CN101096706A - 检测apec、upec毒力基因表达水平的dna芯片及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片及其构建方法，属于人兽共患病技术领域，先扩增大肠杆菌已知的毒力基因和部分耐药基因的97个基因片段、用SSH方法获得的APEC特异性基因的44个基因片段、用SCOTS方法获得的APEC特异性基因的13个基因片段；再以重组质粒为模板，将各基因片段回收并纯化；然后，用SmartArrayTM microarrayer点样于化学修饰的载玻片上，同时设置阳性对照和阴性对照，构建154个靶基因探针的DNA芯片，用于检测APEC、UPEC毒力基因表达水平。
Description
技术领域
本发明涉及禽致病性大肠杆菌、人尿道致病性大肠杆菌毒力基因表达芯片的研究，属于人兽共患病技术领域。
背景技术
禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病，包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(Hjarre氏病)、气囊病(慢性呼吸道病，CRD)、禽蜂窝织炎、肿头综合症、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及脐炎/卵黄囊感染。禽大肠杆菌病是2至12周龄鸡和火鸡的一种常见传染病，给养禽业造成了严重的经济损失。APEC感染相关的毒力因子已被相继报道，但是其发病机理尚未完全清楚。
APEC和人尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli，UPEC)均能引起肠道外感染，可能与它们的毒力特性有关，如黏附素，铁获得系统，毒素，保护素和侵袭素等，这些毒力特性使它们能够在宿主环境中生存进而产生疾病。很多研究证明，APEC和UPEC的毒力因子之间存在着一定的相似性。但APEC的毒力基因是否人类UPEC毒力基因来源，或反过来，人类UPEC毒力基因是否APEC毒力基因的来源，更是我们关注的问题。了解APEC、UPEC这些毒力基因在相同条件下的表达情况可为APEC、UPEC是否互为对方毒力基因贮库这一问题提供依据。
基因芯片技术是近年来发展起来并逐渐完善的一种微型化、集成化、平行化和高通量的基因分析新技术。基因芯片技术的应用已不局限于最初的DNA序列测定，现已在基因表达分析、基因突变及多态性分析、药物及毒物基因组学等多个领域显示出重大的理论意义和实际应用价值，具有广阔的前景。自Stanford大学的Schena M等首次发表了用DNA微阵列研究基因表达的论文后，基因芯片正越来越多地应用于基因表达的研究。
发明内容
本发明的目的在于发明一种可同时对APEC、UPEC毒力基因表达水平实行检测的DNA芯片。
本发明是主要由154个靶基因探针组成的DNA芯片。其中97个基因片段扩增自大肠杆菌已知的毒力基因和部分耐药基因，44个基因片段扩增自用SSH方法获得的APEC特异性基因，13个基因片段扩增自用SCOTS方法获得的APEC特异性基因。
本发明应用APEC、UPEC已知的毒力基因、耐药基因及通过SSH、SCOTS方法获得的APEC特异的潜在毒力基因作为探针，构建APEC、UPEC毒力基因表达芯片。通过对APEC E058株和UPEC HEC4株体内、外毒力因子表达水平的检测结果表明，该基因芯片具有高通量、微型化、集成化和平行化的优点。本发明之基因芯片可对APEC、UPEC在体内、外培养条件下的毒力基因的表达水平进行检测。
本发明所述97个基因片段是：fimC、fimH、tsh、iroN、irp2、fvuA、kpsM、csgA、papC、felA、facA、cvaC、iss、iucCD、vat、bmaE、hlyE、cnf1、chuA、hlyA、iutA、sitA、kfiB、papGII、papGIII、ireA、focG、malX、afaBC、sfaDE、gyrB、recA、mdh、uspA、sepL、fepC、rtx、ehxA、espP、flic、iha、tir、eae、ler、stx1、stx2、rfbE、paa、katP、neuC、etpD、toxB、tagA、cesT、pas、espA、cdtA、east、bfpA、cif、efaI、sheA、perA、espB、ompA、faeG、fanC、fasA、f41、f17a-A、lt、sta、stb、stx2eB、tetA、tetB、tetG、blaTEM-1、carb2、addA1、sulI、sulII、addA2、strA-B、qac、int-I、cat I、floR、aac(3)-IV、dfr-12、aph(3)-Ia、cmlA、uidA、fhuA、yiaA、feoB、16srDNA。
所述44个基因片段是：ecs-1、ecs-6、ecs-7、ecs-8、ecs-9、ecs-10、ecs-11、ecs-12、ecs-13、ecs-l4、ecs-l5、ecs-16、ecs-17、aes-1、aes-2、aes-3、aes-4、aes-5、aes-6、aes-7、aes-8、aes-9、aes-10、aes-11、aes-12、aes-13、aes-l4、aes-15、aes-16、aes-17、aes-18、aes-19、aes-20、aes-21、aes-22、aes-23、aes-24、aes-25、aes-27、aes-28、aes-29、aes-30、aes-31、aes-32。
所述13个基因片段是：aec-8、aec-11、aec-13、aec-14、aec-18、aec-2O、aec-24、aec-25、aec-26、aec-27、aec-29、aec-3O、aec-31。
本发明的第二个目的在于发明一种上述基因芯片的构建方法：
先通过PCR方法分别扩增大肠杆菌已知的毒力基因和部分耐药基因的97个基因片段、用SSH方法获得的APEC特异性基因的44个基因片段、用SCOTS方法获得的APEC特异性基因的13个基因片段；再以重组质粒为模板，将各基因片段回收并纯化；然后，用SmartArrayTM microarrayer点样于化学修饰的载玻片上，同时设置阳性对照和阴性对照，构建成检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片。
扩增所述97个基因片fimC、fimH、tsh、iroN、irp2、fvuA、kpsM、csgA、papC、felA、facA、cvaC、iss、iucCD、vat、bmaE、hlyE、cnf1、chuA、hlyA、iutA、sitA、KfiB、papGII、papGIII、ireA、focG、malX、afaBC、sfaDE、gyrB、recA、mdh、uspA、sepL、fepC、rtx、ehxA、espR、flic、iha、tir、eae、ler、stx1、stx2、rfbE、paa、katP、neuC、etpD、toxB、tagA、cesT、pas、espA、cdtA、east、bfpA、cif、efaI、sheA、perA、espB、ompA、faeG、fanC、fasA、f41、f17a-A、lt、sta、stb、stx2eB、tetA、tetB、tetG、blaTEM-1、carb2、addA1、sulI、sulII、addA2、strA-B、qac、int-I、cat I、floR、aac(3)-IV、dfr-l2、aph(3)-Ia、cmlA、uidA、fhuA、yjaA、feoB、16srDNA的引物分别是：
fimC：CGTCAATGTAAGGAAATCGCAGG
和GGCATTCAACTCTGTTACCGTC；
fimH：ATGAAACGAGTTATTACCCTGTTTG
和TTATTGATAAACAAAAGTCACGCC；
tsh：TTATTCTCTTCGCTACAG和GATGACAGGCTACCGACAG；
iroN：TCCTGGTTGGGTTGAATA和CAGCCAGAGGCCCACTA；
irp2：AAGGATTCGCTGTTACCGGA和TCGGCCAGGATGATTCGTCG；
fyuA：ACACGGCTTTATCCTCTGGC和GGCATATTGACGATTAACGAA；
kpsM：GCGCATTTGCTGATACTGTTG
和CATCCAGACGATAAGCATGAGCA；
csgA：ACTCTGACTTGACTATTACC和AGATGCAGTCTGGTCAAC；
papC：GACGGCTGTACTGCAGGGTGTGGCG
和ATATCCTTTCTGCAGGGATGC AATA；
felA：GGCAGTGGTGTCTTTTGGTG
和GGCCCAGTAAAAGATAATTGAACC；
facA：ATGAAGTTA AAATTCATCTCC和CTGGTACTGAACTTTAAAGG；
cvaC：CACACACAA ACGGGAGCTGTT
和CTTCCCGCAGCA TAGTTC CAT；
iss：GTGGCGAAA ACTAGTAAA ACAGC和CGCCTCGGGTGGATAA；
iucCD：ATCCATGATTTGCAGACGG和ATGACAATCCGGTACCAGCA；
vat：TCGCTTACCCTGACTATCC和CCTTACCAGACATACCGC；
bmaE：GCTATCGCAAGCAGTGTC和CAATGTCTGGTCTCCGAAG；
hlyE：ACTCTCAATCGGCATCCAC和CTTCAACAACCCCAGCAG；
cnf1：ACGCAGTTTCAGTGATGGTG和TCATAGTAGATGCCGCTCAG；
chuA：GAACCAACGGTCAGGATG和ATGGATTCGTCATTCGGC；
hlyA：TTGTCAGGACGGCAGATG和CGTTCAGGTGCTTTGTATTG；
iutA：ACAGCCGACAACTGGACTC和GTAATCGTCGTCGCCCTG；
sitA：ACAACTTTTACCATCATCGC和GTTCCGCAATCTGCTTAC；
kfiB：GAGGGATTTAGAATACGAGAC和GCATTATGGGAGGTAGTCG；
papGII：CCTTGTGTGTGTCTGGTGAG和TCAGTCAGACGGGTTGTTTC；
papGIII：TGTCAGGCTGTAATGATGCTC
和CTGTCCAGATGTGTTTGCTTC；
ireA：ATTACACGCTGATTCTGGTC和CTTCTGGCTTTCAGTCGG；
focG：AGCACAGGCAGTGGATACG和TAATACTTCCCGCACCAGC；
malX：GCTGGCGACTAATAACCC和TATCCCATTGCTCTGCTAAG；
afaBC：GCTGGGCAGCAAACTGATAATTCTC
和CATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCG；
sfaDE：CTCCGGAGAACTGGGTGCATCTTAC
和CGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCA；
gyrB：CACCATTCACGCCGATAAC和CCACTTCGACGCCAATACC；
recA：AAAACCACGCTGACGCTG和AAGTTGATACCTTCGCCG；
mdh：GGAGTTTAGGATGAAAGTCGC和GCCCATAGACAGGGTTGC；
uspA：GCGTTGGCATCTGCTTTG和GCCGTTATTGGATACCGAC；
sepL：TAATCAAAACACCGCATCTG和ACTCCCAATCATCTTCGCC；
fepC：ATGGCGAGCACATTCAAC和ACAACTCCAGCAAATCAATC；
rtx：GGTCACCGTTACCTTTGGC和GGTTACCCGCTTTATCGC；
ehxA：TTGCTGAGAAAACAACGGG和CCAACATTTCCAAGAACCTG；
espP：TAGTGAAGAAAGATGGCTCC和GTCATCAATGTGAACGAAAG；
flic：ATCGGTGGAAGCCAGGCATACG
和GCAGCATCACTGGATTCACCCG；
iha：TAACCACTCTGGCTTCCGTAG和CTGACAGAATCATCCACAAGG；
tir：GCACCTCCATTACCTTCAC和CAACGGTGACCATAGCAT；
eae：TAACGGCTATTTCCGCATGA和TCCCAGACGATACGATCCAG；
ler：CGCACACAACAAGCCCATAC和GATGAGTTCCGGCGAGCAA；
stx1：GCAGTTGATGTCAGAGGGATA
和CTACTCAACCTTCCCCAGTTCATG；
stx2：TATCTCAGGGGACCACATCGG
和ACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT；
rfbE：CTACAGGTGAAGGTGGAATGG和ATTCCTCTCTTTCCTCTGCGG；
paa：GGTCCTGGTGGCCCGCATAC和GTCTGGTCAGGTCGTCAATAC；
katP：GTCGCTGAAAGAGCAGGTTA
和TACTCCATCGTGTTGACATATCC；
neuC：TGCTAAGAGAAACTCCAGAA和GATCATTAACCGACTGCGTG；
etpD：GGGACTGGTGATGAGGTTG和CCACTAAATCCTTCGCCTTC；
toxB：GGCAAAATACACCTTCCTC和CATTAGGGGCGATGTTTAC；
tagA：TGAGAGATGGAGAACACCG和GAATAGAACTCCCGCTGG；
cesT：GCTTTTATTAGATAGATTTGC和ATGTTATTCCCTGATTATG；
pas：GCGGGAGATGTTGATACC和GATGTCTTAACGGAATACGG；
espA：ATGTGAGTGCGAGTTCTTC和TATTCACTACCGTTGTCAGG；
cdtA：CTCAAGTAGAGGGAGGACC和TCTGGCTTAACAATAGTGGC；
east：ATCCTCATCGCCTGTGTG和CGAGTGACGGCTTTGTAG；
bfpA：CGTTACCGCAGGTGTGATG和CAGCAGGAGTAATAGCAGTCG；
cif：ATAGGGCGAGAGAAAGGC和GGTGTCATACTCAAACAACTGG；
efaI：GATGGAACTATCCTGCCG和CATAGGTGATAACGACGAAG；
sheA：GCAGATAAAACGGTAGAAG和CCCGCAGCAATAGAATAG；
perA：CACCGAATACACAATAGAATCC
和CATTGAACTACTGACATCGCC；
espB：TAACAGTGCTACGAAAGGCG和GCTCTGCGAACTTCTTGC；
ompA：GACTGGTTAGGTCGTATGCC和AACAACAGACTGAGCACGG；
faeG：CCTGGATGACTGGT和CGTAGCAATAACTTATTAC；
fanC：AATACAGGTACATTAACTTCAATG
和ATCCTTCTTAGTCACTTATATG；
fasA：GCGCCCGCTGAAAACAA和CGGTGTACCTGCTGAACGAA；
f41：GCTGATTGGACGGAAGGT和TTAACTATAAATAACGGTGATAGTC；
f17a-A：GCTACGCTTGCTTATGAC和CGTGTTCGCATTAGGTTC；
lt：TGGATTCATCATGCACCACAAGG
和CCATTTCTCTTTTGCCTGCCATC；
sta：TCTTTCCCCTCTTTTAGTCAG和ACAGGCAGGATTACAACAAAG；
stb：TGCCTATGCATCTACACAATC和GCAGTGAGAAATGGACAATG；
stx2eB：GCGGATTGTGCTAA和AGTTAAACTTCACCTGG；
tetA：CACTATGGC ATTCTGCTGGC和CATAGATCGCCGTGAAGAGG；
tetB：GCCCAGTGC TGT TGT TGTC和AAGACCAAGACCCGCTAATG；
tetG：CGGTCTTATGGGTGCTCTAT和CCTTGCTTGTTACTGCTGAC；
blaTEM-1：CAGCGG TAAGATCCTTGAGA
和ACTCCCCGTCGTGTAGATAA；
carb2：GGTGTTTCCGTTCTTGATAC和TATTGCCTTAGGAGTTGTCG；
addA1：TATCAGAGGTAGTTGGCGTCAT
和GTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATT；
sulI：GTGACGGTGTTCGGCATTCTG和TCTAACCCTCGGTCTCTGGC；
sulII：CAT TTTCGGCATCGTCAAC和AGT TTGGCAGAT GAT TTCGC；
addA2：TGTTGGTTACTGTGGCCGTA和GATCTCGCCTTTCACAAAGC；
strA-B：AACGCCTTGCCTTCTATCTGC和CCAAAGCCCACTTCACCGAC；
qac：CTTCCGCCGTTGTCATAA和GCAGCGACTTCCACGATG；
int-I：CGAATGTCGTAACCGCTG和CCTTGATGTTACCCGAGAG；
catI：GTATGGCAATGA AAGACGG和TCAGCACCT TGTCGCCTT；
floR：TATGGTGATGCTCGGCGT和TTCGTGCCACCTGAAACC；
aac(3)-IV：GTCTCTGACACATTCTGGCG和ATGACCGACTGGACCTTC；
dfr-12：GAATCGGTCCGCATTTATC和ATTGGGAAGAAGGCGTCAC；
aph(3)-Ia：AGCGTCTCCGACCTGATG和GTATTGACCGATTCCTTGC；
cmlA：CTCTTGTTTGGACCGCTATC和ACAACCAGAAGTTCAGGCAC；
uidA：GTCACGCCGTATGTTATTGC和AACTGTTCGCCCTTCACTG；
fhuA：CCGAACCGCTGAAAGAAG和CAGACGCCGTAACCATAAAC；
yjaA：AGACGCTGCCTTCAGTAAC和GACGCTCTGAGGTGGACG；
feoB：GTGTAGGTAACTGGGCTGG和AGTGAATCTGCTTCGTTGAG；
16srDNA：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
和AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。
本发明用已知的APEC、UPEC毒力基因、耐药基因以及用SSH(suppressionsubtractive hybridization)和SCOTS(selective capture of transcribed sequences)方法筛选出来的APEC特异的片段为探针，构建了禽致病性大肠杆菌、人尿道致病性大肠杆菌的毒力基因表达芯片，通过芯片上设置的阳性对照和阴性对照控制芯片的质量，建立了研究禽致病性大肠杆菌、人尿道致病性大肠杆菌的毒力基因和耐药基因表达差异的DNA芯片。
附图说明
图1为芯片点阵的矩阵排布；
图2为E058株在鸡体内及LB培养条件下的芯片扫描图；
图3为尿液静置培养条件下HEC4/E058芯片扫描图。
具体实施方式
一、禽致病性大肠杆菌、人尿道致病性大肠杆菌毒力基因表达芯片的构建：
1、靶基因及引物设计：
分别对GenBank中收录的APEC、UPEC和部分其他大肠杆菌的毒力基因以及耐药基因的序列进行多重对位排列分析，选定各毒力基因的保守区域，用Primer Premier 5.0引物设计软件设计各靶基因的引物，引物Tm值控制在55±5℃左右，靶基因片段大小在200-900bp之间，引物设计结果见表1，引物由上海生工生物工程公司合成。部分基因克隆来自于通过SSH和SCOTS方法获得的APEC特异性克隆。其中禽致病性大肠杆菌各分离株、猪源大肠杆菌TB1、C83907、107/86猪源大肠杆菌Fc株、大肠杆菌933W、人源大肠杆菌各分离株、沙门氏菌S0503、S339、S10150、S09256、S213、S5216、41/06、S5213、S5413、S9305、S5301模板、大肠杆菌DH5α均可由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室购买；菌株复苏和培养在LB液体或固体培养基37℃培养过夜。克隆载体为pGEM-T easy Vector、PCR 2.1 Vector，购自Invitrogen公司。混合模板见表1，PCR扩增所用各模板见表2。
表1.混合模板
| 混合模板 | 大肠杆菌分离株 | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| 1#2#3#5#10#14#23#24#AB | E058E210E112E036E298E530E800E8140922010159 | E037B11E653E039E299E536两A5E815108909106 | E149E114E627E040E302E537王A5E8161132710278 | 1794E633E158E041E309E538E805E844101581060 | E120E78E313E044E311E546王B11E8550925609134 | B12E105天A5E045E313E554E807E8591123309109 | E235E67E698E67E314E559E808E860102400981 | 王A3新A2E536E069E321E561E809E864098311249 | E267E123E002E71E333E566E811E865 | E462E598E469E78E334E567E812E868 |
表2靶基因扩增所用引物、模板以及退火温度
| 靶基因片段 | 引物5’-3’ | 模板 | 退火温度(℃) | 靶基因片段长度(bp) | GenBank序列号 |
| fimCfimHtshiroNirp2fyuAkpsMcsgApapCfelAfacAcvaCissiucCDvatbmaEhlyEcnf1chuAhlyAiutA | CGTCAATGTAAGGAAATCGCAGGGGCATTCAACTCTGTTACCGTCATGAAACGAGTTATTACCCTGTTTGTTATTGATAAACAAAAGTCACGCCTTATTCTCTTCGCTACAGGATGACAGGCTACCGACAGTCCTGGTTGGGTTGAATACAGCCAGAGGCCCACTAAAGGATTCGCTGTTACCGGATCGGCCAGGATGATTCGTCGACACGGCTTTATCCTCTGGCGGCATATTGACGATTAACGAAGCGCATTTGCTGATACTGTTGCATCCAGACGATAAGCATGAGCAACTCTGACTTGACTATTACCAGATGCAGTCTGGTCAACGACGGCTGTACTGCAGGGTGTGGCGATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATAGGCAGTGGTGTCTTTTGGTGGGCCCAGTAAAAGATAATTGAACCATGAAGTTAAAATTCATCTCCCTGGTACTGAACTTTAAAGGCACACACAAACGGGAGCTGTTCTTCCCGCAGCATAGTTCCATGTGGCGAAAACTAGTAAAACAGCCGCCTCGGGTGGATAAATCCATGATTTGCAGACGGATGACAATCCGGTACCAGCATCGCTTACCCTGACTATCCCCTTACCAGACATACCGCGCTATCGCAAGCAGTGTCCAATGTCTGGTCTCCGAAGACTCTCAATCGGCATCCACCTTCAACAACCCCAGCAGACGCAGTTTCAGTGATGGTGTCATAGTAGATGCCGCTCAGGAACCAACGGTCAGGATGATGGATTCGTCATTCGGCTTGTCAGGACGGCAGATGCGTTCAGGTGCTTTGTATTGACAGCCGACAACTGGACTC | E058E058E149E149E149E1491794E037E058E058E058E149E058E1492#17#3#A2#HEC2E058 | 605559555855585364585060585557575757555559 | 565854685603295953237200353279540678760467441444453534415472440 | AY734876AF089840AF218073AF449498L18881Z29675Johnso&Stell(2000)X90754Leouguenecet al.(1992)L07420AF298200Johnso&Stell(2000)Johnso&Stell(2000)AY553855AY151282M15677AF052225X70670AM055961AF037578AY602767 |
| 靶基因片段 | 引物5’-3’ | 模板 | 退火温度(℃) | 靶基因片段长度(bp) | GenBank序列号 |
| sitAkfiBpapGHpapGIIIireAfocGmalXafaBCsfaDEgyrBrecAmdhuspAsepLfepCrtxehxAespPflicihatir | GTAATCGTCGTCGCCCTGACAACTTTTACCATCATCGCGTTCCGCAATCTGCTTACGAGGGATTTAGAATACGAGACGCATTATGGGAGGTAGTCGCCTTGTGTGTGTCTGGTGAGTCAGTCAGACGGGTTGTTTCTGTCAGGCTGTAATGATGCTCCTGTCCAGATGTGTTTGCTTCATTACACGCTGATTCTGGTCCTTCTGGCTTTCAGTCGGAGCACAGGCAGTGGATACGTAATACTTCCCGCACCAGCGCTGGCGACTAATAACCCTATCCCATTGCTCTGCTAAGGCTGGGCAGCA AACTGATAATTCTCCATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCGCTCCGGAGAACTGGGTGCATCTTACCGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCACACCATTCACGCCGATAACCCACTTCGACGCCAATACCAAAACCACGCTGACGCTGAAGTTGATACCTTCGCCGGGAGTTTAGGATGAAAGTCGCGCCCATAGACAGGGTTGCGCGTTGGCATCTGCTTTGGCCGTTATTGGATACCGACTAATCAAAACACCGCATCTGACTCCCAATCATCTTCGCCATGGCGAGCACATTCAACACAACTCCAGCAAATCAATCGGTCACCGTTACCTTTGGCGGTTACCCGCTTTATCGCTTGCTGAGAAAACAACGGGCCAACATTTCCAAGAACCTGTAGTGAAGAAAGATGGCTCCGTCATCAATGTGAACGAAAGATCGGTGGAAGCCAGGCATACGGCAGCATCACTGGATTCACCCGTAACCACTCTGGCTTCCGTAGCTGACAGAATCATCCACAAGGGCACCTCCATTACCTTCACCAACGGTGACCATAGCAT | E058BHEC424#3#23#5#HEC4HEC4HEC410#HEC4B933W933W933W933W933W933W933W933W | 535657585557556362575558575553575553635855 | 451579415368440414411793408581595674615473357446360458350592451 | AY598030X77617AY212280AF237473AF320691S68237AF081286Leouguenecet al.(1992)Leouguenecet al.(1992)X04341V00328Y00129AB056440AJ277443X57471AE005229AF043471AF074613U47614AF126104AF070067 |
| 靶基因片段 | 引物5’-3’ | 模板 | 退火温度(℃) | 靶基因片段长度(bp) | GenBank序列号 |
| eaelerstxlstx2rfbEpaakatPneuCetpDtoxBtagAcesTpasespAcdtAeastbfpAcifefaIsheAperA | TAACGGCTATTTCCGCATGATCC CAGACGATACGATCCAGCGCACACAACAAGCCCATACGAT GAG TTC CGG CGA GCAAGCAGTTGATGTCAGAGGGATACTACTCAACCTTCCCCAGTTCATGTATCTCAGGGGACCACATCGGACACAGGAGCAGTTTCAGACAGTCTACAGGTGAAGGTGGAATGGATTCCTCTCTTTCCTCTGCGGGGTCCTGGTGGCCCGCATACGTCTGGTCAGGTCGTCAATACGTCGCTGAAAGAGCAGGTTATACTCCATCGTGTTGACATATCCTGCTAAGAGAAACTCCAGAAGATCATTAACCGACTGCGTGGGGACTGGTGATGAGGTTGCCACTAAATCCTTCGCCTTCGGCAAAATACACCTTCCTCCATTAGGGGCGATGTTTACTGAGAGATGGAGAACACCGGAATAGAACTCCCGCTGGGCTTTTATTAGATAGATTTGCATGTTATTCCCTGATTATGGCGGGAGATGTTGATACCGATGTCTTAACGGAATACGGATGTGAGTGCGAGTTCTTCTATTCACTACCGTTGTCAGGCTCAAGTAGAGGGAGGACCTCTGGCTTAACAATAGTGGCATCCTCATCGCCTGTGTGCGAGTGACGGCTTTGTAGCGTTACCGCAGGTGTGATGCAGCAGGAGTAATAGCAGTCGATAGGGCGAGAGAAAGGCGGTGTCATACTCAAACAACTGGGATGGAACTATCCTGCCGCATAGGTGATAACGACGAAGGCAGATAAAACGGTAGAAGCCCGCAGCAATAGAATAGCACCGAATACACAATAGAATCCCATTGAACTACTGACATCGCC | 933W933W933W933W933W933W933W14#933W933W933W933W933W933W17#1#37#37#37#37#37# | 535950505959575355555750555555.575952575356 | 552195473430327292641594487572494383531432601149438510376576427 | AJ223063AF200363M17358M59432S83460U82533X89017M84026Y09824AB011549NC002128AF253560Y13068Y13068AJ508930L11241Z68186AY128538AF159462AF200955AF255771 |
| 靶基因片段 | 引物5’-3’ | 模板 | 退火温度(℃) | 靶基因片段长度(bp) | GenBank序列号 |
| espBompAfaeG(K88)fanC(K99)fasA(987P)f41f17a-Altstastbstx2eBtetAtetBtetGblaTEM-1carb2(blaPSE)addA1sulIsulIIaddA2strA-B | TAACAGTGCTACGAAAGGCGGCTCTGCGAACTTCTTGCGACTGGTTAGGTCGTATGCCAACAACAGACTGAGCACGGCCTGGATGACTGGTCGTAGCAATAACTTATTACAATACAGGTACATTAACTTCAATGATCCTTCTTAGTCACTTATATGGCGCCCGCTGAAAACAACGGTGTACCTGCTGAACGAAGCTGATTGGACGGAAGGTTTAACTATAAATAACGGTGATAGTCGCTACGCTTGCTTATGACCGTGTTCGCATTAGGTTCTGGATTCATCATGCACCACAAGGCCATTTCTCTTTTGCCTGCCATCTCTTTCCCCTCTTTTAGTCAGACAGGCAGGATTACAACAAAGTGCCTATGCATCTACACAATCGCAGTGAGAAATGGACAATGGCGGATTGTGCTAAAGTTAAACTTCACCTGGCAC TAT GGC ATT CTG CTG GCCAT AGA TCG CCG TGA AGA GGGCC CAG TGC TGT TGT TGT CAAG ACC AAG ACC CGC TAA TGCGGTCTTATGGGTGCTCTATCCTTGCTTGTTACTGCTGACCAG CGG TAA GAT CCT TGA GAACT CCC CGT CGT GTA GAT AAGGTGTTTCCGTTCTTGATACTATTGCCTTAGGAGTTGTCGTAT CAG AGG TAG TTG GCG TCA TGTT CCA TAG CGT TAA GGT TTC ATTGTG ACG GTG TTC GGC ATT CTGTCT AAC CCT CGG TCT CTG GCCAT TTT CGG CAT CGT CAA CAGT TTG GCA GAT GAT TTC GCTGT TGG TTA CTG TGG CCG TAGATCTCGCCTTTCACAAAGCAACGCCTTGCCTTCTATCTGCCCAAAGCCCACTTCACCGAC | 37#37#107/86C83907987PFcC83927213421342134TB1S0503S09256S21310159S5109S1015802/98S0503S521641/06 | 575758585957555058505859575746555351555860 | 495618788477513768243313166283205948553900643423537825357713645 | AF144010V00307M35945M35282M35257X14354AF022140X83966M34916M34916AB252836X00006J01830AF071555AJ6346025DQ238104AY125351AF071555AF542061AF071555AF100173 |
| 靶基因片段 | 引物5’-3’ | 模板 | 退火温度(℃) | 靶基因片段长度(bp) | GenBank序列号 |
| aacint-Icat IfloRaac(3)-IVdfr-12aph(3)-IacmlAuidAfhuAyjaAfeoB16srDNA | CTT CCG CCG TTG TCATAAGCAGCGACTTCCACGATGCGAATG TCG TAACCG CTGCCTTGATGTTAC CCGAGAGGTATGG CAATGAAAGACG GTCAGCACCTTGTCGC CTTTATGGTGATGCTCGGCGTTTC GTG CCA CCT GAAACCGTC TCT GAC ACATTC TGG CGATGACC GAC TGGACC TTCGAATCGGTCCGCATTTATCATTGGGAAGAAGGCGTCACAGC GTC TCC GAC CTGATGGTA TTG ACC GAT TCC TTG CCTCTTGTTTGGACCGCTATCACAACCAGAAGTTCAGGCACGTCACGCCGTATGTTATTGCAACTGTTCGCCCTTCACTGCCGAACCGCTGAAAGAAGCAGACGCCGTAACCATAAACAGACGCTGCCTTCAGTAACGACGCTCTGAGGTGGACGGTGTAGGTAACTGGGCTGGAGTGAATCTGCTTCGTTGAGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAAGGAGGTGATCCAGCCGCA | S5213S5213S5413S4207S5213S9305S5301S5339933W933W1#E149E058 | 55575557575555575757575555 | 234455333403387354372454493481437478550 | AY152821AF071555U46780AY499129X01385AF175203V01499DQ018384AF30597M12486U00096X71063 |
表3 SSH方法获得的APEC E058特异的潜在毒力基因的44个基因片段
| 基因片段 | 片段长度(bp) | GenBank中的登录号 |
| ecs-1ecs-6ecs-7ecs-8ecs-9ecs-10ecs-11ecs-12ecs-13ecs-14 | 7655341519984629649594215689801 | M31808AF218051AF218051AF218051D30057D30061AY048853AF218051AF311902AF311902 |
| 基因片段 | 片段长度(bp) | GenBank中的登录号 |
| ecs-15ecs～16ecs-17aes-1aes-2aes-3aes-4aes-5aes-6aes-7aes-8aes-9aes-10aes-11aes-12aes-13aes-14aes-15aes-16aes-17aes-18aes-19aes-20aes-21aes-22aes-23aes-24aes-25aes-27aes-28aes-29aes-30aes-31aes-32 | 1803302205761144721933586697412652253550321792616594304367424393893259230478321270639102421646512011199372 | AE015101AE000412X61676AF550679AF550679AF550679AF550679AJ223631AY205565AY205565X14566X05874U15625AE016765AF493797U82619AE016764AE016758AE016760AE016760AE016760AE016761AE016761AE016768AE016771AE016772AE016772AF222160X57524L07942U82619AE016759AE016759D90750 |
表4 SCOTS方法获得的APEC特异性潜在毒力基因的13个基因片段
| 基因片段 | 片段长度(bp) | GenBank中的登录号 |
| aec-8aec-11aec-13aec-14aec-18aec-20aec-24aec-25aec-26aec-27aec-29aec-30aec-31 | 261223275322253342435473293392254393386 | D30057D30059Y14016AF218051AB027308AY333433AE005674AE005674AE005674AE005674AE000516AJ875436X58999 |
2、靶基因的扩增
PCR扩增体系：在总量为25μL的反应体系中加入：10×PCR缓冲液(含15mmol/L Mg2+)2.5μL、2.5mmol/L dNTP 1.5μL、每条引物1μl(引物浓度为20μmol/L)、DNA模板1～2μL(0.1-1ng)、Taq DNA聚合酶1.5U，加灭菌超纯水至25μL。
PCR反应参数如下：94℃30s，退火(各退火温度见表1)30s，72℃60s，30个循环，72℃延伸7min。
3、分子生物学基本操作
琼脂糖凝胶电泳、DNA目的片段的纯化回收、载体连接、转化、质粒提取、酶切鉴定、亚克隆等分子生物学操作按Sambrook J，Russell DW编著的《分子克隆实验指南》(科学出版社，第三版，2002年)进行。测序工作由上海联合基因科技有限公司和上海生工生物工程公司完成。
4、靶基因序列分析
序列分析采用DNAstar4.0序列分析软件包中多重序列对位排列分析程序进行序列比对分析，BLAST搜索评价靶基因的正确性和特异性。
5、基因芯片制备
以通用引物进行PCR扩增，PCR产物长度约为200-900bp左右。靶基因以0.5mg/mL溶解于DNA Spotting Solution(CapitalBio Corp.Beijing，China)中，PCR产物用SmartArrayTM microarrayer(CapitalBio Corp.Beijing，China)点样于经过化学修饰的载玻片上。点制在芯片上的样品还包括：Hex作为点样阳性对照，以及酵母的8个基因序列作为外标。整个点阵分成1个亚阵：亚阵有24列，21行，点间距为180μm，点的直径约为150μm，每个样品在芯片上重复三次。玻片经水合(2h)、室温干燥(30min)、紫外线(UV)交联，再分别用0.5％SDS水洗涤后以无水乙醇浸泡(30sec)，离心干燥。
如图1中，Hex为点样对照(immobilized control)；Y1～8为来自酵母的8个核酸序列外标；Blank(点样溶液)，为阴性对照。
fimH(type 1 fimbriae)；afaBC(afimbrial adhesion)；sfa/foc(S and F 1 Cfimbriae)；focG(F 1 C fimbriae)；papC，papG(P fimbrial major subunit or adhesin，respectively)；bmaE(M fimbriae)；felA(fimbriae F11)；gafD(G fimbriaefimbriae)；iha(iron-regulated gene homologue adhesin)；sitA(S.flexneriputative iron transport gene)；iutA(aerobactin receptor)；iroN(siderophorereceptor)；cvaC(colicin V)；iss(increased serum survival)；tsh(temperaturesensitive hemagglutinin)；traT(the serum survival gene)；kpsM(group 2 capsule)，ireA(siderophore receptor)；feoB(ferrous iron uptake gene)；iucCD(aerobactinsystem)；fyuA，irp2(yersiniabactin system)；cnf1，cnf2(cytotoxic necrotizingfactor 1)；cdtA(cytolethal distending toxin protein A)；hlyA，hlyE(hemolysin)；vat(vacuolating autotransporter toxin)；flic(H-antigen type)；malX(marker forpathogenicity island from strain CFT073)；kfiB(K5 capsule gene cluster)；ibeA(invasion)；leoA(labile enterotoxin output)；ompA(outer membrane proteinA).uidA(glucuronidase reporter gene)；uspA(encodes a uropathogenicstrain-specific protein)；mdh(malate dehydrogenase)；recA(strand transferases)；chuA(haem transporter)；fhuA(outer membrane receptor)；cmlA(chloramphenicol resistance)；aph(3)-Ia(kanamycin resistance)；aac(3)-IV(aminoglycoside resistance)；floR(florfenicol resistance)；catI(chloramphenicol resistance)；intI(integrasin I)；sheA(hemolysin)；csgA(curlifibers)；cdtA(cytolethal distending toxin)；sepL，espA，espB，espP，eae，tir，ler，tagA，paa，cesT(LEE-specific gene)；ehxA(EHEC hemolysin A)；katp(catalase)；rfbE(O157 somatic antigene gene)；stx1，stx2：(shiga toxin)；stx2eB：(shiga liketoxin)；eae(intimin gene)；sta，stb(heat-stable toxin)；lt(heat-liable toxin)；rtx(theputative RTX famly exoprotein)；paa(related attaching-and-effacing gene)；cdtA(cytolethal distending toxin A)；bfpA(bundle forming pili)；cif(cell cycle-inhibitingfactor)；efaI(EHEC factor for adherence 1)；toxB(enterotoxin B)；perA(atranscriptional activator)；faeG(Escherichia coli K88 fimbrial subunit)；fanC(E.coli K99 Pilus Forming Subunit)；F41(fimF.41a.)；fasA(P987；ETEC.F6fimbrial adhesin.)。
ecs-1，ecs-7，ecs-10，ecs-11，ecs-12，ecs-13，ecs-15，ecs-8，ecs-16，ecs-17，aec-11，aec-13，ecs-14，aes-2，aec-14，aec-18，aec-20，aec-24，aec-25、aec-26，aec-27，aec-29，aec-30，aec-31，ecs-6，ecs-9，aes-1，aes-4，aes-2，aes-3，aes-6，aes-5，aes-6，aes-7，aes-8，aes-9，aes-10，aes-11，aes-12，aes-13，aes-14，aes-15，aes-16，aes-17，aes-18，aes-19，aes-20，aes-21，aes-22，aes-23，aes-24，aes-25，aes-27，aes-29，aes-32，aes-28，aes-3，aes-30，aes-31为通过SSH和SCOTS方法获得的APEC潜在毒力基因片段。
二、禽致病性大肠杆菌、人尿道致病性大肠杆菌毒力基因表达芯片的应用：
1、细菌在不同培养基中的培养
将禽高致病性大肠杆菌E058株和UPEC HEC4株分别接种于LB液体培养基、无菌的人尿液中，于37℃静置培养至对数生长期(OD600＝0.4～0.8)。
2、E058株感染SPF鸡及样品的采集、处理
接种鸡血液中APEC E058株的分离和富集：左胸气囊接种1日龄SPF鸡3只(108CFU/只)，5h后采血，共采血4mL，将血液低速离心(500rpm，5min)，再将上清转移至新的离心管，在室温下12000rpm离心2min，去上清，菌体沉淀于液氮中速冻10min，而后转移到-85℃冰箱中保存待用。
3、细菌RNA的提取
细菌在培养基中培养至对数生长中期，OD600在0.4～0.8之间。将培养液分装于10mL的离心管，在室温下12000rpm离心2min，然后各加入1mL室温无菌水重悬，转移到1.5mL的离心管中，在室温下12000rpm离心2min，去上清，菌体沉淀于液氮中速冻10min，而后转移到-85℃冰箱中保存待用。
抽提RNA时，从-85℃冰箱中取出装有菌体沉淀的1.5mL离心管，室温溶化，先后加入400μL的TES液、400μL的水饱和酚，剧烈振荡混匀，于60-65℃的水浴中加热1h，期间每隔约10min剧烈振荡一次；离心管冰浴5min，4℃、12000rpm下离心5min；水相转移至一新1.5mL离心管中，加入等体积氯仿抽提一次，4℃、12000rpm离心5min；水相转移至一新1.5mL离心管中(约400μL)，加入1/10体积的DEPC水配制的NaAc(3M，pH5.2)及2.5倍体积的无水乙醇，-20℃静置30min；4℃下12000rpm离心10min，沉淀用1mL 70％乙醇洗一次，室温晾干，加入50-100μLDEPC水，在65℃水浴加热15min充分溶解RNA沉淀。
4、RNA质量检查
取1μLRNA，测OD260和OD280，RNA样品OD 260/280应在1.7-2.1之间。取约0.5μgRNA样品电泳，加入0.2mL的指形管中，补水至8μL，加入2μL5×loading buffer混匀。如样品浓度过高，要进行稀释。70℃加热变性10mim，然后冰上骤冷，加入EB 1μL，离心后上样。电泳结束后，凝胶成像仪照像。RNA质量判定标准(原核生物)：有清晰的23S、16S条带，无降解，且肉眼观察23S条带亮度约是16S的1-2倍。
5、RNA纯化
电泳检查符合标准，进行RNA纯化(MN试剂盒)：加DEPC水至总体积50μL，加2倍体积的NT buffer(100μL)，转移至纯化柱中，离心1min，弃掉溶液，加600μLNT3 washing buffer，10000rpm离心30s，把柱子转移到新Eppendorf管中，加30μL NE/2(65℃预热)，离心1min，弃掉柱子。
6、反转录、标记和杂交
取20μg total RNA，60℃抽干，用DEPC水补平体积至6.5μL，和反转录引物9 Random Primer(上海英骏生物技术有限公司)4μL以及外标(对照组x外标1μL，实验组y外标1μL)，总体积11.5μL；混匀振荡，8000rpm离心30s；65℃加热5min，室温冷却10min后，加M-MLV反转录酶(200U/μL)1.5μL，5×1stbuffer(M-MLV)4μL，dNTP(10mM)1μL，0.1M DTT 2μL，总体积为20μL进行反转录：25℃10min，37℃90min。加入反转录终止液5μL，65℃10min后，再加如10N乙酸1μL终止反应。反转录产物用PCR NucleoSpin Extract II Kit(MN)纯化，过程同步骤4。
将纯化后的反转录产物(浓缩至14μL)和9 Random Primer引物(4μL)先95℃变性3min，再进行Klenow酶标记。标记过程中dATP，dGTP，dTTP使用浓度120μM，dCTP使用浓度为60μM，Cy5-dCTP、Cy3-dCTP使用浓度为40μM。Cy3-dCTP标记实验组cDNA，Cy5-dCTP标记对照组cDNA，标记的总体积为26μL，37℃，90min；70℃变性5min；冰浴5min。
标记产物用PCR NucleoSpin Extract II Kit(MN)纯化，过程同步骤4。不同点为用NE洗脱2次(30μL/次)，纯化后抽干至1.5μL。
7、杂交与清洗
标记的DNA溶于3μL灭菌水中(溶解顺序为先实验组-cy3，再对照组-cy5)，加入甲酰胺6μL和4×杂交液缓冲液3μL，杂交体系为总体积12μL，95℃变性3min，冰浴5min，将杂交液点在芯片上，于42℃水浴过夜；杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的洗液中洗5min，而后在0.2×SSC溶液中室温洗5min。玻片甩干后即可用于扫描。
8、芯片扫描
芯片用LuxScan 10KA双通道激光扫描仪进行扫描。
9、芯片图像的采集与数据分析
采用LuxScan 3.0图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号；然后对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化；最后以t test结合两倍差异的标准来确定差异表达基因。筛选差异表达基因标准为(1)统计意义：在95％显著性水准上为显著差异。(2)生物学意义：差异表达大于2倍。
三、芯片初步应用结果
1、E058株体内外毒力基因差异表达的DNA芯片检测结果
E058株在体内生长条件下，相对于其在体外LB培养，其差异表达基因共有9个，其中上调基因5个，下调基因4个(图2，表5)。
如图2所示E058鸡体内(cy3)/E058 LB培养(cy5)芯片杂交伪色图。
表5 鸡体内外E058株差异表达基因 (上调基因5个，下调基因4个)
| 基因 | 功能 | 平均Ratio值(cy3/cy5) | T值 | P＜0.05 | P＜0.01 |
| neuCiutAcvaCaes-15iucCDaes-8gyrBaec-30mdh | K1 capsule antigensaerobactin receptorcolicin Vcell division protein ftsk，UPECaerobactintraT lipoprotein，E.coliDNA gyrasenegative response regulatormalate dehydrogenase | 13.36677.84002.81002.54002.40330.48600.45730.41430.3280 | 28.1779174.729594.575714.634738.94285.615728.083125.255481.6348 | TTTTTTTTT | TTTTTTTT |
2、E058株和HEC4株在尿液培养条件下毒力基因差异表达的DNA芯片检测结果
实验样品HEC4株基因表达和对照样品E058株的基因表达有差异，HEC4(cy3)/E058(cy5)差异表达基因共有18个，其中上调基因10个，下调基因8个(图3，表6)。
如图3尿液静置培养条件下HEC4/E058芯片扫描图所示。
表6尿液静置培养条件下HEC4株与E058株差异表达基因
(上调基因10个，下调基因8个)
| 基因 | 功能 | 平均Ratio值(cy3/cy5) | T值 | P＜0.05 | P＜0.01 |
| catIleoAstrA-BsulIIihasheAaph(3)-IartxBlaTEM-1aec-11aes-31aes-2uspAireAsitAfhuAcvaCneuC | antibiotic resistancelabile enterotoxin outputantibiotic resistanceantibiotic resistanceadhesinhemolysinantibiotic resistancecholera toxinantibiotic resistancecolE4，Shigella sonneiunknown，UPECSopA，sopB，plasmid F，E.coliuropathogenic strain-specificproteinsiderophore receptorS. flexneri putative iron transportgeneyersiniabactin systemcolicin VK1 capsule antigens | 38.364316.143314.088911.31746.37993.91903.15903.07792.28462.14190.45570.42530.25300.15770.14700.09230.06890.0318 | 215.4136105.415851.656343.871734.862049.419520.8289259.423622.186512.48437.77298.722798.343532.6012107.028564.3944199.322828.5213 | TTTTTTTTTTTTTTTTTT | TTTTTTTTTTTTTTTT |
通过对APEC E058株和UPEC HEC4株体内、外毒力因子表达水平的检测结果表明，该基因芯片具有高通量、微型化、集成化和平行化的优点。本发明由154个靶基因探针组成的基因芯片可同时对APEC、UPEC在体内、外培养条件下的毒力基因的表达水平进行检测。
cgtcaatgtaaggaaatcgcagg
ggcattcaactctgttaccgtc
atgaaacgagttattaccctgtttg
ttattgataaacaaaagtcacgcc
ttattctcttcgctacag
gatgacaggctaccgacag
tcctggttgggttgaata
cagccagaggcccacta
aaggattcgctgttaccgga
tcggccaggatgattcgtcg
acacggctttatcctctggc
ggcatattgacgattaacgaa
gcgcatttgctgatactgttg
catccagacgataagcatgagca
actctgacttgactattacc
agatgcagtctggtcaac
gacggctgtactgcagggtgtggcg
atatcctttctgcagggatgcaata
ggcagtggtgtcttttggtg
ggcccagtaaaagataattgaacc
atgaagttaaaattcatctcc
ctggtactgaactttaaagg
cacacacaaacgggagctgtt
cttcccgcagcatagttccat
gtggcgaaaactagtaaaacagc
cgcctcgggtggataa
atccatgatttgcagacgg
atgacaatccggtaccagca
tcgcttaccctgactatcc
ccttaccagacataccgc
gctatcgcaagcagtgtc
caatgtctggtctccgaag
actctcaatcggcatccac
cttcaacaaccccagcag
acgcagtttcagtgatggtg
tcatagtagatgccgctcag
gaaccaacggtcaggatg
atggattcgtcattcggc
ttgtcaggacggcagatg
cgttcaggtgctttgtattg
acagccgacaactggactc
gtaatcgtcgtcgccctg
acaacttttaccatcatcgc
gttccgcaatctgcttac
gagggatttagaatacgagac
gcattatgggaggtagtcg
ccttgtgtgtgtctggtgag
tcagtcagacgggttgtttc
tgtcaggctgtaatgatgctc
ctgtccagatgtgtttgcttc
attacacgctgattctggtc
cttctggctttcagtcgg
agcacaggcagtggatacg
taatacttcccgcaccagc
gctggcgactaataaccc
tatcccattgctctgctaag
gctgggcagcaaactgataattctc
catcaagctgtttgttcgtccgccg
ctccggagaactgggtgcatcttac
cggaggagtaattacaaacctggca
caccattcacgccgataac
ccacttcgacgccaatacc
aaaaccacgctgacgctg
aagttgataccttcgccg
ggagtttaggatgaaagtcgc
gcccatagacagggttgc
gcgttggcatctgctttg
gccgttattggataccgac
taatcaaaacaccgcatctg
actcccaatcatcttcgcc
atggcgagcacattcaac
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ggtcaccgttacctttggc
ggttacccgctttatcgc
ttgctgagaaaacaacggg
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gtcatcaatgtgaacgaaag
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ctgacagaatcatccacaagg
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cgcacacaacaagcccatac
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gcagttgatgtcagagggata
ctactcaaccttccccagttcatg
tatctcaggggaccacatcgg
acacaggagcagtttcagacagt
ctacaggtgaaggtggaatgg
attcctctctttcctctgcgg
ggtcctggtggcccgcatac
gtctggtcaggtcgtcaatac
gtcgctgaaagagcaggtta
tactccatcgtgttgacatatcc
tgctaagagaaactccagaa
gatcattaaccgactgcgtg
gggactggtgatgaggttg
ccactaaatccttcgccttc
ggcaaaatacaccttcctc
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tattcactaccgttgtcagg
ctcaagtagagggaggacc
tctggcttaacaatagtggc
atcctcatcgcctgtgtg
cgagtgacggctttgtag
cgttaccgcaggtgtgatg
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cataggtgataacgacgaag
gcagataaaacggtagaag
cccgcagcaatagaatag
caccgaatacacaatagaatcc
cattgaactactgacatcgcc
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atccttcttagtcacttatatg
gcgcccgctgaaaacaa
cggtgtacctgctgaacgaa
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gcagtgagaaatggacaatg
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tatcagaggtagttggcgtcat
gttccatagcgttaaggtttcatt
gtgacggtgttcggcattctg
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agtttggcagatgatttcgc
tgttggttactgtggccgta
gatctcgcctttcacaaagc
aacgccttgccttctatctgc
ccaaagcccacttcaccgac
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ccttgatgttacccgagag
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gtcacgccgtatgttattgc
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ccgaaccgctgaaagaag
cagacgccgtaaccataaac
agacgctgccttcagtaac
gacgctctgaggtggacg
gtgtaggtaactgggctgg
agtgaatctgcttcgttgag
agagtttgatcctggctcag
aaggaggtgatccagccgca
Claims (6)
1、检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片，其特征在于：包含154个靶基因探针的DNA芯片；其中97个基因片段扩增自大肠杆菌已知的毒力基因和部分耐药基因，44个基因片段扩增自用SSH方法获得的APEC特异性基因，13个基因片段扩增自用SCOTS方法获得的APEC特异性基因。
2、根据权利要求1所述检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片，其特征在于所述97个基因片段是：fimC、fimH、tsh、iroN、irp2、fyuA、kpsM、csgA、papC、felA、facA、cvaC、iss、iucCD、vat、bmaE、hlyE、cnf1、chuA、hlyA、iutA、sitA、kfiB、papGII、papGIII、ireA、focG、malX、afaBC、sfaDE、gyrB、recA、mdh、uspA、sepL、fepC、rtx、ehxA、espP、flic、iha、tir、eae、ler、stx1、stx2、rfbE、paa、katP、neuC、etpD、toxB、tagA、cesT、pas、espA、cdtA、east、bfpA、cif、efaI、sheA、perA、espB、ompA、faeG、fanC、fasA、f41、f17a-A、lt、sta、stb、stx2eB、tetA、tetB、tetG、blaTEM-1、carb2、addA1、sulI、sulII、addA2、strA-B、qac、int-I、cat I、floR、aac(3)-IV、dfr-12、aph(3)-Ia、cmlA、uidA、fhuA、yjaA、feoB、16srDNA。
3、根据权利要求1所述检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片，其特征在于所述由SSH方法获得的44个基因片段是：ecs-1、ecs-6、ecs-7、ecs-8、ecs-9、ecs-10、ecs-11、ecs-12、ecs-13、ecs-14、ecs-15、ecs-16、ecs-17、aes-1、aes-2、aes-3、aes-4、aes-5、aes-6、aes-7、aes-8、aes-9、aes-10、aes-11、aes-12、aes-13、aes-14、aes-15、aes-16、aes-17、aes-18、aes-19、aes-20、aes-21、aes-22、aes-23、aes-24、aes-25、aes-27、aes-28、aes-29、aes-30、aes-31、aes-32。
4、根据权利要求1所述检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片，其特征在于所述由SCOTS方法获得的13个基因片段是：aec-8、aec-11、aec-13、aec-14、aec-18、aec-20、aec-24、aec-25、aec-26、aec-27、aec-29、aec-30、aec-31。
5、-种如权利要求1所述检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片的构建方法，其特征是：先通过PCR方法分别扩增大肠杆菌已知的毒力基因和部分耐药基因的97个基因片段、用SSH方法获得的APEC特异性基因的44个基因片段、用SCOTS方法获得的APEC特异性基因的13个基因片段；再以重组质粒为模板，将各基因片段回收并纯化；然后，用SmartArrayTM microarrayer点样于化学修饰的载玻片上，同时设置阳性对照和阴性对照，构建成检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片。
6、根据权利要求5所述检测APEC、UPEC毒力基因表达水平的DNA芯片的构建方法，其特征是：扩增所述97个基因片段fimC、fimH、tsh、iroN、irp2、fyuA、kpsM、csgA、papC、felA、facA、cvaC、iss、iucCD、vat、bmaE、hlyE、cnf1、chuA、hlyA、iutA、sitA、kfiB、papGII、papGIII、ireA、focG、malX、afaBC、sfaDE、gyrB、recA、mdh、uspA、sepL、fepC、rtx、ehxA、espP、flic、iha、tir、eae、ler、stx1、stx2、rfbE、paa、katP、neuC、etpD、toxB、tagA、cesT、pas、espA、cdtA、east、bfpA、cif、efaI、sheA、perA、espB、ompA、faeG、fanC、fasA、f41、f17a-A、lt、sta、stb、stx2eB、tetA、tetB、tetG、blaTEM-1、carb2、addA1、sulI、sulII、addA2、strA-B、qac、int-I、cat I、floR、aac(3)-IV、dfr-12、aph(3)-Ia、cmlA、uidA、fhuA、yjaA、feoB、16srDNA的引物分别是：
fimC：CGTCAATGTAAGGAAATCGCAGG
和GGCATTCAACTCTGTTACCGTC；
fimH：ATGAAACGAGTTATTACCCTGTTTG
和TTATTGATAAACAAAAGTCACGCC；
tsh：TTATTCTCTTCGCTACAG和GATGACAGGCTACCGACAG；
iroN：TCCTGGTTGGGTTGAATA和CAGCCAGAGGCCCACTA；
irp2：AAGGATTCGCTGTTACCGGA和TCGGCCAGGATGATTCGTCG；
fyuA：ACACGGCTTTATCCTCTGGC和GGCATATTGACGATTAACGAA；
kpsM：GCGCATTTGCTGATACTGTTG
和CATCCAGACGATAAGCATGAGCA；
csgA：ACTCTGACTTGACTATTACC和AGATGCAGTCTGGTCAAC；
papC：GACGGCTGTACTGCAGGGTGTGGCG
和ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA；
felA：GGCAGTGGTGTCTTTTGGTG
和GGCCCAGTAAAAGATAATTGAACC；
facA：ATGAAGTTAAAATTCATCTCC和CTGGTACTGAACTTTAAAGG；
cvaC：CACACACAAACGGGAGCTGTT
和CTTCCCGCAGCATAGTTCCAT；
iss：GTGGCGAAAACTAGTAAAACAGC和CGCCTCGGGTGGATAA；
iucCD：ATCCATGATTTGCAGACGG和ATGACAATCCGGTACCAGCA；
vat：TCGCTTACCCTGACTATCC和CCTTACCAGACATACCGC；
bmaE：GCTATCGCAAGCAGTGTC和CAATGTCTGGTCTCCGAAG；
hlyE：ACTCTCAATCGGCATCCAC和CTTCAACAACCCCAGCAG；
cnf1：ACGCAGTTTCAGTGATGGTG和TCATAGTAGATGCCGCTCAG；
chuA：GAACCAACGGTCAGGATG和ATGGATTCGTCATTCGGC；
hlyA：TTGTCAGGACGGCAGATG和CGTTCAGGTGCTTTGTATTG；
iutA：ACAGCCGACAACTGGACTC和GTAATCGTCGTCGCCCTG；
sitA：ACAACTTTTACCATCATCGC和GTTCCGCAATCTGCTTAC；
kfiB：GAGGGATTTAGAATACGAGAC和GCATTATGGGAGGTAGTCG；
papGII：CCTTGTGTGTGTCTGGTGAG和TCAGTCAGACGGGTTGTTTC；
papGIII：TGTCAGGCTGTAATGATGCTC
和CTGTCCAGATGTGTTTGCTTC；
ireA：ATTACACGCTGATTCTGGTC和CTTCTGGCTTTCAGTCGG；
focG：AGCACAGGCAGTGGATACG和TAATACTTCCCGCACCAGC；
malX：GCTGGCGACTAATAACCC和TATCCCATTGCTCTGCTAAG；
afaBC：GCTGGGCAGCAAACTGATAATTCTC
和CATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCG；
sfaDE：CTCCGGAGAACTGGGTGCATCTTAC
和CGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCA；
gyrB：CACCATTCACGCCGATAAC和CCACTTCGACGCCAATACC；
recA：AAAACCACGCTGACGCTG和AAGTTGATACCTTCGCCG；
mdh：GGAGTTTAGGATGAAAGTCGC和GCCCATAGACAGGGTTGC；
uspA：GCGTTGGCATCTGCTTTG和GCCGTTATTGGATACCGAC；
sepL：TAATCAAAACACCGCATCTG和ACTCCCAATCATCTTCGCC；
fepC：ATGGCGAGCACATTCAAC和ACAACTCCAGCAAATCAATC；
rtx：GGTCACCGTTACCTTTGGC和GGTTACCCGCTTTATCGC；
ehxA：TTGCTGAGAAAACAACGGG和CCAACATTTCCAAGAACCTG；
espP：TAGTGAAGAAAGATGGCTCC和GTCATCAATGTGAACGAAAG；
flic：ATCGGTGGAAGCCAGGCATACG
和GCAGCATCACTGGATTCACCCG；
iha：TAACCACTCTGGCTTCCGTAG和CTGACAGAATCATCCACAAGG；
tir：GCACCTCCATTACCTTCAC和CAACGGTGACCATAGCAT；
eae：TAACGGCTATTTCCGCATGA和TCCCAGACGATACGATCCAG；
ler：CGCACACAACAAGCCCATAC和GATGAGTTCCGGCGAGCAA；
stx1：GCAGTTGATGTCAGAGGGATA
和CTACTCAACCTTCCCCAGTTCATG；
stx2：TATCTCAGGGGACCACATCGG
和ACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT；
rfbE：CTACAGGTGAAGGTGGAATGG和ATTCCTCTCTTTCCTCTGCGG；
paa：GGTCCTGGTGGCCCGCATAC和GTCTGGTCAGGTCGTCAATAC；
katP：GTCGCTGAAAGAGCAGGTTA
和TACTCCATCGTGTTGACATATCC；
neuC：TGCTAAGAGAAACTCCAGAA和GATCATTAACCGACTGCGTG；
etpD：GGGACTGGTGATGAGGTTG和CCACTAAATCCTTCGCCTTC；
toxB：GGCAAAATACACCTTCCTC和CATTAGGGGCGATGTTTAC；
tagA：TGAGAGATGGAGAACACCG和GAATAGAACTCCCGCTGG；
cesT：GCTTTTATTAGATAGATTTGC和ATGTTATTCCCTGATTATG；
pas：GCGGGAGATGTTGATACC和GATGTCTTAACGGAATACGG；
espA：ATGTGAGTGCGAGTTCTTC和TATTCACTACCGTTGTCAGG；
cdtA：CTCAAGTAGAGGGAGGACC和TCTGGCTTAACAATAGTGGC；
east：ATCCTCATCGCCTGTGTG和CGAGTGACGGCTTTGTAG；
bfpA：CGTTACCGCAGGTGTGATG和CAGCAGGAGTAATAGCAGTCG；
cif：ATAGGGCGAGAGAAAGGC和GGTGTCATACTCAAACAACTGG；
efaI：GATGGAACTATCCTGCCG和CATAGGTGATAACGACGAAG；
sheA：GCAGATAAAACGGTAGAAG和CCCGCAGCAATAGAATAG；
perA：CACCGAATACACAATAGAATCC
和CATTGAACTACTGACATCGCC；
espB：TAACAGTGCTACGAAAGGCG和GCTCTGCGAACTTCTTGC；
ompA：GACTGGTTAGGTCGTATGCC和AACAACAGACTGAGCACGG；
faeG：CCTGGATGACTGGT和CGTAGCAATAACTTATTAC；
fanC：AATACAGGTACATTAACTTCAATG
和ATCCTTCTTAGTCACTTATATG；
fasA：GCGCCCGCTGAAAACAA和CGGTGTACCTGCTGAACGAA；
f41：GCTGATTGGACGGAAGGT和TTAACTATAAATAACGGTGATAGTC；
f17a-A：GCTACGCTTGCTTATGAC和CGTGTTCGCATTAGGTTC；
lt：TGGATTCATCATGCACCACAAGG
和CCATTTCTCTTTTGCCTGCCATC；
sta：TCTTTCCCCTCTTTTAGTCAG和ACAGGCAGGATTACAACAAAG；
stb：TGCCTATGCATCTACACAATC和GCAGTGAGAAATGGACAATG；
stx2eB：GCGGATTGTGCTAA和AGTTAAACTTCACCTGG；
tetA：CACTATGGC ATTCTGCTGGC和CATAGATCGCCGTGAAGAGG；
tetB：GCCCAGTGC TGT TGT TGTC和AAGACCAAGACCCGCTAATG；
tetG：CGGTCTTATGGGTGCTCTAT和CCTTGCTTGTTACTGCTGAC；
blaTEM-1：CAGCGG TAAGATCCTTGAGA
和ACTCCCCGTCGTGTAGATAA；
carb2：GGTGTTTCCGTTCTTGATAC和TATTGCCTTAGGAGTTGTCG；
addA1：TATCAGAGGTAGTTGGCGTCAT
和GTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATT；
sulI：GTGACGGTGTTCGGCATTCTG和TCTAACCCTCGGTCTCTGGC；
sulII：CAT TTTCGGCATCGTCAAC和AGT TTGGCAGAT GAT TTCGC；
addA2：TGTTGGTTACTGTGGCCGTA和GATCTCGCCTTTCACAAAGC；
strA-B：AACGCCTTGCCTTCTATCTGC和CCAAAGCCCACTTCACCGAC；
qac：CTTCCGCCGTTGTCATAA和GCAGCGACTTCCACGATG；
int-I：CGAATGTCGTAACCGCTG和CCTTGATGTTACCCGAGAG；
catI：GTATGGCAATGA AAGACGG和TCAGCACCT TGTCGCCTT；
floR：TATGGTGATGCTCGGCGT和TTCGTGCCACCTGAAACC；
aac(3)-IV：GTCTCTGACACATTCTGGCG和ATGACCGACTGGACCTTC；
dfr-12：GAATCGGTCCGCATTTATC和ATTGGGAAGAAGGCGTCAC；
aph(3)-Ia：AGCGTCTCCGACCTGATG和GTATTGACCGATTCCTTGC；
cmlA：CTCTTGTTTGGACCGCTATC和ACAACCAGAAGTTCAGGCAC；
uidA：GTCACGCCGTATGTTATTGC和AACTGTTCGCCCTTCACTG；
fhuA：CCGAACCGCTGAAAGAAG和CAGACGCCGTAACCATAAAC；
yjaA：AGACGCTGCCTTCAGTAAC和GACGCTCTGAGGTGGACG；
feoB：GTGTAGGTAACTGGGCTGG和AGTGAATCTGCTTCGTTGAG；
16srDNA：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
和AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102559892A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-07-11 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 饲料样品中肠毒性大肠杆菌的快速测定引物及其应用 |
| WO2014043838A1 (zh) * | 2012-09-24 | 2014-03-27 | 河北科星药业有限公司 | 预防禽类大肠杆菌病的广谱菌苗的制备方法 |
| CN104164476A (zh) * | 2013-05-20 | 2014-11-26 | 复旦大学 | 脑膜脓毒黄杆菌分子检测方法 |
| CN105385685A (zh) * | 2015-12-11 | 2016-03-09 | 扬州大学 | 用于快速预判禽源大肠杆菌分离株致病力的引物组合及试剂盒 |
| CN105779585A (zh) * | 2015-12-18 | 2016-07-20 | 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 肠出血性大肠杆菌检测用的引物和探针组、试剂盒及pcr检测方法 |
| CN107312841A (zh) * | 2017-07-05 | 2017-11-03 | 贵州省畜牧兽医研究所 | 猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒 |
| CN109402035A (zh) * | 2018-11-06 | 2019-03-01 | 华中农业大学 | 一种肠外致病性大肠杆菌重组菌株及其应用 |
Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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-
2007
- 2007-06-29 CN CN2007100239402A patent/CN101096706B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102559892A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-07-11 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 饲料样品中肠毒性大肠杆菌的快速测定引物及其应用 |
| CN102559892B (zh) * | 2011-12-30 | 2014-07-09 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 饲料样品中肠毒性大肠杆菌的快速测定引物及其应用 |
| WO2014043838A1 (zh) * | 2012-09-24 | 2014-03-27 | 河北科星药业有限公司 | 预防禽类大肠杆菌病的广谱菌苗的制备方法 |
| CN104164476A (zh) * | 2013-05-20 | 2014-11-26 | 复旦大学 | 脑膜脓毒黄杆菌分子检测方法 |
| CN104164476B (zh) * | 2013-05-20 | 2018-10-26 | 复旦大学 | 脑膜脓毒黄杆菌分子检测方法 |
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