CN101112627B - 封管用枸橼酸钠注射液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种封管液枸橼酸钠注射液的配方及其制备方法和用途。本发明设计的体外中心静脉插管仿真装置设备简单、成本低、仿真性好，为封管液的临床前研究提供了体外筛选封管液的试验装置。筛选的该封管液具有防治凝血和抗感染双重作用，药理作用较强，疗效确切，性质稳定，安全低毒，质量可控，直接使用，作用更理想，克服了封管中凝血与感染两大难题，避免了抗生素给患者带来的不良影响，与同类产品相比具有显著的优势。且原料来源丰富，制备工艺简单，可行性强，适用于大规模生产，易推广应用。随着中末期肾衰患者数目的逐年增多，血液透析的需求量也会随之上升，因此，本发明能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。

Description

封管用枸橼酸钠注射液及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药、食品、饮料技术领域，具体地说是涉及一种封管液的配方及其制备方法和用途，更具体地说是涉及一种枸橼酸钠注射液的配方及其制备方法和用途。

背景技术

(一)血液透析中抗凝剂应用的有关情况

在血液透析过程中，血液经过透析器、血路管及中央静脉留置导管时易发生凝血现象，常需要抗凝处理。现已有多种方法用于血液透析时抗凝，以保持管路通畅，如：小剂量肝素法、低分子量肝素法、鱼精蛋白中和肝素的局部肝素法、无肝素的盐水冲洗法、前列环素抗凝法、重组水蛭素抗凝法等。但上述方法都有各自的局限性，如：肝素法的全身抗凝作用可导致出血，是引起出血并发症的重要原因(Moritz ML，Vats A，Ellis D.Systemicanticoagulation and bleeding in children with hemodialysis catheters.Pediatr Nephrol，2003，18(1)：68-70；和Karaaslan H，Peyronnet P，Benevent D，et al.Risk of heparin lock-relatedbleeding when using indwelling venous catheter in haemodialysis.Nephrol Dial Transplant，2001，16(10)：2072-2074)；局部肝素法中的鱼精蛋白的精确用量较难控制；无肝素盐水冲洗法流量高，会增加容量负荷，血液动力学不稳定的危重病人难以耐受；前列环素法的全身扩血管作用可引起严重的低血压；重组水蛭素法的价格昂贵(傅晓，刘慎微，刘晓城.局部枸橼酸抗凝在不同血液净化方式的应用.国外医学泌尿系统分册，2005，25(1)：139-143)等等。近年来，枸橼酸钠抗凝方法在血液透析方面的应用研究已越来越受到关注。

由于枸橼酸钠用于血液透析患者具有更加安全、可靠的特性，因此，枸橼酸钠注射液被用于血液透析中有明显出血倾向、凝血功能障碍及使用肝素过敏的透析患者的抗凝。另外，高浓度枸橼酸钠兼有抗凝血和抗感染的作用，亦被用于静脉留置导管的封管。

通过查阅近年来在CBM、PUBMED和国外公司网站中报道的高浓度枸橼酸钠注射液相关文献，对所得数据进行汇总分析，发现目前已有20％、23％、30％、46.7％(47％)等多种高浓度的枸橼酸钠注射液应用于血液透析方面，但多为研究者自配自用的，仅有46.7％枸橼酸钠注射液一个品种在国外有上市产品，中国国内并未见其踪影。

(二)高浓度枸橼酸钠注射液在血液透析应用的研究进展

高浓度枸橼酸钠注射液兼有抗凝和抗感染的特性，在血液透析及相关临床方面有着广阔的开发应用前景。现将高浓度枸橼酸钠注射液在血液透析中用于体外局部抗凝和静脉留置导管封管的作用特点、临床应用、安全性及世界各地品种开发等方面的情况作一汇总。

1.在体外局部抗凝方面的应用

1.1作用特点枸橼酸钠是通过螯合血液中可促进凝血活素、凝血酶和纤维蛋白形成的游离钙离子，来阻止凝血酶原转化成为凝血酶，起到抗凝血作用。枸橼酸钠在体外局部抗凝的方法为：将一定浓度的枸橼酸钠注射液从血液透析机体外循环部分的通路动脉端(离心部分)滴入，防止血液在透析器和血管路凝血。由于枸橼酸钠是人体正常生理代谢的中间产物，并且可以通过透析器清除，即使进入体内也会立即进入三羧酸循环很快被代谢成为碳酸根离子，而无任何残留，不会产生全身性抗凝血作用，可以减少出血并发症的发生率。正常情况下，应用枸橼酸钠做局部抗凝是非常安全的，只有其进入机体速度超过患者的代谢速度时才可能出现枸橼酸钠中毒现象，枸橼酸钠中毒的主要症状为低血钙引起的口唇麻木和畏寒。实验证明，枸橼酸盐可以避免由于肝素的副作用和系统肝素化引起的出血并发症(Karaaslan H，Peyronnet P，Benevent D，et al.Risk of heparin lock-related bleedingwhen using indwelling venous catheter in haemodialysis.Nephrol Dial Transplant，2001，16(10)：2072-2074)。

1.2临床研究1961年，Morita^[4]等(4Morita Y，Johnson RW，Dron RE，et al.Regionalanticoagulation during hemodialysis using citrate.Am J Med Sci，1961，Jul，242：32-43)首次在血液透析中应用枸橼酸进行局部抗凝；1982年，Pinnick等(Pinnick RV，Wiegmann TB，Diederich DA.Regional citrate anticoagulation for hemodialysis in the patients at high risk forbleeding.N Engl J Med，1983，308(5)：258-261)对高危出血患者行局部枸橼酸抗凝，取得了满意的疗效。中国使用高浓度枸橼酸钠注射液的报道较晚、也较少。1997年，上海中山医院报道了使用高浓度枸橼酸钠注射液用于体外抗凝；1998年，上海华山医院吴云生等人报道了将30％高浓度枸橼酸钠用来体外局部抗凝，对19例患者行86例次血液透析，取得了满意的效果，86例次透析中无因体外循环凝血致透析中止或透析效果下降。此后，温州医学院附属医院、南京军区南京总院和上海长征医院也报道应用高浓度枸橼酸钠注射液来进行血液透析的体外局部抗凝。毛志国等(毛志国，叶朝阳，陈静等.高浓度枸橼酸钠抗凝及联机预制置换液在连续肾脏替代治疗中的应用.上海医学，2003，26(11)：801-804)对25位患者行连续静脉-静脉血液透析滤过(CVVHDF)38例次，其中20例次采用30％高浓度枸橼酸钠局部抗凝，18例次采用小剂量普通肝素抗凝，枸橼酸钠组在治疗过程中未观察到出血或原有出血加剧征象，2例治疗3～4h时出现轻微的低血钙症状，肝素组9例次发生出血或原有出血加剧。同年，龚德华等报道对40例需要行连续性血液净化(简称：CBP)治疗并伴出血倾向的患者行枸橼酸钠抗凝，治疗后无一例患者出现出血加重情况(龚德华，季大玺，徐斌等.枸橼酸钠抗凝在重危患者连续性血液净化治疗中的应用.中华内科杂志，2003，42(2)：121-122)。

1.3枸橼酸钠用于局部抗凝的产品开发及应用情况

目前，国外文献中已有多种浓度枸橼酸钠溶液进行实验室及临床研究的报道，但仅有46.7％枸橼酸钠注射液一个品种在欧洲有上市产品。

中国尚无用于局部抗凝的枸橼酸钠产品上市，但在上海、南京、温州等地区的医院使用自制的医院制剂用于血液透析体外局部抗凝，其浓度有30％的枸橼酸钠注射液，规格为250毫升/袋和500毫升/瓶。

2.在静脉留置导管封管方面的应用

2.1作用特点对于需要长期透析的患者，为减少每次插管的不便和疼痛，常在股静脉、颈静脉或锁骨下静脉处插入单针双腔导管，建立临时的血管通路，多年的临床应用表明凝血和感染是血液透析留置导管面临的主要问题。微生物可以附着在血液透析中所用的导管内壁，并且不断的集聚，形成多糖蛋白质生物膜，能阻止抗生素和白细胞的浸入，临床上常因感染引发菌血症而不得不拔除导管。凝血和感染分别会引起导管阻塞和菌血症的发生，缩短导管使用寿命，患者要经常更换导管才可以保持血液透析通路的畅通。选择良好的封管液可以有效的减少上述情况的发生。高浓度枸橼酸盐可在导管中发挥很好的抗感染作用。由于高浓度枸橼酸钠注射液在血液透析中兼有抗凝血和抗感染的作用，所以用其进行封管相对于其他封管液具有独特的优势。

研究表明，当枸橼酸钠的浓度大于20％时就成为具有抑菌活性的抗凝血剂，用做封管液可以减少导管感染、闭塞及延长导管寿命(Dogra GK，Herson H，Hutchison B，et al.Prevention of tunneled hemodialysis catheter-related infections using catheter-restricted fillingwith gentamicin and citrate：A randomized controlled study.J Am Soc Nephrol，2002，13(8)：2133-2139)。枸橼酸盐的浓度越高，其封管液的抗感染效果越好，而目前临床上所用枸橼酸钠的最高浓度为47％(46.7％)，已接近枸橼酸钠的饱和浓度。

2002年，Weijmer等报道将2.2％、7.5％、15％和30％四种浓度的枸橼酸钠溶液与5000IU/ml的肝素溶液对血液透析中发生感染时常见的五种菌株(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌)抑菌能力进行比较，结果发现：枸橼酸钠溶液随着浓度的增大，抑菌作用增强，其中30％的枸橼酸钠溶液可以完全杀灭金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌，并且可以明显抑制白色念珠菌的生长；而肝素没有任何抑菌作用(9 Weijmer MC，Debets-Ossenkopp YJ，van de Vondervoort FJ，et al.Superior antimicrobial activity of trisodium citrate over heparin for catheter locking.NephrolDial Transplant，2002，17(12)：2189-2195)。

2.2临床研究Ash认为23％浓度的枸橼酸钠是最理想的封管液(Ash SR，MankusRA，Sutton JM，et al.Concentrated Sodium Citrate(23％)for Catheter Lock.HemodialysisInternational，2000，(4)：22-31)；Weijmer则认为30％是封管液最佳浓度(Weijmer MC，Van den Dorpel MA，Van de Ven PJG，et al.Randomized，Clinical Trial Comparison ofTrisodium Citrate 30％and Heparin as Catheter-Locking Solution in Hemodialysis Patients.JAm Soc Nephrol，2005，16(9)：2769-2777)。

1998年Buturovic等做了肝素和枸橼酸盐的抗凝血对比实验，使用肝素和4％枸橼酸盐作为封管液的导管使用时间分别为23±24days、51±36days；凝血容积分别为0.052±0.035ml和0.059±0.032ml，实验证明了枸橼酸盐比肝素更适于做封管液(Buturovic J，Ponikvar R，Kandus A，et al.Filling hemodialysis catheters in the interdialytic period：heparinversus citrate versus polygeline：a prospective randomized study.Artif Organs，，1998，22(11)：945-947)。

Ash等曾间隔3～4个月相继使用①肝素注射液，②10％枸橼酸钠注射液联合3mg/ml庆大霉素注射液，③20％枸橼酸钠注射液联合3mg/ml庆大霉素注射液，④47％枸橼酸钠注射液，⑤肝素注射液，⑥23％枸橼酸钠注射液作为封管液封管，观察菌血症发生率的变化。实验结果显示，肝素没有抑菌作用，而不同浓度的枸橼酸钠具有不同程度的抑菌作用。虽然高浓度枸橼酸盐具有轻微的腐蚀作用，但是正是这种腐蚀作用可以帮助溶解细胞和凝块，阻止生物膜的形成(Ash SR，Mankus RA，Sutton JM，et al.Concentrated Sodium Citrate(23％)for Catheter Lock.Hemodialysis International，2000，(4)：22-31)。

目前许多医院为防止插管部位感染，通常在一些封管液中加入抗生素，但该抗生素可通过导管渗漏入血，使患者暴露于抗生素中，如果长期使用，会产生细菌耐药，更加容易引发感染(Dogra GK，Herson H，Hutchison B，et al.Prevention of tunneled hemodialysiscatheter-related infections using catheter-restricted filling with gentamicin and citrate：Arandomized controlled study.J Am Soc Nephrol，2002，13(8)：2133-2139；和Saxena AK，Panhotra BR，Naguib M.Sudden irreversible sensory-neural hearing loss in a patient withdiabetes receiving amikacin as an antibiotic-heparin lock.Pharmacotherapy，2002，22(1)：105-108)。

2003年，Weijmer等报道，在9所荷兰透析中心和1所比利时透析中心做了多中心随机双盲实验，用来比较肝素注射液和30％枸橼酸钠注射液抗凝血和抗感染的效果。虽然由于出现各种不同程度导管相关的感染并发症而终止实验，但是已经得到的数据充分证明了使用30％枸橼酸钠注射液封管相对于使用肝素注射液封管能减少出血并发症和感染的发生率，高浓度枸橼酸钠可以代替肝素作为封管液封管，并具有更好的抗凝血和抗感染作用(P≤0.01)(Weijmer MC，Van den Dorpel MA，Van Geelen JACA，et al.Reduction of bleedingcomplications with high concentration trisodium citrate for hemodialysis catheter locking；Aprospective multicenter double-blind randomized controlled trial.Nieuwsbrief van de nfn·6EJaargang，2003，NR，1；和Weijmer MC，Van den Dorpel MA，Van Geelen JACA，et al.Substantial reduction of infectious complications in hemodialysis catheters with trisodium citrate30％for catheter locking；A prospective multicenter double-blind randomized controlledtrial.Nieuwsbrief van de nfn·6E Jaargang，2003，NR，1)。

2.3安全性分析Ash等观察了四组使用不同封管液的不良反应情况，联合使用3mg/ml庆大霉素的10％和20％枸橼酸钠注射液，与单独使用23％枸橼酸钠注射液的患者都未发现明显的不良反应；而在使用47％枸橼酸钠注射液的患者中，10％的患者感觉口中有金属味，并且手指有刺痛感(Ash SR，Mankus RA，Sutton JM，et al.Concentrated Sodium Citrate(23％)for Catheter Lock.Hemodialysis International，2000，(4)：22-31)。Weijmer等在210位血液透析患者中，分别用肝素注射液和30％枸橼酸钠注射液作封管液，结果发现由于导管相关菌血症所引发的死亡人数分别为5人与0人；封管后立即有异常感觉的人数分别为9人与4人(Weijmer MC，Van den Dorpel MA，Van Geelen JACA，et al.Reduction of bleedingcomplications with high concentration trisodium citrate for hemodialysis catheter locking；Aprospective multicenter double-blind randomized controlled trial.Nieuwsbrief van de nfn·6EJaargang，2003，NR，1；和Weijmer MC，Van den Dorpel MA，Van Geelen JACA，et al.Substantial reduction of infectious complications in hemodialysis catheters with trisodium citrate30％for catheter locking；A prospective multicenter double-blind randomized controlledtrial.Nieuwsbrief van de nfn·6E Jaargang，2003，NR，1)。上述不良反应主要是因为没有控制好注入量的原因，当注入量超过管腔标注容量时就容易入血引起不良反应。高浓度枸橼酸钠进入血液后可引起低钙血症，一但发现应及时进行纠正，有人建议规定必须由技术熟练、经验丰富的专职人员操作。

2.4枸橼酸钠用于导管封管的产品开发及应用情况

2.4.1国外情况目前，仅有欧洲的Dirinco公司生产供应用于留置导管封管的枸橼酸钠注射液(浓度为46.7％)。Dirinco公司在荷兰和比利时分别有Dirinco BV公司和BirincoBVBA公司，上市的枸橼酸钠注射液(Dirinco

)规格为3ml和5ml，，用于留置导管封管。网上报价的最低价格分别为81.18(12×3ml)和67.65

(10×5ml)。

美国Medcomp公司也生产供应46.7％枸橼酸钠注射液(商品名：Tricitrasol

，规格为30ml)，但不是FDA批准的正式药品，被限用于体外粒细胞分离，并不用于留置导管封管。

2.4.2中国情况目前尚未见中国临床应用高浓度枸橼酸钠作留置导管封管的报道，也未见高浓度枸橼酸钠产品在中国正式上市供应。中国临床多应用肝素、肝素或低浓度枸橼酸钠联合抗生素(庆大霉素)进行封管。

综上所述，高浓度枸橼酸钠相对于其他抗凝剂兼有抗凝血和抗感染的特性，在临床上使用安全有效，尤其适用于有高度出血危险、凝血功能障碍及使用肝素过敏的透析患者，对机体全身抗凝血功能无影响，可以完全避免抗凝所致的出血并发症。此外，高浓度枸橼酸钠注射液具有很强的抑菌作用，减少菌血症的发生，避免了因使用抗生素引起的细菌耐受性。目前国外仅有一种高浓度枸橼酸钠注射液品种上市，中国尚无正式此类商品。血液透析患者非常需要安全和有效的高浓度枸橼酸钠注射液。2001年有统计数字显示，在美国，每一百万人中就有900人需要用血液透析治疗终末期肾脏病，并在2010年前以每年7.1％的速度增长，全球有100万以上终末期肾病患者，每年以8％的速度增长，中国约占十分之一(Xue JL，Ma JZ，Louis TA，et al.Forecast of the number of patients with end-stage renaldisease in the United States to the year 2010.J Am Soc Nephrol，2001，12(12)：2753-2758；和US Renal Data System：2003Annual Data Report：Atlas of End Stage Renal Disease in theUnited States，Bethesda，National Institutes of Health，National Institute of Diabetes andDigestive and Kidney Diseases，2003)。由于肾脏移植的肾源有限，对终末期肾病患者来说，血液透析疗法仍是主要治疗手段。高浓度枸橼酸钠注射液在血液透析方面具有重要意义和广阔的应用前景，因此，在中国开发与应用此类药品迫在眉睫，以便满足临床的需求。

目前已查询到PCT专利《Method of enhancing catheter patency using a citrate salt catheterlock solution》，专利申请号是：PCT/US99/19307。

(三)体外血管插管仿真装置的研究进展

对于需要长期透析的患者，为减少每次插管的不便和疼痛，常在股静脉、颈静脉或锁骨下静脉处插入单针双腔导管，建立临时的血管通路，但在不做血液透析治疗时需将留置导管用封管液进行封管，待下一次透析治疗时再启用留置导管。一种好的封管液应具有抗凝血和抗感染作用，并能在一定时间里保持其有效和安全。体外血管插管仿真装置可为研究封管液在留置导管中的滞留情况，进行封管液处方筛选等药物临床前研究提供良好的实验平台。

经文献检索，到目前为止，尚未发现有任何对封管液研究的体外模型装置以及新的枸橼酸钠注射液配方及制备方法和新用途等方面的相关报道。

发明内容

本发明所需要解决的技术问题是公开了一种新的枸橼酸钠注射液配方及制备方法和新用途，以克服现有技术存在的上述缺陷。

也就是说，本发明意在于明确一种新的枸橼酸钠注射液的配方及其制备方法和新的用途；即本发明涉及一种枸橼酸钠注射液配方及其制备方法和双重作用的用途。

所述的封管用产品是指用于包括留置导管的能够同时抗凝血和抗感染及相关病症的产品；其中，所述的封管用产品是包括抗凝血与抗感染药物、抗凝血与抗感染试剂、抗凝血与抗感染食品或抗凝血与抗感染饮料等中的一种或多种，优选抗凝血与抗感染药物。

(一)技术构思

自主开发创新药物是中国目前的一项紧迫任务。中国医药学具有悠久的历史，在预防和治疗疾病方面积累了丰富的经验，发挥中国药物研制的优势，进行药物的开发利用是一条有效的途径，对现有剂型进行开发也大有作为，将具有重大应用需求和临床前景。

发明人对临床静脉留置导管的使用现状进行了深入的调查，发现静脉留置导管在使用过程中常因被血块等堵塞而更换，或发生感染导致患者出现败血症等不良反应，造成不必要的经济负担(仅每只静脉留置导管需1000元人民币左右)，甚至危及生命。究其原因，主要与留置导管的封管液有关。目前，临床采用的肝素钠注射液或肝素钠注射液与抗生素配伍应用作封管液，但是对于有严重出血倾向、凝血功能障碍及肝素过敏的患者不宜使用，而且长期应用带有抗生素的封管液封管由于抗生素渗漏入血会产生耐药性从而更易引发感染。发明人根据国外研究者的报道，结合实验结果发现高浓度枸橼酸钠溶液兼有抗凝血和抗感染双重作用，用其作封管也可以完全改善静脉留置导管的使用现状，使其使用寿命延长，减少患者经济负担等。

发明人为了方便筛选封管液新配方，自行设计了一个仿真的体外中心静脉插管装置，利用虹吸原理和蠕动泵来作为系统的动力装置，模拟血液流动和留置导管工作状态，并对封管液进行滞留期观察。

在此基础上，发明人结合枸橼酸钠的水溶液的溶液度情况，通过研究和实验筛选，发现近饱和浓度(47％)来配制封管用枸橼酸钠注射液，具有抗凝和抗感染的双重作用，并能够使其发挥至最佳效果。

(二)一种枸橼酸钠注射液配方的组成

发明人通过对封管用枸橼酸钠注射液进行系统的实验研究和理论探索，包括处方筛选、制备工艺研究、稳定性试验、体外药效学试验、体外安全性试验等的研究和分析，发现：研制的封管用枸橼酸钠注射液性质稳定，制备工艺简单，安全有效，并适合工业化生产。

经药理实验证明，本发明的封管用枸橼酸钠注射液对中心静脉插管常出现的两大问题——凝血和感染均具有显著的双重防治作用，能够用于留置导管的封管。

该封管用枸橼酸钠注射液(简称：该封管液)的组成为：

枸橼酸钠    35.0％～50.0％

pH调节剂    0.1％～4.0％

增稠剂      0.0％～20.0％

溶剂        加至1000ml

所述的枸橼酸钠为原料药，直接投料；按照该配方配制的封管用枸橼酸钠注射液的浓度为35.0％～50.0％，优选45.0％～50.0％，进一步优选47.0％或49.0％。

所述的pH调节剂是为了使该配方的pH值范围为6.4～7.5而添加的组分，是包括枸橼酸、醋酸、酒石酸或乳酸等中的一种或多种，优选枸橼酸或酒石酸中的一种或多种；进一步优选枸橼酸作为该配方中的pH调节剂，含量范围是0.1％～4.0％，优选0.3％，因为枸橼酸钠与枸橼酸能构成缓冲离子对，且有不引入其他离子的特点。

发明人通过试验研究发现，选用枸橼酸作为pH调节剂，其中的枸橼酸还起到了助溶的作用，使枸橼酸钠的溶解度超过了一般状态下的人们常见的常规饱和浓度46.7％，达到了50.0％的浓度，因此该封管用枸橼酸钠注射液的浓度优选为47.0％和49.0％。发明人发现：在近饱和浓度46.7％时，该封管用枸橼酸钠注射液具有一定的黏度，在封管中可以存在一定的时间；且在超过这一常规的饱和浓度的情况下，枸橼酸钠兼有抗凝血与抗感染的双重作用；该配方配制的产品剂量准确，澄明度好；稳定性研究也表明其稳定性好，质量符合有关规定，适用于大规模生产。按照以上配方配制的枸橼酸钠注射液的浓度为47.0％或49.0％，该浓度超过了一般状态下的人们常见的枸橼酸钠的常规饱和浓度。

所述的溶剂是包括水溶剂和非水溶剂，水溶剂主要是注射用水，非水溶剂是包括丙二醇、聚乙二醇或甘油等中的一种或多种；优选水溶剂作为该配方中的溶剂，进一步优选注射用水作为该配方中的溶剂。需要强调的是，如果选用聚乙二醇或甘油作为溶剂，那么聚乙二醇或甘油还能够起到增稠剂的作用。

本发明能够根据需要再额外增加增稠剂。所述的可用于注射剂的增稠剂是包括甘油、聚乙二醇或泊洛沙姆F68等中的一种或多种，优选5％～20％以内的甘油，进一步优选含15％的甘油。在满足枸橼酸钠溶解度要求的基础上，根据增稠剂的溶解情况能够确定其可以加入的剂量范围，一般是需要依据泊肃叶方程进行均匀设计对处方进行优化，以选择黏度最为合适的处方。

例如，单独选择其中的甘油作为增稠剂，其含量以小于20％为宜；单独选择其中的聚乙二醇300作为增稠剂，其含量以小于6％为宜；单独选择其中的泊洛沙姆F68作为增稠剂，其在注射液中的最大用量为0.6％；当增稠剂的浓度为0％时，则表示该配方不含增稠剂，这也是本发明所述配方的优选方案，因为根据安全性原则，加入成分种类越少，相对来说越安全，所以最后发明人选用不加增稠剂的处方作为最优化的配方。

由于本发明的配方中未加入特殊物质，故生产该注射剂的一般工艺即可满足该配方的制备要求。例如：

最优选方案1(不加增稠剂的处方)：

枸橼酸钠            467g

枸橼酸              3g

注射用水            加至1000ml

最优选方案2(加入增稠剂的处方)：

枸橼酸钠            467g

枸橼酸              3g

甘油                150g

注射用水            加至1000ml

最优选方案3(非水溶剂处方)：

枸橼酸钠            467g

枸橼酸              3g

乙醇                加至1000ml

根据临床上的使用要求，对患者进行封管时要求按照标注容量将封管液注满管腔，通常留置导管的标注容量为A腔1.0ml、V腔1.1ml，A腔1.1ml、V腔1.2ml，或者是A腔1.3ml、V腔1.4ml，两腔总量小于3ml为使用方便，本发明确定封管用枸橼酸钠注射液的装量优选为3ml:1.4g。

(三)该枸橼酸钠注射液的配方研究及其制备方法

枸橼酸钠为传统的体外抗凝剂，通过与血液中的钙离子螯合，阻止凝血酶原转化成为凝血酶而起到抗凝作用。近几年的研究表明，高浓度的枸橼酸钠溶液兼有抑菌活性，可用做留置导管的封管液，具有减少导管感染及堵塞、延长导管寿命的作用。本发明研究了封管用枸橼酸钠注射液的处方及工艺，包括对pH值及黏度进行单因素考察；建立插管体外仿真血液流动模型进行验证；通过影响因素试验对稳定性进行初步考察，从而筛选出了封管用枸橼酸钠注射液最优化的处方与工艺。

1.仪器与试剂

1.1仪器

Waters高效液相色谱系统：Waters600色谱泵，Waters996PDA紫外检测仪，Millennium32色谱工作站；梅特勒-托利多320型pH计(梅特勒-托利多仪器<上海>有限公司)；梅特勒-托利多AE240电子分析天平(梅特勒-托利多仪器<上海>有限公司)；SB2200型超声清洗器(上海市BRANSON超声仪器有限公司)；SHB-III型循环水多用真空泵(河南太康教材仪器厂)；YB-2型澄明度检测仪(天津大学精密仪器厂)；热压灭菌器(天津大学无线电厂)；NDJ-1旋转式粘度计(上海精密科学仪器有限公司)。

1.2试剂

枸橼酸钠(湖南华日制药有限公司，批号20051012)；枸橼酸(广东省台山市新宁制药厂，批号20050303)；甘油(上海运佳黄浦制药有限公司，批号20051011)；聚乙二醇300(中国医药集团上海化学试剂公司，批号20011126)；磷酸二氢钾(湖南华日制药有限公司，批号20040422)；甲醇(上海化学试剂研究所，批号20060301，色谱纯)，注射用水(自制)。

2.方法和结果

2.1处方与制备工艺

2.1.1剂量确定依据

参照欧洲Dirinco公司生产供应用于留置导管封管的枸橼酸钠注射液(浓度为46.7％)，该浓度为枸橼酸钠近饱和浓度，在这一浓度下枸橼酸钠兼有抗凝血与抗感染的作用，另根据临床使用方法，对病人进行封管时要求按照标注容量将封管液注满管腔，通常留置导管的标注容量为A腔1.0ml，V腔1.1ml；A腔1.1ml，V腔1.2ml；A腔1.3ml，V腔1.4ml，两腔总量小于3ml，为使用方便，确定封管用枸橼酸钠注射液的装量定为3ml：1.4g。

2.1.2处方依据及研制

封管用枸橼酸钠注射液的处方是在借鉴文献和欧洲Dirinco公司生产的citra-lock的基础上，以枸橼酸钠原料药直接投料，并经初步试验研究、加速试验、留样观察、安全性试验等基础上确定的，分别对处方组成中的pH调节剂、增稠剂的种类及用量进行了考察。

2.1.2.1原料来源

枸橼酸钠原料药购自湖南华日制药有限公司，其各项理化性质均符合《中国药典》2005年版要求。本品为无色结晶或白色洁晶性粉末，在水中的溶解度为1∶1.5，在沸水中的溶解度为1∶0.6，熔点为150℃。

2.1.2.2pH调节剂的种类及用量

为适应人体生理需要，同时考虑药液中枸橼酸钠的溶解度，在配液时需要对药液的pH值进行适当调整。根据枸橼酸钠与枸橼酸能构成缓冲离子对，不引入其他离子的特点，首先考虑以枸橼酸作为pH调节剂，并对其用量进行研究。

分别按照含枸橼酸0.1％、0.2％、0.3％、0.4％处方量投料，在适量注射用水中加热溶解，冷却至室温，定容。测定pH值，试验结果见表1。

表1、封管用枸橼酸钠注射液pH调节剂用量的筛选

根据以上结果，在枸橼酸钠达到溶解度要求的基础上，结合注射剂的pH值要求与血液相等或接近的原则，同时参照Dirinco公司的产品pH值范围6.4～7.5，最后确定该制剂的pH值范围为6.5～7.5，处方中枸橼酸含量为0.3％。

2.1.2.3增稠剂的种类及用量

封管液在管腔中疗效的发挥依赖于其在管腔中的滞留时间，根据泊肃叶方程 $Q={\&Integral;}_0^{R}u2\mathrm{\&pi;rdr}=-\frac{\mathrm{\&pi;}}{2\mathrm{\&mu;}}\frac{\mathrm{dp}}{\mathrm{dx}}{\&Integral;}_0^R(R^2-r^2)\mathrm{rdr}=-\frac{\mathrm{\&pi;}}{8\mathrm{\&mu;}}\frac{\mathrm{dp}}{\mathrm{dx}}{R}^4,$ 液体在管腔中的流速与其黏度成反比，故设想加入增稠剂以增加其黏度，延长在管腔中的滞留时间，更好的发挥抗凝血与抗感染的作用。

可用于注射剂的增稠剂通常有甘油，聚乙二醇，泊洛沙姆F68等，根据溶解情况确定其可以加入的剂量范围，进行均匀设计选择黏度最为合适的处方。

在原处方基础上配制含10％、20％、30％甘油的封管液密闭静置一天，结果含20％、30％甘油的均出现可见性析出，故甘油含量以小于20％为宜。

在原处方基础上配制含2％、4％、6％聚乙二醇300的封管液，结果发现含6％聚乙二醇300的处方溶液在超声后分层，故聚乙二醇含量以小于6％为宜。

泊洛沙姆F68在注射液中的最大用量为0.6％。

应用均匀设计方法对处方中的增稠剂进行优化

------------------试验基本信息------------------

指标数：1，因素个数：3，运行次数：9

试验设计选用均匀设计表U9*(94)

各因素水平数相等

指标名称：黏度      单位：厘泊

因素1名称：甘油     单位：含量

因素2名称：PEG300   单位：含量

因素3名称：F68      单位：含量

-------------------多元回归分析-------------------

回归分析采用逐步回归法，显著性水平α＝0.05

引入变量的临界值Fa＝5.591

剔除变量的临界值Fe＝5.318

拟建立回归方程：

y＝b(0)+b(1)*X(1)+b(2)*X(2)+b(3)*X(3)+b(4)*X(1)*X(2)+b(5)*X(1)*X(3)+b(6)*X(2)*X(3)

第1步，引入变量：

各项的判别值(升序排列)：

Vx(3)＝8.05e-2

Vx(5)＝0.211

Vx(4)＝0.356

Vx(6)＝0.549

Vx(2)＝0.779

Vx(1)＝0.779

未引入项中，第1项[X(1)]Vx值(≥0)的绝对值最大，

引入检验值Fa(1)＝24.68，引入临界值Fa＝5.591，

Fa(1)＞Fa，引入第1项，已引入项数＝1。

第2步，引入变量：

各项的判别值(升序排列)：

Vx(1)＝-0.779

Vx(0)＝0.00

Vx(4)＝1.54e-5

Vx(6)＝5.96e-2

Vx(3)＝8.05e-2

Vx(5)＝8.44e-2

未引入项中，第5项[X(1)*X(3)]Vx值(≥0)的绝对值最大，引入检验值Fa(5)＝3.707，

引入临界值Fa＝5.591，

Fa(5)≤Fa，不能引入第5项，已引入项数＝1。

变量筛选结果：

检验项数＝6，预期引入项数＝0，实际引入项数＝1，实际引入项数≠预期引入项数

回归方程：y＝b(0)+b(1)*X(1)

回归系数b(i)：

b(0)＝9.70

b(1)＝0.536

标准回归系数B(i)：

B(1)＝0.883

复相关系数        R＝0.8827

决定系数            R^2＝0.7791

修正的决定系数      R^2a＝0.7791

变量分析：

表2、变量分析表

样本容量N＝9，显著性水平α＝0.05，检验值Ft＝24.68，临界值F(0.05，1，7)＝5.591

剩余标准差s＝1.46

回归系数检验值：

t检验值(df＝7)：

t(1)＝4.968

F检验值(df1＝1，df2＝7)：

F(1)＝24.68

偏回归平方和U(i)：

U(1)＝52.8

偏相关系数ρ(i)：

ρ1，＝0.8827

各方程项对回归的贡献(按偏回归平方和降序排列)：

U(1)＝52.8，U(1)/U＝100％

残差分析：

表3、残差分析表

------------------回归分析结束------------------

------------------试验条件优化------------------

试验优化方法：网格尝试法

表4、条件优化设置列表

表5、优化的试验条件

------------------试验优化结束------------------

根据以上结果，在枸橼酸钠达到溶解度要求的基础上，最优的处方为含甘油15％处方。

2.1.2.4封管用枸橼酸钠注射液不加增稠剂的处方为枸橼酸钠467g，枸橼酸3g，注射用水加至1000ml；加入增稠剂的处方为枸橼酸钠467g，枸橼酸3g，甘油15g，注射用水加至1000ml。

2.1.2.5插管体外仿真血液流动模型的建立

本发明以体外中心静脉插管仿真装置为例。利用虹吸原理将纯化水导入已调节温度为(37±0.5)℃的水浴锅中，再通过恒流泵(可根据需要调节流速)用直径为6mm的硅胶管从水浴锅中将已预热的水泵出，硅胶管的另一侧插入留置导管，插管体外仿真血液流动模型的示意图见图1。注入封管液在不同时间点抽取导管腔内下端溶液测枸橼酸钠含量。

2.1.2.6含量测定方法的建立

色谱条件色谱柱：迪马Diamonsil^TM C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇-磷酸二氢钾水溶液(50mmol/L，磷酸调pH至2.5～2.8)(5∶95)，流速：1.0mL/min，检测波长：210nm，柱温：23±2℃，进样量：20μl。

溶液的配制对照品溶液的配制：精密称取枸橼酸钠999.9mg，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液。供试品溶液的配制：精密量取封管用枸橼酸钠注射液1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

线性关系考察精密量取对照品储备液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0ml分别置于5个10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配成0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml与6mg/ml浓度的系列对照品溶液。在2.1色谱条件下，吸取20μl，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。以枸橼酸盐峰面积Y为纵坐标，枸橼酸盐浓度C为横坐标进行线性回归，得标准曲线为Y＝636969.05X-9945.24，(r＝0.9999，n＝5)，线性范围：0.5～6mg/ml。

精密度试验取4mg/ml浓度的对照品溶液连续进样5次，测得日内RSD＝0.79％(n＝5)；将该溶液放置3天，每天进样一次，测得日间RSD＝1.48％(n＝3)。

2.1.2.7将不加增稠剂与加入增稠剂两种处方的注射液分别加入至模型中封管，循环72h，拔除导管，抽取导管下端液体，用HPLC测其枸橼酸钠含量。结果为0.225mg/ml与0.689mg/ml。

2.1.3制备工艺

2.1.3.1操作步骤

(1)称量：根据处方，按称量SOP称取原料。

(2)取适量热注射用水，加入枸橼酸钠、枸橼酸搅拌溶解，加注射用水至全量，搅匀。

(3)滤过：脱炭过滤用板框过滤器，滤材为微孔滤膜，孔径1.2μm、0.8μm；终端过滤用微孔滤盘，滤材为微孔滤膜，孔径0.65μm；中间品质控含量：含量为标示量的97.0％-103.0％，pH值6.8～7.5。

(4)灌装：自动定量灌装，灌装过程中，检查封口。

(5)灭菌：按安瓿要求进行，温度110℃，时间20分钟，热压灭菌。

(6)灯检：置安瓿于光照度2000～3000LX的澄明度检测议前，用目检视，按澄明度检查要求进行，灯检人员视力应为5.0以上，无色盲。检漏，剔除有药液渗漏、漏气及有异物的产品，成品澄明度应符合药典规定。

(7)包装：合格的检品按要求贴签并装入5支装纸盒，点检装箱。

2.1.3.2工艺流程

称量→配制→滤过→灌装→灭菌→灯检→包装

2.1.4处方中辅料的作用

枸橼酸为pH调节剂，注射用水为溶剂。

2.2三批中试试验结果

按上述确定的制备工艺制备，三批中试试验结果见表6。

表6、三批封管用枸橼酸钠注射液中试试验结果

2.3影响因素试验

2.3.1高温试验

取封管用枸橼酸钠注射液置烘箱中，于40℃温度下放置10天，于第5天和第10天取样，按照本制剂质量标准(草案)进行分析，考察结果见表7。

表7、初步稳定性考察(高温40℃)

结果表明：40℃温度放置5天与10天后其含量与0天相比基本保持不变，未见有关物质产生。

2.3.2强光照射试验

取封管用枸橼酸钠注射液置光照箱中照射，照射度为4500±500LX，放置时间10天，于第5天和第10天取样，按照本制剂质量标准(草案)进行分析，考察结果见表8。

表8、初步稳定性考察(光照：4500±500LX)

结果表明：40℃温度放置5天与10天后其含量与0天相比基本保持不变，未见有关物质产生。

通过影响因素实验表明，本处方工艺条件下制得的封管用枸橼酸钠注射液在高温和光照条件下，各项指标均未发生较大改变，因此，本处方工艺克用于封管用枸橼酸钠注射液的生产。

3讨论与小结

3.1该注射剂用途为封管，大部分留滞在导管内，但仍有少部分入血，应与血液有很好的相容性，所以本试验选用pH值范围为6.4～7.5。

3.2根据泊肃叶方程采用均匀设计对处方进行优化，结果显示甘油对其黏度起着决定性作用，在满足枸橼酸钠溶解度要求的基础上，含甘油15％的处方为最优处方。

3.3由于该处方未加入特殊物质，故生产注射剂的一般工艺既可满足该封管液的制备要求。

3.4从以上结果可以看出不加增稠剂的处方在封管3天后下端剩余量仍可以测出，根据安全性原则，加入成分种类越少相对来说越安全，所以最后我们选用不加增稠剂的处方作为最后处方。

3.5本试验通过筛选得到的处方：枸橼酸钠467g，枸橼酸3g，注射用水加至1000ml。其中枸橼酸在处方中为pH调节剂，注射用水为溶剂。因其浓度为近饱和浓度，具有一定的黏度，在封管中可以存在一定的时间，该制剂在上述工艺条件下，产品剂量准确，澄明度好。经稳定性研究表明，所得注射液稳定性好，质量符合有关规定，适用于大规模生产。

(四)体外血管插管仿真装置的建立及封管液滞留期的观察

以上所述的插管体外仿真血液流动模型的有关详细情况在这里进一步阐述。建立体外中心静脉插管仿真装置的目的是为了研究封管液在留置导管中的滞留情况。以纯化水、硅胶管及橡胶管模拟血液与血管，利用虹吸原理及恒流泵来做为仿真血液流动的驱动力，在硅胶管上插入静脉留置导管，建立起体外血管插管仿真装置；往留置导管腔内注入封管用枸橼酸钠注射液，在不同时间点抽取导管腔下端液体，测定其枸橼酸钠含量，考察其装置的稳定性以及封管液滞留期。测得3天内不同时间点样品的含量与滞留时间成负相关，得回归方程为y＝-0.0136x+1.0875(r＝0.9055)，连续多次测得1h、2h和4h时间点在留置导管侧孔处枸橼酸钠残留量的RSD(n＝5)分别为9.03％、9.82％与11.43％；封管用枸橼酸钠注射液在体外模型留置导管中可至少滞留3天以上。该装置在一定程度上能够模拟静脉血液流动，具有一定的仿真性，适用于封管液的体外滞留期的考察，为封管液临床前研究提供了试验平台。

对于肾衰患者需要进行长期的血液透析，通常以深静脉导管作为留置导管建立血液透析通路，封管液对导管的堵塞及感染至关重要，然而尚未有任何对封管液研究的体外模型装置的相关报道。本试验为封管液临床前研究建立了体外血管插管仿真装置，并以此研究了封管用枸橼酸钠注射液在留置导管中的滞留情况。

1.材料与方法

1.1材料插管体外仿真血液流动模型(或称：体外血管插管仿真装置)是包括容器1、导管2、流量调节器3、水浴锅4、烧杯5、导管6、恒流泵7、夹子8、三通接头9和留置导管10，以体外中心静脉插管仿真装置为例，导管(2)选用橡胶管，通过恒流泵(7)的导管(6)选用硅胶管；容器(1)选择塑料桶：

塑料桶(容量40L)；橡胶管(内径6mm)；流量调节器；硅胶管(内径6mm)；大烧杯(容量1000ml)；水浴锅(HWS12型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司)；恒流泵(HL-2恒流泵，上海沪西分析仪器厂)；三通接头；夹子；静脉留置导管(A1.0ml V1.1ml，德国)；纯化水(自制)；生理盐水(自制)；封管用枸橼酸钠注射液(自制，批号20051024)。

1.2体外血管插管仿真装置的组成见图1。

1.3体外血管插管仿真装置的工作原理

1.3.1体外血管插管仿真装置的驱动力该装置利用虹吸原理及蠕动装置完成模型的一系列驱动。首先利用虹吸原理，通过橡胶管将处于稍高处塑料桶中的液体导出至水浴锅内大烧杯中加热，然后通过恒流泵将大烧杯中经加热后的液体以恒速泵出，完成流动过程。

1.3.2体外血管插管仿真装置的模拟系统该装置中的水浴锅可以加热从塑料桶导出的液体以模拟血液的温度，恒流泵可以控制液体流出的速度，从而模拟血液流速，通过选择合适的液体可以模拟血液的黏度，改变插管处橡胶管的内径可以模拟不同部位的静脉。

1.4模拟试验为了验证体外血管插管仿真装置的实际效果，选用封管用枸橼酸钠注射液进行滞留期观察试验及该装置性能稳定性考察。

1.4.1试验方法在已启动的体外血管插管仿真装置中(温度37℃，流速16ml/min)，将封管用枸橼酸钠注射液按照管腔标示量注入静脉留置导管中，在模拟血液恒温恒速流动的条件下，于相应时间点自导管两腔下端各取样100μl，用HPLC法测定其枸橼酸钠含量^[1]，并以取样时间作横坐标，枸橼酸钠含量为纵坐标进行回归计算。

1.4.2试验步骤

(1)调节流量调节器，使流速与恒流泵所设流速一致；

(2)将水浴锅温度调至37.5℃，大烧杯内加满液体，预热10min；

(3)开启恒流泵，排除各部分连接导管内的空气；

(4)从留置导管动静脉腔分别注满生理盐水，以排除留置导管内空气；

(5)以注射器将封管用枸橼酸钠注射液按照导管标示量匀速注入管腔，夹好导管夹，旋紧导管帽；

(6)按要求在不同时间点拔除导管，从导管下端侧孔处抽取液体各100μl，用HPLC法测定枸橼酸钠含量(王雯佶，张纯，秦小雷等。用RP-HPLC法测定高渗枸橼酸盐腺嘌呤-II保存液中三种成分的含量，药学服务与研究，2006，6(4)：297-298)。

1.4.3性能稳定性试验参照上述试验方法和步骤，重复操作5次，分别1h、2h与4h时间点取样测枸橼酸钠含量，计算各时间点含量的RSD(n＝5)。

1.4.4滞留期考察参照上述试验方法和步骤，分别在1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h时间点取样测枸橼酸钠含量，考察封管用枸橼酸钠注射液在体外血管插管的滞留期。

2.结果

2.1体外中心静脉插管仿真装置稳定性试验的结果见表9。

2.2封管用枸橼酸钠注射液在体外模型留置导管中可至少滞留3天(72h)以上，测定结果见表10。

以取样时间与所测得样品含量做线性回归，得回归方程为y＝-0.0136x+1.0875(r＝0.9055)。

表9、体外中心静脉插管仿真装置稳定性试验测定结果

表10、封管用枸橼酸钠注射液在体外中心静脉插管仿真装置中各时间点的枸橼酸钠含量(mg/ml)

3.讨论与小结

3.1装置材料的选择封管液在静脉留置导管中起到抗凝和抗感染的作用，为了了解封管液在留置导管中的滞留情况，筛选新型封管液配方，建立合适的体外试验模型非常必要。本试验采用一般的管材和简单设备，设计了体外中心静脉插管仿真装置，为封管液的临床前研究提供了试验平台。

图1中编号的各部件按顺序连接，其中2号部分导管选用的是橡胶管，因为其弹性大，流量调节器可以很好的控制流速，插入静脉留置导管后在插入口处可以很好的闭合，控制空气的进入；通过恒流泵部分的导管6则选用硅胶管，因该部分易磨损，而硅胶管具有良好的韧性，经久耐用，内径的选择可根据需要自行调整；容器1应足够大，最小容量应满足夜间流量；5号大烧杯的容量应尽量大，以保证在液体从上一容器导入后能与其中已加热后的液体迅速混合后没有明显的温度变化；恒流泵应具有合适的流速范围以满足需要；流动的液体可以根据需要自行配制。本试验装置是基于本试验室现有材料基础上搭建，塑料桶的容量与恒流泵的最大流速16ml/min。

3.2模型的确立在研制本装置过程中曾尝试过建立闭合式循环装置，但该试验药物枸橼酸钠在体内可通过酶被迅速代谢，不会被循环利用；而在体外闭合式循环装置中的枸橼酸钠不会迅速代谢，能被循环利用，仿真效果不佳。故本装置选用开放式，可以避免上述情况的发生。

3.3影响试验的因素从装置稳定性试验结果来看，本装置测试封管用枸橼酸钠的重现性较好，RSD均在10％左右。影响该装置稳定性的因素主要有以下几点：①在试验过程中装置连接导管中的气泡对封管液的滞留时间有很大影响，可导致到达规定时间后在导管下端抽得液体量减少甚至无液体，故严禁气泡产生；②插入留置导管部分的橡胶管摆放位置不同，由于重力作用原因对结果也会有影响(Hans-Dietrich Polaschegg.Loss of catheterlocking solution caused by fluid density.ASAIO journal，2005，51(3)：230-235)；③人工操作中注入封管液的速度对试验结果有一定影响。

3.4本试验根据目前临床封管液一般滞留期不超过3天(血液透析患者通常每周需要透析2～3次)来设计，取样时间分别为1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h，能基本反映封管液在留置导管的滞留情况。从封管液滞留期考察结果来看，封管用枸橼酸钠注射液在体外模型留置导管3天(72h)时仍有滞留，已能满足临床需要。

该装置材料易得，搭建简单，操作方便，与体内血液流动情况有一定的相关性，具有一定的仿真性，其试验数据可以用作封管液临床前研究的参考，为临床研究提供了一定的试验基础。

(五)该枸橼酸钠注射液中枸橼酸盐的含量测定

本发明建立了封管用枸橼酸钠注射液中枸橼酸盐的含量测定方法。本发明选用HPLC法，选用迪马Diamonsil C₁₈色谱柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾(pH调至2.5～2.8)(5∶95，v∶v)为流动相，流速为1.0ml/min，紫外检测波长210nm。枸橼酸盐在0.5mg/ml～6mg/ml范围内呈良好的线性关系，(r＝0.9999，n＝5)；平均加样回收率为98.79％(RSD＝1.08％)；三批封管用枸橼酸钠注射液中的枸橼酸盐标示含量分别为100.51％、98.22％、97.78％。本方法操作简便、快速，结果准确、可靠，适用于该制剂中枸橼酸盐的含量测定。

封管用枸橼酸钠注射液为本院自制制剂，专用于静脉留置导管封管。枸橼酸盐的含量测定方法有非水滴定法(中国药典2005年版二部)，离子交换法(中国人民解放军总后勤部卫生部药品检验所编.药品检验，1979，186)、紫外分光光度法(李之林.枸橼酸盐两种测定方法的比较[J].中国医院药学杂志，2000，20(2)：122)、高效液相色谱法(董晓东，孙静，何影.高效液相色谱法测定红细胞保存液中枸橼酸及其钠盐总量[J].色谱，2003，21(1)：46-48)等。本实验采用高效液相色谱法测定封管用枸橼酸钠注射液中枸橼酸盐的含量，并与经典的非水滴定法进行比较。

1.仪器与试药

Waters高效液相色谱系统：Waters600色谱泵，Waters996PDA紫外检测仪，Millennium32色谱工作站；梅特勒-托利多320型pH计(梅特勒-托利多仪器<上海>有限公司)；梅特勒-托利多AE240电子分析天平(梅特勒-托利多仪器<上海>有限公司)；101-2型电热鼓风箱(上海市上海县实验仪器厂)。

封管用枸橼酸钠注射液(3ml：1.4g，自制，批号20040727，20050120，20050221)，枸橼酸钠(湖南华日制药有限公司，批号20051012)，枸橼酸(广东省台山市新宁制药厂，批号20050303)，磷酸二氢钾(湖南华日制药有限公司，批号20040422)；冰醋酸(上海埃彼化学试剂公司，批号F20050725)；醋酐(上海医药集团上海化学试剂公司，批号F20021018)；甲醇(上海化学试剂研究所，批号20060301，色谱纯)，注射用水(自制)。

2.方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：迪马Diamonsil^TM C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇-磷酸二氢钾水溶液(50mmol/L，磷酸调pH至2.5～2.8)(5∶95)，流速：1.0mL/min，检测波长：210nm，柱温：23±2℃，进样量：20μl。

2.2溶液的配制

对照品溶液的配制：精密称取枸橼酸钠999.9mg，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液。

供试品溶液的配制：精密量取封管用枸橼酸钠注射液1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3线性关系考察

精密量取对照品储备液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0ml分别置于5个10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配成0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml与6mg/ml浓度的系列对照品溶液。在2.1色谱条件下，吸取20μl，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。以枸橼酸盐峰面积Y为纵坐标，枸橼酸盐浓度C为横坐标进行线性回归，得标准曲线为Y＝636969.05X-9945.24，(r＝0.9999，n＝5)，线性范围：0.5～6mg/ml。

2.4精密度试验

取4mg/ml浓度的对照品溶液连续进样5次，测得日内RSD＝0.79％(n＝5)；将该溶液放置3天，每天进样一次，测得日间RSD＝1.48％(n＝3)。

2.5加样回收率试验

取已知含量的样品，先用水稀释4倍，精密量取稀释样品1.0ml，置100ml量瓶中，再加入一定量的枸橼酸钠，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取20μl注入高效液相色谱仪中，测定含量，计算回收率，结果平均回收率为98.79％，RSD＝1.08％(n＝9)。详细结果见表11。

2.6样品测定

分别取封管用枸橼酸钠注射液三批(批号20040727，20050120，20050221)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1色谱条件下进行测定，采用外标法定量，测得3批样品中的枸橼酸盐的标示含量分别为100.51％、98.55％、97.78％，色谱图见图2(枸橼酸盐HPLC图谱，Fig2HPLC chromatogram of citrate)。

表11、加样回收率结果

2.7与非水滴定法比较

精密量取3批样品各2.0ml，分别置50ml容量瓶中，加水定容，精密量取3.0ml至锥形瓶中，置水浴上蒸干后，再在105℃烘箱中干燥1h，放冷，加冰醋酸20ml，加热溶解后，放冷，加醋酐2ml与结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液显蓝绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于9.803mg的C₆H₅Na₃O₇·2H₂O。3批样品的测定结果分别为其标示量的99.71％、97.96％、96.75％。与上述高效液相色谱法的测定结果比较无显著差异。

3讨论

3.1从与非水滴定法比较试验结果可以看出，高效液相色谱法测定该制剂中的枸橼酸盐含量的准确度与非水滴定法没有显著性差别，但其操作简便，快速，数分钟内就可以测定一个样品；而非水滴定法的操作较繁琐，费时，测定一个样品至少花半天时间。另外，高氯酸非水滴定法仅能测定制剂中的枸橼酸钠含量，对含枸橼酸较多的枸橼酸钠制剂的测定结果往往会偏低。

3.2本法改进了流动相为甲醇-磷酸二氢钾水溶液(pH至2.5～2.8)(5∶95)，与已有报道的用17～18mmol/L磷酸溶液(pH 2.0～2.5)作为流动相高效液相色谱法[4]测定枸橼酸盐条件相比，具有更好的枸橼酸盐峰形，能改善其拖尾现象。

3.3本法测定封管用枸橼酸钠注射液中枸橼酸盐的含量操作简便、快速，结果准确、可靠，适用于该制剂中枸橼酸盐的含量测定，尤其适合于制剂中间品的质控及制剂稳定性研究。

(六)该枸橼酸钠注射液的用途

1、概述

临床长期的封管实践表明凝血与感染是常见的两大难题。随着肾脏病中末期患者数目的逐年增多，而肾源有限，故血液透析疗法是治疗的主要手段，2001年有统计数字显示，在美国，每一百万人中就有900人需要用血液透析治疗终末期肾脏病，并在2010年前以每年7.1％的速度增长，全球有100万以上终末期肾病患者，每年以8％的速度增长，中国约占十分之一(Xue JL，Ma JZ，Louis TA，et al.Forecast of the number of patients with end-stagerenal disease in the United States to the year 2010.J Am Soc Nephrol，2001，12(12)：2753-2758；和US Renal Data System：2003Annual Data Report：Atlas of End Stage Renal Disease in theUnited States，Bethesda，Naional Institutes of Health，Naional Institute of Diabetes andDigestive and Kidney Diseases，2003)。

以上的实验研究证明该封管用枸橼酸钠注射液具有显著的药理活性，发明人因此认定该封管用枸橼酸钠注射液具有良好的抗凝血与抗感染作用，应主要是通过封管来发挥作用的。

本发明所指的该封管用枸橼酸钠注射液主要由枸橼酸钠与枸橼酸组成，能与血液中的钙离子螯合生成可溶难解离的枸橼酸钙，从而减少钙离子的浓度起到抗凝作用，本发明的实验结果显示该封管用枸橼酸钠注射液有较好的疗效，上述实验表明该封管用枸橼酸钠注射液临床用于封管，对常见的凝血和感染具有很好的抑制作用。

2、该封管用枸橼酸钠注射液的使用方法与要求

本发明应严格按照导管标示量注入导管，在下一次血液透析前将其抽出导管。

本发明该封管用枸橼酸钠注射液可以单独或与其它活性组分联合使用，包括用于制备用于诊断、检测、预防、保护、治疗或研究相关疾病的产品，包括药物、试剂、食品或饮料等，尤其是药物。

在具体使用方面，本发明所述的该封管用枸橼酸钠注射液能够单独使用，还能够与其他许多化学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，包括辅助功能如协同放大作用、拮抗或缓解该枸橼酸钠注射液的副作用等，这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、食品、天然产物、化学合成药物或人类用药等中的一种或多种；优选包括医药学上可接受的载体或者食品等中的一种或多种；进一步优选医药学上可接受的载体。所述的有活性的化学物质是包括有治疗作用的化学物质，或者是对治疗有辅助作用的化学物质等中的一种或多种。

本文使用的“医药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。医药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油或乙醇等等及其组合物中的一种或多种。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化钠等中的一种或多种。医药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等中的一种或多种，它们增强了该枸橼酸钠注射液的有效期或效力。

从具体的分类上看，所说的医药学上可接受的载体是指医药学领域常规的药物载体，包括赋形剂，如淀粉或水等中的一种或多种；润滑剂，如甘油或硬脂酸镁等中的一种或多种；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如淀粉或乳糖等中的一种或多种；粘接剂，如预胶化淀粉、糊精、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等中的一种或多种；渗透压调节剂，如葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一种或多种；稀释剂，如水等；崩解剂，如琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠等中的一种或多种；吸收促进剂，如季铵化合物等；表面活性剂，如十六烷醇等；吸附载体，如高岭土或皂粘土等中的一种或多种；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇等中的一种或多种；另外，还可以在组合物中加入其它辅剂，如香味剂或甜味剂等中的一种或多种。

例如，将活性组分该枸橼酸钠注射液溶解、混悬或乳化于适宜的水性溶剂中(例如，蒸馏水、生理盐水或格林溶液等中的一种或多种)或油性溶剂中(例如，植物油例如橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一种或多种)中，即可制得注射制剂，其中溶剂中可含有分散剂(例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇或苯酚等中的一种或多种)、渗透压调节剂(例如，氯化钠、甘油、D9-甘露糖、D-山梨醇或葡萄糖等中的一种或多种)。在这种情况下，如有必要，可加入添加剂，例如增溶剂(例如，水杨酸钠或醋酸钠等中的一种或多种)、稳定剂(例如，人血清白蛋白等)、止痛剂(例如，苯甲醇等)等。

本发明所述及的该枸橼酸钠注射液还可以以组合物的形式联合使用，特别是与用其它化学物质如药物对动物尤其是哺乳动物包括人或其他动物进行治疗所用的组合物或者是类似的组合物。所述哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种。例如，可以将本发明该枸橼酸钠注射液加入适于给与受治疗者的药用组合物中。通常，该药用组合物包含本发明该枸橼酸钠注射液和药学上可接受的载体。

该枸橼酸钠注射液的组合物特别是药物组合物可以有各种形式，包括例如液体、半固体等剂量形式中的一种或多种；其中所说的药物组合物包括治疗有效量的该枸橼酸钠注射液为活性成分，以及一种或多种医药学上可接受的载体。

该枸橼酸钠注射液的药物组合物可以采用本领域公知的常规生产方法制成部分剂型，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述的剂型包括混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种，采取注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行抗凝、抗感染及相关病症的诊断、检测、治疗或科学研究。

药物组合物优选含有重量比为0.5～99％的活性成分该枸橼酸钠注射液，进一步优选含有重量比为1～95％的活性成分该枸橼酸钠注射液，最优选含有重量比为5～90％的活性成分该枸橼酸钠注射液。

该枸橼酸钠注射液的药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的该枸橼酸钠注射液与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将该枸橼酸钠注射液加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如，通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。通过在该组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐或明胶)可以达到注射组合物的延长吸收。

用于患者时，本发明所述的该枸橼酸钠注射液剂量为5～40mg/kg·d，该剂量或用量通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。

本发明该枸橼酸钠注射液及其药用组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明该枸橼酸钠注射液。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间下有效达到所需治疗效果的量。该枸橼酸钠注射液的治疗有效量可以根据诸如个体的病况、年龄、性别和体重以及该枸橼酸钠注射液在该个体引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量亦指该枸橼酸钠注射液的有益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。“预防有效量”是指在必要剂量和时间下有效达到所需预防效果的量。因为预防剂量用于患病前或疾病早期的受治疗者，预防有效量通常小于治疗有效量。本发明该枸橼酸钠注射液的治疗或预防有效量的典型的非限制性范围是5～40mg/kg，更优选为30～40mg/kg。应注意，剂量值将根据欲减轻的疾病类型和严重性变化，也就是说用于患者时，本发明所述的该枸橼酸钠注射液的剂量或用量，通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。另外，应理解，对于任何特定受治疗者，应随着时间根据个体需要和给与或监督给与所述组合物的人的专业判断调整特定剂量制度，并且本文设定的剂量范围仅为例证性的，并不会限制要求保护的组合物的范围或实践。

也就是说，需要根据治疗的对象、给药途径、所治疗疾病和状况等，变化本发明该枸橼酸钠注射液的每次和/或每日的剂量或用量。例如，经静脉给予哺乳动物，尤其是成年人(如体重60kg)，所述该枸橼酸钠注射液的单剂量约为5～40mg，优选约40mg，优选每周给药1～3次。可以调整剂量单位，以提拱最佳所需反应(例如治疗或预防应答)。例如，可以单次大剂量给药，可以在一段时间内给予几个均分量或根据治疗情况的迫切性按比例降低或增加剂量。配制易于给药和剂量统一的剂量单位形式的非肠道组合物尤其有利。本文使用的剂量单位形式，指适于欲治疗的哺乳动物受治疗者的单元剂量的物理分离单位；每个单位含有预定量的计算用于与所需药用载体一同产生所需治疗效果的活性物该枸橼酸钠注射液。本发明的剂量单位形式的规格，由以下确定并直接取决于以下(a)该枸橼酸钠注射液的独特特征和欲达到的特定治疗或预防效果，和(b)在混合这种用于治疗个体敏感性该枸橼酸钠注射液的技术中的内在限制。

3、该枸橼酸钠注射液的药物剂型和给药途径

本发明所述的该封管用枸橼酸钠注射液能够有效的抑制血液凝固与感染，该枸橼酸钠注射液能够制备封管用产品，其中按照饮料、食品技术领域的要求制备的产品能够诊断、检测、预防、保护、治疗或研究凝血、感染及其并发症；按照医药技术领域的要求制备的产品能够用于患者的治疗或保健，既能够单独直接用于制备治疗或保健的药物，也能够与许多化学物质进行混合或组合，直接或间接用于制备治疗或保健的药物；特别是按照医药技术领域的要求制备的产品能够用于患者的留置导管封管。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。

在本发明中，所需物料包括本发明的原料、上述配套使用的化学物质等，均应根据实际情况和需要，采用药用级的物料。

本发明所述的该封管用枸橼酸钠注射液，在使用领域中优选以注射剂形式往留置导管中推注使用。

本发明所述的该封管用枸橼酸钠注射液，优选是用注射器按照导管标示量注入留置导管，其使用量方面应严格按照导管标示量。

本发明所述的该枸橼酸钠注射液，可以用本领域已知的各种方法给药。但是，技术人员会理解给药途径/给药方式随所需的结果而变化。在某些具体实施中，该活性化合物可以与保护该化合物免于快速释放的载体一同制备例如空释制剂，包括移植物传递系统、透皮贴传递系统或微囊传递系统等中的一种或多种。此外，还可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一种或多种。制备这种制剂的许多方法均已申请专利或一般为本领域技术人员所知(参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，MarcelDekker，Inc.，纽约，1978)。

本发明所述的该枸橼酸钠注射液，通常通过肠胃外给药等中的一种或多种方式，施用于需要这种治疗的患者。

为了以非肠道给药之外给予本发明该枸橼酸钠注射液，可能需要用防止其失活的材料对该枸橼酸钠注射液包衣或与该枸橼酸钠注射液一同给予。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在具体实施时，将本发明该枸橼酸钠注射液与一种或多种可以用于治疗疾病的其它治疗药物共配制和/或共给予。这种联合使用，可以优越地利用较低剂量的该给予的治疗药物，因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。

制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它液体制剂中的一种或多种；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等中的一种或多种。

此外，该枸橼酸钠注射液所使用的药材原料在某些情况下也能够单独直接用于制备封管用产品，也能够与许多化学物质进行混合或组合，以组合物的形式直接或间接用于制备封管用产品。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。

综上所述，本发明该枸橼酸钠注射液可用于制备封管用产品，优选药物和食品，进一步优选药物。

(七)技术特长

本发明有针对性地研究一种封管用枸橼酸钠注射液配方，该原料使用安全，互为兼顾，一物多用，最大限度地发挥了作用，容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。

本发明的研究结果表明该产品具有疗效确切、毒副作用低的优点，与同类产品相比具有显著的优势。也就是说，本发明的研究结果能够被进一步深入开发为具有临床应用前景的防治凝血和抗感染双重作用的产品尤其是新药。随着中末期肾衰患者数目的逐年增多，血液透析的需求量也会随之上升，因此，本发明能够产生更大的经济效益和社会效益。

经过长期的药理学试验，一种封管用枸橼酸钠注射液配方具有抗凝及抗感染的活性，直接使用一种封管用枸橼酸钠注射液配方，作用更理想，从而克服了封管中凝血与感染两大难题，避免了抗生素给患者带来的不良影响；而且该封管用枸橼酸钠注射液药理作用较强，其原料来源丰富，制备工艺简单。

本发明的制备方法简单，可行性强，重复性高，所生产的产品质量合格，且稳定性好，适用于大规模生产。

本发明中的体外中心静脉插管仿真装置采用一般的管材和简单设备，利用虹吸原理及蠕动装置完成模型的一系列驱动，可以模拟血液的温度，黏度，流速及不同部位的静脉，具有一定的仿真性，可以作为体外筛选封管液的试验装置，为封管液的临床前研究提供了试验平台。目前国内外尚未有该装置的报道。

总之，本发明积极适应了现代医疗和科研领域的工作需要和人性化服务的需要，是用于留置导管封管的理想封管液。

附图说明

图1表示：插管体外仿真血液流动模型的示意图，

其中，1：塑料桶；  2：橡胶管； 3：流量调节器；4：水浴锅；

      5：烧杯；    6：硅胶管； 7：恒流泵；    8：夹子；

      9：三通接头；10：留置导管；

图2表示：枸橼酸盐HPLC图谱(HPLC chromatogram of citrate)，其中，A：对照品(reference)色谱图；B：供试品(sample)色谱图；

图3表示：枸橼酸钠对照品HPLC图；

图4表示：供试品HPLC图；

图5表示：封管用枸橼酸钠注射液(25℃±2℃，12个月)HPLC图。

具体实施方式

本发明研究了一种新的枸橼酸钠注射液配方及其制备方法和新用途，提供了一种能够用于制备抗凝、抗感染及其并发症产品如药物的原料，便于医疗行业和相关行业如食品、饮料等领域的安全使用，包括疾病治疗、科学研究等。

下面以该枸橼酸钠注射液的有关药理实验为例，详细阐述该枸橼酸钠注射液的抗凝作用。

观察封管用枸橼酸钠注射液的体外抗凝效果。取兔心脏血液，制备血浆，分别加入封管用枸橼酸钠注射液和不同浓度的肝素钠注射液，采用血液凝聚仪测定血小板最大聚集率PAG(M)、部分凝血活酶时间(简称：APTT)、凝血酶原时间(简称：PT)及凝血酶时间(简称：TT)。封管用枸橼酸钠注射液能明显延长APTT、PT及TT，完全抑制血小板的凝聚，其抗凝聚作用优于肝素注射液。封管用枸橼酸钠注射液具有良好的体外抗凝作用。

目前临床上用于留置导管封管主要采用不同浓度的肝素钠溶液，肝素钠主要通过与抗凝血酶结合，抑制其活化凝血因子而起到抗凝作用。但由于大剂量应用肝素钠可致自发性出血倾向，因而对于有明显出血倾向、凝血功能障碍及使用肝素钠过敏的透析患者来说，应选择其他更为安全的抗凝剂。枸橼酸钠通过螯合血液中可促进凝血活素、凝血酶和纤维蛋白形成的游离钙离子，阻止凝血酶原转化成为凝血酶，从而发挥抗凝血作用，并可以避免肝素钠封管带来的副作用，较肝素钠安全可靠，而且高浓度的枸橼酸钠具有很好的抗菌效果，也是留置导管封管必需的。本试验旨在研究封管用枸橼酸钠注射液的体外抗凝作用，并与肝素钠注射液进行比较。

1.材料与方法

1.1试验对象新西兰大白兔3只，雌雄不限，2.5±0.5kg，购于第二军医大学动物中心。

1.2受试药物：封管用枸橼酸钠注射液(3ml:1.4g，自制，批号20051024)；肝素钠注射液(2ml：12500单位，常州千红生化制药有限公司，批号060608)。

1.3试剂与仪器部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)及凝血酶时间(TT)试剂盒均为上海鹰跃生物试剂有限公司生产，批号060307；枸橼酸钠(湖南华日制药有限公司，批号20051012)；生理盐水(自制)；氯化钙(北京市燕京制药厂，批号041122)；ADP(Sigma公司，进口分装)；Anke 80-2C离心沉淀机(上海飞鸽牌)；TYXN-96多功能智能血液凝聚仪(上海通用机电技术研究所研制)。

1.4实验方法

1.4.1血浆的制备取新西兰大白兔心脏新鲜血液9ml，用1ml 3.28％枸橼酸钠溶液抗凝，混匀后离心(10min，700r/min，37℃)，上清液即为富含血小板血浆(PRP)。剩余液体再次离心(10min，2000r/min，37℃)，上清液即为贫血小板血浆(PPP)。

1.4.2肝素钠溶液的制备取肝素钠注射液1ml，按照对半稀释法以生理盐水配成50mg/ml～1.5625mg/ml(125单位相当于1mg，即肝素钠注射液规格为2ml：100mg)6个浓度的肝素钠溶液。

1.4.3血小板最大凝聚率PAG(M)的测定以200μl PRP加10μl不同受试药物，37℃预温5min，加入6μlADP诱导，测定血小板凝聚率。

1.4.4APTT、PT与TT的测定分别以100μl PPP加10μl不同受试药物，37℃预温5min，按照仪器提示时间分别加入部分凝血活酶、凝血酶原及凝血酶，测定APTT、PT与TT。

1.5统计学处理所用实验数据均采用成组设计的方差分析，用PEMS软件进行处理，结果均以x±s表示。

2结果

2.1封管用枸橼酸钠注射液对PAG(M)的影响

封管用枸橼酸钠注射液能完全抑制兔体外血小板的凝聚(同空白组比有非常显著差异，P＜0.01)，而6个浓度的肝素钠溶液对血小板凝聚率有影响(同空白组比有显著差异，P＜0.05，但各组间无显著性差别(P＞0.05)，结果详见表12。

2.2封管用枸橼酸钠注射液对APTT、PT及TT的影响

封管用枸橼酸钠注射液与6个浓度的肝素钠均可以明显延长兔体外APTT与TT；封管用枸橼酸钠注射液相对于除肝素钠原液以外的5个浓度溶液对PT更显著的延长作用，结果见表13。

表12、封管用枸橼酸钠注射液与不同浓度肝素钠对血小板最大凝聚率的影响(n＝3)

注：^**P＜0.01VS空白血浆组，^*P＜0.05VS空白血浆组。

表13、封管用枸橼酸钠注射液与不同浓度肝素钠对APTT、PT及TT的影响(n＝3)

注：^*APTT栏中的120s与TT栏中的80s均为仪器显示的极限值；^**P＜0.01VS空白血浆。

3.讨论

肝素钠与枸橼酸钠的作用机理不同，前者主要是通过激活对凝血酶及凝血因子XIIa、IXa、Xa、Xla具有灭活作用的抗凝血酶III(AT_III)来实现的。因肝素钠含有大量负电荷，能与AT_III分子上带正电的赖氨酸结合，使AT_III分子构型发生变化，精氨酸活性部位被暴露，易与凝血因子中的丝氨酸结合，生成无活性的AT_III凝血因子复合物，使凝血因子受抑制而产生抗凝作用。而枸橼酸钠是通过枸橼酸根离子与血中钙离子生成难解离的可溶性络合物枸橼酸钙，使血中钙离子减少，从而抑制凝血过程、阻止血液凝固(李端，药理学(第5版)，人民卫生出版社，2003，8)。

从表12的结果可以看出，封管用枸橼酸钠注射液对血小板凝聚的抑制率高于肝素钠溶液，各浓度肝素钠溶液对血小板的抑制率之间没有显著性差异。这可能是与血浆中的凝血酶量有关，即本试验中的最低浓度的肝素钠溶液就可以与凝血酶完全发生作用。表13的结果显示，封管用枸橼酸钠注射液与肝素钠对兔体外APTT、PT和TT均有显著的延长作用。

对于静脉留置导管的封管，临床上多采用2mg/ml浓度的肝素钠溶液进行封管，有时根据病人的个体情况进行适当调整用量(李保春，苏红，崔若兰。应用带涤纶环双腔导管经锁骨下静脉建立长期血透通路，生物医学工程与临床，2001，5(1)：27～28)，有时最高可达50mg/ml。虽然高浓度肝素钠具有很好的抗凝作用，但是对于肝素钠过敏、有自发出血倾向、血液凝固迟缓者及严重肝功能不全者不适用，而枸橼酸钠一般在三羧酸循环中可以完全氧化代谢，一旦出现低血钙症状可以静注葡萄糖酸钙及时纠正，且从本试验结果可以看出封管用枸橼酸钠注射液的体外抗凝效果总体上优于肝素钠注射液。另外，封管用枸橼酸钠注射液为高浓度枸橼酸钠溶液，本身有较好抗菌作用(Dogra GK，Herson H，Hutchison B，et al.Prevention of tunneled hemodialysis catheter-related infections usingcatheter-restricted filling with gentamicin and citrate：A randomized controlled study.J Am SocNephrol，2002，13：2133-2139)。因此，封管用枸橼酸钠注射液更适合于静脉留置导管的封管。

下面以该枸橼酸钠注射液的有关药理实验为例，详细阐述该枸橼酸钠注射液的抑菌作用。

评价封管用枸橼酸钠注射液的体外抑菌作用，并与肝素钠注射液作用进行比较。采用琼脂稀释法和肉汤稀释法测定封管用枸橼酸钠注射液对204株标准及临床分离菌的最低抑菌浓度(简称：MIC)，以琼脂打洞扩散法与目前临床使用的肝素钠封管液进行抑菌效果比较。封管用枸橼酸钠注射液对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌及白色念珠球菌的MIC范围分别为3.6～29.2mg/ml、3.6～14.6mg/ml、116.8～233.5mg/ml、58.4～116.8mg/ml及29.2～58.4mg/ml；抑菌圈直径分别为2.6cm、2.8cm、1.2cm、4.4cm及2.4cm，而肝素无抑菌圈。封管用枸橼酸钠注射液对留置导管感染常见病原菌具有良好的抑菌作用，有望成为替代肝素的新一代理想封管液。

枸橼酸钠一直被人们只当作抗凝剂在临床中使用，而有研究表明，当枸橼酸钠的浓度大于20％时就成为具有抑菌活性的抗凝血剂，用做封管液可以减少导管感染、闭塞及延长导管寿命(Dogra GK，Herson H，Hutchison B，et al.Prevention of tunneled hemodialysiscatheter-related infections using catheter-restricted filling with gentamicin and citrate：Arandomized controlled study.J Am Soc Nephrol，2002，13(8)：2133-2139)。导管相关性败血症的主要病原菌为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌与真菌(陈秀苹，任苇，项领，导管相关性败血症临床及病原学分析，中华医院感染学杂志，2006，16(2)：159-160)，我们从中挑选了金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌及白色念珠球菌5种较为常见的病原菌作为试验对象，对封管用枸橼酸钠注射液进行了体外抑菌试验，报道如下。

1.材料与方法

1.1试验菌株金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)，大肠杆菌标准株(ATCC25922)，绿脓杆菌标准株(ATCC27853)，金黄色葡萄球菌47株(临床分离菌株)，表皮葡萄球菌48株(临床分离菌株)，大肠杆菌47株(临床分离株)，绿脓杆菌34株(临床分离株)，以上菌株均由长征医院呼吸科实验室提供；白色念珠球菌25株(临床分离菌株)，由长征医院皮肤科实验室提供。

1.2培养基MH琼脂(上海市疾病预防控制中心，中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心，批号20060515)，MH肉汤(上海市疾病预防控制中心，中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心)。

1.3实验仪器恒温培养箱，超净工作台，麦氏比浊管(法国梅里埃公司)。

1.4实验药品封管用枸橼酸钠注射液(3ml：1.4g，自制，批号20051024)，肝素钠注射液(2ml：12500单位，常州千红生化制药有限公司，批号060608)。

1.5菌液的制备经麦氏管比浊，用生理盐水将菌苔配成1×10⁸cfu/ml。

1.6实验方法

1.6.1最低抑菌浓度(简称：MIC)测定采用琼脂稀释法与肉汤稀释法结合测定MIC(叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程[M].南京：东南大学出版社，1997，562-564；周庭银，赵虎.临床微生物学诊断与图解.上海：上海科学技术出版社，2001，34-35)。

1.6.1.1琼脂稀释法将用蒸馏水对药物进行对倍稀释后的灭菌药液加入融化并经121℃高压灭菌15min，冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含药量分别为116.8，58.4，29.2，14.6，7.3，3.7，1.8，0.91，0.45，0.24mg/ml不同递减浓度药物的平板，接种待测菌，35℃孵育24h，无细菌生长的最低药物浓度为测试菌的MIC。

1.6.1.2肉汤稀释法在肉汤中将药物进行对倍稀释后，制成含药量分别为233.5，116.8mg/ml等一系列的无菌药物培养基，每管中加入待检菌菌液100μl，35℃培养箱中孵育24h，药物最低浓度管无细菌生长者即为待检菌的最低抑菌浓度。

1.6.2琼脂打洞扩散法：用无菌棉拭蘸取校正后的试验菌菌液(1×10⁸cfu/ml)，在试管壁上挤压几次，压去多余的菌液，分别均匀密集涂布于琼脂平板，反复数次，每次旋转平板60°，使整个平板涂布均匀，用无菌8mm孔径打孔器打孔，然后每孔各加受试物200μl，平放于35℃温箱中培养24h观察结果，以孔周围完全不长菌区测量抑菌圈直径，记录抑菌圈直径的平均值。

2结果

2.1封管用枸橼酸钠注射液对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌及白色念珠球菌的MIC范围分别为58.4～7.3mg/ml、29.2～7.3mg/ml、233..5～116.8mg/ml、233.5～58.4mg/ml与58.4～29.2mg/ml。其详细分布见表14。

表14、封管用枸橼酸钠注射液对204株实验病原菌的MIC分布(mg/ml)

2.2封管用枸橼酸钠注射液在金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌及白色念珠球菌的平皿上均有较大的抑菌圈，而肝素钠注射液无抑菌圈。抑菌圈直径详见表15。

表15、封管用枸橼酸钠注射液与肝素钠注射液抑菌效果比较

3.讨论

枸橼酸钠虽然有抑菌作用但是不同于抗生素，只有当其浓度较高时才有抑菌作用，本试验中测定MIC的方法参照细菌对抗菌药物的敏感试验方法，但由于枸橼酸钠含量较高的琼脂平板会出现沉淀，所以对于MIC较高的大肠杆菌和绿脓杆菌采用肉汤稀释法进行测定。

从本试验结果可以看出，48株金黄色葡萄球菌中有68.8％的菌株MIC为14.6mg/ml，48株表皮葡萄球菌中有70.8％的菌株MIC为29.2mg/ml，48株大肠杆菌中有83.3％的菌株MIC为116.8mg/ml，35株绿脓杆菌中有88.6％的菌株MIC为116.8mg/ml，25株白色念珠球菌中有88％的菌株MIC为29.2mg/ml；封管用枸橼酸钠注射液在上述5种菌的平皿上均有较大的抑菌圈，而肝素钠注射液无抑菌圈，表明封管用枸橼酸钠注射液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的标准菌株及临床分离菌株，表皮葡萄球菌与白色念珠球菌的临床分离菌株生长均有良好的抑制作用而肝素钠注射液无抑菌作用，这一结果与国外文献(Weijmer MC，Debets-Ossenkopp YJ，van de Vondervoort FJ，et al.Superior antimicrobial activity of trisodiumcitrate over heparin for catheter locking.Nephrol Dial Transplant，2002，17(12)：2189-2195)报道一致。

对于需要长期透析的患者，经常采用插入静脉留置导管的方法避免每次透析的不便，然而导管感染成为了重要障碍，一旦发生感染就易引发菌血症。本试验选用的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、表皮葡萄球菌与白色念珠球菌为留置导管感染中革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌中最为常见病原菌代表。目前临床上常用的肝素钠注射液没有抑菌作用，许多医院为防止插管感染，在封管液中加入抗生素，但是抗生素可通过导管渗漏入血，如长期使用使患者暴露于抗生素中会产生细菌耐药。而封管用枸橼酸钠注射液可以有效抑制上述细菌的生长，即使有少量渗漏于血液中也会通过三羧酸循环代谢至正常水平，故封管用枸橼酸钠注射液相对于肝素钠注射液安全有效，可以作为新一代封管液更好的服务于临床。

下面通过该枸橼酸钠注射液的溶血性试验，探讨该枸橼酸钠注射液的安全性。

观察两种配方封管用枸橼酸钠注射液在体外对新西兰大白兔有无溶血、凝集作用。依照《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》，取规定量受试药加入2％兔血生理盐水混悬液中，观察溶血和凝集情况，并用分光光度计测定吸光度值，计算溶血率。I型封管用枸橼酸钠注射液(含枸橼酸0.3％)与II型封管用枸橼酸钠注射液(含枸橼酸4％)在药物浓度10％时的溶血率分别为3.3％与13.4％，在药物浓度2％时的溶血率分别为1.1％与8.3％。含枸橼酸0.3％的封管用枸橼酸钠注射液对兔红细胞无明显溶血和凝集现象，溶血率小于5％，符合注射剂要求；而含枸橼酸4％的封管用枸橼酸钠注射液的溶血率大于5％，静脉注射会有溶血倾向。

封管用枸橼酸钠注射液在临床上用于静脉留置导管的封管，会有少量药液流入患者静脉内。本文依照《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》(国家食品药品监督管理局《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》课题研究组，《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》，2005年3月)，对两种封管用枸橼酸钠注射液进行溶血性试验。

1.材料与方法

1.1试验对象新西兰大白兔，雌雄不限，2.5±0.5kg，购于第二军医大学动物中心。

1.2受试药物I型封管用枸橼酸钠注射液(3ml：1.4g，含枸橼酸0.3％，pH7.0，自制，批号20051024)，II型封管用枸橼酸钠注射液(3ml：1.4g，含枸橼酸4％，pH5.6，自制，批号20060823)。

1.3仪器：离心沉淀机(上海飞鸽牌Anke 80-2C)；DK-8AD型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)；UV1100分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)。

表16、封管用枸橼酸钠注射液溶血试验加药一览表

表17、溶血判断标准

1.4实验步骤取新西兰大白兔3只，每只心脏穿刺取血10ml，分别置烧杯中用玻璃棒搅拌去除纤维蛋白，然后加入10倍量的生理盐水，摇匀，离心15min(1000r/min)，去除上清液，沉淀的红细胞再加入生理盐水按照上述方法洗涤2次，上清液不显红色。将所得红细胞按其容积，用生理盐水稀释成2％的混悬液，供试验用。取洁净试管14支，分成两组，按照1～7顺序编号，1～5号管为供试品管，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管。按表16所示依次加入2％红细胞悬液、0.9％氯化钠溶液或蒸馏水，混匀后，立即置37±0.2℃的恒温箱中进行温育，分别于第15min、30min、45min、1h、2h和3h观察各试管是否有溶血或凝集现象，判断标准见表17。

2.结果

1号～6号管溶液中红细胞全部下沉，上层液体无色澄明，表明封管用枸橼酸钠注射液和生理盐水无溶血及红细胞凝集现象，而7号管内液体红色澄明，管底无细胞残留，表明全部溶血，结果详见表18。

表18、封管用枸橼酸钠注射液溶血试验结果

表中：-无溶血+全溶血。阴性对照为生理盐水；阳性对照为蒸馏水。

将各管溶液置入干燥离心管中离心10min(1500r/min)，取上清液在分光光度计545nm处，以蒸馏水为空白，测定吸光度，按照下面公式计算溶血率，结果详见表19。

溶血率(％)＝(ODt-ODnc)/(ODpc-ODnc)(ODt为试验管吸光度；ODnc为阴性对照管吸光度；ODpc为阳性对照管吸光度)

表19、封管用枸橼酸钠注射液1～5号管溶血率(％)(n＝3)

3.讨论

正常情况下人的血液pH值为7.35～7.45，理论上近中性制剂与血液具有良好的相容性。由于枸橼酸钠溶液呈碱性(pH10，47％)，因此采用枸橼酸来调节枸橼酸钠注射液的pH值。本研究对两种pH的枸橼酸钠注射液的溶血性进行比较，含枸橼酸0.3％的枸橼酸钠注射液(pH7.0)近中性，含枸橼酸4％的枸橼酸钠注射液(pH5.6)呈酸性。试验采用体外兔血法对比两种枸橼酸钠注射液的溶血和凝集作用。结果发现，含枸橼酸4％的枸橼酸钠注射液的溶血率高于含枸橼酸0.3％的枸橼酸钠注射液，表明枸橼酸钠注射液在pH偏酸性时有溶血率倾向。为进一步证实上述推断，另设计试验比较4％枸橼酸溶液与4％枸橼酸钠溶液的溶血情况，结果肉眼观察到4％枸橼酸溶液1～5号管溶液呈棕色，表示部分溶血，而4％枸橼酸钠溶液1～5号管溶液无溶血。因此，枸橼酸钠注射液的pH拟调至近中性，以增加制剂的安全性。

本试验中I型封管用枸橼酸钠注射液对兔红细胞无明显溶血和凝集现象，溶血率小于5％，符合注射剂要求；而II型封管用枸橼酸钠注射液的溶血率大于5％，静脉注射有溶血倾向。

下面以该枸橼酸钠注射液的几个典型配方为例，详细阐述该枸橼酸钠注射液的稳定性。

1、依据

中国药典2005年版二部附录药物稳定性试验指导原则。

2、仪器

pHS-3型酸度计(上海第二分析仪器厂)；DZF-1型真空干燥箱(上海医用恒温设备厂)；DZ-60型电热恒温真空干燥箱(上海疗器械七厂)；DG-1多功能恒温箱；Waters高效液相色谱系统(600E pump，600controllor，996PDA，Millennium³²软件系统)；申江SC 680-B型澄明检测仪(上海黄海药检仪器厂)。

3、材料及试药

医药用安瓿(上海宜锦玻璃厂，生产批号：021022)；三批46.7％封管用枸橼酸钠注射液(玻璃安瓿，自制，3ml，批号分别为040727、050120、050221)

4、方法

长期试验：将三批制剂置于温度25℃±2℃条件下放置12个月，分别于0、3、6、12个月取样检测。

5、考察项目

性状、含量、pH值、可见异物、有关物质、无菌。

6、含量测定方法

精密称取枸橼酸钠23.35mg至50ml容量瓶中，加水至全量作为对照品溶液；精密量取样品1ml至100ml容量瓶中，加水至全量作为供试品溶液；采用HPLC方法测定枸橼酸钠含量。

色谱条件：固定相：Waters SYMMETRY C₁₈柱(250mm×4.6mm 5μm)；流动相：0.01mmol/L磷酸二氢钾-甲醇(95∶5)，流速：1.0ml/min；检测波长：210nm；柱温：23℃；进样量20μl。见图3(枸橼酸钠对照品HPLC图)、图4(供试品HPLC图)。

7、结果

长期试验结果：经室温条件下6个月考察，三批制剂的性状均未发生改变，仍为无色澄明液体；无菌检测均合格；微粒检测均合格；从封管用枸橼酸钠注射液(25℃±2℃，12个月)HPLC色谱图上(见：图5)看未见有关物质；pH值与含量详见表20。

表20、三批制剂长期试验中各项目考察结果

8、讨论

①封管用枸橼酸钠注射液的稳定性试验结果表明，封管用枸橼酸钠注射液稳定性良好，对光反应不敏感，其安瓿制剂可以不用避光保存，12个月内性质稳定。

②从长期试验情况看，安瓿封管用枸橼酸钠注射液在25℃±2℃储存12个月内稳定。

③本试验结果表明，封管用枸橼酸钠注射液(玻璃安瓿)在室温下保存12个月是稳定的。

下面以几个典型的剂型为例，详细阐述该枸橼酸钠注射液各种剂型的具体制备方法。

本发明制备粉针剂一般采用常规的冷冻干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取该枸橼酸钠注射液，加入赋形剂，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，灌装，半轧塞，冷冻干燥，压塞轧盖即可。所用的赋形剂选自甘露醇、水解明胶、葡萄糖、乳糖或右旋糖苷等中的一种或几种。每瓶含该枸橼酸钠注射液10～100mg。

本发明制备粉针剂也可采用喷雾干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取该枸橼酸钠注射液，加或不加赋形剂(赋形剂同上)，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，喷雾干燥，无菌分装，压塞轧盖即可。每瓶含该枸橼酸钠注射液10～100mg。

本发明制备小针剂时，以注射用水作为溶媒配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯或二甲基乙酰胺等中的一种或几种。每支含该枸橼酸钠注射液10～100mg。

该枸橼酸钠注射液的急性毒性试验(枸橼酸钠注射液尾静脉注射对小鼠的急性毒性试验)

本试验通过以1∶0.85的等比梯度给小鼠尾静脉注射给予4.50％、3.83％、3.25％、2.76％、2.35％、2.00％枸橼酸钠注射液10ml/kg体重，观察其对小鼠的急性毒性。试验结果表明，以1∶0.85的等比梯度给小鼠尾静脉注射给予4.50％、3.83％、3.25％、2.76％、2.35％、2.00％枸橼酸钠注射液10ml/kg体重后，十四天内的死亡率分别为100％、80％、70％、30％、10％、0。因此，小鼠对枸橼酸钠注射液的半数致死量(LD₅₀)为0.305g/kg体重。

试验目的

观察枸橼酸钠注射液给小鼠尾静脉注射后产生的急性毒性反应及其严重程度，并观察小鼠在给药后14天内的死亡情况，考察枸橼酸钠注射液对小鼠的急性毒性，为临床安全用药及监测提供参考，也为该制剂其它毒性试验的剂量选择提供依据。

设计依据

试验严格按照2005年国家药品监督管理局新审定的化学药物急性毒性试验技术指导原则进行。根据枸橼酸钠注射液在临床应用的给药途径为静脉注射，试验选择对小鼠进行尾静脉注射给药。小鼠给药后观察14天，记录其毒性反应、体重变化及死亡情况。

受试药物

名称：47％枸橼酸钠注射液

批号：050125

理化性质：无色透明溶液

贮存条件：室温避光密闭保存

质量：250ml

包装：输液袋

提供单位：上海长征医院

配制方法：生理盐水稀释至所需浓度

试验动物

种属：远交系ICR小鼠

性别：雌雄各半

年龄：6～8周

体重：18～22克

数量：60只，雌雄各半

来源：上海第二军医大学实验动物中心，清洁级，动物合格证号：SCXK(沪)2002-0006；

饲养：上海第二军医大学药学院动物房，合格证号：医动字第02-64号；给药前12小时禁食，自由饮水；给药后2小时自由饮食。

试验方法

给药途径：尾静脉注射

容量：10ml/kg体重

剂量：共分为六组，以1∶0.85的等比梯度给小鼠单次尾静脉注射4.50％、3.83％、3.25％、2.76％、2.35％、2.00％枸橼酸钠注射液10ml/kg体重。

观察指标：观察给药后14天内小鼠的中毒及死亡情况，未死亡小鼠于第14天称重后处死，解剖，肉眼及显微镜检查各脏器是否有病变。

统计方法：

LD50求算软件(bliss法)

结果

ICR小鼠单次尾静脉注射给予4.50％、3.83％、3.25％、2.76％、2.35％、2.00％枸橼酸钠注射液10ml/kg体重后，十四天内的死亡率分别为100％、80％、70％、30％、10％、0(表21)，14天后解剖给药小鼠，肉眼检查未见脏器有明显病理改变。

表21、ICR小鼠单次尾静脉注射给予不同浓度枸橼酸钠注射液10ml后死亡情况

结论

60只ICR小鼠尾静脉注射给予4.50％、3.83％、3.25％、2.76％、2.35％、2.00％枸橼酸钠注射液10ml/kg后，十四天内的死亡率分别为100％、80％、70％、30％、10％、0。因此，小鼠对枸橼钠注射液尾静脉注射的半数致死量(LD₅₀)为0.305g/kg体重，LD₅₀(Feiller校正)95％的可信限＝0.279～0.334g/kg体重。

该枸橼酸钠注射液对大鼠的长期毒性试验

根据美国化学会在2001年6月20日对美国高产量化学品评估资料中显示，枸橼酸钠对哺乳类动物行单剂量多次给药，没有不利的副作用发生。此外，发明人已研究该封管用枸橼酸钠注射液多年，且本发明在临床使用2年多时间、约500人次，未发现明显毒性，未见明显不良反应。以上都证明和证实了本发明用于血液透析中的体外局部抗凝是安全的。

在本发明中，以上所述的具体实施方式和以下所述的实例均是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制发明的范围。

下面通过实施例对本发明作详细描述。

实施例1、该封管用枸橼酸钠注射液的制备

根据处方，按称量SOP称取原料；取适量热注射用水，加入枸橼酸钠、枸橼酸搅拌溶解，加注射用水至全量，搅匀；脱炭过滤用板框过滤器，滤材为微孔滤膜，孔径1.2μm、0.8μm；终端过滤用微孔滤盘，滤材为微孔滤膜，孔径0.65μm；中间品质控含量：含量为标示量的97.0％-103.0％，pH值6.8-7.5；灌装；检查封口；温度110℃，时间20分钟，热压灭菌；置安瓿于光照度2000-3000LX的澄明度检测议前，用目检视，按澄明度检查要求进行，灯检人员视力应为5.0以上，无色盲；检漏，剔除有药液渗漏、漏气及有异物的产品，成品澄明度应符合药典规定；包装：合格的检品按要求贴签并装入5支装纸盒，点检装箱。

实施例2、该封管用枸橼酸钠注射液临床应用1

研究47％枸橼酸钠溶液对血液透析患者长期留置导管封管的效果。选择尿毒症维持透析长期留置导管患者40例，随机分为枸橼酸试验组20例，肝素对照组20例。每次透析结束后试验组以47％枸橼酸钠溶液封管，对照组以肝素钠溶液封管，均连续使用6月，记录用药前6月及用药6月导管通畅情况，观察导管相关感染情况。在用药前和用药1月、3月及6月末，抽取动、静脉端封管液进行细菌培养。测定患者用药前、及用药2周及6月后透前电解质。试验组导管不通畅率和导管感染率均显著低于用药前及对照组(p＜0.05)。用药前后两组电解质均无显著变化。试验组用药后1月血培养阳性率即开始下降，3月后显著低于用药前及对照组。封管用枸橼酸钠溶液对长期留置导管进行封管可提高导管通畅率，降低导管相关感染率，不良反应少，操作方便，适合长期使用。

□试验目的

研究47％枸橼酸钠溶液对血液透析患者长期留置导管封管的效果，并与肝素钠溶封管作对比观察。

□一般资料及病例选择

选择尿毒症维持透析长期留置导管患者40例，男性16例，女性24例，年龄30～85岁，透析龄1～145月，导管留置时间1月～5年，既往均以肝素封管。随机分为枸橼酸试验组20例，肝素对照组20例。

□试验方法

1、给药方法和剂量

试验组：每次透析结束后以47％枸橼酸钠溶液(自制)按照管腔容量注入留置导管动脉端和静脉端管腔。

对照组：每次透析结束后以肝素钠溶液(2mg/ml)按照管腔容量注入留置导管动脉端和静脉端管腔。两组均连续使用6月。

2、临床观察指标

记录患者用药前6月及用药6月每次血透导管通畅情况，观察导管相关感染情况。在用药前和用药1月、3月及6月末，抽取动、静脉端封管液进行细菌培养。测定患者用药前、及用药2周、6月后透前电解质。

□统计学方法

计量资料以x±s表示，采用t检验，计数资料采用x²检验。

□试验结果

1、疗效分析

试验组和对照组患者的性别、年龄、透析龄、导管留置时间经统计学检查均无显著性(P＞0.05)，表明两组构成均衡，具有可比性。试验组用药前6月共行血透1440例次，用药后6月共行血透1448例次，对照组用药前6月共行血透1466例次，用药后6月共行血透1462例次。试验组导管不通畅例次和导管感染次数均显著低于用药前及对照组用药后(p＜0.05)。用药前后两组电解质均无显著变化。试验组用药后1月血培养阳性率即开始下降，显著低于用药前及对照组，6月后全阴性。主要观察结果见表22、表23。

2.药物的不良反应

试验组中有28例次(1.93％)用药后出现不同程度口唇麻木症状，其中20例次数分钟后自行缓解，8例次给予10％葡萄糖酸钙10ml静推后缓解。无其他严重不良反应。

表22、用药前后各观察指标变化

^*p＜0.05vs试验组用药前；^△p＜0.05vs对照组用药后

表23、血培养阳性率

^*p＜0.05vs用药前；^△p＜0.05vs对照组

□讨论

在血液透析血管通路中，长期留置导管是血管条件差而无法建立内瘘患者较好的替代方法。随着插管及护理技术的成熟，长期留置导管的使用寿命不断延长，并发症逐渐减少，但仍存在血栓或纤维蛋白鞘导致的导管不通畅及导管感染等问题，严重时可影响患者透析效果及导管使用期限。留置导管传统的封管方法采用肝素溶液，这种方法对部分高凝状态患者导管抗凝效果差，并且无预防感染作用。本研究采用47％枸橼酸钠溶液对长期留置导管进行封管，观察其抗凝及预防感染作用，取得了较好疗效。

枸橼酸钠可结合血中的钙离子，起到抗凝作用，目前在血液透析的抗凝中得到了深入开展。此外，枸橼酸钠是一种强碱，具有一定的抗菌作用。20世纪90年代末期欧洲学者开始将低浓度(3％～10％)枸橼酸钠溶液联合或不联合抗生素应用于透析导管的封管并取得了一定效果(Sodemann K，Polaschegg HD，Feldmer B.Two years′experience with Dialockand CLS(a new antimicrobial lock solution).Blood Purif，2001，19(2)：251～254；Meeus G，Kuypers DR，Claes K，et al.A prospective，randomized，double-blind crossover study on the useof 5％citrate lock versus 10％citrate lock in permanent hemodialysis catheters.Blood Purif，2005，23(2)：101～105)，通畅率提高，导管相关感染率下降。本研究采用高浓度枸橼酸钠溶液封管，观察到导管不通率从14.3％下降至6.6％，导管相关感染率从35％下降至5％，疗效显著。

由于枸橼酸钠溶液可结合钙离子，故可引起患者发生低钙血症，出现麻木、抽搐、心律失常等症状。文献报道应用枸橼酸封管不良反应发生率较低(Dogra GK，Herson H，Hutchison B，et al.Prevention of tunneled hemodialysis catheter-related infections usingcatheter-restricted filling with gentamicin and citrate：a randomized controlled study.J Am SocNephrol，2002，13(8)：2133～2139)。本研究中试验组不良反应发生率为1.93％，均为不同程度的口唇麻木症状，大部分患者可自行缓解，少部分患者补充钙剂后亦很快缓解，逐步减少封管液用量或减慢推注速度后均未再发生。无一例发生抽搐、心律失常等严重症状。电解质测定显示用药后血钠、血钙、CO₂CP等无明显改变。故47％枸橼酸钠溶液用于长期导管封管具有较佳的安全性，适合患者长期使用。

□结论

47％枸橼酸钠溶液对长期留置导管进行封管可提高导管通畅率，降低导管相关感染率，不良反应少，操作方便，适合长期使用。

实施例3、该封管用枸橼酸钠注射液临床应用2

研究应用30％枸橼酸钠注射液体外局部抗凝的安全可行性和效果，并与普通肝素抗凝对比观察。选择院内有高危出血危相的血液透析患者60例，随机分成两组，分别用30％枸橼酸钠注射液和肝素注射液行体外局部抗凝，进行对照试验。观察比较其血液净化效果和不良反应。结果，肝素抗凝组有出血或原有出血加剧现象发生；枸橼酸钠组均顺利完成治疗单元，未观察到出血或原有出血加剧征象。两组患者平均血流速、总超滤量、置换量和透析器寿命的差异均无显著性。枸橼酸钠组治疗结束后，血清钠、pH值高于对照组(P＜0.05)，但均在正常范围内；其余生化指标在治疗前后的差异无显著性。结论高浓度枸橼酸钠抗凝对于抢救高出血风险的危重患者具有很好的推广应用价值。

□试验目的

研究应用30％枸橼酸钠注射液体外局部抗凝的安全可行性和效果，并与肝素注射液作抗凝对比观察。

□一般资料及病例选择

在某医院肾内科选择有高危出血危相的血液透析患者62例，随机分成两组，分别用30％枸橼酸钠和普通肝素体外局部抗凝，进行对照试验。

62例患者中，男性36例，女性26例，平均年龄为48.6岁。病因：慢性肾小球肾炎20例，高血压4例，糖尿病4例，多囊肾4例，类风关2例，急进性肾炎并肺部感染、咯血性痰3例，肝移植术后3例，骨髓瘤化疗后全血细胞减少3例，急性淋巴细胞性白血病化疗后2例，肾综合征出血热2例，心肌梗死经皮腔内冠状动脉成形术后急性肾功能衰竭1例，腹主动脉瘤术后失血性休克1例，嗜铬细胞瘤术后脓胸1例，多发伤1例，其他3例。高危出血情况：内瘘术后10例，肾移植和肾切除术后8例，消化道出血7例，多脏器衰竭4例，脑出血3例，月经过多2例，慢性肾功能衰竭合并颅内出血7例，急性肾功能衰竭17例，其他手术后4例。□试验方法

1.给药方法和剂量

抗凝剂从Prisma床旁血滤机配套管路的抗凝管输入。

血液净化参数设置：血流量120～180ml/min，透析液流速1000～1500ml/h，置换液流速1500～2000ml/h。根据患者的病情、液体平衡情况来决定超滤率，变动范围较大(50～500ml/h)。CVVHDF治疗以72h为一个治疗单元。

试验组：采用30％枸橼酸钠注射液作抗凝剂，应用微量输液泵精确控制30％枸橼酸钠溶液的流速，根据血液流速、患者血红蛋白含量等因素进行调节，流速维持于20～30mmol/h。同时在患者外周静脉持续输入葡萄糖酸钙溶液，流速约为4mmol/h，并根据血钙浓度调节流速。

对照组：采用肝素注射液抗凝剂，使用机器原有的肝素泵，初始剂量为750～1500U，维持剂量为375～750U。

2.临床观察指标

(1)临床指标：监测患者血压、脉搏、呼吸及原有病情的变化、出血情况，记录透析参数。每12小时以生理盐水冲管路1次，注意血滤器有无凝血，对有轻微红细胞聚积者给予加强冲洗。

(2)凝血指标：测血滤器前与患者体内血标本的APTT值。枸橼酸钠组血滤器前APTT值控制在较正常基础值延长40％～180％，肝素抗凝组控制在较正常基础值延长40％～120％。根据抗凝的目标值调整抗凝剂的剂量。

(3)血生化指标：在CVVHDF治疗前及治疗中，每4小时测定1次患者的肾功能、血清电解质、动脉血气分析。根据血生化指标的情况，调节各种电解质、酸碱的补充速度。

□试验结果

60例患者治疗过程中生命体征平稳，未发生明显低血压、休克。肝素抗凝组在治疗中共有18例次发生出血或原有出血加剧，进一步减少肝素用量后，仍有10例出血症状无改善，予鱼精蛋白中和后退出肝素抗凝组，其中6例改用高浓度枸橼酸钠抗凝。

枸橼酸钠组均顺利完成治疗单元(包括6例小剂量肝素抗凝不能耐受而转行枸橼酸钠抗凝的患者)，治疗过程中未观察到出血或原有出血加剧征象。4例患者治疗3～4h时诉指尖、嘴唇麻木，测血钙偏低，予加快补钙速度后迅速缓解。

两组患者平均血流速、超滤量、置换量和透析器寿命的差异均无显著性(P＞0.05)，见表24。定期生理盐水冲洗管路过程中，可见枸橼酸钠组在血滤器的两端、压力壶等部位较易形成细片状的红细胞集聚，通过加强冲洗后可明显减轻红细胞集聚程度，对透析器的寿命和透析效率亦无明显影响。

两组患者透析过程中，血滤器前血标本APTT平均值分别为(42.1±2.5)和(45.8±2.4)S，体内血标本的APTT平均值分别为(42.4±4.3)和(31.5±3.3)S，正常对照为(31.0±1.5)S。两组患者透析前、后的血清生化指标比较见表25。

表24、两组CVVHDF参数和血滤器寿命比较

表25、两组血生化指标比较

与同组治疗前比较：^①P＜O.01，^②P＜O.05；与肝素抗凝组治疗后比较：^③P＜0.05

□讨论

本研究为高出血风险的危重患者行CVVHDF治疗中使用30％高浓度枸橼酸钠抗凝，并与边缘肝素化抗凝的患者进行比较，结果显示枸橼酸钠组患者在安全性方面占优势，体外抗凝效果理想且不增加体内出血的风险。肝素抗凝组中有发生出血或原有出血加剧现象，而枸橼酸钠组无一例发生出血，其中包括肝素抗凝出血退出治疗的患者。检测的客观凝血指标满意，血滤器前APTT值较基础值延长

45.4％，而体内APTT值无明显延长。透析器寿命、透析对毒素的清除效果也与肝素抗凝相似。

高浓度枸橼酸钠(30％)与低浓度枸橼酸钠(多为4％左右)相比，其优点为所需的抗凝剂容积较小，可减少大量抗凝剂输入带来的超滤压力，也适应商品化CRRT机较精细的抗凝剂管路。

CVVHDF治疗具有时间长、输入的枸橼酸钠总量大、理论上更容易出现相关并发症的特点。为避免长时间枸橼酸钠抗凝造成的高钠和代谢性碱中毒，使用低钠、低碳酸氢根的透析液和置换液，用大置换量血液透析滤过模式来加强交换、促进钠离子和碳酸氢根离子的清除。透析后枸橼酸钠组患者的血Na⁺、HCO^-、pH值水平均较肝素抗凝组高，但均控制在正常范围内。同时，大置换量血液透析滤过模式可清除外周血中细胞因子等炎症介质，也有利于改善危重患者的整体病情。治疗

中监测到部分患者血清钙出现下降趋势，通过加快外周血补钙的速率仍可将血钙控制在理想范围。

□结论

对高危出血患者应用高浓度枸橼酸钠在含钙透析液中行常规血液透析是可行和安全的，可替代肝素起到抗凝作用，同时又可以避免由肝素带来的不良反应，具有很好的临床推广及应用价值。

Claims (2)

1.筛选封管用枸橼酸钠注射液所使用的一种插管体外仿真血液流动模型，其特征在于，所述的该插管体外仿真血液流动模型是包括容器(1)、导管(2)、流量调节器(3)、水浴锅(4)、烧杯(5)、导管(6)、恒流泵(7)、夹子(8)、三通接头(9)和留置导管(10)，各部件按顺序连接；

其中所述的导管(2)选用橡胶管，通过恒流泵(7)的导管(6)选用硅胶管；容器(1)是塑料桶，应足够大，最小容量应满足夜间流量；烧杯(5)的容量应尽量大，以保证在液体从上一容器导入后能与其中已加热后的液体迅速混合后没有明显的温度变化；恒流泵应具有合适的流速范围，塑料桶的容量应适应恒流泵的最大流速16ml/min。

2.根据权利要求1所述的插管体外仿真血液流动模型，其特征在于，所述的塑料桶容量40L、橡胶管内径6mm、硅胶管内径6mm、烧杯容量1000ml，所述的留置导管(10)是指静脉留置导管A1.0ml V1.1ml。

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