CN101113164B - 与肿瘤转移相关蛋白prl-3特异性结合的12肽及其应用 - Google Patents
与肿瘤转移相关蛋白prl-3特异性结合的12肽及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合的12肽序列。本发明应用噬菌体展示文库，筛选能够与人再生肝脏磷酸酶-3(PRL-3)特异性结合的12肽，该12肽具有与PRL-3特异性结合的特性，并且能够影响PRL-3磷酸酶活性。因此，本发明提供的12肽对PRL-3在肿瘤转移中的作用的研究以及靶向药物的设计与研发具有很高的应用价值。可应用于制备检测肿瘤转移的药物。以及作为药物开发的新靶点，应用于制备抑制肿瘤转移的药物中。
Description
技术领域
本发明涉及利用噬菌体展示文库技术筛选能与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合的多肽的方法，具体地说，是应用随机12肽噬菌体展示文库筛选与PRL-3特异性结合的噬菌体，得到能够影响PRL-3磷酸酶活性的12肽序列。
背景技术
从原位生长的肿瘤到转移的肿瘤这个转变，即肿瘤转移，是肿瘤发生过程中最危险的变化。它包含许多为完成肿瘤转移而进行的一系列复杂事件[Ridley A.转移的分子开关.Nature，406：466-467，2000]。
近来，Zeng和他的同事发现中国仓鼠卵巢细胞稳定地表达PRL-3，显示出增强的活动性，入侵活性和诱导裸鼠转移肿瘤形成。这些发现为将PRL-3作为肿瘤转移的早期诊断和药物开发的新靶点提供了依据，因为现在几乎没有肿瘤转移的治疗靶点。
现有噬菌体展示技术是对纯化了的蛋白进行筛选，得到与该蛋白特异结合的寡肽或抗体。在此基础上我们运用噬菌体展示技术对细胞表面抗原进行筛选，通过这种方法可以得到对细胞表面特异结合的寡肽分子。我们的方案克服了以往细胞筛选中的一些问题，主要是细胞表面成分复杂而且未知，细胞筛选的非特异性较大，背景值高，而且转移与非转移肿瘤细胞间细胞表面差异小。
发明内容
本发明的目的是应用噬菌体展示文库技术对PRL-3进行筛选，以获得能与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合的12肽。因为有许多证据表明PRL-3与肿瘤转移相关，所以它是潜在的肿瘤转移早期诊断和药物开发的新靶点。
本发明应用12肽噬菌体展示文库对PRL-3进行了4轮筛选，获得了能与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合的12肽，其氨基酸序列如下：
Gln-Tyr-Thr-Trp-Ile-Phe-Pro-Pro-Met-Gly-Tyr-Gln 。
本发明获得的12肽能够与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合，并且能够影响PRL-3的磷酸酶活性。
与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异结合的12肽的筛选和鉴定包括如下步骤：
第一、经过对人再生肝脏磷酸酶-3(PRL-3)进行四轮筛选，获得能与PRL-3选择性结合的重组噬菌体；
第二、上步得到的重组噬菌体对PRL-3结合能力的测定；
第三、从上步得到的噬菌体库中分离制备单克隆噬菌体；
第四、上步得到的单克隆噬菌体基因组单链DNA的提取和获得寡肽序列；
第五、上步得到的单克隆噬菌体对PRL-3进行ELISA测定；
第六、磷酸酶活性实验证明第四步得到的12肽对PRL-3磷酸酶活性的影响。
本发明所述的与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合的12肽，可应用于制备检测肿瘤转移的药物。
以及作为药物开发的新靶点，应用于制备抑制肿瘤转移的药物中。
本发明的有益效果是：
本发明提供的12肽能够特异性的与PRL-3结合，并能够影响PRL-3磷酸酶的活性，对PRL-3在肿瘤转移中的作用的研究以及靶向药物的设计与研发具有很高的应用价值。
附图说明
图1是噬菌体展示各轮PRL-3特异性结合的噬菌体数，以空孔作为对照；
图2是经过四轮筛选得到的噬菌体以及原噬菌体库与PRL-3及对照结合能力的比较；
图3是15个噬菌体单克隆分别与PRL-3以及固定了his标签的GFP作ELISA检测；
图4是证明筛选所得12肽对肿瘤转移相关蛋白PRL-3磷酸酶活性的影响，图A是加入不同量12肽-GST后PRL-3磷酸酶活性的变化；图B是加入不同量GST后PRL-3活性的变化。
具体实施方式
实施例1：经过四轮筛选获得能与PRL-3特异性结合的重组噬菌体
1.第一轮筛选与洗脱：
①.用NaHCO3溶液稀释蛋白为100μg/mL的溶液，要求NaHCO3的终浓度为0.1M。加100μL该溶液到96孔板的一个空中，4℃过夜固定。
②.加150μL新鲜配制的含2％奶的PBS(MPBS)溶液到固定了蛋白的孔中，封闭未结合蛋白的部分。室温摇摆平台放置1小时。
③.与此同时，将噬菌体(1011pfu)加到100μL MPBS中，加到一个空孔中，室温摇摆平台放置1小时，目的是将可以与ELISA板结合的噬菌体吸收掉。
④.倒掉蛋白和MPBS混合溶液，用200μL PBST(pH 7.4)洗5遍，注意每次都不要让孔干了。最后一次洗完后，将先前与板吸收过的噬菌体和MPBS的混合溶液转移到这个孔中。室温摇摆平台放置2小时。
⑤.倒掉噬菌体和MPBS混合溶液，用200μL PBST洗5遍，再用200μL PBS洗5遍。
⑥.加100μL 0.1M HCl洗脱结合的噬菌体，室温摇摆平台放置10分钟，立即转移到小离心管中，并用Tris-HCl buffer中和到pH为7-8。4℃保存直到测定噬菌体浓度或扩增。
⑦.对照按相同方法操作，只是不固定蛋白。得到洗脱下的噬菌体并测定浓度。
2.扩增，第二轮及之后几轮筛选与洗脱：
①.保留20-50μL噬菌体洗脱液用于测浓度，将剩余的噬菌体全部扩增产生用于下一轮筛选的噬菌体。将对数期的K12接到LB培养基中，摇床培养到OD600为0.5，将1mL转接到含有30mL LB培养基的三角瓶中，同时将要扩增的噬菌体加入，37℃摇床培养4-5小时。
②.转移培养物到离心管中，4℃，10000rpm离心10分钟。将80％的上清吸到新的离心管中，加1/6体积的PEG溶液中，4℃沉淀2-4小时，最好过夜。
③.4℃，10000rpm离心30分钟，缓慢倒出上清，再小心的将管壁上的液体离心下来，用微量移液器小心吸弃。
④.用200μL PBS重悬沉淀，转移悬液到0.5mL离心管中，4℃，10000rpm离心5分钟。
⑤.上清转移到新的0.5mL离心管中，这就是扩增了的噬菌体。4℃保存用于测浓度和下一轮筛选。
⑥.固定ELISA板的另一个孔，按第一轮的方法做第二轮及之后几轮。噬菌体的加入量要保持与第一轮一致。
3.噬菌体滴度的测定的具体实施：
①.K12接种到5mL LB培养基中，37℃摇床培养至对数中期(OD600大约0.5)。
②.融化上层胶，每个要测浓度的噬菌体稀释液一管，45℃平衡，准备好使用。
③.每个要测浓度的噬菌体稀释液还要预先37℃与预温一块LB平板(涂有IPTG和X-gal)，准备好使用。
④.稀释噬菌体悬液。
稀释比例如下：
对于扩增的噬菌体液，准备1010和1011稀释度。
对于洗脱下来的噬菌体液，第一轮按102和103稀释，以后每多一轮就增加10倍稀释度。
⑤.将培养到对数中期的K12菌液接200μL到0.5mL离心管中，每个要测浓度的噬菌体稀释液一管。
⑥.将噬菌体稀释液加入到K12菌液中，室温放置1-5分钟。
⑦.转移噬菌体感染的K12到先前45℃平衡的上层胶中，迅速摇动，立即倒入预温的LB平板(涂有IPTG和X-gal)上，均匀铺平。
⑧.冷却5分钟，反转平板，37℃培养过夜。
⑨.计数器统计平板上的噬菌斑数量，根据稀释倍数计算噬菌体的浓度。
结果：进行4轮富集筛选，每轮从PRL-3上洗脱下来的噬菌体量在总体上逐渐升高，与对照孔比较实现了特异性的富集(见表1)。表1中四轮的噬菌体数用图1表示。图1中：纵坐标用对数值表示，横坐标代表轮数。黑色柱代表对PRL-3的筛选结果；白色柱代表对空孔的筛选结果。
表1筛选对PRL-3特异性结合的噬菌体
| PRL-3(pfu) | 空白(pfu) | |
| 第一轮 | 7.3×10<sup>4</sup> | 2.0×10<sup>4</sup> |
| 第二轮 | 3.6×10<sup>4a</sup> | 6.0×10<sup>3</sup> |
| PRL-3(pfu) | 空白(pfu) | |
| 第三轮 | 2.2×10<sup>7</sup> | 8.0×10<sup>4</sup> |
| 第四轮 | 2.2×10<sup>7b</sup> | 1.0×10<sup>5</sup> |
a.从第二轮开始加强了洗脱强度，目的是筛选到特异性强的12肽。因此会出现洗脱量/加入量减小的现象。
b.第四轮洗脱下的噬菌体量与第三轮一样说明已经达到最大程度结合。
实施例2：筛选到的噬菌体对PRL-3及对照结合能力的测定
①.用NaHCO3溶液稀释蛋白为100μg/mL的溶液，要求NaHCO3的终浓度为0.1M。加100μL该溶液到96孔板的两个孔中，4℃过夜固定。同时按照同样的方法将BSA加入另两个孔作对照。
②.加150μL新鲜配制的含2％奶的PBS(MPBS)溶液到固定了蛋白的孔中，封闭未结合蛋白的部分。室温摇摆平台放置1小时。
③.倒掉蛋白和MPBS混合溶液，用200μL PBST(pH 7.4)洗5遍，注意每次都不要让孔干了。最后一次洗完后，将1010特异性噬菌体溶液以及文库噬菌体分别加入到两个孔中。同时室温摇摆平台放置2小时。
④.倒掉噬菌体和MPBS混合溶液，用200μL PBST洗5遍，再用200μL PBS洗5遍。
⑤.加100μL 0.1M HCl洗脱结合的噬菌体，室温摇摆平台放置10分钟，立即转移到小离心管中，并用Tris-HCl buffer中和到pH为7-8。4℃保存直到测定噬菌体浓度。
⑥.测定洗脱下的噬菌体浓度。
结果：第四轮得到的特异性噬菌体库与PRL-3结合能力较原始噬菌体库提高了近100倍，第四轮得到的特异性噬菌体库与PRL-3结合能力是其与BSA结合能力的100倍，即第四轮得到的噬菌体库能够特异性与PRL-3结合(见图2)。图2中：纵坐标是洗脱下噬菌体的对数值，1代表文库噬菌体，2代表筛选到的特异性噬菌体，黑色柱代表对PRL-3的筛选结果，白色柱代表对对照的筛选结果。
实施例3：单克隆的噬菌体的分离制备
1.特异性结合的噬菌体克隆的确定
①.在所筛选的噬菌体量长到一定程度而不再增加时，就可以在长有噬菌斑的平板上挑取单克隆鉴定了。挑15个单克隆对于鉴定就足够了。
②.用灭菌的牙签或枪头挑取一个蓝色噬菌斑，并转到一个含5mL LB培养基的试管中。
③.37℃摇床培养4-5小时。
④.转移培养物到7mL离心管中，10000rpm离心10分钟。
⑤.将80％的上清吸到新的离心管中，加1/6体积的PEG溶液，4℃沉淀2-4小时。
⑥.4℃，10000rpm离心30分钟，缓慢倒出上清，用微量移液器小心将残留的液体吸弃。
⑦.用200μL PBS重悬沉淀，转移悬液到0.5mL离心管中，4℃，10000rpm离心5分钟。
⑧.上清转移到新的0.5mL离心管中，这就是所挑取的噬菌体单克隆。4℃保存用于测浓度，如果要长期保存，加50％甘油，冻于-20℃。
2.通过ELISA检测挑取的单克隆
①.用NaHCO3溶液稀释蛋白为100μg/mL的溶液，要求NaHCO3的终浓度为0.1M。对于每个单克隆要固定至少两个孔，一个孔固定所筛的蛋白，另一个孔以his-GFP作对照，以排除与his结合的可能。每孔加100μL，4℃过夜固定。
②.每孔加100μL浓度10mg/mL的BSA封闭未结合蛋白的部分，室温摇摆平台放置1小时。
③.根据所测的噬菌体单克隆浓度，将一定量的噬菌体单克隆用PBST稀释，每孔加100μL，使噬菌体加入量在109-1010。室温摇摆平台放置2小时。
④.每个孔用200μL PBST洗5次，每次在摇摆平台上放置5分钟。
⑤.抗体按1∶5000用PBST稀释，每孔加100μL，室温摇摆平台放置1小时。
⑥.每个孔用PBST洗5次。
⑦.按60μL TMB(10mg/mL溶于DMSO)加到12mL Critate-Ac中，再加入3μLH2O2配制底物，每孔加100μL显色。
⑧.90s后加100μL 1M H2SO4终止反应。
⑨.用酶标仪在OD450下测定吸光值。
结果：15个单克隆都表现出对PRL-3的高结合性，见图3。图3中：横坐标表示不同的噬菌体单克隆，纵坐标表示平均净吸光值；黑色柱表示PRL-3孔的平均净吸光值；白色柱表示GFP孔的平均净吸光值。图3中每个噬菌体单克隆均与PRL-3及GFP结合。洗涤后，用辣根过氧化物酶偶联M13抗体及其底物TMB对每个孔进行ELISA反应，并检测OD450。对每个克隆进行了两组检测，图中数据为两组检测的平均值。
实施例4：噬菌体基因组单链DNA的提取和12肽序列的获得
①.将所挑取的15个单克隆噬菌体进行扩增。
②.取60μL扩增后的单克隆噬菌体溶液，加入20μL PEG溶液，置于4℃冰箱内沉淀过夜。
③.10000rpm离心10分钟，弃上清并倒扣离心管，使液体流尽。
④.加入200μL碘化物缓冲液，再加入500μL无水乙醇，室温孵育10分钟。
⑤.10000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗沉淀。
⑥.10000rpm离心10分钟，弃上清，干燥，让残余液体蒸发完全。
⑦.重悬沉淀于30μL去离子水中，该溶液即该单克隆噬菌体的基因组单链DNA。
⑧.以-96gIII引物(5’-C CCTCATAGTTAGCGTAACG-3’，New England Biolabs随机十二肽噬菌体展示文库产品)测序。测序结果用Prime Primier软件翻译，得到多肽序列。序列如下：
Gln-Tyr-Thr-Trp-Ile-Phe-Pro-Pro-Met-Gly-Tyr-Gln
实施例5：12肽对PRL-3磷酸酶活性的影响
①.将测序得到的12肽构建到pGEX-4T1载体中与GST融合表达。
②.纯化出12肽-GST及GST(对照)。
③.在以MUP为底物测定PRL-3磷酸酶活性的反应体系(15μg PRL-3与36μM MUP在25mM MOPS，pH 7.0，37℃条件下)中分别加入7，14，21μg的12肽-GST或GST，检测12肽对PRL-3磷酸酶活性的影响。
结果：12肽-GST表现出对PRL-3磷酸酶活性的激活作用，而对照组GST对磷酸酶PRL-3活性没有显著影响。见图4，图中横坐标为反应时间，纵坐标为底物MUP被PRL-3脱去磷酸基团形成MU后的紫外吸光值。A图为加入不同量12肽-GST后PRL-3磷酸酶活性的变化；B图为加入不同量GST后PRL-3活性的变化。
序列表
<110>南开大学
<120>与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合的12肽及其应用
<160>1
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>噬菌体
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)...(12)
<223>
<400>1
Gln Tyr Thr Trp Ile Phe Pro Pro Met Gly Tyr Gln
1 5 10
Claims (3)
1.一种与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合的12肽，其氨基酸序列如下：
Gln-Tyr-Thr-Trp-Ile-Phe-Pro-Pro-Met-Gly-Tyr-Gln。
2.权利要求1所述的与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合的12肽，其特征在于，所述12肽的筛选和鉴定步骤如下：
第一、经过对人再生肝脏磷酸酶-3(PRL-3)进行四轮筛选，获得能与PRL-3选择性结合的重组噬菌体；
第二、上步得到的重组噬菌体对PRL-3结合能力的测定；
第三、从上步得到的噬菌体库中分离制备单克隆噬菌体；
第四、上步得到的单克隆噬菌体基因组单链DNA的提取和获得寡肽序列；
第五、上步得到的单克隆噬菌体对PRL-3进行ELISA测定；
第六、磷酸酶活性实验证明第四步得到的12肽对PRL-3磷酸酶活性的影响。
3.权利要求1所述的与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合的12肽在制备检测肿瘤转移药物中的应用。
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