CN101293917B - 与pkr激酶结构域特异性结合的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

一种能够与PKR激酶结构域特异性结合的多肽及其应用。本发明涉及PKR激酶结构域(PKR_cat)的抑制12肽序列，其氨基酸序列为：Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-Arg。本发明应用噬菌体展示文库，筛选能够与PKR_cat特异性结合的12肽，该12肽具有与PKR_cat特异性结合的特性，并且能够抑制其激酶活性。因此，该12肽对研究PKR_cat在细胞调亡中的作用及PKR_cat抑制剂的开发具有实用价值。

Description

与PKR激酶结构域特异性结合的多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物工程与生物医药技术领域，涉及利用噬菌体展示技术筛选能与PKR激酶结构域(PKR_cat)特异性结合的多肽及其应用。

背景技术

PKR是一种由干扰素诱导的依赖于双链RNA的蛋白激酶，是真核翻译起始因子eIF2α激酶家族成员之一。它是一种有551个氨基酸组成的丝氨酸-苏氨酸激酶，而近期研究也发现其具有酪氨酸激酶的活性[Su，Q.et al.Tyrosine phosphorylation acts as a molecular switch tofull-scale activation of the eIF2α RNA-dependent protein kinase.2006.PNAS]。结构上，主要包括2个功能性结构域：N端与RNA结合的调节性结构域和C端的催化结构域。PKR在干扰素诱导的抗病毒防御应答中发挥主要的作用，被认为是IFN诱导的最具有特征性的抗病毒路径。

PKR也可能是治疗多种神经退行性病变的药物靶标[Peel，Alyson L.PKR Activation inNeurodegenerative Disease]。其中，阿尔茨海默症(AD)是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，老年斑，神经纤维丝缠结和神经细胞死亡等病理变化为病理特征。β-淀粉诱导的神经细胞凋亡中半胱天冬酶Caspase从PKR的Asp251切掉PKR的调节结构域，释放出组成型激活的eIF2α激酶结构域从而导致神经细胞蛋白合成的抑制[Rohn TT.et al.Activation of caspase-8 in the Alzheimer’s disease brain.2001.Neurobiol Dis.]。以PKR_cat作为靶蛋白筛选抑制剂可以用于开发延缓老年痴呆病中神经细胞的死亡，缓解和治疗老年痴呆的药物。

在过去的10年间，多肽疗法对医药行业来说，被认为是一项很有前途的新开发。全球范围内有600-700种多肽正处于开发阶段。其中，在细胞信号通路的基础研究和药物研发方面，激酶多肽类抑制剂已成为一个非常有前途的领域。例如，多肽PKI抑制PKA的激酶活性被用于研究人淋巴细胞的调亡通路[Zhang，B.et al.Racl inhibits apoptosis in human lymphoma cells bystimulating Bad phosphorylation on Ser-75.2004.Mol.Cell.Biol.]。豆蔻酰基化蛋白激酶C的抑制肽在细胞水平和动物水平都能够特异的抑制PKC的活性。[Spyridopoulos，I.et al.Divergence of angiogenic and vascular permeability signaling by VEGF inhibition of proteinkinase C suppresses VEGF-induced angiogenesis but promotes VEGF-induced，NO-dependentvascular permeability.2002.Aterioscler.Thromb.Vasc.Biol.]。尽管PKR激酶结构域在老年痴呆等疾病中发挥作用，但目前还未有PKR抑制剂和PKR多肽类抑制剂的报道。

多肽药物设计中，利用噬菌体呈现技术构建不同容量的随机肽库，从这些肽库中快速筛选出活性多肽，并鉴定其结构，可以简便快速地获得与靶分子具有强亲和力和特异性的小肽或新型蛋白，这些肽段可以作为候选药物进行开发。

发明内容

本发明目的是提供一种能够与PKR激酶结构域特异性结合的多肽及其应用。

PKR是神经细胞凋亡相关疾病，如老年痴呆症药物开发的新靶点。本发明应用12肽噬菌体展示文库对PKR_cat进行五轮筛选，获得了能与PKR_cat特异性结合的12肽，并且该12肽能够抑制PKR_cat的激酶活性。

本发明应用噬菌体展示文库对神经细胞凋亡相关蛋白PKR_cat进行筛选，获得了一个特异性结合PKR_cat的12肽，其氨基酸序列如下：

Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-Arg。

上述多肽，能与PKR激酶结构域特异性结合，并且能够抑制PKR_cat磷酸化eIF2α的能力，IC₅₀为2.5μM。

所述的多肽可以用于抑制PKR_cat激酶活性。可应用于开发PKR_cat抑制剂。

本发明提供的与PKR激酶结构域特异性结合的多肽的筛选和鉴定步骤如下：

·经过对人PKR_cat进行五轮筛选，获得与PKR结合的重组噬菌体；

·ELISA法检测噬菌体与PKR_cat的结合；

·单克隆噬菌体的分离制备；

·噬菌体基因组单链DNA的提取和获得寡肽序列；

·多肽固相合成，竞争ELISA检测多肽与PKR_cat的结合；

·应用体外生物化学方法研究12肽对PKR_cat激酶活性的影响。

本发明的有益效果是：本发明提供的12肽能够特异性的与PKR_cat结合并抑制PKR_cat的激酶活性，可应用于PKR_cat抑制剂的药物设计。

附图说明

图1.是免疫印迹法(Western Blot)检测纯化PKR_cat的激酶活性，    

图2.是噬菌体展示中每轮洗脱的噬菌体数，以空孔作为对照，

图3.是ELISA法检测筛选得到的噬菌体和原噬菌体库与包被PKR_cat的孔和空孔的结合，

图4.是ELISA法检测10个噬菌体单克隆与PKR_cat及空孔的结合，

图5.是竞争ELISA法检测合成12肽与PKR_cat的结合，

图6.是体外酶学方法检测合成12肽对PKR_cat激酶活性的影响。

具体实施方式

实施例1：重组PKR_cat的表达纯化及活性的初步研究

1.重组PKR_cat质粒的构建

利用已有的pET28a-PKR模板，下面的PCR引物和Pfu聚合酶PCR扩增PKR_cat：

正向引物：5′-CATGCCATGGGCGACATGAAAGAAACAAAGTATACTG-3′

反向引物：5′-GGCTCTCGAGACATGTGTGTCGTTCATTTTTCTC-3′

利用Nco I/Xho I消化扩增DNA片段，并且克隆进入质粒pET28a(Novagen)。将这样构建的重组质粒命名为pET28a-PKR_cat并且导入大肠杆菌BL21。重组质粒pET28a-PKR_cat允许在成熟的PKR_cat的N末端具有另外一个甲基硫氨酸残基和在C末端具有另外6个组氨酸的重组PKR_cat的表达。

2.重组PKR_cat的纯化

①.接含有pET28a-PKR_cat的BL21于5mL LB培养基(50μg/ml卡那霉素)，37℃，250rpm摇菌过夜。

②.1∶50的比例转接到4个大瓶中(每瓶250mL LB培养基，50μg/ml卡那霉素)，37℃，250rpm摇菌2小时。加入300μMIPTG，27℃，250rpm，过夜诱导。

③.将诱导过夜的菌液10000rpm，离心15分钟。用Lysis Buffer(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.5)重悬沉淀，10000rpm，离心15分钟。

④.用40mL Lysis Buffer重悬所有沉淀，加入PMSF蛋白酶抑制剂至终浓度为1mM，在冰浴中超声破碎(功率300W，超声5s，停15s，90循环)。

⑤.将裂解液12000rpm，15分钟离心两次。将离心后的上清与4mL Ni树脂4℃结合1小时。

⑥.在蛋白与树脂结合的同时，清洗蛋白纯化仪：先用清水清洗B管道，再清洗A管道(5mL/分钟)；再用Elution Buffer(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，250mM咪唑，pH7.5)清洗B管道(0.5mL/分钟)；最后用Lysis Buffer清洗A管道(0.5mL/分钟)。

⑦.将结合蛋白的树脂离心，弃上清，装柱，连接于AKTA prime plus蛋白纯化仪(通用电气)。用Lysis Buffer漂洗Beads，洗下非特异结合的蛋白。用Elution Buffer梯度洗脱目的蛋白。

⑧.根据蛋白峰的位置，收集相应管的洗脱液，跑SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，考马斯亮兰染色验证。

3.PKRcat激酶活性的初步分析：

反应体系为40μL：

①.将50ng纯化PKR_cat加入置于冰上的试管中，其终浓度为25nM。

②.混合底物纯化的eIF2α，ATP，5×Buffer A(100mM Tris-HCl，200mM KCl，10mM MgCl₂)和双蒸水使反应液中含终浓度为20mMTris-HCl，40mMKCl，2mMMgCl₂，500nMeIF2α，100μM ATP，以此混合液启始反应。

③.以②混合液启始反应，30℃水浴准确反应10分钟。加8μL 6×Loading Buffer终止反应。

④.90℃沸水中煮5分钟。样品冷却至室温，微型离心机短暂离心(～15s)。

⑤.上样，进行SDS-PAGE电泳。

⑥.Western Blot法检测eIF2α的磷酸化状态。

方法如下：

100mA，电转移1.5小时。

用3％的脱脂牛奶封闭膜，室温摇床轻摇1小时。加入第一抗体(磷酸化eIF2α抗体，兔源，Invitrogen)，室温摇床轻摇1小时。1×TBST(含0.1％Tween的TBS，pH7.4)洗膜3次，每次5分钟。与第二抗体反应(HRP偶联羊抗兔二抗，Santa Cruz Biotechnology)，室温摇床轻摇40分钟。1×TBST洗膜3次，每次5分钟。去离子水洗5分钟。加化学发光底物(ECL)曝光。曝光强度经凝胶成像系统Chemidoc XRS System(Bio-Rad)定量。

Stripe Buffer(7M盐酸胍，10mMDTT)处理膜30分钟。去离子水洗膜3次，每次5分钟。用3％的脱脂牛奶封闭膜，室温摇床轻摇1小时。加入第一抗体(anti-eIF2αantibody，兔源，Santa CruzBiotechnology)，室温摇床轻摇1小时。1×T BST(含0.1％Tween的TBS，pH7.4)洗膜3次，每次5分钟。与第二抗体反应(HRP偶联羊抗兔二抗，Santa Cruz Biotechnology)，室温摇床轻摇40分钟。1×TBST洗膜3次，每次5分钟。去离子水洗5分钟。加化学发光底物(ECL)曝光。曝光强度经凝胶成像系统Chemidoc XRS System(Bio-Rad)定量。

eIF2α磷酸化程度＝磷酸化eIF2α曝光强度/全eIF2α曝光强度。

结果：从1L菌液中纯化出4.8mg的PKR_cat蛋白，酶活分析表明纯化蛋白具有激酶活性，能够磷酸化eIF2α；对照组未加入PKR_cat，eIF2α未被磷酸化(图1)。

实施例2：经过五轮筛选获得能与PKRcat特异性结合的重组噬菌体

1.第一轮筛选与洗脱：

①.用NaHCO₃溶液稀释PKR_cat蛋白至100μg/mL的溶液，要求NaHCO₃的终浓度为0.1M。加100μL该溶液到96孔板的一个孔中，4℃包被过夜。

②.加150μL新鲜配制的含0.5％(w/v)BSA的TBS(BTBS)溶液到上步包被蛋白的孔中，室温摇摆平台放置1小时。

③.与此同时，将噬菌体(10¹¹ pfu)加到100μL BTBS中，加到一个空孔中，室温摇摆平台放置1小时，目的是将可以与ELISA板非特异性结合的噬菌体吸收掉。

④.倒掉蛋白/BTBS溶液，用200μLTBST(含 0.1％Tween的TBS，pH7.4)洗6遍，注意每次都不要让孔干了。最后一次洗完后，将先前与板吸收过的噬菌体/BTBS溶液转移到这个孔中。室温摇摆平台放置1小时。

⑤.倒掉噬菌体/BTBS溶液，用200μL TBST洗10遍。

⑥.加100μL 0.2M Glysine洗脱结合的噬菌体，室温摇摆平台放置8分钟，立即转移到小离心管中，并用Tris-HCl buffer中和到pH为7-8。4℃保存直到测定噬菌体浓度或扩增。

⑦.对照：另一孔不包被蛋白按相同方法操作，得到洗脱噬菌体并测定浓度。

2.扩增，第二轮及之后几轮筛选与洗脱：

①.保留10-20μL上步得到的噬菌体洗脱液用于测噬菌体滴度，将剩余的噬菌体全部扩增产生用于下一轮筛选的噬菌体。

提前将大肠杆菌ER2738[F’lacI^qΔ(lacZ)M15 proA⁺B⁺ zzf::Tn10(Tet^R)/fhuA2 supE thiΔ(lac-proAB)Δ(hsdMS-mcrB)5(r_k ^-m_k ^-McrBC^-)菌株保存在含50％甘油的LB培养基中，存于-70℃]接到LB培养基中，摇床培养到OD_600nm为0.5时，取1mL大肠杆菌ER2738转接到含有30mLLB培养基的三角瓶中，同时将要扩增的噬菌体加入，37℃摇床培养4.5小时。

②.转移上步的培养物到离心管中，室温，10000rpm离心15分钟。将80％的上清吸到新的离心管中，加入1/6上清体积的PEG溶液，4℃沉淀过夜。

③.4℃，10000rpm离心30分钟，缓慢倒出上清，再小心的将管壁上的液体离心下来，用微量移液器小心弃掉。

④.用200μL TBS重悬沉淀，转移悬液到0.5mL离心管中，室温10000rpm离心5分钟。

⑤.上清转移到新的0.5mL离心管中，这就是扩增了的噬菌体。4℃保存用于测浓度和下一轮筛选。

⑥.包被ELISA板的另一个孔，加入10¹¹ pfu第一轮扩增噬菌体。按第一轮的方法进行第二轮及之后几轮的筛选和扩增，每轮噬菌体的加入量要保持与第一轮一致。

3.噬菌体滴度的测定的具体实施：

①.大肠杆菌ER2738接种到5mL LB培养基中，37℃摇床培养至对数早中期(OD_600nm大约0.5)。

②.融化上层胶(含有0.7％琼脂粉的LB培养基)，分装3mL/管，45℃水浴平衡，准备好使用。

③.用LB培养基将洗脱(或扩增)后的噬菌体进行10倍系列稀释。

稀释比例如下：

对于扩增的噬菌体液，稀释10¹⁰和10¹¹倍。

对于洗脱下来的噬菌体液，第一轮按10²和10³稀释，以后每多一轮就增加10倍稀释度。

将10μL噬菌体稀释液加入到200μL第一步的ER2738菌液中，，轻轻混匀，室温放置1-5分钟。

④.转移第三步噬菌体感染的ER2738菌液到第二步中45℃平衡的上层胶中，迅速摇动，立即倒入37℃预温的LB平板(涂有IPTG和X-gal)上，均匀铺平。

⑤.冷却5分钟，反转平板，37℃培养过夜。

⑥.计数器统计平板上的噬菌斑数量，根据稀释倍数计算噬菌体的浓度。

结果：进行5轮富集筛选，每轮从PKR_cat上洗脱下来的噬菌体量在总体上逐渐升高，与对照孔比较实现了10⁴倍富集(表1)。表1中五轮的噬菌体数用图1表示。图1中：纵坐标用对数值表示，横坐标代表轮数。

表1筛选对PKR_cat特异性结合的噬菌体

	PKR<sub>cat</sub>(pfu)	空白(pfu)
			第一轮	3.0×10<sup>4</sup>	8.0×10<sup>2</sup>
第二轮	9.0×10<sup>5</sup>	2.0×10<sup>3</sup>
			第三轮	2.0×10<sup>7</sup>	3.2×10<sup>3</sup>
第四轮	6.0×10<sup>8</sup>	4.7×10<sup>3</sup>
			第五轮	7.0×10<sup>8a</sup>	5.0×10<sup>3</sup>

a.第五轮洗脱下的噬菌体量与第四轮持平说明对PKR_cat结合噬菌体的富集已经达到饱和，更多轮的筛选并不能增加富集程度。

实施例3：ELISA检测筛选到的噬菌体对PKRcat及对照结合能力

①.用NaHCO₃溶液稀释蛋白为100μg/mL的溶液，要求NaHCO₃的终浓度为0.1M。加100μL该溶液到96孔板的两个孔中，4℃过夜固定。同时按照同样的方法将BSA加入另两个孔作对照。

②.每孔加100uL 3％的BSA封闭未结合蛋白的部分，室温摇摆平台放置1小时。

③.根据所测的第五轮洗脱下的噬菌体的浓度，将噬菌体用TBST稀释，每孔加100μL，噬菌体约10⁹-10¹⁰。室温摇摆平台放置1小时。

④.每个孔用200μl TBST洗6次。

⑤.HRP-抗M13抗体(Pharmacia Biotech公司)按1∶5000用TBST稀释，每孔加100μL，室温摇摆平台放置1小时。

⑥.每个孔用TBST洗6次。

⑦.按60μL四氨基联苯胺(TMB，Sigma公司，10mg/mL溶于DMSO)加到10mL柠檬酸-醋酸钠(Critate-Ac)中，再加入3μL H₂O₂配制底物，每孔加100μL所配制的底物显色。

⑧.1分钟后加100μL 1M H₂SO₄终止反应。

⑨.用酶标仪在OD_450nm下测定吸光值。

结果：第五轮得到的特异性噬菌体库与PKR_cat结合能力远远大于原始噬菌体库，第五轮得到的特异性噬菌体库与PKR_cat结合能力也远远大于其与BSA结合能力，即第五轮得到的噬菌体库能够特异性与PKR_cat结合(图2)。图2中：横坐标代表不同的噬菌体库，纵坐标表示平均净吸光值，lib代表文库噬菌体，R5代表第五轮筛选到的特异性噬菌体，白色柱代表与PKR_cat的结合，黑色柱代表与对照的结合。

实施例4：单克隆噬菌体的分离制备

1.特异性结合的噬菌体克隆的确定

①.在测定第五轮洗脱噬菌体的平板上挑取10个单克隆鉴定多肽序列。

②.用灭菌的牙签挑取一个蓝色噬菌斑转接于含培养至对数中期的大肠杆菌ER2738的试管中。

③.37℃摇床培养4-5小时。

④.转移培养物到7mL离心管中，10000rpm离心10分钟。

⑤.将80％的上清吸到新的离心管中，加1/6上清体积的PEG溶液，4℃沉淀2小时。

⑥.4℃，10000rpm离心30分钟，缓慢倒出上清，用微量移液器小心将残留的液体吸弃。

⑦.用200μL TBS重悬沉淀，转移悬液到0.5mL离心管中，4℃，10000rpm离心5分钟。

⑧.上清转移到新的0.5mL离心管中，这就是所挑取的噬菌体单克隆。4℃保存用于测浓度，如果要长期保存，加50％甘油，冻于-20℃。

2.通过ELISA检测挑取的单克隆

①.用NaHCO₃溶液稀释蛋白为100μg/mL的溶液，要求NaHCO₃的终浓度为0.1M。对于每个单克隆要包被至少两个孔，一个孔包被所筛的蛋白，另一个孔包被BSA作对照。每孔加100μL蛋白，4℃过夜固定。

②.每孔加100μL 3％的BSA封闭未结合蛋白的部分，室温摇摆平台放置1小时。

③.根据所测的噬菌体单克隆浓度，将一定量的噬菌体单克隆用TBST稀释，每孔加100μL，使噬菌体加入量在10⁹-10¹⁰。室温摇摆平台放置1小时。

④.每个孔用200μl TBST洗6次。

⑤.抗体按1∶5000用TBST稀释，每孔加100μL，室温摇摆平台放置1小时。

⑥.每个孔用TBST洗6次。

⑦.按60μL TMB(10mg/mL溶于DMSO)加到10mL Critate-Ac中，再加入3μL H₂O₂配制底物，每孔加100μL显色。

⑧.1分钟后加100μL 1M H₂SO₄终止反应。

⑨.用酶标仪在OD_450nm下测定吸光值。

结果：10个单克隆都表现出对PKR_cat的高结合性(图3)。图3中：横坐标表示不同的噬菌体单克隆，纵坐标表示平均净吸光值；白色柱表示PKR_cat孔的平均净吸光值；黑色柱表示BSA孔的平均净吸光值。图3中每个噬菌体单克隆均与PKR_cat及BSA结合。洗涤后，用辣根过氧化物酶偶联M13抗体及其底物TMB对每个孔进行ELISA反应，并检测OD_450nm。对每个克隆进行了两组检测，图中数据为两组检测的平均值。

实施例5：噬菌体基因组单链DNA的提取和12肽序列的获得

①.将所挑取的10个单克隆噬菌体进行扩增。

②.取60μL扩增后的单克隆噬菌体溶液，加入20μL PEG溶液，置于4℃冰箱内沉淀过夜。

③.10000rpm离心10分钟，弃上清并倒扣离心管，使液体流尽。

④.加入200μL碘化物缓冲液，再加入500μL无水乙醇，室温孵育10分钟。

⑤.10000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗沉淀。

⑥.10000rpm离心10分钟，弃上清，干燥，让残余液体蒸发完全。

⑦.重悬沉淀于30μL去离子水中，该溶液即该单克隆噬菌体的基因组单链DNA。

⑧.以-96gIII引物(5’-C CCTCATAGTTAGCGTAACG-3’，New England Biolabs随机十二肽噬菌体展示文库产品)测序。测序结果用Prime Primier软件翻译，得到多肽序列。序列如下：

Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-Arg

Asp-Tyr-Met-Ser-Thr-Leu-Phe-Met-Ala-His-Gln-Thr

实施例6：固相多肽合成

①.采用Fmoc保护氨基酸合成的策略，在固相载体上合成多肽；合成完成后用TFA(三氟乙酸)切割，乙醚沉淀得到多肽粗产品。

②.用制备色谱(HPLC)纯化多肽，得到多肽纯品。

用Merck C18色谱柱，含0.05％的TFA的乙腈线性梯度洗脱(乙腈浓度在30min内从5％变化到35％)，紫外210nm波长检测，收集单一组分的峰。

③质谱测试(MS)。

结果：HPLC峰面积积分比较得到两种多肽纯度均大于95％，质谱中目标肽的分子离子峰和设计肽的理论分子量一致，两个试验结果表明获得了高纯度的目标肽。

实施例7：合成多肽的竞争ELISA实验

①.用NaHCO₃溶液稀释蛋白为20μg/mL的溶液，要求NaHCO₃的终浓度为0.1M。每孔加60μL，共48个孔，4℃过夜固定。

②.倒掉蛋白液，每个孔用200μL TBS洗四遍。

③.每孔加200μL 3％的BSA封闭未结合蛋白的部分，室温摇摆平台放置1小时。

④.倒掉BSA液，加入不同浓度梯度的多肽1和多肽2(6个梯度)，每孔加100μL，室温摇摆平台放置1小时。多肽1和多肽2分别以无关序列(Scrambled Sequence)为对照，其它步骤相同。

⑤.每个孔对应加入10⁹的噬菌体(如加入多肽1的孔用带有多肽1的噬菌体去竞争)，让其和多肽竞争与蛋白的结合，室温摇摆平台放置1小时。

⑥.每个孔用200μL TBST洗8次。

⑦.抗体按1∶5000用TBST稀释，每孔加60μL，室温摇摆平台放置1小时。

⑧.每个孔用TBST洗8次。

⑨.60μL TMB(10mg/mL溶于DMSO)加入到10mL Critate-Ac(PH6.0)中，再加入3μL H₂O₂即为底物，每孔加100μL显色。90s后加50μL 1M H₂SO₄终止反应。

⑩.用酶标仪在OD_450nm下测定吸光值。

结果：随着多肽1和多肽2浓度增加，表征噬菌体与PKR_cat结合的OD_450nm逐渐降低；而无关序列多肽的加入并不引起OD_450nm的降低(图4)。表明合成多肽1和合成多肽2能够与对应噬菌体竞争结合PKR_cat。

实施例8：多肽对PKR_cat激酶活性的影响

①.用DMSO配制5mg/ml多肽(多肽1，多肽2，对照多肽)储液，保存于-70℃冰箱。

②.用缓冲液TBS稀释多肽1至100μg/mL，对照多肽至100μg/mL；用含2％DMSO的TBS稀释多肽2至10μg/mL。用含2％DMSO的TBS连续稀释多肽1至浓度为50μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，1μg/mL；稀释多肽2至5μg/mL，2.5μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL。

③.10μL不同浓度多肽与50ng纯化PKR_cat混合，冰上孵育15分钟。

④.其余步骤与实施例1(3)PKR_cat活性的初步分析相同，求得eIF2α的磷酸化程度。

结果：对照多肽对PKR_cat激酶活性没有影响，多肽1和多肽2抑制PKR_cat对eIF2α的磷酸化反应(图5)。多肽1的IC₅₀约为2.5μM，多肽2的IC₅₀约为250nM。

SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>与PKR激酶结构域特异性结合的多肽及其应用

<160>2

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<223>

<400>1

Ser Val His Leu Tyr His Ser Thr Lys Thr Leu Arg

1                5                   10

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<223>

<400>2

Asp Tyr Met Ser Thr Leu Phe Met Ala His Gln Thr

1                5                  10

Claims (3)

1.与PKR激酶结构域PKR_cat特异性结合的多肽，其氨基酸序列如下：

Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-Arg。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，能与PKR激酶结构域特异性结合，并且能够抑制PKR_cat磷酸化eIF2α的能力，IC₅₀为2.5μM。

3.权利要求1所述的多肽在开发PKR_cat抑制剂中的应用。

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