CN101126081A - 一种抗人基质金属蛋白酶的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种抗人基质金属蛋白酶的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种抗中国人种基质金属蛋白酶的单克隆抗体及其在检测MMP9的ELISA试剂盒中的应用。该单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.1743，保藏日为2006年6月27日的杂交瘤细胞制得。所述的该单抗在检测MMP9的ELISA试剂盒中的应用包括：该单抗包被的96孔酶标板，采用辣根过氧化物酶标记的抗MMP9的多克隆抗体双抗夹心检测样品中的MMP9的含量。对于判断中国人在肝癌手术后是否转移复发时有重大的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗人基质金属蛋白酶的单克隆抗体，及其在检测基质金属蛋白酶含量试剂盒中的应用
背景技术
研究表明，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，简称MMP)是一种肽链内切酶，对肿瘤的侵袭和转移产生重要作用，特别是MMP-9与恶性肿瘤侵袭和转移的关系更为密切，MMP-9不仅可以降解细胞外基质成分，还能够降解IV型胶原，从而直接导致基底膜的破坏，使肿瘤细胞释放入血。许多恶性肿瘤患者和肝脏疾病患者的外周血中MMP-9的含量均有明显升高。因而，MMP-9的检测对鉴别肿瘤具有重要意义。
检测血清中MMP9的最灵敏和准确的方法是酶联免疫吸附试验(ELISA法)。该方法的原理是将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用分光光度计判定结果。建立该方法的关键是制备特异性单克隆抗体，因为单克隆抗体的质量决定ELISA法的灵敏度和准确度。
美国Amershan Biosceinces和R&D Systems Inc公司研发了一种检测基质金属蛋白酶的试剂盒，包括：一抗包被96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，缓冲液，和显色剂。其中，抗体是以美国人的基质金属蛋白酶为抗原制备的。该试剂盒的灵敏度为0.6ng/ml，可对血清，血浆及细胞培养液等样本中的基质金属蛋白酶含量进行定量检测。其检测原理采用了常规的酶联免疫双抗体夹心法(ELISA)。使用时，将以美国人的基质金属蛋白酶为抗原制备的抗体加入固相载体——酶标板的凹孔上，加入待测样品，孵育半小时，样品中的抗原可与载体上的抗体结合，用缓冲液洗去非特异结合的杂蛋白后，再加入该抗原的酶标记抗体并孵育半小时，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。检测的结果可以作为临床上肝癌患者术后复发和转移的一个重要的指标。
但是，美国Amershan Biosceinces和R&D Systems Inc公司研发的这种试剂盒所用的制备抗体的抗原是基于美国人的基因表达的，而中国汉族人的基因由于种族差别，与美国人种存在着相当大的差异，因而使用这种试剂盒检测中国人的基质金属蛋白酶时，准确性不高，有时甚至检测不到。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术检测基质金属蛋白酶时，使用的是基于美国人的基因表达的抗原制备的抗体，其在检测中国人的基质金属蛋白酶时，准确性不高的缺陷，从而提供一种适用于抗中国人种基质金属蛋白酶的、新的MMP-9表位的单克隆抗体，该抗原与美国产的试剂盒中所用的抗原不同，在第13位的氨基酸由丝氨酸突变为脯氨酸。
本发明的另一目的在于提供一种采用所述的单克隆抗体检测血清样本中基质金属蛋白酶含量的试剂盒。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：
本发明选择中国汉族肝癌患者术后切除的肝癌组织，提取RNA后用逆转录酶合成cDNA，再用高保真DNA聚合酶采用PCR方法扩增MMP-9基因片断，经基因测序后构建表达载体并在大肠杆菌表达和纯化，制备出与目前试剂盒用的不同表位的抗原。本发明用不同表位的抗原按照常规标准单克隆抗体制备技术制备出数株单克隆抗体。
本发明提供一种适用于抗中国人种基质金属蛋白酶的单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.1743，保藏日为2006年6月27日的杂交瘤细胞制得。
本发明提供的杂交瘤细胞系，已于2006年6月27日保藏在《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)，其保藏号为CGMCC No.1743，其分类命名为基质金属蛋白酶的单克隆抗体细胞株。
本发明提供一种包含了上述抗中国人种基质金属蛋白酶的单克隆抗体的试剂盒，可以用于准确检测中国人血清中的基质金属蛋白酶，其包括：一抗中国人种基质金属蛋白酶多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记的本发明所述的单克隆抗体，洗涤液和显色剂。
所述的洗涤液优选为pH7.0，0.01M PBS(磷酸盐缓冲液)，0.1M NaCl，0.1％吐温20的混合液；
所述的显色剂优选为4-氯-1-萘酚，简称TMB。
本发明提供的检测基质金属蛋白酶的试剂盒采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清和活体组织中基质金属蛋白酶含量，灵敏度高，特异性好，操作简单，价格低廉。尤其适用于中国人种，对于判断中国人在肝癌手术后是否转移复发时有重大的意义。
附图说明
图1为中国汉族病人肝癌基质金属蛋白酶的核苷酸序列；
图2为中国汉族病人肝癌基质金属蛋白酶的氨基酸序列；
图3为美国人的基质金属蛋白酶的氨基酸序列；
图4为单克隆阳性克隆株的western blot的检测，泳道1为重组的基质金属蛋白酶与单抗结合，泳道2和3分别是血清上样量为15μl和10μl的样品与单抗的结合。
具体实施方式
实施例1、中国汉族人基质金属蛋白酶的获得
本发明提供的作为抗原的基质金属蛋白酶，为采用基因工程技术从中国汉族病人肝癌患者的肝癌组织中提取的RNA，经反转录和RT-PCR获得基质金属蛋白酶基因，然后克隆到质粒中，转化大肠杆菌表达后得到的，其具体的克隆和纯化过程如下：
1)首先采用常规技术从中国汉族人群的肝癌患者的肝癌组织克隆基质金属蛋白酶基因并测序。反转录和RT-PCR的具体条件以及相应的引物序列为：
上游引物：ggA TCC ggC CgC TCC TAC TCT gC，下划线标注为BamHI位点
下游引物：gTC gAC TA T gTC gCT gTC A A A gTT Cg，下划线标注为SalI位点
反转录的条件为：cDNA的合成：取5μl总RNA加入1μl Oligo(dT)18、2μl dNTP，用DEPC水补至12μl混匀，65℃孵育10min，置冰上3～5min；加入4μl 5×缓冲液，1μl DTT，1μl逆转录酶AMV，1μl RNA酶抑制剂，DEPC水补足至20μl，混匀后，50℃孵育1h，85℃孵育5min，终止反应，-20℃保存。
RT-PCR反应条件step1：94℃5min，step2：94℃1min，step3：60℃ 30sec，step4：72℃1min，step5：return to step 2for 35cycles，step6：72℃10min，step7：end.0.8％琼脂糖电泳鉴定。PCR所用酶为高保真的pfu DNA聚合酶。
克隆的基质金属蛋白酶基因其具有图1所示的核苷酸序列，图2为图1序列所对应的氨基酸序列，与美国人的基质金属蛋白酶的氨基酸序列(如图3所示)相比，在第13个位置上的氨基酸不同；
2)将步骤1)获得的基质金属蛋白酶的图1所示的基因克隆到pQE-30(Qiagen公司)表达质粒，将pQE-30载体和RT-PCR产物分别用BamH I和Sal I双酶切后用T4连接酶连接，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE)，涂布含氨苄青霉素的琼脂平板，37℃生长，待菌落长出后，挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的液体培养基中，37℃，200rpm生长过夜；第二天，以1∶100接种于新鲜含氨卞青霉素的LB培养基中，37℃生长到OD600＝0.6～0.9之间；按终浓度0.5mM加入1M的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，37℃，200rpm，诱导3小时；5000rpm，4℃离心10分钟，菌体反复冻融三次，超声波破碎；1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，沉淀为包涵体，包涵体用含1％的Triton-X100洗涤一次，1000rpm，4℃离心10分钟；用pH8.0、0.02M PBS(磷酸盐缓冲液)、6M盐酸胍缓冲液溶解包涵体，1000rpm，4℃离心10分钟；用pH8.0、0.02M PBS、8M尿素缓冲液平衡Ni-金属亲和柱，已溶解的包涵体过柱，基质金属蛋白酶蛋白被吸附，用含0.1M NaCl、pH8.0、0.02PBS、8M尿素的缓冲液洗涤除去杂蛋白，用含0.5M NaCl、pH8.0、0.02M PBS、8M尿素缓冲液洗脱，获得中国人种的基质金属蛋白酶，用适量pH8.0、0.02M PBS、8M尿素缓冲液稀释至0.5mg/ml，-20℃冻存。
实施例2、多克隆抗基质金属蛋白酶抗体的制备
本发明所述的多克隆抗基质金属蛋白酶抗体的制备包括如下步骤：
1)免疫用抗原的制备：将实施例1步骤2)中获得的中国人种的基质金属蛋白酶作为抗原，
首次免疫用抗原为200μg/只和等量福氏完全佐剂的混合物；
加强免疫用抗原为200μg/只和5ml福氏不完全佐剂的混合物；
2)免疫程序：选雌性2.5公斤的新西兰大白兔(购于中国医学科学院动物实验中心)饲养数周后，在背部脊柱两侧脱毛区取5～10个接种点接种；然后每隔10天加强接种一次；共加强免疫4次；
3)采血：首次免疫前取耳缘静脉采血，第3次以后各次加强免疫前各采血1次，第5次加强免疫后一周，颈动脉取血；
4)分离血清：分别以饱和硫酸铵分级沉淀血清(从大白兔处死后获得的抗血清)分离抗体，离心后去上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，得到含有抗基质金属蛋白酶多克隆抗体的溶液。
实施例3、生产中国人的基质金属蛋白酶的单克隆抗体杂交瘤细胞株及单克隆抗基质金属蛋白酶抗体的制备
1)免疫用抗原：实施例1步骤2)中获得的中国人种的基质金属蛋白酶；
2)免疫程序：采用BALB/c小白鼠(购于中国医学科学院动物实验中心)作为免疫动物，首次免疫抗原剂量为50μg/只，经腹腔注射，在间隔10～14天，加强免疫4次，取脾细胞；
3)细胞融合：取对数生长期的骨髓瘤细胞SP 2/0与脾细胞在聚乙二醇(分子量4000)的溶剂中进行细胞融合，在含HAT(H是次黄嘌呤hypoxanthine的简称，A是氨甲喋呤Aminopterin的简称，T是胸腺嘧啶核苷Thymidine的简称)培养液中作选择培养；
4)杂交瘤细胞克隆化：采用常规的有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直至得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；
所述的杂交瘤细胞系已于2006年6月27日保藏在《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)，其保藏号为CGMCC No.1743，其分类命名为基质金属蛋白酶的单克隆抗体细胞株；
5)杂交瘤细胞的保存：在液氮中保存；
6)单克隆抗体大量生长及提纯：在小鼠腹腔内注射一定量的杂交瘤细胞，采集腹水，经常规方法提纯后分装待用；
所述的单克隆抗体纯化方法按伯乐公司提供的蛋白A亲和层析柱(Affi-gelProtein-A Agarose(BioRad #153-6153))法纯化，具体如下：用结合缓冲液按1∶5稀释腹水或抗血清，用2个柱体积的结合缓冲液平衡蛋白A亲和层析柱，上样，用5～6个柱体积的结合缓冲液洗柱，用5个柱体积的洗脱缓冲液洗柱用50微升1M Tris接1毫升洗脱液，用2X 4L PBS透析，2～8℃，过夜，抗体保存在-20℃。
实施例4、辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体的制备
将实施例3得到的单克隆抗基质金属蛋白酶抗体用pH9.5、50mM的碳酸缓冲液(CB)透析过夜；
按抗原：HRP的重量比为1∶1的比例，取适量HRP，用高碘酸钠法将HRP活化后，加入1mM pH4.0醋酸缓冲液透析过夜；
第二天，按单克隆抗体：HRP的重量比为1∶1的比例，将单克隆抗基质金属蛋白酶抗体和活化后的HRP混和，用适量pH9.5、0.2M CB调整混合物pH9.2，用pH9.5、0.01M CB调整混合液的体积至单克隆抗基质金属蛋白酶抗体的浓度为1.0mg/ml，25℃暗处反应2小时，然后将反应液降温至4℃，按1mg HRP加入51ul的量加入0.1M NaBH4，4℃反应2小时，终止连接反应；
将反应液装入透析袋，加入pH7.0、0.02M PBS、0.2M NaCl，透析48小时，中间每6小时换液一次；
透析完成后，加入等体积的甘油，混合均匀，-20℃存放，即获得辣根过氧化物酶标记的单克隆抗基质金属蛋白酶抗体。
实施例5、用于中国人种基质金属蛋白酶检测的试剂盒
本发明提供的用于中国人种基质金属蛋白酶检测的试剂盒包括：一多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，洗涤液(pH7.0，0.01M PBS(磷酸盐缓冲液)，0.1MNaCl，0.1％吐温20的混合液)和显色剂(4-氯-1-萘酚，简称TMB)。
本发明提供的试剂盒，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清或活体组织中的基质金属蛋白酶含量，包括如下的步骤：
1)使用多克隆抗体包被的96孔酶标板：将0.5mg/ml实施例2制备的抗基质金属蛋白酶多克隆抗体的溶液按1∶1000的(v/v)用pH9.50、0.05M CB稀释；将此稀释液按100ul/孔加到酶标板的凹孔中，于4℃过夜；使用洗涤液(pH7.0、0.01M PB、0.1M NaCl、0.1％tween·20)洗板一次，按115μl/孔加入含5％小牛血清的pH7.0、0.01M PBS封板，4℃封闭过夜；然后吸净封板液，37℃干燥2小时，加干燥剂封装于铝箔袋中，得到多克隆抗体包被的96孔酶标板；
2)检测时，在包被反应孔中先加入50μl pH7.0、0.01M PBS、0.1M NaCl的PBS，然后加入50ul待检血清、阴性对照为正常人血清(来自献血员)、阳性对照为重组MMP9蛋白，37℃温育20分钟，样品中的抗原可与酶标板上的多克隆抗体结合，用洗涤液(pH7.0，0.01M PBS，0.1MNaCl，0.1％吐温20)洗板五次，洗去非特异结合的杂蛋白；
再加入按1∶3000(v/v)用含20％小牛血清PBS稀释的前述的辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体，37℃温育20分钟，洗去未结合的酶标抗体；
加入显色剂A、B液各1滴，37℃显色10分钟，所述的显色剂A液为H2O2，显色剂B液为TMB(4-氯-1-萘酚)，显色完成后，每孔加入50μl 2M H2SO4终止反应，用酶免疫检测仪在450nm波长读取结果。
对研制的试剂盒检测方法进行质量研究，结果显示：采用该试剂盒检测病人血清中MMP9的含量时，批内检测结果变异系数(CV)为：26.7％：批间检测结果变异系数CV)为：24.07％：标准曲线线性范围为：15.6ng/ml-500ng/ml：标准曲线线性相关系数复相关系数R2为：0.992：检测样品中MMP9的含量的灵敏度为：153.2ng/ml。说明本发明的试剂盒能与中国人基质金属蛋白酶特异性结合。
实施例6、Western Blot免疫印迹实验检测单抗与中国人基质金属相关蛋白酶结合反应
用大肠杆菌体外翻译系统合成重组中国人基质金属蛋白酶(Yanan Liu，DalongMa.Expression of Recombinant Chemokine-Like Factor 1with a Cell-Free ProteinBiosynthesis system.Cell-Free Protein Expression.Editor：Dr.James R.Swartz，2nd ed，2003，ISBN 3-540-05041-8，Springer，Chapter 20，pp165-177)。将合成的重组中国人基质金属蛋白酶5～10ug/毫升和正常人血清15微升和10微升进行15％SDS-PAGE电泳，按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到硝酸纤维素膜上。用实施例3制得的单克隆抗体为一抗，用酶标记兔抗鼠的lgG为二抗做Western Blot免疫印迹实验，结果如图4所示，显示均为特异的一条带，其中泳道1为重组的基质金属蛋白酶与单抗结合，泳道2和3分别是血清上样量为15μl和10μl的样品与单抗的结合。该实验说明本发明制得的单抗与中国人基质金属蛋白酶具有较强的特异性反应。
ELISA和Western Blot的结果都证明本发明制得的单抗能与基质金属蛋白酶发生强烈的结合反应，因此本发明的单抗可以应用到基础研究和临床应用研究。例如该单抗可用于定量检测肝癌患者外周血中MMP-9浓度，作为协助诊断肝癌的参考指标，并且在治疗前检测周围血中MMP-9的水平能够作为预测肝癌复发转移的较好的指标；治疗前外周血MMP-9高水平的肝癌患者可考虑在介入或手术等局部治疗前后给与系统化治疗，预防其转移的发生，以期提高治愈率。
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SEQUENCE LISTING
<110>中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所
<120>一种抗人基质金属蛋白酶的单克隆抗体及其应用
<130>FPI06211
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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Claims (4)
1.一种杂交瘤细胞，于2006年6月27日保藏在《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1743，其分类命名为基质金属蛋白酶的单克隆抗体细胞株。
2.一种抗中国人种基质金属蛋白酶的单克隆抗体，该单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞制得。
3.一种权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测中国人种基质金属蛋白酶的ELISA试剂盒中应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的ELISA试剂盒包括：抗基质金属蛋白酶多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记的权利要求2所述的抗中国人种基质金属蛋白酶单克隆抗体，洗涤液和显色剂。
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2006
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |