CN101096682A - 植物中外源基因的瞬时表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明为植物中外源基因的表达方法，具体涉及一种根部吸收法，本发明是通过病毒载体介导，农杆菌吸收法将植物根部浸于农杆菌重悬液中，通过根部自然吸收携带有目的基因的病毒载体的菌液来表达外源基因，本发明在一定程度上提高了外源蛋白的表达水平。其操作过程更为简单，快捷，可在更短时间内获得较高水平的外源蛋白的表达，其表达量可占植物总可溶性蛋白的6％以上。能够实现外源蛋白大规模的生产和推广应用，更易于一些急需药用蛋白的快速规模化生产。

Description

植物中外源基因的瞬时表达方法

技术领域

本发明为一种植物中外源基因的表达方法，具体涉及一种根部吸收法。

背景技术

近年来，随着利用植物来表达外源蛋白的发展，许多研究者开始了在植物中利用病毒载体来进行瞬时表达外源基因，其实用价值和开发前景已获得普遍的肯定。利用植物生产的一些药用蛋白，疫苗，抗体等已经用于临床实践阶段，利用植物生产外源蛋白越来越显出其重要意义。目前，人们普遍使用叶片注射法来进行外源基因的瞬时表达，其缺点是难以实现规模化生产，从而影响了其在生产上的推广应用。

在过去的二十年中，大量研究表明植物能够有效表达许多外源蛋白，包括人的血清蛋白，生长因子，抗体，疫苗等。利用植物生产外源蛋白主要有两种方式，即稳定表达和瞬时表达。瞬时表达具有快速，安全，有效等优点，因此，近些年来逐渐成为国内外的研究热点。几个植物病毒载体已经被发展为能够成功表达外源蛋白的载体，包括烟草花叶病毒，马铃薯X病毒，烟草脆裂病毒(TMV，PVX和TRV)等。

现在普遍用于瞬时表达外源蛋白的方法有叶片注射法和真空吸收法，但这两种方法都有其局限性，难以实现规模化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物中外源基因的瞬时表达方法

实验材料：

植物材料：包括烟草Nb和Nb-Hc-Pro基因型，Nb-Hc-Pro为表达转录后基因沉默抑制子Hc-Pro的转基因烟草植物。将Nb和Nb-Hc-Pro的种子播种于1/2MS培养基(网上查得)，放于光照培养箱，培养一周左右。将小苗移栽于花盆中，在25±3℃的温度条件下，每天光照16h和黑暗8h的循环条件下进行培养，生长28-35天左右，分别选取处于四叶期，五叶期和六叶期的小苗作为侵染材料。

载体和菌种：

原始载体p35S-30B-GFP(如图1)由中国科学院微生物研究所植物生物技术实验室公开提供，EHA105-30B-GFP载体由本实验室以常规方法构建。农杆菌EHA105由本实验室储备(可以在市场购买到)。绿色荧光蛋白(GFP)纯化蛋白可以在市场购买到。兔源绿色荧光蛋白(GFP)抗体购买于宝生物公司。

农杆菌侵染液：

将农杆菌EHA₁₀₅-30B-GFP放于5ml LB中(添加5ul的50ug/ml卡那霉素，5ul的50ug/ml利福平，5ul的5ug/ml四环素)，28℃条件下过夜培养，，然后将1ml过夜的培养物按照1∶50的比例进行扩摇(280r/min)。50mlLB中加入以上抗生素各50ul后，添加Mes 10mol/L(PH5.6)和AS 20mol/L。28℃条件下过夜，农杆菌培养液在3000r/min，4℃条件下离心收集菌体，然后重悬于重悬液MMA(10mmol/L Mgcl₂，10mmol/LMes，100umol/L AS。分别选择重悬液MMA OD₆₀₀为0.58，0.82，1.05，1.25，1.41，1.62的浓度进行侵染，在侵染前静置3h。

实验方法：

根部吸收法：

取4-5ml的农杆菌EHA₁₀₅-30B-GFP重悬液，盛放于5ml离心管中，然后分别将四叶期，五叶期和六叶期的带根小苗的根部直接放入重悬液中，最后将浸染材料在室温28℃，日光、灯光照射16h或黑暗8h中培养，并在紫外灯照射条件下进行连续一周的观察并拍照。对表达绿色荧光蛋白(GFP)的植株分别提取植物总RNA和总可溶性蛋白，进行RT-PCR水平和蛋白水平(Western-Blot)上的检测。

本发明具有操作过程简单，容易规模化，具有较高的表达水平等优点。将有利于在植物中进行药用蛋白的大规模的生产、推广和应用。

附图说明

附图1为p35S-30B-GFP载体图；

附图2为不同菌液浓度对表达效率影响的示意图；

附图3为不同苗龄的小苗对表达效率影响的示意图；

附图4为干旱处理对表达效率影响的示意图

具体实施方式

实例一：

在非去根处理实验中，以Nb-HC-Pro植株五叶期的小苗作为宿主材料。将Nb-Hc-Pro的种子播种于1/2MS培养基(网上查得)，放于光照培养箱，培养一周左右。将小苗移栽于花盆中，在25±3℃的温度条件下，每天光照16h和黑暗8h的循环条件下进行培养，取生长30天左右的小苗做侵染。当采用菌液重悬液(MMA)OD₆₀₀＝1.23时进行侵染，绿色荧光蛋白(GFP)表达的效率达到了100％；当侵染菌液浓度较低时(MMA OD₆₀₀＝0.58)，其表达效率降低50％(如图2)。表达效率由具有绿色荧光现象表型的植株占总株数的百分比决定。

实例二：

在非去根处理实验中，采用菌液重悬液(MMAOD₆₀₀＝1.2时)进行侵染。将Nb-Hc-Pro的种子播种于1/2MS培养基(网上查得)，放于光照培养箱，培养一周左右。将小苗移栽于花盆中，在25±3℃的温度条件下，每天光照16h和黑暗8h的循环条件下进行培养，生长28～35天左右的小苗作为侵染材料。以Nb-HC-Pro植株四叶期的小苗(移栽后生长28天)作为宿主材料，绿色荧光蛋白(GFP)表达的效率达到了90％；以Nb-HC-Pro植株五叶期的小苗(移栽后生长30天)作为宿主材料，绿色荧光蛋白(GFP)表达的效率达到了95％；以Nb-HC-Pro植株六叶期的小苗(移栽后生长35天)作为宿主材料，绿色荧光蛋白(GFP)表达的效率达到了20％。表达效率由具有绿色荧光现象表型的植株占总株数的百分比决定(如图3)。

实例三：

在去根处理实验中，以Nb-HC-Pro植株五叶期的小苗(移栽后生长30天)作为侵然材料，当菌液重悬液(MMA OD₆₀₀＝1.2时)，侵染后3天可观测到绿色荧光蛋白(GFP)在幼叶中开始表达，侵染后7天可观测到绿色荧光开始扩散到老叶片，并发现在新生的根中绿色荧光蛋白(GFP)也有表达现象。在非去根处理试验中，侵染后12小时即可观察到绿色荧光蛋白(GFP)在茎中大量表达，并开始在幼叶中表达，侵染后3天可观测到绿色荧光蛋白(GFP)在老叶中开始表达，侵染后5天整个植株呈现通透的绿色荧光。非去根处理小苗比去根处理小苗的GFP表达的速度更快，我们推测植株的根部增强了其吸收菌液的能力。RT-PCR结果为外源基因在植物组织中传播提供了证据。

实例四：

我们发现绿色荧光蛋白(GFP)的表达效率还受温度，湿度影响。将Nb-Hc-Pro的种子播种于1/2MS培养基(网上查得)，放于光照培养箱，培养一周左右。将小苗移栽于花盆中，在25±3℃的温度条件下，每天光照16h和黑暗8h的循环条件下进行培养，将生长22天左右的小苗进行干旱处理(不浇水)7天左右，再进行侵染实验。在低浓度的菌液条件下(MMA OD₆₀₀＝0.58)，可增加绿色荧光蛋白(GFP)的表达效率60％(如图4)。结果暗示了用根部吸收体系进行外源蛋白的表达，主要在于菌液迅速在植物体内达到一定量的积累过程。

Claims (2)

1、植物中外源基因的瞬时表达方法，其特征是取4-5ml的农杆菌EHA₁₀₅-30B-GFP重悬液，盛放于5ml离心管中，然后分别将四叶期，五叶期和六叶期的带根小苗的根部直接放入重悬液中，然后将浸染材料在室温28℃，日光、灯光照射16h或黑暗8h中培养，并在紫外灯照射条件下进行连续一周的观察并拍照，对表达绿色荧光蛋白GFP的植株分别提取植物总RNA和总可溶性蛋白，进行RT-PCR水平和蛋白水平Western-Blot上的检测。

2、按照权利要求1的植物中外源基因的瞬时表达方法，其特征是植物材料为烟草Nb和Nb-Hc-Pro基因型，Nb-Hc-Pro为表达转录后基因沉默抑制子Hc-Pro的转基因烟草植物，重悬液MMA OD₆₀₀的浓度为0.58，0.82，1.05，1.25，1.41，1.62。

Images