CN101099536A - 包埋乳酸菌在动物饲料和抑菌促生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物应用技术领域，涉及一种包埋乳酸菌在动物饲料和抑菌促生产中的应用，在动物饲料中添加动物饲料重量百分比0.01-0.5％的包埋乳酸菌，经过包埋固定的乳酸菌存活率及耐热性远远高于未包埋的乳酸菌，延长了微生物的使用寿命，并能使其更有效地发挥作用，本发明在作为动物饲料添加剂及制备颗粒饲料中可广泛应用于猪、鸡、牛、羊等家禽家畜的饲养。
Description
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，涉及一种包埋乳酸菌的应用。
背景技术
目前养殖户和饲料生产者常在动物饲料中添加抗生素作为抑菌促生产剂，虽然提高了动物的生产性能，但由于抗生素具有残留性、抗药性、耐药性及对人类健康危害性的弊端，因而研发新的安全性抗生素替代品已势在必行。乳酸菌等有益微生物是自古以来就被人类作为食品微生物利用的一大类菌，广泛应用于发酵乳制品、水果、蔬菜、黑麦粉制成的面包和动物的饲料中。大量的研究证实，由乳酸菌等微生物产生的益生素在维持动物消化道微生物区系的平衡、抑制有害菌的生长、减少腹泻等消化道疾病的发生及促生产方面作用显著，但是乳酸菌为厌氧菌，培养增殖难度高、对外界抵抗力差，难以制备和长期保存，降低了其在动物体内的作用。目前在发酵、废水处理等领域采用固定化微生物技术来提高微生物稳定性，该方法可保持微生物的活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种存活率高、耐热性好的包埋乳酸菌在动物饲料和抑菌促生产中的应用。
本发明进一步的目的是提供一种提高乳酸菌存活能力的包埋方法。
本发明采用以下技术方案：
在动物饲料中添加动物饲料重量百分比0.01-0.5％的包埋乳酸菌。
包埋乳酸菌的制备方法包括包埋步骤，包埋过程中添加蔗糖保护剂，包埋步骤完成后设有冷冻干燥步骤。
以海藻酸钠为载体，制备包埋乳酸菌的具体步骤如下：将海藻酸钠溶液、蔗糖溶液及乳酸菌液混合均匀后，滴入CaCl2溶液中浸泡硬化处理成凝胶珠，凝胶珠无菌水冲洗后冷冻，冷冻好的凝胶珠真空冷冻干燥，待样品呈白色疏松状态取出。
以聚乙烯醇(PVA)为载体，制备包埋乳酸菌的具体步骤如下：PVA加热溶解制成PVA溶液，将乳酸菌液、PVA溶液、海藻酸钠溶液、蔗糖溶液混合均匀后滴入饱和硼酸及CaCl2的混合溶液中，硬化成凝胶珠，用无菌水冲洗后冷冻，冷冻好的聚乙烯醇凝胶珠真空冷冻干燥，待样品呈白色疏松状态取出。
本发明分别以海藻酸钠和聚乙烯醇为载体，对乳酸菌进行包埋固定，包埋法的原理是通过聚合作用或者离子网络形成，或通过沉淀作用，或改变溶剂、温度、pH值将微生物截流在凝胶聚合物孔隙的网络空间中，载体材料聚乙烯醇(polyvinyl alcohol简称PVA)的突出优点是抗微生物分解性能好，机械强度高，化学稳定性能好。聚乙烯醇是一种新型的微生物包埋固定化载体，它具有机械强度高，化学稳定性好，抗微生物分解性能强，对微生物无毒，价格低廉等一系列优点，是一种具有实用潜力的包埋材料。在包埋时形成的凝胶小球有一个均匀的球壳，其结构为外密内疏，内部呈蜂窝状结构对乳酸菌形成很好的保护。经过包埋固定的乳酸菌在冻干后的存活率及耐热性大于未包埋的乳酸菌，把包埋工艺和冷冻干燥工艺偶联在一起，既简化了程序又提高了微生物的存活力，在包埋工艺中添加了蔗糖作为保护剂，可有效提高包埋保护效果，包埋固定可以延长微生物的使用寿命及使其更有效地发挥作用，并且聚乙烯醇的耐热性明显好于用海藻酸钠包埋的乳酸菌，在动物饲料中添加包埋的乳酸菌对于抑制病源性微生物的侵害、降低死亡率和消化道疾病的发生率、提高日采食量等方面具有明显的作用。包埋的乳酸菌的高耐热性，在其作为动物饲料添加剂及制备颗粒饲料中可广泛应用于猪、鸡、牛、羊等家禽家畜的饲养。
具体实施方式
实施例1，包埋乳杆菌的制备：
分别选用海藻酸钠和聚乙烯醇作包埋剂，具体步骤如下：
(一)乳酸菌的培养
将0.1ml乳酸菌(干酪乳杆菌)接种于5ml去氧MRS培养基中，置于37℃恒温箱中培养18h。培养完毕，得到的菌浓度为1.072×108个/ml。
MRS厌氧培养基：胰蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、酵母浸出物5g/l、葡萄糖20g/l、吐温(80)1ml/l、K2HPO2g/l、乙酸钠5g/l、柠檬酸三铵2g/l、MgSO40.2g/l、MnSO40.05g/l，在120℃下高压灭菌20min。
(二)海藻酸钠固定化小球的制备
1、包埋材料
海藻酸钠，1％CaCl2，无菌水，50％蔗糖溶液
2、实验方法
首先，用电子天平准确称取5g海藻酸钠，加入到100ml的蒸馏水中，配成5％的溶液，然后取其10ml与10ml 50％蔗糖溶液，与3ml的乳酸菌液混合均匀。将混合液用中号移液枪头滴入1％CaCl2溶液中，并浸泡5min，进行硬化处理。捞出凝胶珠，用无菌水冲洗三次，洗去凝胶珠表面的CaCl2。最后，将凝胶珠装入小瓶中，封口，置于-20℃的冰箱内，进行冷冻，供冻干使用。
(三)聚乙烯醇固定化小球的制备
1、包埋材料
聚乙烯醇PVA(平均聚合度1750-50)，5％海藻酸钠溶液，饱和硼酸溶液，1％CaCl2溶液，50％蔗糖溶液。
2、实验方法
首先，准确称取10g PVA，加入50ml蒸馏水中，在88℃水浴锅内溶解，制成20％的PVA溶液。然后，将饱和硼酸与1％CaCl2以3∶2(体积比)配成混合溶液。将3ml乳酸菌液，20％PVA溶液10ml，5％海藻酸钠溶液10ml，50％蔗糖溶液5ml混合均匀。将上述混合物用中号移液枪滴入饱和硼酸及CaCl2的混合溶液中。静置一段时间后，取出凝胶珠，用无菌水冲洗。将凝胶珠装入小瓶中，封口，置于-20℃的冰箱内，进行冷冻，供冻干使用。
(四)无包埋菌种冷冻
取乳酸菌0.3ml，无菌水1ml，50％蔗糖溶液1ml混合均匀，放入-20℃的冰箱内冷冻，供冻干使用。
(五)凝胶珠与无包埋菌种的冷冻干燥
将装有冷冻好的海藻酸钠与聚乙烯醇凝胶珠和无包埋菌种的小瓶放入真空冷冻干燥器中，迅速抽真空，并冷冻干燥，约24h，待样品呈白色疏松状态方可取出。
(六)结果检测：
1、检测冻干后样品的存活率
在无菌条件下，分别取三种样品0.0104±0.0003g，接种于装有5ml的MRS培养基厌氧试管(A1，A2，A3)中，置于37℃恒温箱中培养24h。将培养好的样品分别取0.1ml再分别接种于另外三支装有5ml的MRS培养液的厌氧试管(B1，B2，B3)中，培养20h后，用平板计数法测定活菌数。其具体操作如下：取样品10μl→加入到5ml生理盐水中→再从中取200μl，接种于MRS琼脂厌氧管内(每种样品做三份)，置于37℃恒温箱中培养24h，培养完毕计数。计算方法为：设厌氧管内的菌落数为C(个)，则原样品(B1，B2，B3)中菌液浓度为W(个/ml)：W＝C·1×500/0.2，所得实验数据如下：
表1不同载体冻干后的活菌数(105个/ml)(n＝3)
注：A、B表示差异极显著P＜0.01，a、b表示差异显著0.01＜P＜0.05
由表1可知，聚乙烯醇与无包埋的差异比较显著(0.01＜P＜0.05)，而海藻酸钠与聚乙烯醇和无包埋的差异极显著(P＜0.01)。以上结果表明，在冻干之初，海藻酸钠包埋的菌的存活率最高，而无包埋的存活率最低。
2、保存不同时间后样品的光密度值
上述步骤中A1，A2，A3试管在37℃恒温箱中培养24h后，分别取1ml，加入到10ml生理盐水中，测其光密度值。在冻干保存第7天和第14天，重复以上步骤。冻干后第一个星期，海藻酸钠包埋的菌的存活率比较高，随着时间的推移，菌的存活率都有所降低，在冻干后9天左右，聚乙烯醇的OD值比海藻酸钠的OD值反而高一些，也就是说，聚乙烯醇的保护效果更持久一些。
从电镜扫描照片对固定化小球内部结构的观察，海藻酸钠与PVA两种固定化材料都具有网状的孔隙结构，而且PVA的孔隙要比海藻酸钠的大一些。相比之下，PVA有内部有更好的蜂窝状结构，海藻酸钠材料在脱水处理后期有皲裂现象，这也说明，PVA有着比海藻酸钠更好的机械强度。
3、保存不同时间后乳酸菌的耐热性状况
将冻干后的三种样品于保存后7天取适量，分别置于80℃和100℃的恒温箱里热处理30min和1h。取出后，接种于MRS培养基中，在37℃下培养，观察是否有乳酸菌生长。在保存后14天和21天时重复以上步骤。其结果如下：
表2保存不同天数后，在85℃下乳酸菌的存活状况
| 7天 | 14天 | 21天 | ||||
| 30min | 1h | 30min | 1h | 30min | 1h | |
| 聚乙烯醇海藻酸钠无包埋 | 存活存活存活 | 存活存活存活 | 存活存活存活 | 存活存活--- | 存活存活--- | 存活存活--- |
表3在保存不同天数后，在100℃下乳酸菌的存活状况
| 7天 | 14天 | 21天 | ||||
| 30min | 1h | 30min | 1h | 30min | 1h | |
| 聚乙烯醇海藻酸钠无包埋 | 存活存活--- | 存活存活--- | 存活存活--- | 存活------ | 存活------ | 存活------ |
乳酸菌在细菌中属于高温菌，乳酪杆菌的温度范围为25℃～45℃。表2和表3显示，经过包埋剂包埋的菌和只添加了保护剂的菌的热稳定性都有所增强。相比之下，以聚乙烯醇包埋的菌在冷冻干燥21天后，在100℃下处理1h后仍有菌存活。以海藻酸钠包埋的乳酸菌在14天后，在100℃下处理30min后仍能存活，保存21天后，只能在85℃下存活。而添加了蔗糖保护剂的无包埋菌最多只能在保存14天后，85℃处理30min的环境下存活。实验表明，以聚乙烯醇包埋的乳酸菌耐热性强，在高温环境中保持较高的生物活性。
这主要是因为聚乙烯醇本身的耐热性非常好，当它加热至130-140℃时，性质几乎不变。它在包埋时形成的凝胶小球有一个均匀的球壳，其结构为外密内疏，内部呈蜂窝状结构对乳酸菌形成很好的保护。海藻酸钠凝胶小球的表面有层极薄的球壳，小球内部也呈多孔结构。虽然两者的结构相似，但是从微细结构来看，聚乙烯醇的球壳较厚。因此用聚乙烯醇包埋后的乳酸菌小球的耐热性更好一些。
用海藻酸钠包埋的乳酸菌，在冻干初期，其菌的存活率比用聚乙烯醇包埋的高，而在9天左右，其菌的存活率大大降低。这主要是因为海藻酸钠材料在脱水处理之后有皲裂现象，从中可以得出一个结论，聚乙烯醇的机械强度好于海藻酸钠。
在耐热性实验中，聚乙烯醇的耐热性也明显好于用海藻酸钠包埋的菌，这一点在益生菌作为动物饲料添加剂及制备颗粒饲料中具有特别重要的意义。
实施例2，饲养试验选用24只产蛋高峰后期的矮小型固始蛋鸡，随机地分为3组，每组8只鸡，每只鸡单笼单槽饲养，自由采食自由饮水。对照组饲喂普通蛋鸡饲料(加无菌培养液和稀释剂平衡)，试验I组在对照组的日粮中添加乳酸菌鲜样(加稀释剂平衡)，试验II组在对照组的日粮中添加0.1％包埋乳酸菌(加无菌培养液平衡)，试验期为34天。结果表明，两个试验组鸡的腹泻率比对照组下降了8.5-23.4％，产蛋率和蛋重分别比对照组提高了2.0-6.7％及4.7-7.8％，结果见表1。
在饲养试验的末期，对所有参试鸡进行鸡志贺氏大肠杆菌攻毒保护实验。结果表明，对照组鸡的死亡率为37.5％，抗生素组的死亡率12.5％，而两个试验组无一只鸡死亡。在攻毒实验期间添加有包埋乳酸菌组鸡的产蛋率和蛋重分别比对照组提高了40.0％和13.7％；同时也使鸡小肠、大肠和盲肠中乳酸菌的数量提高了4000、24和1400倍，结果见表2和表3。
对照组鸡在攻毒实验期间的日采食量比饲养试验期间下降了46.5％，而试验组鸡仅下降了26.9％。这充分说明了添加新鲜或包埋的乳酸菌对于抑制病源性微生物的侵害、提高日采食量和促进产蛋性能方面具有明显的作用。同时研究还证实，无论是在饲养试验或攻毒实验期间，尤以包埋乳酸菌对产蛋率的提高最明显，结果见表2。
为了观察包埋乳酸菌是否可以替代抗生素来抑制病源性微生物的侵害，在攻毒期间，另选8只蛋鸡，特设一个添加土霉素组(0.01％)，结果表明包埋乳酸菌在抑制病源性微生物的侵害和减少死亡率方面要优于土霉素组。
表1蛋鸡生产性能表(34天)
| 平均蛋重(克) | 平均产蛋率 | 日采食量(克) | 平均腹泻率 | |
| 对照组 | 47.13 | 38.24％ | 72.41 | 39.17％ |
| 鲜样组 | 50.80 | 38.97％ | 74.65 | 30.00％ |
| 包埋组 | 49.34 | 40.81％ | 76.29 | 35.83％ |
表2攻毒期间的蛋鸡生产性能(3天)
| 蛋重(克) | 平均产蛋率 | 日采食量(克) | 死亡率 | 腹泻率 | |
| 对照组 | 45.08 | 20.83％ | 38.73 | 37.50％ | 75.56％ |
| 抗生素 | 51.34 | 22.78％ | 55.98 | 12.5％ | 52.22％ |
| 鲜样组 | 54.07 | 16.67％ | 56.01 | 0％ | 54.17％ |
| 包埋组 | 51.26 | 29.17％ | 55.75 | 0％ | 54.50％ |
表3攻毒处理后蛋鸡消化道各段乳酸菌的生长情况(个/克内容物)
| 肌胃 | 小肠 | 大肠 | 盲肠 | |
| 对照组 | 3.24×103 | 2.89×105 | 5.09×108 | 1.75×105 |
| 抗生素 | 5.44×106 | 1.78×107 | 7.78×107 | 1.18×108 |
| 鲜样组 | 9.54×105 | 1.16×109 | 2.67×108 | 2.42×108 |
| 包埋组 | 2.22×107 | 8.15×109 | 1.22×1010 | 5.78×107 |
实施例3，饲养试验选用24只产蛋高峰后期的矮小型固始蛋鸡，除试验II组在对照组的日粮中添加0.01％包埋乳酸菌，其分组情况和实验条件和实施例2相同。
结果表明，两个试验组鸡的腹泻率比对照组下降了8-21％，产蛋率和蛋重分别比对照组提高了3-6％及4-7％。在饲养试验的末期，对所有参试鸡进行鸡志贺氏大肠杆菌攻毒保护实验，对照组鸡的死亡率为31％，而两个试验组无一只鸡死亡。在攻毒实验期间添加有包埋乳酸菌组鸡的产蛋率和蛋重分别比对照组提高了35％和11％；同时也使鸡小肠、大肠和盲肠中乳酸菌的数量提高了2100、19和800倍。对照组鸡在攻毒实验期间的日采食量比饲养试验期间下降了41％，而试验组鸡仅下降了25％。这充分说明了添加新鲜或包埋的乳酸菌对于抑制病源性微生物的侵害、提高日采食量和促进产蛋性能方面具有明显的作用。同时研究还证实，无论是在饲养试验或攻毒实验期间，尤以包埋乳酸菌对产蛋率的提高最明显。
实施例4，饲养试验选用21只产蛋高峰后期的矮小型固始蛋鸡，除试验II组在对照组的日粮中添加0.5％包埋乳酸菌，其分组情况和实验条件和实施例2相同。
结果表明，两个试验组鸡的腹泻率比对照组下降了25-38％，产蛋率和蛋重分别比对照组提高了5-9％及7-10％。在饲养试验的末期，对所有参试鸡进行鸡志贺氏大肠杆菌攻毒保护实验，对照组鸡的死亡率为36％，而两个试验组无一只鸡死亡。在攻毒实验期间添加有包埋乳酸菌组鸡的产蛋率和蛋重分别比对照组提高了42％和15％；同时也使鸡小肠、大肠和盲肠中乳酸菌的数量提高了5000、30和1900倍。对照组鸡在攻毒实验期间的日采食量比饲养试验期间下降了43％，而试验组鸡仅下降了22％。这充分说明了添加新鲜或包埋的乳酸菌对于抑制病源性微生物的侵害、提高日采食量和促进产蛋性能方面具有明显的作用。同时研究还证实，无论是在饲养试验或攻毒实验期间，尤以包埋乳酸菌对产蛋率的提高最明显。
实施例5，饲养试验选用刚断奶仔猪21头，随机地分为3组，每组7头猪，每头猪单独饲养，自由采食自由饮水。对照组饲喂普通饲料，包埋组在对照组的日粮中添加0.1％包埋乳酸菌，鲜样组在对照组的日粮中添加0.1％液体培养的乳酸菌(100ml/吨)。试验期为45天，试验期间对照组死亡1头，死亡率为14％，而两个试验组无1头死亡。结果为下表：
| 样本 | 消化道疾病发生数量 | 平均日增重(克) | 饲料效率 |
| 包埋组 | 18头次 | 494 | 1.77 |
| 鲜样组 | 21头次 | 485 | 1.82 |
| 对照组 | 112头次 | 450 | 2.02 |
| 包埋与对照组比 | 83％ | 9.8％ | 12％ |
从上表可知，仔猪的消化道疾病的发病率降低83％，日增重提高9.8％，饲料效率提高约12％。
实施例6，饲养试验选用中大猪20头，随机地分为2组，每组10头猪，每头猪单独饲养，自由采食自由饮水。对照组饲喂普通饲料，试验组在对照组的日粮中添加0.01％包埋乳酸菌，试验期为60天。结果为下表：
| 样本 | 消化道疾病发生数量 | 平均日增重(克) | 饲料效率 |
| 包埋组 | 10头次 | 673 | 2.94 |
| 对照组 | 94头次 | 621 | 3.30 |
| 变化幅度 | 90％ | 8.5％ | 11％ |
从上表可知，中猪的消化道疾病的发病率降低90％，日增重提高8.5％，饲料效率提高11％。
Claims (5)
1、包埋乳酸菌在动物饲料和抑菌促生产中的应用。
2、如权利要求1所述的包埋乳酸菌在动物饲料和抑菌促生产中的应用，其特征在于，在动物饲料中添加动物饲料重量百分比0.01-0.5％的包埋乳酸菌。
3、如权利要求1或2所述的包埋乳酸菌在动物饲料和抑菌促生产中的应用，包埋乳酸菌的制备包括包埋步骤，其特征在于，包埋过程中添加蔗糖保护剂，包埋步骤完成后设有冷冻干燥步骤。
4、如权利要求3所述包埋乳酸菌在动物饲料和抑菌促生产中的应用，其特征在于，以海藻酸钠为载体，包埋乳酸菌的制备步骤如下：将海藻酸钠溶液、蔗糖溶液及乳酸菌液混合均匀后，滴入CaCl2溶液中浸泡硬化处理成凝胶珠，凝胶珠无菌水冲洗后冷冻，冷冻好的凝胶珠真空冷冻干燥，待样品呈白色疏松状态取出。
5、如权利要求3所述包埋乳酸菌在动物饲料和抑菌促生产中的应用，其特征在于，以聚乙烯醇(PVA)为载体，包埋乳酸菌的制备步骤如下：PVA加热溶解制成PVA溶液，将乳酸菌液、PVA溶液、海藻酸钠溶液、蔗糖溶液混合均匀后滴入饱和硼酸及CaCl2的混合溶液中，硬化成凝胶珠，用无菌水冲洗后冷冻，冷冻好的聚乙烯醇凝胶珠真空冷冻干燥，待样品呈白色疏松状态取出。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080109 |