CN107513098B - 高亲和结合免疫球蛋白g的短肽及应用 - Google Patents

高亲和结合免疫球蛋白g的短肽及应用 Download PDF

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Abstract

一种高亲和结合免疫球蛋白G的短肽及应用，所述短肽(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的短肽，并且通过两端的半胱氨酸巯基形成二硫键构成环状结构；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(a)具有相同生物学功能的由(a)衍生的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，并且通过两端的半胱氨酸巯基形成二硫键构成环状结构。本发明还包括高亲和结合免疫球蛋白G的短肽及应用。本发明筛选的短肽与免疫球蛋白G高度亲和，经过体外亲和能力动力学测定，该短肽结合IgG的结合常数KD可达到7.02E‑06M。

Description

高亲和结合免疫球蛋白G的短肽及应用
技术领域
本发明涉及一种短肽及应用，具体涉及一种高亲和结合IgG的短肽及应用。
背景技术
免疫球蛋白G(IgG)，即抗体，是在脾脏和淋巴结中合成，在人体血清中的含量最高，占血清总Ig的75％～80％，而且在血清中半衰期长，主要分布在血清和组织液中，是抗细菌、抗毒素和抗病毒抗体的主要组成部分，也是机体抗感染免疫的过程中的重要物质基础。IgG分子的基本结构是由四肽链组成的，即2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)，各个链之间以二硫键相连，从而使整个分子具有一定的灵活性。IgG分子可分为恒定区和可变区两部分，分子中没有轻链的部分称为可变区或Fc段(可结晶部分)，此区域是由一组固定的基因所决定，同一个种属中的所有同亚型抗体此区域是一致的；分子中既有重链又有轻链的部分称为恒定区或Fab段(抗原结合区)，此区域的极端包含识别并结合靶抗原表位的高可变位点，Fab段也是由一组固定的基因决定，但需要进一步的体细胞突变产生独特的和高特异的可变位点。
抗体可以结合一个特定结构域(表位区域)的蛋白质与多结构域，从而阻止一部分复合物只有一种蛋白质的功能。可见，抗体因其具有高度的结合特异性靶抗原，是免疫检测的关键因素，已成为检测或调控蛋白质功能的关键工具，可用于疾病诊断或实验室检测生物分子。此外，由于抗体对细胞膜的不渗透性，使用治疗性抗体可通过阻断蛋白质的功能来治愈疾病疾病，而抗体偶联药物(ADC)会显著增强这种渗透治疗效果。但是，在大多数情况下，ADC药物是通过适当的化学接头对共价连接抗体，由于化学连接一般不能很好的定点连接，可能会损害抗体内在功能或结构完整性的交联化学反应，至今仍然存储着没法克服的缺陷。
近年来，为了将抗体输送到活细胞中，已开发许多相关技术，其中具有代表性的方法包括将抗体蛋白结合在脂质体的表面，可具有靶向性，然而由于脂质体存在靶向性不够明显，包封率和稳定性差，载药量相对较低，制备工艺复杂等缺点，特别是脂质体毒性较大，在活体研究中发现其会在肺部聚集并造成炎症，并且与DNA包裹形成的颗粒粒径较大(>500nm)，不利于进入肿瘤组织发挥作用。因此，限制了脂质体的广泛应用。现已研究证明IgG结合肽(FcBP)由于具有可逆和位点特异性的结合抗体部位，可用于抗体-药物偶联。通过将药物连接在短肽上，然后利用短肽定点到抗体上，就可以实现抗体药物的稳定合成，从而为药物在活体内的靶向性提供了非常方便的功能链接工具，而且短肽在生物组织中的穿透性更佳，毒性较低，合成上也更为容易并具有较低的免疫原性。但是，直链短肽虽然在体外具有很好的生物活性和稳定性，但是进入体内后因体内环境复杂，存在各种各样的酶，导致直链短肽在酶的作用下很快降解，活性丧失；另外，直链肽在液相里的构象柔性使得不大容易符合受体的构象要求，这些不利因素造成直链短肽仍有许多问题有待解决。因此，由于线性小肽的亲和力和特异性仍不能满足临床应用的需求，迫切需要获得更高亲和力和特异性的多肽分子。
噬菌体展示技术是一种快速高通量的蛋白多肽展示技术，其原理是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合，在该技术基础上通过反复的结合-洗脱-单克隆扩增可定向、快速、高通量的筛选高亲和的靶向抗体及功能型多肽。目前，利用随机合成的方法，可以将多达109的不同多肽序列展示到噬菌体表面，建立起一个大库容的多肽库，筛选出不同需求的多肽，并以此结合肽为载体与药物相连，这样可以有效地提高定向传递治疗药物的能力。但是应用噬菌体展示随机肽库技术筛选既能与IgG高亲和结合，又能作为靶向抗体药物连接子的短肽的研究，到目前为止鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种高亲和结合免疫球蛋白G的短肽：
(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的短肽，并且通过两端的半胱氨酸巯基形成二硫键构成环状结构；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(a)具有相同生物学功能的由(a)衍生的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，并且通过两端的半胱氨酸巯基形成二硫键构成环状结构。
进一步，(b)中，插入的连接子为GGGS。
进一步，所述免疫球蛋白G为人源化免疫球蛋白G。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种分离的多核苷酸，包含编码所述的短肽的核酸序列。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种核酸构建体，包含所述的多核苷酸。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种重组表达载体，包含所述的核酸构建体。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种重组宿主，包含所述的核酸构建体或所述的重组表达载体。
进一步，所述宿主为大肠杆菌。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种生产高亲和结合免疫球蛋白G的短肽的方法，通过在重组宿主中表达编码所述短肽的核酸序列，形成包含所述短肽的包涵体，然后回收短肽。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种高亲和结合免疫球蛋白G的短肽在制备抗体偶联药物中的应用。
本发明先将靶标IgG蛋白标上生物素(生物素化试剂可选磺基琥珀酰亚胺-6-(生物素)己酸，例如EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin生物素化试剂盒，或磺基琥珀酰亚胺-6-(生物素酰化)己酸，例如EZ-Link Sulfo-NHS-LC Biotinylation Kits生物素化试剂盒。可见，生物素化试剂中包含一个存在于NHS环上的带负电荷的磺酸基，使其分子内产生足够的极性，水溶性好，允许其可以直接加入到反应性水溶液中，而不需要提前溶解在有机溶剂中，在生理条件下就可进行生物素标记。)，然后将其固定到链亲合素磁珠上(链霉亲和素磁珠是由超顺磁性微珠与高纯度链霉亲和素共价结合而成，粒径均一、形貌规整，有利于方便、快捷地捕获目标分子，可轻松和生物素化的IgG蛋白结合。)，最后利用噬菌体展示技术经过多轮生物淘选，获得了一条高亲和结合人源IgG蛋白的环肽序列，命名为IgG12C:(0)CSKEATPFC，环肽因其具有明确的固定构象，能够与受体很好地契合，加上分子内不存在游离的氨基端和羧基端使得对氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低，因此其生物活性半衰期长，受体选择性高，使得环肽的代谢稳定性和生物利用度远远高于直链肽。由此可见，本发明为了筛选高亲和结合的短肽，利用生物素链亲合素结合特异性好，结合能力强，接近于共价结合，可以耐受加热、酸、碱、高浓度的尿素和盐溶液，且对IgG蛋白浓度和纯度要求均不高，IgG蛋白活性也不受影响，从而在后续筛选高亲和结合短肽中，在高强度的洗涤过程中，靶标蛋白不易与磁珠脱离。
本发明高亲和结合人源IgG蛋白的环肽序列直接利用多肽合成仪进行合成，经过体外亲和能力动力学测定，IgG12C结合IgG的结合常数KD达到7.02E-06M，(IG12C)2结合IgG的结合常数KD达到9.37E-08M。
本发明的优点在于：IgG12C短肽结构短小，与IgG的亲和性强，无免疫原性，用量小、毒性低，合成方便，成本低廉；而且IgG12C短肽具有良好的靶向作用，尤其是(IG12C)2短肽可用作疾病靶向治疗载体的构建。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1为合成Ig12C纯化及质谱检测图。
图2为测定Ig12C与IgG蛋白的结合图。
图3为EGFP与两个重复短肽融合表达蛋白纯化图。
图4为测定EGFP-(IG12C)2与IgG的结合力图。
图5为EGFP-(IG12)2肿瘤细胞靶向实验。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
1、噬菌体淘选主要生物材料
库容量为1.1×109的噬菌体展示环七肽文库以及宿主细菌E.coli ER2738均购自NEB公司。
实施例1：IgG蛋白生物素化标记
采用Thermo Scientific的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Kits生物素化试剂盒对靶标IgG蛋白进行生物素化，其中Sulfo-NHS基团提高了水溶性，同时保证了与IgG蛋白形成稳定的氨酰键而将生物素引入IgG蛋白上，这种稳定的氨酰键能够承受许多次缓冲条件，经最后测定每个IgG蛋白标上2个生物素。实施例2：IgG蛋白结合短肽筛选
采用磁珠淘选的方法，将带生物素化标记的IgG蛋白用PBS稀释到10μg/mL，然后取5μg IgG稀释液与5μL活化的链亲合素磁珠37℃孵育1h，将IgG蛋白固定到磁珠上，用500μLPBS洗涤磁珠1遍；然后将固定IgG蛋白的磁珠与NEB噬菌体展示库(约有1×1011cfu)37℃孵育1小时，吸出未结合的噬菌体，先加入PBS洗3遍(逐轮增加洗涤次数)，再加入PBST洗3遍，接着加入100μL pH＝2.2的甘氨酸-盐酸溶液，快速冲洗磁珠，将结合到磁珠上展示了短肽的噬菌体洗脱下来；然后加入Tris-HCl溶液(pH＝8.8)，将洗脱液pH调到7，接着取100μL洗脱液感染100mL OD600nm 0.6的ER2738菌，扩增噬菌体，扩增后产生下一级短肽库，用于下一轮短肽筛选淘选，如此重复5次淘选。
实施例3：噬菌体库滴度的测定和检测噬菌体展示短肽对靶分子的结合活性
每次扩增噬菌体库时，取感染噬菌体的ER2738菌10μL进行梯度稀释测定出噬菌体库的滴度，并随机挑取克隆进行phage-ELISA鉴定对LC3蛋白的结合，结果显示一个克隆显现出较强的阳性结果。
实施例4：噬菌体阳性克隆序列测定
将该阳性克隆送样测序，最终测得一个阳性克隆序列为CSKEATPFC，命名为Ig12C。为后续方便标记，在后加一个K,CSKEATPFCGGK,该序列送吉尔生化(上海)有限公司进行短肽合成，合成Ig12C纯化及质谱检测图，见图1，从图1中可以看到目标肽蜂的良好分离以及目标肽的分子量为1225.40。
实施例5：测定Ig12C肽与IgG的结合能力
利用Fortebio分子相互作用仪(Fortebio Octect Red 96)分别对Ig12C、IG120(Ig12C开环后形成的直链肽)与IgG的结合能力进行测定。
先将IgG蛋白固定到测定仪器的探针上，Ig12C短肽、IG120分别在溶液流动相中，利用激光干涉测定其结合常数的变化，如图2，之后利用PBS溶液进行解离，测定其解离常数KD＝Kd/Ka，式中Kon为结合常数，Kdis解离常数，KD为平衡解离常数。测定结果见表1。
表1-平衡常数、分离常数和解离常数的测定值
检测 K<sub>on</sub> K<sub>dis</sub> KD(M)
IG12C 1.04E03 7.31E-03 7.02E-06
IG120 1.4E01 1.5E-01 1.09E-02
由表1可知，IG12C环肽与IgG蛋白的结合力较强，而IG120与IgG蛋白的结合力变弱。
实施例6：应用实验
EGFP(增强绿色荧光蛋白)与两个重复短肽IG12C的直链中间加了GGGS的linker(即(IG12C)2)氨基酸序列为CSKEATPFCGGGSCSKEATPFC，如SEQ ID NO:2)进行融合，表达EGFP-(IG12C)2蛋白纯化图，如图3，目的蛋白的大小约为35kD，按实施例5测定Ig12C肽与IgG的结合能力方法，测定EGFP-(IG12C)2与IgG浓度为40ug/ml时的结合力KD＝9.37E-08，如图4，比单个IG12C短肽的结合能力提高80倍。
利用(IG12C)2短肽作为EGFP荧光蛋白与靶向抗体曲妥珠单抗(例如商品赫赛汀)的连接子，将EGFP-(IG12C)2与曲妥珠单抗体外混匀，分别加入到her2阳性细胞SKBR3(购自ATCC)中，冰上孵育30min，吸去细胞上清溶液，用PBS洗涤细胞2次，荧光显微镜下观察，如图5，可以看出曲妥珠单抗与EGFP单独混时，没有Ig12C短肽做为连接子,不能将EGFP荧光带到癌细胞细胞周围，细胞无EGFP荧光，而有Ig12C作为连接子，通过曲妥珠单抗介导，能将EGFP带到癌细胞边，细胞有EGFP荧光发生。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Figure BDA0001401136900000081
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
<120> 高亲和结合免疫球蛋白G的短肽及应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Ig12C
<400> 1
Cys Ser Lys Glu Ala Thr Pro Phe Cys
1 5
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> (IG12C)2
<400> 2
Cys Ser Lys Glu Ala Thr Pro Phe Cys Gly Gly Gly Ser Cys Ser Lys
1 5 10 15
Glu Ala Thr Pro Phe Cys
20

Claims (9)

1.一种高亲和结合免疫球蛋白G的短肽，其特征在于，
(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的短肽，并且通过两端的半胱氨酸巯基形成二硫键构成环状结构；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(a)具有相同生物学功能的由(a)衍生的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，并且通过两端的半胱氨酸巯基形成二硫键构成环状结构。
2.根据权利要求1所述的高亲和结合免疫球蛋白G的短肽，其特征在于，所述免疫球蛋白G为人源化免疫球蛋白G。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，包含编码权利要求1～2之一所述的短肽的核酸序列。
4.一种核酸构建体，其特征在于，包含权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求4所述的核酸构建体。
6.一种重组宿主，其特征在于，包含权利要求4所述的核酸构建体或权利要求5所述的重组表达载体。
7.根据权利要求6所述重组宿主，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌。
8.一种生产如权利要求1～2之一所述的高亲和结合免疫球蛋白G的短肽的方法，其特征在于，通过在权利要求6所述的重组宿主中表达编码所述短肽的核酸序列，形成包含所述短肽的包涵体，然后回收所述短肽。
9.根据权利要求1～2之一所述的高亲和结合免疫球蛋白G的短肽、权利要求3所述的多核苷酸或权利要求4所述的核酸构建体在制备抗体偶联药物中的应用。
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