CN101130079A - 乳铁蛋白在制备防治人轮状病毒所致疾病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了乳铁蛋白在制备防治人轮状病毒所致疾病的药物中的应用。所述乳铁蛋白的半数有效剂量为278.45±12.88μg/mL。药物治疗指数为17.98。本发明提供了一种来源广泛、成本低廉、对HRV有较好防治效果的物质，为新药筛选提供了基础。
Description
(一)技术领域
本发明涉及乳铁蛋白在制备防治人轮状病毒所致疾病的药物中的应用。
(二)背景技术
乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)1960年首先由Groves从牛乳中分离获得，因与铁结合而呈红色，故称之为“红蛋白”。在发现之初，LF被认为是一种与铁的转运和存储有关的蛋白质，所以又称乳转铁蛋白。进一步研究表明，LF是一种分子量为70～80kD的糖蛋白，广泛存在于乳汁、唾液、泪液等外分泌液或血浆、中性粒细胞中。乳汁，尤其是初乳中LF的含量很高，如牛初乳中的LF质量浓度为1g/L。深入研究发现，LF是一种具有多种生物学功能的蛋白质，它不仅参与铁的转运，而且具有抗菌、抑菌、抗病毒、抗氧化、调节机体免疫和提高肠道对铁离子的吸收等作用，被认为是一种新型的抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂。
还有报道乳铁蛋白具有抗病毒作用乳铁蛋白通过抑制病毒进入细胞，减轻对人体肝细胞的损害。肝细胞病毒C(HCV)是一种有囊膜的单链RNA病毒，它可以引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌。LF可通过结合在肝细胞病毒C的囊膜蛋白上阻止病毒与靶细胞结合。但没能报道以实验表明LF对轮状病毒有抑制或抵抗作用。
人轮状病毒(HRV)是引起全世界婴幼儿严重胃肠炎和脱水的最主要病因，几乎所有儿童在出生后3～5年都感染过HRV。在发展中国家和发达国家中HRV感染情况相似，公共卫生条件的改善不能够减少轮状病毒腹泻的发病率。HRV感染是世界范围的，几乎每个儿童在5岁前都感染过HRV，在发展中国家和发达国家都是一个重要的健康和公共卫生问题，因此迫切需要研制一种成本低廉、对HRV有较好防治效果，可大范围推广使用的药物。
(三)发明内容
本发明既是为了提供一种成本低廉、对HRV有较好防治效果的物质，为新药筛选提供了基础。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是：
本发明提示：乳铁蛋白在制备防治人轮状病毒所致疾病的药物中的应用。
所述乳铁蛋白的半数有效剂量为278.45±12.88μg/mL。药物治疗指数为17.98。
本发明通过实验证明，乳铁蛋白不仅具有直接抗人轮状病毒的作用，还可提高细胞的抗人轮状病毒作用，并且还具有抑制人轮状病毒增殖的作用，另外也具有直接抗人轮状病毒和提高细胞的抗人轮状病毒的联合作用。因此，乳铁蛋白可用于制备抗人轮状病毒的药物、提高细胞抗人轮状病毒作用的药物中、以及抑制人轮状病毒增殖的药物，也可作为疫苗应用于人轮状病毒所致相关疾病的防疫。特别的，乳铁蛋白可用于制备预防和治疗人轮状病毒引起的婴幼儿腹泻。
所述的药物制成分散片时，每200片配方如下：乳铁蛋白50g、微晶纤维素30g、甘露醇10g、PVPP 10g、PVP适量。
所述的药物制成咀嚼片时，每1000片配方如下：乳铁蛋白100g，甘露醇40g，聚唯酮10g，硬脂酸镁适量。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一种来源广泛、成本低廉、对HRV有较好防治效果的物质，为新药筛选提供了基础。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：乳铁蛋白抗人轮状病毒作用
材料与方法：
1、细胞：采用MA-104细胞，在EagleMEM培养基营养液(0.05％谷氨酰胺，10％新生牛血清，双抗)培养成单层，形态良好；
2、病毒：采用人轮状病毒Wa株，为浙江大学医学院微生物研究室保存株；
3、药物：乳铁蛋白：由浙江省中医药研究院提供，以EagleMEM培养基稀释到实验浓度；
4、病毒滴定：采用空斑滴定法；
5、乳铁蛋白抗人轮状病毒作用：采用不同浓度的乳铁蛋白分别处理病毒、细胞和加入维持液，即直接抗病毒、提高细胞抗病毒能力和抑制病毒增殖三个作用环节，100空斑形成单位的人轮状病毒经10U/mL的胰蛋白酶(Sigma)37℃处理30分钟，感染形态良好MA-104细胞单层，37℃吸附30分钟，去除未吸附的病毒，加含1U/mL的胰蛋白酶的EagleM E M培养基维持液(0.05％谷氨酰胺，无新生牛血清，双抗)，37℃培养48小时后，覆盖含中性红的EagleMEM培养基维持琼脂，37℃培养48小时后计数病毒空斑；
6、药物治疗指数(TI)：按TI＝TD50/IC50进行计算，TI值愈大，表明药物的安全范围愈大。
实验结果：
1、乳铁蛋白直接抗人轮状病毒作用：浓度为5000、2500、1000、500、250、100、50、10、5、1和0ug/mL的乳铁蛋白37℃处理人轮病毒30分钟，结果病毒空斑抑制率平均(n＝6)分别为66.8、53.4、41.2、33.5、21.1、15.4、0.8、0.2、0、0和0％；
2、乳铁蛋白提高细胞人轮状抗病毒作用：浓度为5000、2500、1000、500、250、100、50、10、5、1和0ug/mL的乳铁蛋白37℃处理细胞30分钟，结果病毒空斑抑制率平均(n＝6)分别为42.8、38.4、36.2、31.5、27.1、16.4、8.3、1.8、0、0和0％；
3、乳铁蛋白抑制人轮状病毒增殖作用：浓度为5000、2500、1000、500、250、100、50、10、5、1和0ug/mL的乳铁蛋白加入维持液，结果病毒空斑抑制率平均(n＝6)分别为33.2、28.3、19.6、5.6、0、0、0、0、0、0和0％；
4、乳铁蛋白直接抗人轮状病毒和提高细胞人轮状抗病毒的联合作用：浓度为5000、2500、1000、500、250、100、50、10、5、1和0ug/mL的乳铁蛋白37℃处理细胞30分钟和37℃处理细胞30分钟，结果病毒空斑抑制率平均(n＝6)分别为70.2、68.4、59.6、51.3、48.7、40.6、30.5、22.6、12.3、6.6、1.1％；
5、药物半数有效剂量为278.45±12.88μg/mL。
药物治疗指数为17.98。
实施例2：牛乳铁蛋白(bLf)对轮状病毒感染的腹泻的治疗作用
为了解牛乳铁蛋白(bLf)对轮状病毒感染的腹泻的治疗作用，建立了树鼩感染轮状病毒的模型，用不同剂量bLf的对腹泻树鼩进行治疗，用电镜法观察粪便中的轮状病毒，同时计算轮状病毒的抗原检出率及抗原滴度及动物死亡率、平均死亡日、延长生命率。
1、材料
1.1试验动物：成年树鼩(健康无腹泻)，雌雄各半，由昆明中医学院动物中心提供；
1.2 bLf，浙江省中医药研究院提供；
1.3人轮状病毒粪液，昆明市儿童医院收集，经(RV-Ag)检测为轮状病毒强阳性
1.4轮状病毒的处理：收集多例经(RV-Ag)检测为轮状病毒阳性的儿童粪便600g，用PBS液1∶1稀释，经3000r/min，30′离心收集上清400ml加青霉素80万，链霉素800mg搅拌均匀置4℃冰箱。24h内送电镜检查，调整病毒含量至106/ml，同时镜检无其它细菌。待用。
1.5树鼩自制饲料的配方是：(按每kg百分比含量)
1.米粉20％(200g)2.玉米粉20％(200g)3.麦夫10％(100g)
4.黄豆粉10％(100g)5.小牛肉20％(200g)6.鸡蛋10％(100g)
7.全脂奶粉0.5％(50g)8.白糖0.3％(30g)9.食盐0.05％(5g)
10.鱼肝油0.05％(5g)11.生长素1片12.复合V.B.6片13.V.C.600mg
14.v.e.600mg15.蔬菜少许(白菜2片)16.水果17.凉开水少。
2、方法
2.1、轮状病毒动物模型的建立
用轮状病毒抗原(RV-Ag)对90只健康树鼩进行抗原检测，在呈阴性的动物中随机抽取♀
各半的10只作为正常对照组待用。另再随机抽取10只取粪样作电镜检查轮状病毒。电镜检查结果皆无轮状病毒颗粒(见电镜照片1)。用含量106/ml的人轮状病毒粪悬液对上述树鼩灌胃，每只2ml，当日上下午各灌胃一次。动物给病毒经72h后，普遍拉稀、精神萎靡、饲料剩余。用轮状病抗原(RV-Ag)检测，对呈强阳性(在显色读数时，即刻显深蓝)的树鼩随机分组，分别为高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型对照组、阳性对照组、正常对照组，对各组动物取粪样进行抗原检测及抗原滴度测定，检测及测定结果均表明除正常对照组外，其余各组均呈强阳性。同时对造模成型的高、中、低剂量组，病模对照组，阳性对照组分别随机抽取1只动物粪样进行电镜检查轮状病毒颗粒，检查结果为5只动物有可见光滑实心的轮状病毒颗粒。
2.2、牛乳铁蛋白对感染轮状病毒树鼩的治疗
高、中、低剂量组分别按动物体重5mg/g，1mg/g，0.2mg/g给予生理盐水稀释的牛乳铁蛋白，阳性对照组按动物体重给予0.75mg/g病毒唑，模型对照组和正常对照组给予生理盐水。以上各组每天给药一次，每次每只动物2ml。连续给药10天。同时给予充分相同的自制饲料和一般饮用水(自来水煮开冷却)。饲养室的室内温度和相对湿度分别控制在18℃～22℃，50％～60％。用电镜法观察粪便中的轮状病毒，同时计算轮状病毒的抗原检出率及抗原滴度及动物死亡率、平均死亡日、延长生命率。
死亡率＝死亡动物数/总的动物数×100％，
平均死亡日＝动物存活天数之和/总的动物数，
(不死亡的动物存活天数以10天计算)
延长生命率＝(各组平均死亡日-模型组平均死亡日)/模型组平均死亡日×100％
3、试验结果
3.1各给药组和对照组经过连续给药10天，死亡率、平均死亡日、延长生命率见表1。由表1可见，bLF高、中、低剂量组的死亡率分别为10％、20％、60％；平均死亡日分别为9.3、8.9、7.0天：延长生命率分别为93.7％、85.4％、45.8％，与模型对照组死亡率70％、平均死亡日4.8天均有显著区别。随着bLF剂量的增加，其抗轮状病毒的作用愈明显。
表1：各组死亡率、平均死亡日、延长生命率比较
| 死亡率(％) | 平均死亡日(天) | 延长生命率(％) | |
| 高剂量组 | 10 | 9.3 | 93.7 |
| 中剂量组 | 20 | 8.9 | 85.4 |
| 低剂量组 | 60 | 7.0 | 45.8 |
| 阳性对照组 | 60 | 5.9 | 22.9 |
| 模型对照组 | 70 | 4.8 | - |
| 正常对照组 | 20 | 9.0 | 87.5 |
3.2第11天所有的试验动物以RV-Ag进行轮状病毒抗原检测。检测结果为bLf高、中、低剂量组，阳性对照组、正常对照组的动物均呈阴性，模型对照组中3只动物有2只呈阳性，1只呈阴性。各组造模后及药物治疗后的抗原滴度比较，见表2。
表2：各组造模后及药物治疗后的抗原滴度比较
| 造模后治疗前 | 治疗后 | |||
| 动物数 | OD值 | 动物数 | OD值 | |
| 高剂量组 | 10 | 0.517±0.219 | 8 | 0.039±0.010 |
| 中剂量组 | 10 | 05.14±0.202 | 7 | 0.052±0.036 |
| 低剂量组 | 10 | 0.498±0.298 | 4 | 0.085±0.045 |
| 阳性对照组 | 10 | 0.524±0.236 | 4 | 0.135±0.039 |
| 模型对照组 | 10 | 0.510±0.218 | 3 | 0.155±0.036 |
| 正常对照组 | 10 | 0.137±0.185 | 8 | 0.076±0.033 |
3.3停止给药后一天，分别从bLf高、中、低剂量组，阳性对照组，正常对照组，模型对照组随机抽取1只取粪样进行电镜检查。检查结果为：病模组的1只样品有模糊的轮状病毒颗粒，其它5组中抽取的5只动物无一例可见有轮状病毒颗粒。
结论：乳铁蛋白对成年树鼩感染了轮状病毒引起的腹泻有显著的治疗作用。
实施例3：分散片制备
乳铁蛋白50g、微晶纤维素30g、甘露醇10g、PVPP 10g、PVP适量(约0.1g)，制成200片。
实施例4：咀嚼片制备
乳铁蛋白100g，甘露醇40g，聚唯酮10g，硬脂酸镁适量(约0.5g)，制成1000片。
Claims (6)
1.乳铁蛋白在制备防治人轮状病毒所致疾病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述乳铁蛋白的半数有效剂量为278.45±12.88μg/mL。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：乳铁蛋白在制备抗人轮状病毒的药物中的应用。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：乳铁蛋白在制备提高细胞抗人轮状病毒作用的药物中的应用。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：乳铁蛋白在制备抑制人轮状病毒增殖的药物中的应用。
6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：乳铁蛋白在制备防治人轮状病毒引起的婴幼儿腹泻的药物中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN103429092A (zh) * | 2010-12-29 | 2013-12-04 | Mjn美国控股有限责任公司 | 包含乳铁蛋白的营养组合物在支持抵抗疾病和状况中的用途 |
| CN114129713A (zh) * | 2021-11-23 | 2022-03-04 | 南方科技大学 | 乳铁蛋白活性肽或编码该活性肽的核苷酸序列在制备抗炎和/或抗氧化产品中的应用 |
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2007
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