right)\right]\▿E_{\mathrm{rms}}^2---\left(1\right)$

其中K(ω)表达式为：

$K\left(\mathrm{\ω}\right)=\frac{{\mathrm{\ϵ}}_p^{*}-{\mathrm{\ϵ}}_m^{*}}{{\mathrm{\ϵ}}_p^{*}+2{\mathrm{\ϵ}}_m^{*}}---\left(2\right)$

上式中，R为细胞半径，E_rms为电场强度有效值，ε^*为复介电常数，表达式为ε^*＝ε–jσ/ω，ε、σ分别为介电常数和电导率，下角标p、m分别代表细胞和液体。Re[K(ω)]为Clausius-Mossotti(CM)极化因子的实部，其取值范围为-0.5～1。当CM极化因子大于零时，细胞受正介电泳机械力作用，向入射光处运动；当CM极化因子小于零时，被操纵细胞远离入射光处；而当CM极化因子等于零时，细胞受零介电泳力作用，应呈现出静止行为，此时的频率定义为交越频率。因此，当施加不同频率的外加交流电压时，细胞将呈现出被吸引、静止、排斥三种连续变化的行为特征；通过计算机实时检测细胞行为特征发生变化的频率，即可获得细胞的交越频率。

淋巴瘤B细胞一般被看作球形单层核壳结构，其复介电常数表达式为：

${\mathrm{\ϵ}}_p^{*}=C_{m}R\frac{\mathrm{j\ω}{\mathrm{\τ}}_c+1}{\mathrm{j\ω}({\mathrm{\τ}}_c+{\mathrm{\τ}}_m)+1}---\left(3\right)$

其中C_m为细胞膜电容，τ_c＝ε_c/σ_c，τ_m＝C_mR/σ_c，下角标c代表细胞质。ω为交流电压角频率,其表达式为ω＝2πf，其中f为交流电压频率。

联合公式(2)与(3)，可得淋巴瘤B细胞的交越频率表达式为：

$f_{\mathrm{crossover}}=\frac{\sqrt{2}{\mathrm{\σ}}_m}{2\mathrm{\πR}{C}_m}---\left(4\right)$

本发明的光电子镊实验系统如图1所示。由计算机产生的可编程图案，经投影仪传输，并通过物镜(50×)聚焦后，照射光电子镊芯片的下表面(光电子镊芯片结构可参见专利《基于聚3-己基噻吩和C60衍生物的光敏混合聚合物光电导薄膜操控芯片及制备方法》，申请号为201010562995.2，申请公布号为CN102478581A)；由函数信号发生器产生的交流电压，通过导线连接，分别作用于光电子镊芯片上、下表面的导电电极；细胞的运动状态，通过装有CCD的光学显微镜进行实时的观测和记录。

当可编程的数字化入射光通过投影仪照射于光电子镊芯片时，入射光激发半导体光敏材料产生电子空穴对，使得入射光明亮处的电阻显著减小，从而在溶液层中产生空间非均匀电场；空间非均匀电场与悬浮于溶液层中的癌细胞相互作用，产生的光诱导介电泳机械力作用于癌细胞；由于癌细胞自身几何尺寸、电生理特性与其在光诱导电场中的极化特性存在偶联关系，因此可通过控制不同频率的外加交流电压，获得癌细胞的交越频率，从而获得癌细胞的膜电容。

采用光斑型图案作为入射光类型；调整外加交流电压的频率，初始时，细胞呈现出被排斥而远离入射光的行为运动特征；不断增加外加交流电压的频率，细胞逐渐呈现出静止行为；细胞完全静止的频率，即为细胞的交越频率；进一步增加外加交流电压的频率，细胞呈现出被吸引而朝入射光明亮处运动的行为特征。

如图2所示，为求取四种不同尺寸的淋巴瘤B细胞在光电子镊芯片中的交越频率实验过程，其中外加交流电压为5V_pp，淋巴瘤B细胞悬浮液电导率为1.5×10^-2S/m，入射光斑直径为60μm。其具体过程为：如图2(a)所示，当外加频率为从20kHz到55kHz时，四种尺寸的淋巴瘤B细胞均被排斥而远离入射光处，一般地，当频率低于20kHz时，淋巴瘤B细胞易裂解；当频率升高至57kHz时，15μm直径的淋巴瘤B细胞I被吸引移动至入射光处(如图2(b))，此频率即为交越频率，在此频率下，其他三种尺寸的淋巴瘤B细胞均位于远离入射光处；进一步升高频率至60kHz时，14μm直径的淋巴瘤B细胞II被吸引至入射光处，而淋巴瘤B细胞I则完全被吸引至入射光内部，而其他两种尺寸的淋巴瘤B细胞均在入射光明亮区域之外，淋巴瘤B细胞II的交越频率为60kHz，(如图2(c))；当频率为64kHz时，13μm直径的淋巴瘤B细胞III被吸引至入射光处，(如图2(d))，而淋巴瘤B细胞I与淋巴瘤B细胞II均位于入射光内部，淋巴瘤B细胞IV仍在入射光明亮区域之外，此63kHz即为淋巴瘤B细胞III的交越频率；当频率升高至75kHz时，10μm直径的淋巴瘤B细胞IV被吸引至入射光处，此频率即为淋巴瘤B细胞IV的交越频率，如图2(e)所示；关闭入射光及外加交流电压，细胞最终位置如图2(f)所示，表明：当四种不同尺寸的淋巴瘤B细胞被吸引至入射光明亮处后，仍均受正介电泳力作用。

如图3所示，为利用阵列型入射光斑投影光测试得出的淋巴瘤B的交越频率与其直径间关系。表明：当淋巴瘤B细胞直径增加时，其交越频率相应减小。

如图4所示，为经过计算获得的淋巴瘤B细胞膜电容与直径间关系。利用图3中的淋巴瘤B细胞交越频率与淋巴瘤B细胞尺寸之间的实验结果，并联合公式(4)，可计算得出淋巴瘤B细胞的膜电容与淋巴瘤B细胞直径之间关系，计算结果如图4所示，淋巴瘤B细胞膜电容为从7.90E-3±0.27E-3F/m²到9.40E-3±0.34E-3F/m²。拟合结果表明：淋巴瘤B细胞膜电容与淋巴瘤B细胞直径满足反比例分布的关系。这是由于淋巴瘤B细胞处于不同的细胞周期，引起细胞内部的细胞器及细胞形态不同，从而导致较大尺寸的淋巴瘤B细胞在非均匀电场中极化特性较小。

Claims (4)

1.基于光诱导介电泳机械力的免标记细胞电特性获取方法，其特征在于包括以下步骤：

将入射光投影到光电子镊芯片下表面；信号发生器发出交流电压至光电子镊芯片的导电层；

细胞开始远离入射光运动；增加外加交流电压的频率，当某细胞静止时，此时的频率为该细胞的交越频率；继续增加交流电压的频率，该细胞朝入射光处运动；当所有细胞均进入入射光范围内，关闭入射光及外加交流电压；得到各细胞的交越频率和直径的关系；

根据细胞膜电容与细胞直径的关系，得到各细胞膜电容。

2.按权利要求1所述的基于光诱导介电泳机械力的免标记细胞电特性获取方法，其特征在于所述入射光为光斑型图案。

3.按权利要求1所述的基于光诱导介电泳机械力的免标记细胞电特性获取方法，其特征在于所述交流电压的频率为20kHz～55kHz。

4.按权利要求1所述的基于光诱导介电泳机械力的免标记细胞电特性获取方法，其特征在于所述根据细胞膜电容与细胞直径的关系，得到各细胞膜电容通过下式得到：

$f_{\mathrm{crossover}}=\frac{\sqrt{2}{\mathrm{\σ}}_m}{2\mathrm{\πR}{C}_m}$

其中，f_crossover为细胞的交越频率，R为细胞半径，C_m为细胞膜电容，σ_m为溶液电导率。