CN101115845B - 微生物数的测定方法及微生物数的测定装置 - Google Patents

微生物数的测定方法及微生物数的测定装置 Download PDF

Info

Publication number
CN101115845B
CN101115845B CN2005800403514A CN200580040351A CN101115845B CN 101115845 B CN101115845 B CN 101115845B CN 2005800403514 A CN2005800403514 A CN 2005800403514A CN 200580040351 A CN200580040351 A CN 200580040351A CN 101115845 B CN101115845 B CN 101115845B
Authority
CN
China
Prior art keywords
electric current
value
minute
microbe quantity
oxygen electric
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2005800403514A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101115845A (zh
Inventor
赤松惠
奥村千晶
宫原精一郎
福井直树
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daikin Industries Ltd
Original Assignee
Daikin Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daikin Industries Ltd filed Critical Daikin Industries Ltd
Publication of CN101115845A publication Critical patent/CN101115845A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101115845B publication Critical patent/CN101115845B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明提供微生物数的测定方法及微生物数的测定装置。所述微生物数的测定方法及微生物数的测定装置对在沿流程图的处理中使用的各种设定进行复位(SI00)。进行氧电流(Inew)的测定(S101)。求出氧电流的斜率(SA)。判定能否判断为该斜率稳定(SB)。确定第1测定时间(SC)。为了对斜率的稳定进行判定，依次进行氧电流(Inew)的测定，更新求出氧电流的斜率直到判断为稳定。在判断为斜率稳定时确定第1测定时间(SC)。在判断为斜率不稳定时进一步进行氧电流(Inew)的测定。

Description

微生物数的测定方法及微生物数的测定装置 
技术领域
本发明涉及计算微生物的个体数的方法。 
背景技术
已经提出了各种计算微生物的个体数的方法。例如，在作为公定法而采用的方法中，存在如下的方法：在培养基中对细菌进行增菌培养，经过预定时间之后对群体(colony)进行计数而求出初始菌数。 
但是，进行增菌培养直到能够目视辨认群体的程度需要近二十小时。因此，提出了对培养微生物的培养基中的溶解的氧浓度进行测定的方法。例如，通过测定流过氧电极的电流(以下称为“氧电流”)，从而测定培养基中的溶解的氧浓度。例如在专利文献1中公开了所述方法。但是，在专利文献1中示出的方法中，是对氧电流达到预定的阈值为止的时间进行计测。 
日本特开2003-235599号公报 
发明内容
本发明的目的在于提供基于氧电流的能够更早地评价微生物的个体数的方法。 
该发明的微生物数的测定方法的第1方面是，在包含有以初始个数作为测定对象的微生物的培养基中，依次对根据氧量而流过的电流即氧电流(Inew)进行测定(S101、S112)，求出所述氧电流预定次数(Z2)超过第1阈值(IP)而降低所需的时间即第1测定时间(ts)，其中，所述微生物的测定方法具备下述步骤(a)～(c)。即：(a)根据预定的测定期间的所述氧电流的测定值，求出所述氧电流的每单位时间的差分即时间差分值(Knew)的步骤(SA)；(b)判定在所述步骤(a)中求出的 所述时间差分值是否稳定的步骤(SB)；以及(c)当所述步骤(b)的判定为肯定时，设定所述第1阈值，使得所述第1阈值依赖于基于在最近的所述测定期间所测定的所述氧电流(I1～IZ+1)的值、且比该值低的步骤(S114a、S114b)。 
该发明的微生物数的测定方法的第2方面是，在微生物数的测定方法的第1方面中，在所述步骤(c)中，从最近所测定的所述氧电流(IZ+1)减去预定的阈值(Δ)来设定所述第1阈值(IP)。 
该发明的微生物数的测定方法的第3方面是，在微生物数的测定方法的第2方面中，在所述步骤(c)中，将最近所测定的所述氧电流(IZ+1)乘以大于0小于1的系数(q)来设定所述第1阈值(IP)。 
在微生物数的测定方法的第3方面中，优选将所述系数(q)设定为0.8。 
该发明的微生物数的测定方法的第4方面是，在包含有以初始个数作为测定对象的微生物的培养基中，依次对根据氧量而流过的电流即氧电流(Inew)进行测定(S101、S112)，求出所述氧电流的减小超过阈值(E3)而变得缓和的第1测定时间(tu)，其中，所述微生物的测定方法具备下述步骤(a)～(c)。即：(a)根据预定的测定期间的所述氧电流的测定值，求出所述氧电流的每单位时间的差分即时间差分值(Knew)的步骤(SA)；(b)判定在所述步骤(a)中求出的所述时间差分值是否稳定的步骤(SB)；以及(c)当所述步骤(b)的判定为肯定时，在之后所测定的所述时间差分值(Knew)相比步骤(b)的所述时间差分值(Kold)增大、且增量超过所述阈值的情况下，根据在最近所测定的所述测定期间来确定所述测定时间的步骤(SC)。 
本发明的微生物数的测定方法的第5方面是，在微生物数的测定方法的第1方面至第4方面中的任意一方中，在所述步骤(b)中，根据所述时间差分值的绝对值(|Knew|)在预定期间收敛于预定范围(E2)内(S108b、S109)，判定为所述时间差分值稳定。 
本发明的微生物数的测定方法的第6方面是，在微生物数的测定方法的第1方面至第5方面中的任意一方中，在所述步骤(b)中，根据所 述时间差分值的相对于时间的变动(|Knew-Kold|/Δt)的绝对值在预定期间内收敛于预定范围(E1)内(S108a、S109)，判定为所述时间差分值稳定。 
在微生物数的测定方法的第6方面中，优选所述预定范围(E1)换算为电流密度时为0.6nA/mm2/min2，所述预定次数(Z2)是10次，所述预定期间是连续5次(Z1)进行所述氧电流的测定的长度。 
本发明的微生物数的测定方法的第7方面是，在微生物数的测定方法的第1方面至第6方面中的任意一方中，在所述步骤(b)中，在所述步骤(a)之后，经过了预定的停歇时间后，判定所述时间差分值是否稳定。 
本发明的微生物数的测定方法的第8方面是，在微生物数的测定方法的第7方面中，将所述停歇时间设定为200分钟。 
本发明的微生物数的测定方法的第9方面是，在微生物数的测定方法的第1方面至第8方面中的任意一方中，所述微生物数的测定方法还具备：(d)求出第2测定时间(tt)的步骤，所述第2测定时间(tt)是所述氧电流超过第2阈值(Id)而降低所需的时间。 
本发明的微生物数的测定方法的第10方面是，在微生物数的测定方法的第9方面中，所述第2阈值(Id)换算为电流密度时是60nA/mm2/min2。 
本发明的微生物数的测定方法的第11方面是，在微生物数的测定方法的第1方面至第10方面中的任意一方中，根据标准曲线，针对所述微生物的所述初始个数为未知的所述培养基求出所述第1测定时间，计算出未知的所述初始个数。该标准曲线是根据与所述微生物的所述初始个数为已知且彼此不同的所述培养基中的各个培养基相关的所述第1测定时间与该已知的初始个数的关系，针对该微生物以及培养基而求出的。该标准曲线中成为所述第1测定时间的测定对象的所述培养基的种类与计算未知的所述初始个数时的所述培养基的种类相同。但是，在该方法的第11方面中，虽然基于所述标准曲线计算出所述微生物的未知的所述初始菌数，但在生成该标准曲线之前不要求进行该计算。 
本发明的微生物数的测定方法的第12方面是，在微生物数的测定方 法的第1方面至第11方面中的任意一方中，针对所述微生物的所述初始个数为已知且彼此不同的同一种类的所述培养基中的各个培养基，求出所述第1测定时间，根据多个该已知的所述初始个数与多个该第1测定时间的关系，求出关于该微生物以及该培养基的所述标准曲线。 
该发明的微生物数的测定装置的第1方面具备：氧电流测定部(201)，其在包含有以初始个数作为测定对象的微生物的培养基中，依次对根据氧量而流过的电流即氧电流(Inew)进行测定(S101、S112)；以及评价部(202)，其求出所述氧电流预定次数(Z2)超过第1阈值(IP)而降低所需的时间即第1测定时间(ts)。所述评价部执行下述步骤(a)～(c)。即：(a)根据预定的测定期间的所述氧电流的测定值，求出所述氧电流的每单位时间的差分即时间差分值(Knew)的步骤(SA)；(b)判定在所述步骤(a)中求出的所述时间差分值是否稳定的步骤(SB)；以及(c)当所述步骤(b)的判定为肯定时，设定所述第1阈值，使得所述第1阈值依赖于基于在最近的所述测定期间所测定的所述氧电流(I1～IZ+1)的值、且比该值低的步骤(S114a、S114b)。 
本发明的微生物数的测定装置的第2方面是，在微生物数的测定装置的第1方面中，在所述步骤(c)中，从最近所测定的所述氧电流(IZ+1)减去预定的阈值(Δ)来设定所述第1阈值(IP)。 
本发明的微生物数的测定装置的第3方面是，在微生物数的测定装置的第2方面中，将最近所测定的所述氧电流(IZ+1)乘以大于0小于1的系数(q)来设定所述第1阈值(IP)。 
在微生物数的测定装置的第3方面中，优选将所述系数(q)设定为0.8。 
该发明的微生物数的测定装置的第4方面具备：氧电流测定部(201)，其在包含有以初始个数作为测定对象的微生物的培养基中，依次对根据氧量而流过的电流即氧电流(Inew)进行测定；以及评价部(202)，其求出所述氧电流的减小超过阈值(E3)而变得缓和的第1测定时间(tu)。所述评价部执行下述步骤(a)～(c)。即：(a)根据预定的测定期间的所述氧电流的测定值，求出所述氧电流的每单位时间的差 分即时间差分值(Knew)的步骤(SA)；(b)判定在所述步骤(a)中求出的所述时间差分值是否稳定的步骤(SB)；以及(c)当所述步骤(b)的判定为肯定时，在之后所测定的所述时间差分值(Knew)相比步骤(b)的所述时间差分值(Kold)增大、且增量超过所述阈值的情况下，根据在最近所测定的所述测定期间来确定所述测定时间的步骤(SC)。 
本发明的微生物数的测定装置的第5方面是，在微生物数的测定装置的第1方面至第4方面中的任意一方中，在所述步骤(b)中，根据所述时间差分值的绝对值(|Knew|)在预定期间内收敛于预定范围(E2)内(S108b、S109)，判定为所述时间差分值稳定。 
本发明的微生物数的测定装置的第6方面是，在微生物数的测定装置的第1方面至第5方面中的任意一方中，在所述步骤(b)中，根据所述时间差分值的相对于时间的变动(|Knew-Kold|/Δt)的绝对值在预定期间内收敛于预定范围(E1)内(S108a、S109)，判定为所述时间差分值稳定。 
在微生物数的测定装置的第6方面中，优选所述预定范围(E1)换算为电流密度时是0.6nA/mm2/min2，所述预定次数(Z2)是10次，所述预定期间是连续5次(Z1)进行所述氧电流的测定的长度。 
本发明的微生物数的测定装置的第7方面是，在微生物数的测定装置的第1方面至第6方面中的任意一方中，在所述步骤(b)中，在所述步骤(a)之后，经过了预定的停歇时间后，判定所述时间差分值是否稳定。 
本发明的微生物数的测定装置的第8方面是，在微生物数的测定装置的第7方面中，所述停歇时间被设定为200分钟。 
本发明的微生物数的测定装置的第9方面是，在微生物数的测定装置的第1方面至第8方面中的任意一方中，所述评价部(201)还执行：(d)求出第2测定时间(tt)的步骤，所述第2测定时间(tt)是所述氧电流超过第2阈值(Id)而降低所需的时间。 
本发明的微生物数的测定装置的第10方面是，在微生物数的测定装置的第9方面中，所述第2阈值(Id)换算为电流密度时是60nA/mm2/min2。 
本发明的微生物数的测定装置的第11方面是，在微生物数的测定装置的第1方面至第10方面中的任意一方中，基于标准曲线，针对所述微生物的所述初始个数为未知的所述培养基求出所述第1测定时间，计算出为未知的所述初始个数。该标准曲线是根据与所述微生物的所述初始个数为已知且彼此不同的所述培养基中的各个培养基相关的所述第1测定时间与该已知的初始个数的关系，针对该微生物以及培养基所求出的。该标准曲线中成为所述第1测定时间的测定对象的所述培养基的种类与计算未知的所述初始个数时的所述培养基的种类相同。但是，在该装置的第11方面中，虽然基于所述标准曲线计算出所述微生物的未知的所述初始菌数，但在生成该标准曲线之前不要求进行该计算。 
本发明的微生物数的测定装置的第12方面是，在微生物数的测定装置的第1方面至第11方面中的任意一方中，针对所述微生物的所述初始个数为已知且彼此不同的同一种类的所述培养基中的各个培养基，求出所述第1测定时间，根据多个该已知的所述初始个数与多个该第1测定时间的关系，求出关于该微生物以及该培养基的所述标准曲线。 
该发明的微生物数的测定装置以及测定方法的第1方面对于针对培养基测定根据氧量而流过的电流而求出微生物的初始个数的方法而言，都缩短了该方法需要的时间。 
该发明的微生物数的测定装置以及测定方法的第2方面都设定步骤(c)中的第1阈值。 
该发明的微生物数的测定装置以及测定方法的第3方面都在使用在各自的第2方面中所设定的第1阈值来取得第1测定时间时，提高了与通过以往的方法获得的结果的一致率。 
该发明的微生物数的测定装置以及测定方法的第4方面都在针对培养基测定根据氧量而流过的电流而求出微生物的初始个数的方法中，缩短了该方法所需要的时间。 
该发明的微生物数的测定装置以及测定方法的第5方面都判定步骤(b)的时间差分值的稳定。 
该发明的微生物数的测定装置以及测定方法的第6方面都在各自的第5方面中判断时间差分值的稳定时，提高了与通过以往的方法得到的结果的一致率。 
该发明的微生物数的测定装置以及测定方法的第7方面都除去了测定的最初时的电流的紊乱对步骤(b)的判定的影响。 
该发明的微生物数的测定装置以及测定方法的第8方面都在使用在各自的第7方面中所采用的停歇时间来取得第1测定时间时，提高了与通过以往的方法获得的结果的一致率。 
该发明的微生物数的测定装置以及测定方法的第9方面都是即使在初始个数多到无法进行步骤(c)的判定的情况下，也能够使用第2测定时间来求出该初始个数。 
该发明的微生物数的测定装置以及测定方法的第10方面都在取得在各自的第9方面中所采用的第2测定时间时，提高了与通过以往的方法获得的结果的一致率。 
该发明的微生物数的测定装置以及测定方法的第11方面都在针对培养基测定根据氧量而流过的电流而求出微生物的初始个数的方法中，缩短了该方法需要的时间。 
该发明的微生物数的测定装置以及测定方法的第12方面都生成在各自的第11方面中计算微生物数的初始个数时使用的标准曲线。 
通过以下的详细说明和附图，将使本发明的目的、特征、局面、以及优点变得更加明了。 
附图说明
图1是将初始菌数作为参量而例示出测定时间和氧电流的关系的图表。 
图2是示出本发明的第1实施方式的微生物数测定方法的一部分的流程图。 
图3是详细例示出步骤SA的流程图。 
图4是详细例示出步骤SB的流程图。 
图5是详细例示出步骤SB的其他例子的流程图。
图6是详细例示出步骤SC的流程图。 
图7是例详细示出步骤SC的其他的例子的流程图。 
图8是示出从氧电流的测定求出第1测定时间的处理的概要的图表。 
图9是本发明的第2实施方式的步骤SA的流程图。 
图10是示出氧电流的值急速降低的第1状态的图表。 
图11是示出氧电流的值急速降低的第2状态的图表。 
图12是示出氧电流的值急速降低的第3状态的图表。 
图13是示出本发明的第3实施方式的微生物数测定方法的一部分的流程图。 
图14是详细示出本发明的第3实施方式的步骤SA的流程图。 
图15是详细例示出本发明的第3实施方式的步骤SA的流程图。 
图16是详细例示出本发明的第3实施方式的步骤SC的流程图。 
图17是详细例示出本发明的第4实施方式的步骤SC的流程图。 
图18是示出能够使用本发明的微生物数计算装置的结构的方框图。 
具体实施方式
发明的基本的考虑方法 
在详细说明本发明的实施方式之前，示出本发明的基本的考虑方法。当然，该基本的考虑方法也属于本发明的范畴。以下对于微生物采用细菌为例子进行说明，但对于其他的微生物也能够进行相同的处理。并且，使用氧电极的面积来规范化并表示氧电流的值及与氧电流的值相关的阈值，所以实际上应该作为电流密度来进行处理，但以下为了简便，作为电流来说明。 
图1是将初始菌数作为参量而例示出测定时间和氧电流的关系的图表。因为在测定期间进行增菌培养，所以溶解的氧量降低，随之氧电流也降低。图表L0例示了初始菌数为0的情况，图表L1、L2、L3、L4、以及L5分别例示了初始菌数为101、102、103、104、以及105(CFU/ml)的情况。 
以往，对于氧电流将其阈值Ith设定为低值。而且，求出图表L1、 L2、L3、L4、以及L5达到阈值Ith的测定时间(分别为测定时间t10、t20、t30、t40、以及t50)。而且，根据测定时间t10、t20、t30、t40、以及t50和已知的初始菌数101、102、103、104、以及105(CFU/ml)求出标准曲线。从而，即使在初始菌数为未知的情况下，也能够根据达到阈值Ith的测定时间和该标准曲线计算出初始菌数。 
但是，如从图表L1、L2、L3、L4、以及L5观察到的那样，虽然随着测定时间的经过氧电流减小，但是氧电流初始的减小斜率小，经过了某段时间之后减小的斜率变大，之后减小的斜率进一步增大。从而，求出该氧电流相对于时间的图表的斜率(换言之，每单位时间的氧电流的差分：以下简称为“氧电流的斜率”)发生变动的时间点处的测定时间(以下称为“斜率变动时间”：对于图表L1、L2、L3、L4、以及L5而言为减小的斜率从小变大的测定时间t11、t21、t31、t41、t51，或减小的斜率从大变小的测定时间t12、t22、t32、t42、t52)，根据所求出的测定时间和已知的初始菌数能够生成标准曲线。 
而且，根据该标准曲线和初始菌数为未知时的斜率变动时间，能够计算出初始菌数。而且，斜率变动时间t11、t12短于测定时间t10，斜率变动时间t21、t22短于测定时间t20，斜率变动时间t31、t32短于测定时间t30，斜率变动时间t41、t42短于测定时间t40，斜率变动时间t51、t52短于测定时间t50。从而，如果能够求出氧电流的斜率变动时间，则能够早期进行初始菌数的计算。如上所述为本发明的基本的考虑方法。 
但是，以目视来观察氧电流的斜率的变动防碍了作业的自动化。并且，不仅是斜率变动时间经过之前，如果对于经过斜率变动时间之后的图表不进行测定，则不能通过目视来确认斜率变动时间。因此，不容易缩短测定时间。 
因此，在以下叙述的第1至第3实施方式中，采用了取代严密地观察氧电流的斜率的变动的捷径。即，在斜率变动时间t11、t21、t31、t41、以及t51之后一旦氧电流的斜率变得稳定，则基于此前所取得的图表来确定第1阈值。而且，基于氧电流1次以上超过第1阈值而降低的测定时间(以下称为“第1测定时间”)和已知的初始菌数生成标准曲线。 
并且，在第4实施方式中，一旦氧电流的斜率变得稳定，则基于该斜率的绝对值变小、即赋予图表的弯曲点(与第1至第3实施方式不同)的第1测定时间(相当于斜率变动时间t12、t22、t32、t42、以及t52)和已知的初始菌数而生成标准曲线。 
在生成标准曲线之后，根据该标准曲线和第1测定时间，能够计算出未知的初始菌数。 
第1实施方式 
图2是示出本发明的第1实施方式的微生物数测定方法的一部分的流程图。在步骤S100中，将在沿流程图执行的处理中所使用的计数器S、F2和氧电流的斜率Kold设定(复位)为初始值。在步骤S101中，进行氧电流Inew的测定。在步骤SA中，求出氧电流的斜率。在步骤SB中，判定是否可以判断为该斜率稳定。在步骤SC中，确定第1测定时间。 
在步骤SB中，为了判断斜率是否稳定，依次进行氧电流Inew的测定，更新地求出氧电流的斜率直到判断为稳定。从而，步骤SB指定了两个执行方向。判断为斜率稳定时，处理从步骤SB进入到步骤SC，判断为斜率没有稳定时，应该进一步进行氧电流Inew的测定，从而返回到步骤S101。 
图3是详细例示出步骤SA的流程图。首先，在步骤S104中计数器S加1。在最初执行步骤S104之前，通过步骤S100计数器S被设定为值0。从而，通过最初执行步骤S104，计数器S的值成为1。 
接下来，在步骤S105中进行氧电流的数据分类。具体而言，把数据I2～IZ+1的值代入到数据I1～IZ，之后把在步骤S101中测定的最近的氧电流Inew代入到数据IZ+1。 
接下来，在步骤S106中，判定计数器S的值是否大于值Z。如果步骤S106的判定为否定，则返回到步骤S101而测定接下来的氧电流Inew。这样，通过重复执行步骤S101～S105直到步骤S106的判定为肯定，把以该顺序时序地排列的氧电流的Z个值设定到数据I1～IZ。这样，在计数器S的值为值Z以下时，例外地使处理从步骤SA返回到步骤S101。在图2中使用虚线示出了该分支。
如果计数器S的值大于值Z，则处理进入到步骤S107。在步骤S107中，求出关于数据I1～IZ+1的回归直线的斜率Knew。例如，如果以一定的间隔T进行步骤S101中的氧电流Inew的测定，则执行步骤S101的测定时间在步骤S107的执行中并不是特别需要的。例如，可以使用最小平方法来求出斜率Knew。 
作为能够代替步骤S107的更简单的步骤，能够求出数据之差(IZ+1-I1)，将该差除以Z·T来得到斜率。不管用哪种方法，在步骤S107中，将得到数据I1～IZ+1的期间(例如Z·T)设为测定期间，根据该测定期间的氧电流的测定值，求出斜率Knew，作为每单位时间的氧电流的差分即时间差分值。 
在步骤S107的执行之后，处理进入到步骤SB。图4是详细例示出步骤SB的流程图。首先，在步骤S108a中，求出氧电流的斜率的变动是否收敛于预定的容许范围内。具体而言，判定将步骤S107中求出的斜率Knew和斜率Kold之差的绝对值除以从上次的氧电流的测定时间到这次的氧电流的测定时间为止的时间间隔△t而得到的值，是否小于预定值E1。而且，如果上述判定为肯定则计数器F1增加1，如果上述判定为否定则计数器F1成为值0。例如，时间间隔△t采用上述的一定间隔T。 
在最初执行步骤S108a之前，通过步骤S100对斜率Kold设定了值ZK。而且，值ZK采用与通常的测定中取得的斜率Knew相比超过预定值E1和时间间隔△t的乘积的大值。从而，通过最初执行步骤S108a，计数器F1的值必然成为0。 
之后，在步骤S109中，判定计数器F1是否达到了预定值Z1。首先，在最初执行了步骤S109时，如上述那样计数器F1的值为0，所以该判定结果成为否定，处理进入到步骤S110。在步骤S110中，将在现状下得到的斜率Knew用作斜率Kold。然后，处理返回到步骤S101，通过步骤SA再次新求出斜率Knew。从而，优选上述的间隔T比步骤SA、SB双方的处理时间之和长。 
根据以上所述，在步骤S108a中，对利用依次测定的最近的氧电流Inew所更新的斜率Knew、和在其之前最近求出的斜率Kold进行比较。并且，鉴于步骤S108a、S109的处理，依次更新的氧电流的斜率的变动连续Z1次收敛于预定值E1的范围内，从而处理进入到步骤SC。 
图5是详细例示出步骤SB的其他例子的流程图。在该例中采用了如下的流程图：与图4示出的流程图相比，将步骤S108a置换为步骤S108b，删除步骤S110。 
在步骤S108b中，判定斜率Knew的绝对值是否小于预定值E2。然后，如果上述判定为肯定则计数器F1增加1，如果上述判定为否定则计数器F1的值成为0。 
图6是详细例示出步骤SC的流程图。在步骤SC中，首先在步骤S111a中设定第1阈值IP。具体而言，将从步骤SB进入到步骤SC时的数据IZ+1的q倍(0＜q＜1)的值用作第1阈值IP。然后，在步骤S112中，再次测定氧电流而得到氧电流Inew。 
步骤S112与步骤S101同样易于执行，优选将步骤S112和步骤S101合并起来以间隔T来测定氧电流。此时，优选间隔T比在步骤SA、SB双方的处理时间之和上再加上步骤S111a的处理时间而得到的时间还长。在这样的优选方式下，在步骤S111a中，可以将在最近的氧电流Inew上乘以系数q而得到的值用作第1阈值IP。 
但是，一般依赖于基于用于测定斜率的最近的测定期间的氧电流的值来确定第1阈值IP即可。其原因在于通过最近计算出的斜率来判断为斜率稳定。例如，能够基于最近的测定时间的氧电流的平均值来设定第1阈值IP。例如，能够采用在该平均值上乘以系数q而得到的值。 
在步骤S114a中，判定在步骤S112中测定的氧电流Inew是否小于第1阈值IP。如果该判定结果为肯定则计数器F2的值增加1。因为在步骤S100中计数器F2被设定了初始值0，所以在最初执行步骤S114a之前计数器F2的值为0。 
之后，处理进入到步骤S115，判定计数器F2的值是否达到了预定值Z2(＞1)。首先，在最初执行了步骤S114a的情况下，因为计数器F2的值为0或1，所以该判定的结果为否定，处理返回到步骤S112，再次求出氧电流Inew。从而，优选间隔T比步骤S114a、S115双方的处理时 间之和还长。 
在步骤S114a中，与步骤S108a、S108b不同，在判定结果为否定时不将计数器F2复位。从而，如果通过步骤S112依次更新的氧电流Inew连续Z2次、或不连续地Z2次比第1阈值IP小，则进入到步骤S116。在步骤S116中，例如将最后执行的步骤S112的测定时间设定为第1测定时间。 
图7是例详细示出步骤SC的其他例子的流程图。此处，步骤S111a、S114a分别置换为步骤S111b、S114b。在步骤S111b中，将从步骤SB进入到步骤SC时的数据IZ+1减去电流降低阈值△而得到的值用作第1阈值IP。如上述那样，一般依赖于基于在最近的测定期间所测定的氧电流的值来确定第1阈值IP，所以也可以将从在该最近的测定期间所测定的氧电流的平均值减去电流降低阈值△而得到的值用作第1阈值IP。 
并且，在步骤S114b中，与步骤S108a、S108b的计数器F1相同，如果不满足条件Inew<IP则将计数器F2复位为0。即，在连续Z2次满足该条件之后，到达步骤S116。 
因为这样得到了第1测定时间，所以在首先生成标准曲线的情况下，对初始菌数已知的情况如上述那样进行第1测定时间的测定。然后，在得到了标准曲线之后，即使初始菌数为未知的情况下，通过测定第1测定时间，也能够基于标准曲线来计算出初始菌数。 
例如，能够分别采用值30、5、以及10来作为值Z、Z1、以及Z2。并且，能够分别采用1(分钟)、1(分钟)来作为间隔T、△t，能够采用0.8来作为系数q，采用30nA/mm2来作为电流降低阈值△。并且，能够采用103(nA/mm2/min)来作为值ZK，分别采用0.6(nA/mm2/min2)、1.2(nA/mm2/min2)来作为预定值E1、E2。在采用了这样的具体值的情况下，可以像下述那样说明上述的流程图。 
首先，每分钟测定氧电流。而且，针对连续的30分钟的氧电流数据，求出回归直线的斜率。每次测定氧电流时，该斜率就被更新，判断其稳定性。 
例如作为稳定性的一个判断方法(参照图4)，该斜率被更新，其变 动的绝对值超过0.6(nA/mm2/min2)时，判断为斜率不稳定。斜率的变动的绝对值连续5次收敛于0.6(nA/mm2/min2)后初次判断为斜率稳定。 
作为稳定性的其他的判断方法(参照图5)，在该斜率的绝对值超过1.2(nA/mm2/min)时，判断为斜率不稳定。斜率的绝对值连续5次收敛于1.2(nA/mm2/min)后初次判断为斜率稳定。 
然后，基于判断为斜率稳定的情况下的最近的氧电流来设定第1阈值。 
例如，作为第1阈值的一个设定方法(参照图6)，将该最近的氧电流乘以0.8所得到的值设定为第1阈值。或者，作为其他的设定方法(参照图7)，将从该最近的氧电流减去30nA/mm2所得到的值设定为第1阈值。 
之后，如果10次低于第1阈值，则视为经过了斜率变动时间，得到第1测定时间。 
图8是示出从氧电流的测定求出第1测定时间的处理的概要的图表，分别在横轴采用了测定时间，在纵轴采用了氧电流。使用白圈来表示氧电流的测定值，使用横线来表示最后执行步骤SA时的数据IZ+1的值。并且，为了易于理解图表，图示出关于最后执行步骤SA时的数据I1～IZ+1的回归直线L。当然，步骤SA、SB中不需要回归直线L本身，而需要其斜率Knew。 
第1阈值IP也使用横线示出。此处，例如Z2的值设定为10，将氧电流的测定值10次低于第1阈值IP时的测定时间作为第1测定时间ts。 
第2实施方式 
如图8所示，在测定时间的最初在斜率变稳定之前有时会产生大的变动。其原因为，不但无用地重复执行了步骤SB中的处理，而且还有可能误检测为斜率已稳定。从而，在测定时间的最初，优选设置不执行步骤SA及步骤SA以后的步骤的停歇时间t0。 
图9是考虑了所述停歇时间的设定的步骤SA的流程图，对图3示出的流程图，在步骤S104前追加了步骤S103。在步骤S103中，判定是否经过了停歇时间。如果没有经过停歇时间则返回到步骤S101，如果经 过了停歇时间则进入到步骤S104。 
由此，除去了测定时间的最初的氧电流的波形的紊乱的影响，能够避免关于氧电流的数据的回归直线的斜率、进而第1测定时间的误判定。 
第3实施方式 
根据氧电流的测定结果，有时氧电流的值急速地降低。图10至图12是示出其各种状态的图表。 
在图10示出的第1状态中，在氧电流的斜率稳定之后，Z2次低于第1阈值IP之前，降低直到无法进行测定。在图11示出的第2状态中，氧电流的斜率不稳定，降低直到无法进行测定。在图12示出的第3状态下，在停歇时间中已经降低直到无法进行测定。因此，即使在这些状态下，为了能够生成标准曲线、计算未知的初始菌数，在氧电流的值超过第2阈值Id而降低时，将该时间点设为第2测定时间tt。关于该第2测定时间也与第1测定时间相同地进行处理，进行标准曲线的生成和未知的初始菌数的计算。 
图13是示出本发明的第3实施方式的微生物数测定方法的一部分的流程图，与图2对应。并且，图14以及图15是详细示出本发明的第3实施方式的步骤SA的流程图，分别与第1实施方式中示出的图3、第2实施方式中示出的图9对应。 
在图13至图15的任意一个图中，都紧接着测定了氧电流Inew后，判定该氧电流Inew是否大于第2阈值Id。具体而言，紧接着步骤S101之后设置步骤S102。例如，采用60nA/mm2来作为第2阈值Id。 
如果步骤S102的判定为肯定，则分别像第1实施方式中示出的那样执行步骤S104(参照图3、图14)，或像第2实施方式中示出的那样执行步骤S103(参照图9、图15)。但是，如果步骤S102的判定结果为否定，则处理进入到步骤S117，将这样的测定了氧电流的时间点用作第2测定时间。 
图16是详细示出本发明的第3实施方式的步骤SC的流程图，与第1实施方式中示出的图6或图7对应。在该流程图中，也紧接着测定了氧电流Inew之后，判定该氧电流Inew是否大于第2阈值Id。具体而言，紧接着步骤S112之后设置了步骤S113。图中，步骤S111综合示出了步骤S111a(图6)和步骤S111b(图7)，可以采用两者中的任意一方。 
如果步骤S113的判定为肯定，则分别像第1实施方式中示出的那样执行步骤S114a(参照图6)或步骤S114b(参照图7)(图中，步骤S114综合示出了步骤S114a(图6)和步骤S114b(图7)，可以采用两者中的任意一方)。但是，如果步骤S113的判定结果为否定，则进入到步骤S117，把这样的测定了氧电流的时间点用作第2测定时间。 
在本实施方式中，因为有时从步骤SC分支到步骤S117，所以在图13中使用虚线示出该分支。 
在图10所示的第1方式中，在步骤S115的判定中，没有得到肯定的结果(参照图16)，从步骤SC分支到步骤S117而求出第2测定时间tt。在图11示出的第2方式中，在步骤S106的判定中没有得到肯定的结果(参照图14、图15)，处理不从步骤SA进入到步骤SB，而从步骤S102进入到步骤S117，处理沿从图13的步骤SA起的使用虚线示出的分支前进。在图12示出的第3方式中，在图15的步骤S103的判定中没有得到肯定的结果，处理连步骤S104也不进入而从步骤S102进入到步骤S117。 
第4实施方式 
在本实施方式中，求出在“发明的基本的考虑方法”中说明的、减小的斜率从大变小的第1测定时间(与在第1至第3实施方式中所说的“第1测定时间”不同)t12、t22、t32、t42、以及t52。第4实施方式中求出的第1测定时间也与第1至第3实施方式中所说的第1测定时间和第2测定时间相同，用于标准曲线的生成和未知的初始菌数的计算。 
当然，在本实施方式中，也可以导入第2实施方式中示出的停歇时间，也可以导入第3实施方式中示出的第2测定时间。为了区别于第1至第3实施方式中所说的第1测定时间，在本实施方式中使用“tu”来作为表示第1测定时间的符号。 
 图17是详细示出本实施方式中使用的步骤SC的流程图。首先，通过步骤SB判断为斜率稳定之后，一度将最近的斜率Knew采用作斜率Kold。然后，在步骤S302中，新测定氧电流Inew。然后，在步骤S303中，计数器F2的值增加1。因为在步骤S100中，计数器F2被设定为初始值0，所以计数器F2的值表示步骤S302被执行的次数。 
而且，与步骤S105相同，在步骤S304中进行氧电流的数据分类，与步骤S106相同，在步骤S305中判定步骤S302的执行次数是否仅重复了希望的次数(Y+1)。 
这些动作与使用图3说明的动作相同。即，在步骤S305的判定结果为肯定时，对数据I1～IY设定以该顺序时序地排列的氧电流的Y个值。然后，在步骤S306中，与步骤S107相同，求出关于数据I1～IY+1的新的回归直线的斜率Knew来作为每单位时间的氧电流的差分。 
另外，在步骤SA的步骤S105中，由于在此之前已经求出了氧电流I1～IZ+1，所以在步骤S304中的数据分类中，能够利用步骤S105的结果。 
而且，在步骤S307中，对步骤S301中设定的斜率Kold、和步骤S306中求出的新的斜率Knew的大小进行比较。斜率Kold、Knew都是氧电流减小的斜率，是负值，所以可以将斜率Knew相比斜率Kold增大且增量超过预定的阈值E3的时间点采用作第1测定时间tu(对图1而言为时刻t22、t32、t42、以及t52)。 
在步骤S307中，为了便于判定，例示出判定斜率Kold的绝对值相比斜率Knew的绝对值是否增大且增量超过阈值E3的情况。但是，在该判定中，显然无需采用绝对值。 
如果步骤S307的判定的结果为肯定则进入到步骤S309，例如将最后执行的步骤S302的测定时间设定为第1测定时间tu。 
如果上述判定的结果为否定，则在步骤S308中，将计数器F2的值复位(采用值0)之后，返回到步骤S302，新求出斜率。 
设定有步骤S302作为步骤S308的返回目的地。即，为了判定氧电流的斜率是否变得缓和，将步骤SB中判断为稳定时的氧电流的斜率采用作基准。 
作为步骤S308的返回目的地，设定有步骤S301，也考虑基于氧电流的斜率的变化求出第1测定时间tu。但是，氧电流的斜率缓和地变化， 所以若与将在步骤SB中判断为稳定时的氧电流的斜率作为基准的情况相比，则第1测定时间tu变长，比达到阈值Ith的测定时间(参照图1)更早地进行测定的效果不大。从而，从早期地进行测定的观点来看，与步骤S301相比优选采用步骤S302来作为步骤S308的返回目的地。 
或者，也可以基于取得最近的斜率Knew的测定期间来确定第1测定时间tu。其原因为，根据在该最近的测定期间所求出的斜率，判定为斜率Knew相比在此之前所求出的斜率Kold增大、且增量超过预定的阈值E3。例如，也可以将第1测定时间tu确定为该最近的测定期间的中央值。 
在初始菌数为已知时，在以上的各个实施方式中所取得的第1测定时间以及第2测定时间被用于标准曲线的生成。而且，如果基于这样取得的标准曲线，针对初始菌数为未知的培养基对氧电流进行计测，则能够计算出该初始菌数。 
当然，为了提高测定的精度，优选生成标准曲线时初始菌数为已知的微生物的种类、与初始菌数为未知的微生物的种类相同，并且优选包含有生成标准曲线时初始菌数为已知的微生物的培养基的种类、与包含有初始菌数为未知的微生物的培养基的种类相同。 
图18是示出能够适用于如上述那样生成标准曲线、或计算初始菌数的技术的微生物数计算装置200的结构的方框图。微生物数计算装置200具备：氧电流测定部201，其测定培养基中的氧电流；以及控制/评价部202，其控制氧电流测定部201的动作，评价氧电流。 
控制/评价部202将指令D提供给氧电流测定部201，所述指令D指示对氧电流进行测定的定时。例如，使得每预定期间T测定氧电流，或经过停歇时间之后测定氧电流，或在取得第1测定时间ts、tu或第2测定时间tt之后中止氧电流的测定。氧电流测定部201主要执行步骤S101、S112，控制/评价部202在上述的流程图中执行步骤S101、S112以外的步骤。 
其他： 
将初始菌数作为参量，预先存储多个测定时间和氧电流的关系，在这些关系中，也考虑基于使得与测定值之间的差异为最小的参量来求出初始菌数。 
例如，预先将图1示出的图表L1、L2、L3、L4、以及L5作为电流数据直接进行存储，或作为函数形式进行存储。而且，确定使图8和图10～12中使用白圈示出的测定值、和与上述的电流数据的差异为最小的电流数据。例如，对于每个测定时间的测定值和电流数据之差的平方，采用在测定时间内的至少一部分中取总和的结果作为上述差异。而且，将与使上述差异为最小的电流数据对应的初始菌数，选定为根据该测定值所得到的初始菌数。 
但是，因为该方法存在根据检体图表发生大幅度失真的情况，所以通过上述实施方式中示出的方法求出初始菌数的方法的精确度更高。 
以下，与应当对照的技术一起，说明本发明。表1是说明应对照的技术的表。 
  检测条件   停歇时间   (min)   时间间隔   (min)   设定电流   (nA/mm2)   斜率   (nA/mm2/min)
  #201   100   30   30   -1.0
  #202   100   30   60   -2.0
  #203   100   30   120   -4.0
  #204   150   30   30   -1.0
  #205   150   30   60   -2.0
  #206   150   30   120   -4.0
检测条件#201～#206都是每分钟对氧电流进行一次测定，将某一时间点的氧电流相对于30分钟(时间间隔)前的氧电流连续5次低于设定电流值的时间点采用为检测时间。考虑该检测时间也依赖于初始菌数。但是，在检测条件#201～#206中，都设定有停歇时间。 
例如在检测条件#201中，将设定电流值设定为30nA/mm2，所以将在经过停歇时间100分钟之后，连续5次发生氧电流的斜率(急剧地)小于-30(nA/mm2)/30(min)＝-1.0(nA/mm2/min)的情况时的测定时间采用作检测时间。 
表2是说明如下的技术的表：根据氧电流的斜率的绝对值处于预定的范围内，而判断为氧电流的斜率稳定。这样的判断与上述的图5中示出的步骤SB对应。 
检测条件#311～#319是每分钟对氧电流进行一次测定(该间隔与上述的一定间隔T相当)。将从当前的氧电流减去10分钟前(或30分钟前)(该期间与关于计数器S的值Z和上述一定间隔T的乘积相当)的氧电流所得的结果除以10分钟(或30分钟)而取得斜率。该斜率不是使用最小平方法来求出的，这一点上与上述的斜率Knew不同。在该斜率的绝对值连续5次(与上述的预定值Z1相当)小于1.2(nA/mm2/min)(与上述的预定值E2相当)的时间点，判断为氧电流的斜率稳定。而且，将连续5次(与上述的预定值Z2相当)观测到比该时间点的氧电流(与上述的IZ+1相当)仅小电流降低阈值(与上述的电流降低阈值△相当)的值的氧电流的时间点采用作第1测定时间。这样的判断与图7示出的步骤SC对应。考虑为这样设定的第1测定时间也依赖于初始菌数。但是，检测条件#311～#319中都设定有停歇时间。 
例如在检测条件#311中，在经过了停歇时间100分钟之后，在连续5次发生氧电流的斜率的绝对值(平坦地)小于1.2(nA/mm2)的情况的时间点，判定为该斜率稳定。而且，将比该稳定的时间点的氧电流的值降低30(nA/mm2)的值采用作第1阈值IP，将连续5次观测到比该第1阈值IP还小的氧电流的时间点采用作第1测定时间。 
表3是说明如下的技术的表：根据氧电流的斜率的变化的绝对值处于预定的范围内，从而判断为氧电流的斜率稳定。这样的判断与上述的图4中示出的步骤SB对应。。 
[表3] 
Figure DEST_PATH_GSB00000014778600021
检测条件#321～#329与检测条件#321～#329相同地求出氧电流的斜率。在该斜率的变化量的绝对值(与图4的步骤S108a的|Knew-Kold|/Δt相当)连续5次(与上述的预定值Z1相当)小于3(nA/mm2/min)的时间点判断为氧电流的斜率稳定。而且，将连续5次(与上述的预定值Z2相当)观测到比该时间点的氧电流(与上述的IZ+I相当)仅小电流降低阈值(与上述的电流降低阈值Δ相当)的值的氧电流的时间点采用作第1测定时间。这样的判断与图7示出的步骤SC对应。考虑为这样设定的该第1测定时间也依赖于初始菌数。但是，检测条件#321～#329中都设定有停歇时间。 
例如在检测条件#321中，在经过了停歇时间100分钟之后，在连续5次发生氧电流的斜率的变化量的绝对值(平坦地)小于3(nA/mm2/min)的情况的时间点判定为该斜率稳定。而且，将比该稳定的时间点的氧电流的值降低30(nA/mm2)的值采用作第1阈值IP，将连续5次观测到比该第1阈值IP还小的氧电流的时间点采用作第1测定时间。 
表4～表6是对上述的检测时间(检测条件#201～#206)和第1测定时间(检测条件#311～#319、#321～#329)、与通过目视进行氧电流的斜率的变动而取得斜率变动时间的情况(自动地进行氧电流的斜率的变动的技术与第4实施方式相当：表中将该结果表述为“基准点”)进行比较的表。另外，表4的条件#101为使用现有技术，测定达到阈值Ith的测定时间的情况。采用180nA/mm2来作为阈值Ith，将3次低于该阈值Ith的时间点采用作检测时间。并且，没有采用第3实施方式中说明的基于第2阈值Id的第2测定时间。 
  
基准点 #101 基准点 #201 基准点 #202
平均 487.2 539.3 491.7 198.0 487.7 393.0
离散 3.0E+04 4.9E+04 3.2E+04 3.3E+04 3.0E+04 7.1E+04
观测数 271 271 281 281 270 270
自由度 270 280 269
t -9.13 20.82 5.44
P(T≤t)两侧 1.7E-17 8.1E-59 1.2E-07
t边界值两侧 2.59 2.59 2.59
  
基准点 #203 基准点 #204 基准点 #205 基准点 #206
459.8 554.9 491.7 384.1 482.4 539.6 458.3 557.5
2.5E+04 5.3E+04 3.2E+04 4.5E+04 2.8E+04 4.3E+04 2.5E+04 5.2E+04
184 184 281 281 263 263 183 183
183 280 262 182
-6.11 8.64 -5.92 -6.54
5.7E-09 4.2E-16 1.0E-08 6.0E-10
2.60 2.59 2.59 2.60
  
基准点 #311 基准点 #312 基准点 #313 基准点 #314
平均 498.9 238.7 498.9 360.4 498.9 453.4 495.1 271.6
离散 3.2E+04 2.0E+04 3.2E+04 3.4E+04 3.2E+04 3.4E+04 3.3E+04 2.9E+04
观测数 279 279 279 279 279 279 282 282
自由度 278 278 278 281
t 20.43 11.76 5.83 18.48
P(T≤t) 两侧 2.7E-57 3.4E-26 1.6E-08 1.9E-50
t边界值 两侧 2.59 2.59 2.59 2.59
  
基准点 #315 基准点 #316 基准点 #317 基准点 #318 基准点 #319
495.1 368.0 495.1 452.0 506.8 361.8 506.8 465.1 508.6 507.5
3.3E+04 3.7E+04 3.3E+04 3.9E+04 2.9E+04 2.8E+04 2.9E+04 2.9E+04 2.9E+04 3.0E+04
282 282 282 282 273 273 273 273 271 271
281 281 272 272 270
11.33 5.80 13.06 6.31 0.24
9.4E-25 1.8E-08 1.4E-30 1.1E-09 8.1E-01
2.59 2.59 2.59 2.59 2.59
  
基准点 #321 基准点 #322 基准点 #323 基准点 #324
平均 495.3 286.7 496.6 379.7 496.7 465.8 505.0 333.4
离散 3.3E+04 2.7E+04 3.3E+04 3.0E+04 3.3E+04 3.0E+04 3.1E+04 3.2E+04
观测数 275 275 274 274 278 278 271 271
自由度 274 273 277 270
t 16.26 9.71 4.12 12.71
P(T≤t)两侧 4.5E-42 2.4E-19 5.1E-05 2.6E-29
t边界值两侧 2.59 2.59 2.59 2.59
  
基准点 #325 基准点 #326 基准点 #327 基准点 #328 基准点 #329
506.7 425.3 507.6 497.7 501.3 398.4 501.3 473.9 504.0 510.0
3.0E+04 3.1E+04 3.0E+04 3.2E+04 3.1E+04 3.0E+04 3.1E+04 2.9E+04 3.1E+04 3.3E+04
267 267 263 263 269 269 269 269 265 265
266 262 268 268 264
8.11 1.73 10.80 4.46 -1.30
1.9E-14 8.5E-02 8.5E-23 1.2E-05 2.0E-01
2.59 2.59 2.59 2.59 2.59
关于各条件，将斜率变动时间和各检测条件的测定结果(检测时间或第1测定时间)作为1对样本来捕捉，通过关于两者的时间的一个样本t检验进行显著误差检验(显著水平1％)。从而，自由度为从观测数减去1的值。作为与各检测条件成对的样本的基准点分别记载在各检测条件的左侧的列中。从而，隔着纵双线相邻的各检测条件和基准点不成为比较的对象。
但是，检体(成为测定对象的培养基)的总数是358个。因为有时使用各检测条件取得的测定结果(检测时间或第1测定时间)、和通过基准点求出的斜率变动时间中的至少任一方表现为非常大的值，所以针对各检测条件的测定结果的观测数比检体的总数少。上述情况即是使用任意的测定方法检体均被判断为阴性的情况。因为无法在斜率变动时间和测定结果之间进行使用数值的统计比较，所以这些情况从观测数中除去。 
表4的检测条件#101以及其基准点的t检验的结果、舍弃阈概率(棄却閾確率)小于1％(＝0.01)。并且，t值的绝对值大于t边界值。从而，可知斜率变动时间平均值、和以往的氧电流达到阈值Ith的测定时间的平均值存在显著误差。即，如“A.发明的基本的考虑方法”中叙述的那样，通过求出氧电流的斜率变动时间，从而能够早期地进行初始菌数的计算。 
另一方面，从表5、表6中不能舍弃如下的解消假设：在检测条件#319、#326、以及#329下取得的第1测定时间的平均值、和分别与上述平均值成对的斜率变动时间的平均值不存在显著误差。另一方面，能够得到如下的结论：除了这三个条件之外，能够舍弃该解消假设，存在显著误差。严密地说，不能舍弃解消假设并不是指解消假设是妥当的，但一般来说大多使用这样的结论。因此，判断为在表1、表2、以及表3中示出的多种检测条件中，仅在检测条件#319、#326、#329下取得的第1测定时间的平均值、和通过目视取得的斜率变动时间的平均值不存在显著误差。 
进而，如果像这样采用检测条件#319、#326、以及#329，则应该能够使用如第1实施方式或第2实施方式中示出的那样自动化地进行作业的第1测定时间来代替通过目视求出的斜率变动时间。因此，接下来，对检测条件#319、#326、以及#329的第1测定时间和条件#101的测定时间进行比较。表7示出测定时间的平均值的t检验(显著水平1％)的结果，表8示出测定时间的CV值(Coefficient ofVariation，差异系数)的平均值的t检验(显著水平5％)的结果。这些结果也与表4、表5、以及表6相同，通过一个样本t检验进行显著误差检验。
  
#101 #319 #101 #326 #101 #329
平均 556.56 499.64 544.02 481.77 552.48 502.35
离散 4.40E+04 2.60E+04 4.97E+04 2.98E+04 4.54E+04 2.85E+04
观测数 259 259 260 260 254 254
自由度 258 259 253
t 7.40 6.97 6.13
P(T≤ t)两侧 1.91527E-12 2.65675E-11 3.34619E-09
t边界 值两侧 2.60 2.59 2.60
  
#101 #319 #101 #326 #101 #329
平均 12.27 9.52 12.12 11.27 12.22 9.74
  
离散 192.19 70.10 187.62 133.32 193.09 72.79
观测数 70 70 72 72 70 70
自由度 69 71 69
t 1.91 0.60 1.77
P(T≤t) 两侧 0.06034342 0.552873319 0.080389151
t边界值 两侧 2.00 2.00 2.00
根据表7，检测条件#319、#326、以及#329的第1测定时间的平均值、和条件#101的测定时间的平均值存在显著误差。从而，可知检测条件#319、#326、以及#329的第1测定时间与基于目视的斜率变动时间相同，相对于以往的氧电流达到阈值Ith的测定时间，存在缩短了时间的效果。 
并且，根据表8，无法舍弃在检测条件#319、#329和条件#101之间CV值不存在显著误差的解消假设。因此，判断为第1测定时间的 偏差的程度与以往的测定时间的偏差的程度相同。并且，关于检测条件#326，从偏差的点来看，判断为效果不好。 
因此，接下来，基于这4个检测条件，对于所有的358个检体，判断细菌的阳性/阴性。将该结果、和通过使用冷天培养基的方法(以下称为“冷天方法”)增菌培养来判断细菌的阳性/阴性的结果进行比较。在表9中示出比较结果。 
  
所有358个检体 伪阳性检体数 伪阴性检体数 与冷天方法的一致 率
#101 5 25 91.6％
#319 14 45 83.5％
#326 14 45 83.5％
#329 14 49 82.4％
此处，所谓“伪阳性”是指通过各检测条件判断为阳性，但在冷天方法中判断为阴性的情况。并且，所谓“伪阴性”是指通过各检测条件判断为阴性，但在冷天方法中判断为阳性的情况。从而，“伪阳性”和“伪阴性”都是与冷天方法的结果不同的情况。而且，在表9中针对每个检测条件记载判断为“伪阳性”、“伪阴性”的检体数，合并起来记载与冷天方法的一致率。例如，在检测条件#101中，成为“伪阳性”、“伪阴性”的检体数分别为5个以及25个，所以一致率成为(358-5-25)/358×100＝91.6(％)。 
根据表9的结果，与作为现有技术的检测条件#101相比，与冷天方法的一致率要低一些。因此，沿用检测条件#326、329的基本的检测方法(采用图4的流程图作为步骤SB)，并且进行进一步提高与冷天方法的一致率的工作。具体而言，作为步骤SC不使用图7的流程图，而是使用图6的流程图。此处，采用0.8来作为系数q。并且，采用0.6(nA/mm2/min2)来作为预定值E1。预定值Z1、Z2分别设为5、10。将该检测条件设为#331。并且，将停歇时间设为200分钟。并且，使用最小平方法来求出氧电流的斜率，与步骤S107(参照图3)的斜率Knew对应。 
进而，除了检测条件#331之外，还采用实施方式3中说明的第2 阈值Id来设定检测条件#332。即，在检测条件#332中，采用了图6、图13、图14、以及图16(其中采用步骤S111a、S114a)中示出的流程图。此处，将第2阈值Id设为60nA/mm2，检测条件#332下取得的测定时间指第1测定时间以及(在实施方式3中所说的)第2测定时间双方。 
对检测条件#331、#332和条件#101进行比较。表10示出测定时间的平均值的t检验(显著水平1％)的结果，表11示出测定时间的CV值的平均值的t检验(显著水平5％)的结果。这些结果也与表7、表8相同，通过一个样本t检验进行显著误差检验。 
  
#101 #331 #101 #332
平均 531.29 498.15 512.95 483.81
离散 5.20E+04 3.05E+04 5.77E+04 3.38E+04
观测数 275 275 287 287
自由度 274 286
t 5.23 4.74
P(T≤t)两侧 3.43341E-07 3.40042E-06
t边界值两侧 2.59 2.59
  
#101 #331 #101 #332
平均 12.27 9.38 12.27 9.44
离散 192.19 81.28 192.19 80.46
观测数 70 70 70 70
自由度 69 69
t 2.37 2.32
P(T≤t)两侧 0.020713609 0.02329029
t边界值两侧 1.99 1.99
根据表10，检测条件#331、#332的测定时间的平均值、和条件#101的测定时间的平均值存在显著误差。从而，可知检测条件#331、#332的测定时间与检测条件#319、#326、以及#329的测定时间同样地，相对于以往的氧电流达到阈值Ith的测定时间，存在缩短了时间的效果。
并且，根据表11，可知在检测条件#331、#332和检测条件#101之间CV值存在显著误差。即，可知如果采用检测条件#331、#332，则与以往的测定时间的偏差相比，能够改善测定时间的偏差。 
因此，接下来，基于这2个检测条件，对所有的358个检体，判断细菌的阳性/阴性。对该结果、和通过使用冷天方法来判断细菌的阳性/阴性的结果进行比较。在表12中示出比较结果。 
  
所有358个检体 伪阳性检体数 伪阴性检体数 与冷天方法的一致率
#331 11 31 88.3％
#332 11 19 91.6％
如根据与表9的比较可知那样，在不导入第2测定时间的检测条件#331下也能改善与冷天方法的一致率，成为88.3％。进而，在导入第2测定时间的检测条件#332下，与冷天方法的一致率成为91.6％，与通过现有技术实现的一致率相等。而且，伪阴性数小于以往的条件#101，存在安全上良好的倾向。 
根据以上所述，可知作为步骤SB优选采用图4示出的流程图，而不采用图5示出的流程图，在步骤SA中，与使用步骤S111b、S114b的情况(参照图7)相比，优选使用步骤S111a、S114a(参照图6)，进而优选设置停歇时间(参照图13)。进而，可知更加优选也导入实施方式3中示出的那样的第2测定时间(参照图16)。 
虽然对本发明进行了详细说明，但上述的说明在所有的情形下都仅是例示而已，本发明不限定于此。可以不脱离该发明的范围而设想得到未例示的无数的变形例。

Claims (28)

1.一种微生物数的测定方法，所述微生物数的测定方法在包含有初始个数作为测定对象的微生物的培养基中，依次对根据氧量而流过的电流即氧电流(Inew)进行测定(S101、S112)，求出所述氧电流以预定次数(Z2)低于第1阈值(IP)而降低所需的时间即第1测定时间(ts)，其中，所述微生物数的测定方法具备：
(a)根据预定的测定期间的所述氧电流的测定值，求出所述氧电流的每单位时间的差分即时间差分值(Knew)的步骤(SA)；
(b)判定在所述步骤(a)中求出的所述时间差分值是否稳定的步骤(SB)；以及
(c)当所述步骤(b)的判定为肯定时，设定所述第1阈值，使得所述第1阈值依赖于基于在最近的所述测定期间所测定的所述氧电流(I1～IZ+1)的值、且比该值低的步骤(S114a、S114b)。
2.根据权利要求1所述的微生物数的测定方法，其中，在所述步骤(c)中，从最近所测定的所述氧电流(IZ+1)减去预定的阈值(Δ)来设定所述第1阈值(IP)。
3.根据权利要求1所述的微生物数的测定方法，其中，在所述步骤(c)中，将最近所测定的所述氧电流(IZ+1)乘以大于0小于1的系数(q)来设定所述第1阈值(IP)。
4.根据权利要求3所述的微生物数的测定方法，其中，将所述系数(q)设定为0.8。
5.一种微生物数的测定方法，所述微生物数的测定方法在包含有初始个数作为测定对象的微生物的培养基中，依次对根据氧量而流过的电流即氧电流(Inew)进行测定(S101、S112)，求出所述氧电流的减小超过阈值(E3)而变得缓和的第1测定时间，其中，所述微生物数的测定方法具备：
(a)根据预定的测定期间的所述氧电流的测定值，求出所述氧电流的每单位时间的差分即时间差分值(Knew)的步骤(SA)；
(b)判定在所述步骤(a)中求出的所述时间差分值是否稳定的步骤(SB)；以及
(c)当所述步骤(b)的判定为肯定时，在之后所测定的所述时间差分值(Knew)相比步骤(b)的所述时间差分值(Kold)增大、且增量超过所述阈值的情况下，根据在最近所测定的所述测定期间来确定所述第1测定时间的步骤(SC)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的微生物数的测定方法，其中，在所述步骤(b)中，根据所述时间差分值的绝对值(|Knew|)在预定期间收敛于预定范围(E2)内(S108b、S109)，判定为所述时间差分值稳定。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的微生物数的测定方法，其中，在所述步骤(b)中，根据所述时间差分值的相对于时间的变动(|Knew-Kold|/Δt)的绝对值在预定期间内收敛于预定范围(E1)内(S108a、S109)，判定为所述时间差分值稳定。
8.根据权利要求7所述的微生物数的测定方法，其中，
所述预定范围(E1)换算为电流密度时为0.6nA/mm2/min2，
所述预定次数(Z2)是10次，
所述预定期间是连续5次(Z1)进行所述氧电流的测定的长度。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的微生物数的测定方法，其中，在所述步骤(b)中，在所述步骤(a)之后，经过了预定的停歇时间后，判定所述时间差分值是否稳定。
10.根据权利要求9所述的微生物数的测定方法，其中，将所述停歇时间设定为200分钟。
11.根据权利要求1至5中任一项所述的微生物数的测定方法，其中，所述微生物数的测定方法还具备：
(d)求出第2测定时间(tt)的步骤，所述第2测定时间(tt)是所述氧电流低于第2阈值(Id)而降低所需的时间。
12.根据权利要求11所述的微生物数的测定方法，其中，所述第2阈值(Id)换算为电流密度时是60nA/mm2/min2。
13.根据权利要求1或5所述的微生物数的测定方法，其中，根据与所述微生物的所述初始个数为已知且彼此不同的同一种类的所述培养基中的各个培养基相关的所述第1测定时间与该已知的初始个数的关系，根据针对该微生物以及该培养基所求出的标准曲线，
针对所述微生物的所述初始个数为未知的所述同一种类的所述培养基求出所述第1测定时间，计算出未知的所述初始个数。
14.根据权利要求1或5所述的微生物数的测定方法，其中，针对所述微生物的所述初始个数为已知且彼此不同的同一种类的所述培养基中的各个培养基，求出所述第1测定时间，
根据多个该已知的所述初始个数与多个该第1测定时间的关系，求出关于该微生物以及该培养基的标准曲线。
15.一种微生物数的测定装置，所述微生物数的测定装置具备：
氧电流测定部(201)，其在包含有初始个数作为测定对象的微生物的培养基中，依次对根据氧量而流过的电流即氧电流(Inew)进行测定(S101、S112)；以及
评价部(202)，其求出所述氧电流以预定次数(Z2)低于第1阈值(IP)而降低所需的时间即第1测定时间(ts)，
所述评价部执行：
(a)根据预定的测定期间的所述氧电流的测定值，求出所述氧电流的每单位时间的差分即时间差分值(Knew)的步骤(SA)；
(b)判定在所述步骤(a)中求出的所述时间差分值是否稳定的步骤(SB)；以及
(c)当所述步骤(b)的判定为肯定时，设定所述第1阈值，使得所述第1阈值依赖于基于在最近的所述测定期间所测定的所述氧电流(I1～IZ+1)的值、且比该值低的步骤(S114a、S114b)。
16.根据权利要求15所述的微生物数的测定装置，其中，在所述步骤(c)中，从最近所测定的所述氧电流(IZ+1)减去预定的阈值(Δ)来设定所述第1阈值(IP)。
17.根据权利要求15所述的微生物数的测定装置，其中，在所述步骤(c)中，将最近所测定的所述氧电流(IZ+1)乘以大于0小于1的系数(q)来设定所述第1阈值(IP)。
18.根据权利要求17所述的微生物数的测定装置，其中，将所述系数(q)设定为0.8。
19.一种微生物数的测定装置，所述微生物数的测定装置具备：
氧电流测定部(201)，其在包含有初始个数作为测定对象的微生物的培养基中，依次对根据氧量而流过的电流即氧电流(Inew)进行测定；以及
评价部(202)，其求出所述氧电流的减小超过阈值(E3)而变得缓和的第1测定时间，
所述评价部执行：
(a)根据预定的测定期间的所述氧电流的测定值，求出所述氧电流的每单位时间的差分即时间差分值(Knew)的步骤(SA)；
(b)判定在所述步骤(a)中求出的所述时间差分值是否稳定的步骤(SB)；以及
(c)当所述步骤(b)的判定为肯定时，在之后所测定的所述时间差分值(Knew)相比步骤(b)的所述时间差分值(Kold)增大、且增量超过所述阈值的情况下，根据在最近所测定的所述测定期间来确定所述第1测定时间的步骤(SC)。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的微生物数的测定装置，其中，在所述步骤(b)中，根据所述时间差分值的绝对值(|Knew|)在预定期间内收敛于预定范围(E2)内(S108b、S109)，判定为所述时间差分值稳定。
21.根据权利要求15至19中任一项所述的微生物数的测定装置，其中，在所述步骤(b)中，根据所述时间差分值的相对于时间的变动(|Knew-Kold|/Δt)的绝对值在预定期间内收敛于预定范围(E1)内(S108a、S109)，判定为所述时间差分值稳定。
22.根据权利要求21所述的微生物数的测定装置，其中，
所述预定范围(E1)换算为电流密度时是0.6nA/mm2/min2，
所述预定次数(Z2)是10次，
所述预定期间是连续5次(Z1)进行所述氧电流的测定的长度。
23.根据权利要求15至19中任一项所述的微生物数的测定装置，其中，在所述步骤(b)中，在所述步骤(a)之后，经过了预定的停歇时间后，判定所述时间差分值是否稳定。
24.根据权利要求23所述的微生物数的测定装置，其中，所述停歇时间被设定为200分钟。
25.根据权利要求15至19中任一项所述的微生物数的测定装置，其中，所述评价部(201)还执行：
(d)求出第2测定时间(tt)的步骤，所述第2测定时间(tt)是所述氧电流低于第2阈值(Id)而降低所需的时间。
26.根据权利要求25所述的微生物数的测定装置，其中，所述第2阈值(Id)换算为电流密度时是60nA/mm2/min2。
27.根据权利要求15或19所述的微生物数的测定装置，其中，根据与所述微生物的所述初始个数为已知且彼此不同的同一种类的所述培养基中的各个培养基相关的所述第1测定时间与该已知的初始个数的关系，根据针对该微生物以及该培养基所求出的标准曲线，
针对所述微生物的所述初始个数为未知的所述同一种类的所述培养基求出所述第1测定时间，计算出未知的所述初始个数。
28.根据权利要求15或19所述的微生物数的测定装置，其中，针对所述微生物的所述初始个数为已知且彼此不同的同一种类的所述培养基中的各个培养基，求出所述第1测定时间，
根据多个该已知的所述初始个数与多个该第1测定时间的关系，求出关于该微生物以及该培养基的标准曲线。
CN2005800403514A 2004-11-24 2005-11-22 微生物数的测定方法及微生物数的测定装置 Expired - Fee Related CN101115845B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP338767/2004 2004-11-24
JP2004338767 2004-11-24
PCT/JP2005/021474 WO2006057253A1 (ja) 2004-11-24 2005-11-22 微生物数の測定方法及び微生物数の測定装置

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101115845A CN101115845A (zh) 2008-01-30
CN101115845B true CN101115845B (zh) 2011-04-13

Family

ID=36497990

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005800403514A Expired - Fee Related CN101115845B (zh) 2004-11-24 2005-11-22 微生物数的测定方法及微生物数的测定装置

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20080057535A1 (zh)
EP (1) EP1816210A4 (zh)
KR (1) KR100857808B1 (zh)
CN (1) CN101115845B (zh)
CA (1) CA2588326C (zh)
WO (1) WO2006057253A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8563265B2 (en) * 2011-04-21 2013-10-22 Mocon, Inc. Analytical instrument and method for evaluating microbial contamination of an object

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3240953B2 (ja) 1997-04-10 2001-12-25 ダイキン工業株式会社 生理活性測定方法およびその装置
JP2000270838A (ja) * 1999-03-26 2000-10-03 Daikin Ind Ltd 検体測定方法およびその装置
JP4375836B2 (ja) 1999-04-07 2009-12-02 ダイキン工業株式会社 細菌数測定方法およびその装置
JP4470078B2 (ja) * 2000-03-17 2010-06-02 学校法人慈恵大学 薬剤感受性測定方法
JP4284916B2 (ja) * 2002-02-12 2009-06-24 ダイキン工業株式会社 微生物測定における検量線作成方法
US7238496B2 (en) * 2002-08-06 2007-07-03 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Rapid and automated electrochemical method for detection of viable microbial pathogens
JP2005160334A (ja) * 2003-12-01 2005-06-23 Daikin Ind Ltd 細菌数測定方法
DK1780286T3 (da) * 2004-08-02 2011-03-14 Daikin Ind Ltd Bakterietællingsmetode, bakterietæller og celle anvendt til tælleren
JP4311448B2 (ja) * 2004-08-02 2009-08-12 ダイキン工業株式会社 酸素電極

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JP特开2000-270838A 2000.10.03
JP特开2000-287699A 2000.10.17
JP特开2001-258591A 2001.09.25
JP特开2003-235599A 2003.08.26
JP特开平10-276796A 1998.10.20

Also Published As

Publication number Publication date
CA2588326A1 (en) 2006-06-01
EP1816210A1 (en) 2007-08-08
US20080057535A1 (en) 2008-03-06
CA2588326C (en) 2013-04-02
CN101115845A (zh) 2008-01-30
KR20070084343A (ko) 2007-08-24
WO2006057253A1 (ja) 2006-06-01
EP1816210A4 (en) 2008-10-29
KR100857808B1 (ko) 2008-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Machlis et al. The pooling fallacy: problems arising when individuals contribute more than one observation to the data set
Leiva et al. Influence diagnostics in log-Birnbaum–Saunders regression models with censored data
EP2290371A1 (de) Kalibrierverfahren zur prospektiven Kalibrierung eines Messgeräts
CN101115845B (zh) 微生物数的测定方法及微生物数的测定装置
Basagaña et al. Power and sample size calculations for longitudinal studies estimating a main effect of a time-varying exposure
Kirichenko et al. Generalized approach to Hurst exponent estimating by time series
Sankaran et al. On proportional reversed hazards frailty models
Worthy et al. Older adults are highly responsive to recent events during decision-making.
Tressoldi et al. Statistical guidelines for empirical studies
CN115440299A (zh) 确定背景微生物的方法、设备、介质和程序产品
CN114925510A (zh) 一种带有自适应交互作用项的多应力加速模型构建方法
Mellenbergh et al. Dichotomous decisions based on dichotomously scored items: a case study
US20170193529A1 (en) Methods and apparatus to determine a causal effect of observation data without reference data
Camargo et al. Applied control charts for analysis of quality control
CN115376657B (zh) 量化产品使用量对人体表征信息影响的方法及装置
Saatci et al. Posterior Cramer–Rao lower bounds for dual Kalman estimation
JP3788478B1 (ja) 微生物数の測定方法及び微生物数の測定装置
Fajriyah Microarray data analysis: Background correction and differentially expressed genes
Sebastian et al. Using Polynomial Smoothing and Data Bounding for the Detection of Adverse Process Changes in a Chemical Process
EP2010873A1 (de) Zählwaage mit multilevel-hinkley-detektor
EP4113530A1 (en) Methods and apparatuses for facilitating maintenance of a medical analyzer device
Spoorenberg Estimators for Respondent Driven Sampling
Lourenço et al. Simplified and Detailed Evaluation of the Uncertainty of the Measurement of Microbiological Contamination of Pharmaceutical Products
CN118760815A (zh) 一种现代农业灵芝抗逆性种植状态监控方法、终端及介质
Ibraheem et al. Use the robust RFCH method with a polychoric correlation matrix in structural equation modeling When you are ordinal data

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20110413

Termination date: 20131122