CN101078031B - 微流路系统 - Google Patents

微流路系统 Download PDF

Info

Publication number
CN101078031B
CN101078031B CN2007101079773A CN200710107977A CN101078031B CN 101078031 B CN101078031 B CN 101078031B CN 2007101079773 A CN2007101079773 A CN 2007101079773A CN 200710107977 A CN200710107977 A CN 200710107977A CN 101078031 B CN101078031 B CN 101078031B
Authority
CN
China
Prior art keywords
path system
hybridization
microflow path
nucleic acid
beading
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2007101079773A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101078031A (zh
Inventor
大西通博
阿部友照
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sony Corp
Original Assignee
Sony Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sony Corp filed Critical Sony Corp
Publication of CN101078031A publication Critical patent/CN101078031A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101078031B publication Critical patent/CN101078031B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502746—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means for controlling flow resistance, e.g. flow controllers, baffles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/56—Labware specially adapted for transferring fluids
    • B01L3/561—Tubes; Conduits
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0832—Geometry, shape and general structure cylindrical, tube shaped
    • B01L2300/0838—Capillaries
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
    • B01L2400/084—Passive control of flow resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/60—Construction of the column
    • G01N30/6004—Construction of the column end pieces
    • G01N30/603—Construction of the column end pieces retaining the stationary phase, e.g. Frits

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的目的在于提供可以进行高流量液体输送的新型微流路系统。在具有内径为0.5mm以上的柱层的微流路系统(1)中，该柱层由杂交形成部(111)、送液促进部(112)构成，该杂交形成部(111)填充有串珠，并填充成珠床长度为4mm以下，该送液促进部(112)设置在该杂交形成部(111)的下游区域，有助于实现液体输送的高速化。由于防止了微流路内的堵塞以及内压上升，从而可以进行高流量液体输送。

Description

微流路系统
技术领域
本发明涉及能够高流量输送液体的微流路系统。更具体地说，涉及通过防止微流路内的堵塞和内压上升，能够实现高流量输送液体的微流路系统。
背景技术
近年来，对可用于遗传因子的变异分析、SNPs(单核苷酸多态)分析、遗传因子显现频度分析、遗传因子网络阐明等的生物鉴定技术的开发正逐步发展。例如列举出使用所谓的DNA芯片或DNA微序列(以下，在本申请中统称为DNA芯片)的集成基板的方法。
以集成有上述DNA芯片、蛋白质的蛋白质芯片等为代表的传感器芯片技术，是利用检测用物质(多被称为探针物质)与目标物质之间的独特的相互作用来调查目标物质的含量、构成成分及效力的方法。
最近，提出有使用流路、毛细管来进行检测用物质与目标物质之间的独特的相互作用的技术。例如，在专利文献1中公开了这样的技术：通过在形成于基板上的流路中进行相互作用分析，可以将分析所需液体检测体的量抑制为较少。在专利文献2中公开了这样的技术：在毛细管的周边形成光学检测部件，将该毛细管自身作为检测用的单元。在专利文献3中公开了检测用物质和目标物质在毛细管通路中进行相互作用，检测其流动特性的技术。
另外，作为物质之间的相互作用的应用，提出了在流路或细管内进行核酸之间的杂交(hybridization)的技术。例如，在专利文献4中公开了用流路将进行多核苷酸(polynucleotide)的增幅的部分、和杂交部分连接而成的多核苷酸的分析用部件，该杂交部分具有固定有检测用寡核苷酸(oligonucleotide)的多孔质层。在专利文献5中公开了在毛细管状的流路的内壁固定探针化合物，使该探针化合物与被检多核苷酸进行杂交的多核苷酸的分析方法。
专利文献1：日本特开2005—030906号公报
专利文献2：日本特开平10—170427号公报
专利文献3：日本特开平06—094722号公报
专利文献4：日本特开2005—130795号公报
专利文献5：日本特开2004—121226号公报
如上所述，在流路或毛细管等的较细流路内进行物质之间的相互作用时，由于输送样本溶液等液体，有时会产生堵塞等，会出现流路内压上升。特别是，在从生物体细胞等中提取的全RNA样本中，由于存在目标核酸以外的浮游物质或不适于杂交检测的长链核酸等，所以在输送液体时容易引起堵塞。
另外，即使在不存在浮游物质或长链核酸的情况下，由于在较细流路内发生杂交等，有时会减少流路的实际体积，同样会出现流路内压上升。
像这样流路内压上升时，会发生所输送的溶液、例如样本溶液等的泄漏，溶液的损失变大。另外，在样本溶液等中含有有害物质时等情况下，由于溶液的泄漏，存在安全性降低这样的问题。
发明内容
在此，本发明的目的在于提供一种可以防止微流路内的堵塞、防止内压上升，从而防止流通的溶液的泄漏，可进行高流量输送液体的微流路系统。
本发明的发明人，为了解决上述问题，对柱层的形态、样本溶液的前处理等的适合条件进行了认真研究，其结果，开发了可以防止微流路内的堵塞、以及防止内压上升，可进行高流量输送液体的新型微流路系统。
在本发明中，首先，提供了具有内径为0.5mm以上的柱层的微流路系统。使柱层的内径为0.5mm以上是为了防止流通的溶液引起堵塞。该柱层由填充有串珠的杂交形成部和设置在该杂交形成部的下游区域的有助于高速输送液体的送液促进部构成。
上述杂交形成部中，最好是填充串珠成珠床的长度为4mm以下、更优选为2mm以下。通过缩短柱长，以防止内压上升。
在本发明中还提供一种微流路系统，其特征是输送经过滤器过滤后的样本溶液。过滤样本溶液的过滤器，最好其孔径为0.65μm以下、更优选是0.1μm以下。用来除去浮游物质等。
在本发明的微流路系统的形成柱层的送液促进部中，可以采用填充灌注层析(Perfusion chromatography)粒子的结构。另外，在送液促进部的下游，也可以进行减压。
本发明的微流路系统的形成柱层的杂交形成部，起到作为使探针核酸与目标核酸进行杂交的场所的作用。固定在填充于杂交形成部中的串珠上的核酸，可以自由选择在探针核酸与目标核酸中任一个。
在将核酸固定在串珠上时，可以在其间介入具有同种碱基序列的连接体。例如，以聚T为连接体，通过使该聚T与全RNA样本中的具有多聚A尾巴部分的mRNA互补结合，可以将作为目标核酸的mRNA固定在串珠上。这种状态下，通过将含有与该mRNA互补结合的探针核酸的溶液输送到微流路系统中，从而在杂交形成部处，进行作为目标核酸的mRNA与探针核酸的杂交。
这时，预先对探针核酸标识(标记)可用于检测杂交的荧光物质或放射性物质等，通过捕捉从该标识物质所得到的光信息或放射线信息，从而可以对上述杂交进行检测。
以下对本发明中所使用的技术术语赋予定义。“碱基序列”是指聚合的两种以上的碱基。“连接体”是指用于将核酸保持于串珠上的规定序列的核酸。“目标核酸”是指与探针核酸之间形成互补链的核酸。“探针核酸”是指能够提供对检测杂交有用的信息的核酸。例如，可以举出标识有荧光物质的单链核酸、或者标识有放射性物质的单链核酸等，前者可通过检测激励荧光来检测杂交，而后者可以通过检测放射线来检测杂交。
“聚合”是指具有聚合了两个以上碱基的碱基序列的核酸分子。“聚T”是指聚合了两个以上碱基胸腺嘧啶(T)的碱基序列的核酸分子，“多聚A尾巴(poli(A)tail)”是指附加在mRNA的3’末端的腺苷(adenosine)链。
根据本发明，由于可以防止微流路内的堵塞以及微流路的内压上升，可以防止流通的溶液的泄漏，从而可以安全、反应效率高地进行高流量输送液体。
附图说明
图1是表示本发明微流路系统1的优选实施方式的一例。
图2是示意地表示填充在杂交形成部111内的串珠21的表面上的物质结构的一例子的图。
图3是示意地表示保持在串珠21上的探针核酸P与目标核酸X发生杂交的情况的图。
图4是表示与图2不同的实施方式的、填充在杂交形成部111内的串珠21的表面上的物质结构的一例子的图。
图5是示意地表示保持在串珠22上的连接体L与目标核酸X互补结合的情况的图。
图6是示意地表示探针核酸Y与通过连接体L保持在串珠22上的目标核酸X发生杂交的情况的图。
图7是表示采用本发明的微流路系统1进行分析的工序的例子。
图8是表示在实施例1中，聚dT串珠的珠床长度为4mm时的荧光测定结果的代替图的图表。
图9是表示在实施例1中，聚dT串珠的珠床长度为2mm时的荧光测定结果的代替图的图表。
具体实施方式
以下，参照附图说明为实施本发明所采用的优选实施方式。另外，以下说明的实施方式只是表示本发明的有代表性的实施方式的一例子，不可由此将本发明的范围解释得较窄。
首先，图1是表示本发明的微流路系统的优选实施方式的一例子。
该图1中附图标记1所示是微流路系统，大致是由作为样本溶液的流路的口径为0.5mm左右的细管11、形成于该细管11的一端的导入部12、形成于该细管11的另一端的排出部13构成。另外，图1所示的箭头W表示为样本溶液等的流动方向。
在该图示的微流路系统1中设有杂交形成部111，该杂交形成部111具有在接近导入部12的细管11部分的内部填充有许多微小粒径的串珠2的结构。该杂交形成部111起到作为进行杂交等所期望的相互作用的部分(区域)的作用。
填充于杂交形成部111中的串珠2的珠床的长度B最好是4mm以下、更优选是2mm以下。通常，珠床的长度B越长，则微流路内压也会上升，因此，在本发明的微流路系统中，缩短杂交形成部111的珠床长度B，以防止微流路内压的上升。
在杂交形成部111的下游侧(即、排出部13一侧)设有送液促进部112。该送液促进部112是起到促进向杂交形成部111送去样本溶液或清洗用的缓冲液等的输送液体速度的作用的部分(区域)。填充于送液促进部中的粒子3，只要是具有可促进液体输送功能的粒子即可，没有特别的限制，举其中一优选例，可以填充灌注层析粒子。
该灌注层析粒子的典型特点是具有被称为贯通孔(Through pore)的大孔与被称为吸附孔(Diffusive pore)的小孔。由此溶入缓冲液中的分子穿过上述贯通孔被送到吸附孔的各个角落。因此，分子与填充材料表面的官能团的接触面积变大，缓冲液的流动和官能团的距离与填充材料的粒子直径无关而变得非常小(1μm以下)，从而能够高流速且低压地输送液体。
另外，由于设置送液促进部112，不仅可以促进液体输送，还可以期待如下效果。通常多是在导入部12或排出部13的附近的细管部分设有用于与外部泵等连接的螺母等各部件，因此在该部分设置杂交形成部111时，难以进行观察和测定。但是，通过将送液促进部112设置在杂交形成部111的下游侧，从而能够将作为检测、测定的对象的杂交形成部111配置在微流路系统1的中央部附近，因此具有容易检测这样的优点。
另外，通过选择灌注层析粒子的种类，将剩余物质或有害物质(如放射性物质)吸附并封存，可以使其不排出到外部。因此，如果选择这样的粒子3，就能将通过了微流路系统1的溶液直接废弃，本发明的微流路系统还具有这样的优点。
向本发明的微流路系统1中输送样本溶液时，虽然也可以直接输送，不过更优选是在将样本溶液过滤之后再将其输送到微流路系统1。这是用于除去浮游物质等。若预先过滤掉样本溶液中的浮游物质等，可以防止微流路系统1的堵塞。
为了去除浮游物质、长链核酸，用于过滤的过滤器的孔径优选是0.65μm以下、更优选是0.1μm以下。在用过滤器过滤之前，为了提高过滤的精度，也可以自由进行离心分离。
本发明的微流路系统1中，也可以在送液促进部112的下游处进行减压。通常，由于从上游输送来的液体，在杂交形成部111的上游侧会产生压力集中，但通过将下游侧保持为负压，从而可以改善微流路系统1中的液相的流动。
举减压方法的一例，在排出部13连接未图示的注射器等，通过吸引该注射器，从而可以将排出侧保持负压。
图2是示意地表示填充在杂交形成部111内的串珠21的表面上的物质结构的一例子的图。
串珠21是由聚苯乙烯等材料形成的微小的微型串珠。这种串珠21的表面具有适于化学结合核酸的一末端的结构。
这种串珠21具有，例如通过抗生物素-生物素(avidin-biotin)结合或耦合反应(例如重氮耦合反应)等结合在该种串珠22的表面上的探针核酸P。在这种状态下，将串珠21填充到微流路系统1的杂交形成部111。探针核酸P以保持在串珠21上的状态，在杂交形成部111等待与被输送到该杂交形成部111中的样本溶液中的互补的目标核酸X发生杂交。杂交的情况如图3所示。
图3中示意地表示目标核酸X与处于保持在串珠21状态的探针核酸P的单链部分发生杂交、形成双链的情况的图。虽然图中未示出，在探针核酸P或目标核酸X上预先标识(标记)能用于检测杂交的荧光物质或放射性物质等，从而通过捕捉从该标识物质发出的光信息或放射性信息，可以对上述杂交进行检测。
图4是示意地表示与图2不同的实施方式的、填充于杂交形成部111内的串珠22的表面上的物质结构的图。
这种串珠22，例如通过抗生物素-生物素结合或耦合反应(例如重氮耦合反应)等结合在该种串珠22的表面上的作为寡聚核酸的连接体L。该连接体L只要是具有与目标核酸X互补结合的碱基序列即可，并没有特别限定，举其一例，优选是具有同种碱基序列的聚T的物质。
图5是示意地表示连接体L与目标核酸X发生互补结合的情况的图。例如，如图5所示，连接体L具有聚T碱基序列部分时，目标核酸X的聚A部位基于聚A选择方式而与上述聚T部位发生互补结合。作为目标核酸X的优选例之一，可以举例具有多聚A尾巴的mRNA。
上述目标核酸X，以通过连接体L保持在串珠22上的状态，在杂交形成部111中等待与被输送到该杂交形成部111的样本溶液中的互补核酸Y发生杂交。杂交的方式如图6所示。
图6示意地表示探针核酸Y与通过连接体L保持在串珠22上的目标核酸X的单链部分发生杂交而形成双链的情况的图。
如图6所示，预先在探针核酸Y标识(标记)可用于检测杂交的荧光物质F或放射性物质(未图示)等，通过捕捉从标识物质中发出的光信息或放射性信息，可以对上述杂交进行检测。
这样的杂交分析可以用于如下目的的检查等，例如将从被检验者的细胞等中提取出来的mRNA通过连接体L保持在串珠22上，判定具有与众所周知的发病原因遗传因子有关的碱基序列的探针核酸Y是否与该mRNA发生杂交。
以上的分析，例如可以基于图7的工序图中所示的方法来实施。首先，进行第1工序：向构成微流路系统1的细管11的规定位置填充如灌注层析粒子那样的具有促进液体输送作用的粒子3，形成柱状的送液促进部112(如图7中的(I)工序)。
然后，进行第2工序：向送液促进部112的上游侧填充固定化有连接体L的串珠22，形成柱状的杂交形成部111(如图7中(II)工序)。
然后，向填充有串珠22的杂交形成部111中输送含有目标核酸X的第1样本溶液S1(如图7中(III)工序)，这时，保持在串珠22上的连接体L(例如，聚T)与目标核酸X(例如聚A的尾部分)发生互补结合(形成第1杂交，如图7中(IV)工序)。
接着，将含有探针核酸Y的第2样本溶液S2输送到杂交形成部111(如图7中(V)工序)。然后在规定温度、pH条件下，按规定时间进行目标核酸X与探针核酸Y之间的杂交。(形成第2杂交、图7中(VI)工序)。这时利用从探针核酸Y得到的信息(例如从所标识的荧光物质得到的激励荧光信息)对杂交进行检测。
实施例1
在实施例1中，调查本发明的微流路系统的构成柱层的杂交形成部中所填充的珠床的长度的影响。
<微柱的制作>
首先，作为构成流路系统的细管，准备内径为0.53mm、外径为0.68mm、长度为6cm的熔融石英毛细试管(fused silicacapillary tube)(ジ一エルサイエンス株式会社制)。
然后，分别采用管子管套、套圈(Ferrule)、螺母将设置有孔径1μm的过滤器的排出部安装到输送液体的下游侧的端部，将未设置滤器的导入部安装到输送液体的上游侧。另外，在上游侧的导入部安装与Rheodyne型注射器对应的填充口，在下游侧的排出部安装有可换针(lure lock needle)。
<灌注层析粒子的调制>
作为灌注层析粒子，使用POROS20R1(应用生化系统)。将其分散在10％酒精溶液中，调制粒子分散溶液(以下称为POROS溶液)。
<与多核苷酸结合的微串珠的调制>
在抗生蛋白链菌素单纯微球(Streptavidin coatedmicrosphere plain)(直径6μm，polysciences)的水溶液中，加入在5’末端修饰有生物素的脱氧胸腺嘧啶核苷(deoxythymidine)(dT)的多核苷酸(21mer)，调制通过与抗生物素-生物素结合而固定了聚dT的串珠(以下称为“聚dT串珠”)。
<送液促进部的形成>
将注射器安装于微柱的排出部的可换针上。将吸入了POROS溶液的Rheodyne型注射器安装到微柱的导入部的填充口。这样，通过吸引安装在排出部的上述注射器，在上述管子内注入了作为灌注层析粒子的POROS粒子。
<送液促进部的泄漏测试>
将POROS的注入量以1.25mg左右可变，制成只有POROS的珠床的微柱。用纯净水作为输送液体，将流量从5μL/min开始逐渐上升到100μL/min地进行输送，但在下游侧的废液按流量排出，没有发现泄漏等情况。
<杂交形成部的形成>
接着，用同样的方法将按上述顺序调制的聚dT串珠1.3mg注入到送液促进部的上游侧。这时的珠床长度为4mm。另外，减少聚dT串珠的注入量，可以形成珠床长度为2mm的微柱。
<杂交形成部的泄漏测试>
与送液促进部一样，输送纯净水，直到流量达到100μL/min都是按流量排出，没有发现泄漏等情况。
<微柱的设置>
从按上述制成的微柱拆卸下可换针与填充口，固定在作为荧光显微镜的平台上的热板上。准备只在一侧安装有套圈与螺母的细管、在两侧都带有套圈与螺母的细管、注射泵及排液瓶。
首先，将两侧都有套圈与螺母的细管安装到微柱的上游侧的导入部。然后，通过中间连轴器将该细管的另一侧的套圈与螺母安装在可换针上，与设置在注射泵上的注射器连接。然后，在微柱的下游侧安装只在一侧安装有套圈与螺母的细管，将该细管的另一侧导入排液瓶。
<泄漏测试>
确认按上述设置的微柱在输送液体时的泄漏等情况。将纯净水输送到微柱中，调查有无泄漏时，没有发现泄漏。
<全RNA的提取>
采用标准的全RNA试剂盒(全RNA kit)的RneasyProtect kit(Qiagen)，在纯净水中从在10cm的皿中培养的Hela细胞提取全RNA，得到全RNA水溶液。
<全RNA样本溶液的调制>
在上述的全RNA水溶液中加入氯化钠水溶液，将氯化钠的浓度最终调整成为0.5M。
<全RNA样本溶液的离心过滤>
准备过滤器的孔径为0.1μm、0.22μm、0.45μm、0.65μm、5μm的离心过滤柱(アミコンウルトMC、日本ミリポア株式会社制)。按过滤器的孔径大小顺序进行离心过滤，将过滤后的液体作为样本溶液。
<聚dT与全RNA过滤样本的聚A部位的杂交形成>
对微柱输送0.5M氯化钠水溶液，置换微柱内的液相。将上述调制的样本溶液提取到注射器，与柱的上游侧的细管的可换针连接。用注射泵输入液体300μL，使聚dT与全RNA过滤样本的聚A部位进行杂交。在输送液体之后，再送入0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的0.5M氯化钠水溶液700μL，对微柱内进行清洗。
<检测物质与目标物质之间复合体的形成>
将具有与在接近mRNA的多聚A尾巴的21碱基序列互补的序列、并在5’侧中标识了Cy3的聚脱氧核苷酸(polydeoxynucleotide)用作β-肌动蛋白的探针物。在确定序列时利用了日本DNA数据库。将该探针物溶解到0.5M氯化钠水溶液中，调制5μM的探针溶液。将该探针溶液提取到注射器中，与上述一样，向微柱内输入300μL。输送液体之后，再送入0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的0.5M氯化钠水溶液700μL，对微柱内进行清洗。
<复合体形成的测量>
使用与具有Cy3用荧光过滤器的荧光显微镜(二コンインステック)连接的显微分光系统(大冢电子)测量Cy3的荧光，确定复合体形成的量。为了排除0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的影响，在0.5M氯化钠水溶液中置换液相后进行测量。杂交形成部的聚dT串珠的珠床长度为4mm时的测定结果示于图8中，聚dT串珠的珠床长度为2mm时的测定结果示于图9中。
<结果>
图8、图9中显示了输送探针溶液之前与之后的荧光光谱的差。在图8、图9中都可清楚的观察到Cy3的荧光的增加。如图8、图9所示，可以知道珠床的长度对荧光测量没有影响。另外，珠床长度为2mm时，即使以50μL/min进行输送液体也不会产生泄漏，与珠床长度为4mm的情况相比，可以确认其内压降低了。
在实施例1中可知，在本发明的微流路系统的形成柱层的杂交形成部中所填充的珠床的长度，优选是设为4mm以下、更优选是2mm以下。微流路内压随珠床的长度的缩短而降低，另外，若珠床的长度是微柱的内径大小的长度，则可以认为对荧光测量不产生影响。
实施例2
实施例2中，对在本发明的微流路系统中，用过滤器对全RNA样本溶液进行过滤时，优选的过滤孔孔径进行调查。
<全RNA样本溶液的离心过滤>
与实施例1一样，准备过滤器的孔径为0.1μm、0.22μm、0.45μm、0.65μm、5μm的离心过滤柱(アミコンウルトMC、日本ミリポア株式会社制)。按过滤器的孔径大小顺序对与实施例1同样的顺序调制出的全RNA样本溶液进行离心过滤，然后对所有过滤器上的残留液体进行观察，特别是孔径为0.65μm的过滤器上的残留液体很多。将过滤后的液体作为过滤样本溶液。采用没有过滤的样本溶液作为比较对象。
<泄漏观察>
观察向按与实施例1同样的顺序设置的微柱内输送过滤样本溶液时的情况、和输送未过滤样本溶液时的泄漏情况。设定聚dT串珠的珠床长度为4mm时，相对于流量的泄漏情况的结果如表1所示。将产生泄漏的情况用×表示、不产生泄漏的情况用O表示、可以输送液体但会产生一些泄漏的情况用Δ表示。
表1
 
流量(μL/min) 2 5 10 20 50
 
过滤样本溶液 O O Δ Δ Δ
未过滤样本溶液 Δ Δ Δ × ×
如表1所示可知，过滤样本溶液在50μL/min的高流量下有时也会产生一些泄漏，但可以采用10μL/min以上流量来输送液体。与此相对，若以50μL/min的高流量输送未过滤样本溶液，则在配管的连接部等频繁产生泄漏。若降低流量则可以输送液体，但要保证在没有泄漏的情况下输送液体，有时需要将流量降低到5μL/min乃至2μL/min。
从实施例2中可知，由于在输送样本溶液之前对其进行过滤，可以去除样本溶液中的浮游物质等，防止流路的堵塞。另外，在对样本溶液进行离心过滤的过程中，孔径为0.65μm的过滤器上的残留液体较多，由此可知，过滤器的优选孔径是0.65μm以下、更优选是0.1μm以下。另外，对过滤样本溶液以50μL/min的流量进行输送时，产生一些泄漏，这可以认为是由于被聚A选择到聚dT串珠上的mRNA使串珠间的流路的阻力变大、内压上升的缘故。
实施例3
在实施例3中，对在本发明的微流路系统的下游侧，一边进行减压一边输送样本溶液时的泄漏情况进行调查。
<注射器的安装>
按与实施例1同样的顺序设置微柱，在微柱的下游侧安装在两侧都具有套圈与螺母的细管。在细管的下游侧通过中间连轴器和可换针与注射器连接。
<样本溶液的输送与结果>
吸引上述安装的注射器，以将排出侧保持负压不变的状态输送样本溶液。设定聚dT串珠的珠床长度为4mm。与实施例2同样，将产生了泄漏的情况用×表示、不产生泄漏的情况用O表示、可以输送液体但产生一些泄漏的情况用Δ表示，结果如表2所示。如表2所示可知，在输送过滤后的样本溶液时，在流量为2μL/min、5μL/min、10μL/min、20μL/min时不产生泄漏，可以以20μL/min以上的流量输送液体。在输送未过滤的样本溶液时，由于吸引作用，虽然还有一些泄漏，但可以见到有所改善。
表2
 
流量(μL/min) 2 5 10 20 50
过滤样本溶液 O O O O Δ
未过滤样本溶液 Δ Δ Δ Δ ×
由实施例3可知，通过在本发明的微流路系统的下游侧进行减压，可以进行更高流量的输送液体。这是由于，虽然由上游送来的液体在上游侧发生压力集中，但由于将下游侧保持负压，从而可以改善液相的流动。
另外，在并用将实施例1中所调查得到的珠床长度的优选长度(2mm)与本实施例的减压时，可以预见将有进一步的改善液体输送的趋势。
在本发明的微流路系统中，由于可防止在微流路中的堵塞及微流路内的内压上升，所以可以实现高流量液体输送。特别是可有效用于对含有各种浮游物质、长链的核酸等的全RNA样本溶液进行输送。另外，由于在填充于微流路内填充的串珠的表面进行杂交形成，所以反应效率高，而且通过进一步对串珠进行清洗等，从而可以用作可重复利用的杂交检测技术。

Claims (6)

1.一种微流路系统，具有内径为0.5mm以上的柱层，其中，
该柱层由杂交形成部、送液促进部构成，该杂交形成部填充有串珠，并填充成珠床长度为4mm以下，该送液促进部设置在该杂交形成部的下游区域，有助于实现液体输送的高速化。
2.根据权利要求1所述的微流路系统，其特征在于，
对用孔径为0.65μm以下的过滤器过滤后的样本溶液进行输送。
3.根据权利要求1所述的微流路系统，其特征在于，
上述送液促进部中填充有灌注层析粒子。
4.根据权利要求1所述的微流路系统，其特征在于，
在上述送液促进部下游进行减压。
5.根据权利要求1所述的微流路系统，其特征在于，
在上述串珠上固定有具有同种碱基序列的连接体。
6.根据权利要求5所述的微流路系统，其特征在于，
上述连接体的同种碱基序列为聚T，
在上述杂交形成部，进行该聚T与全RNA样本中的具有多聚A尾巴部分的mRNA发生互补结合的第1杂交形成、和该mRNA与探针核酸发生互补结合的第2杂交形成。
CN2007101079773A 2006-05-22 2007-05-22 微流路系统 Expired - Fee Related CN101078031B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006-141896 2006-05-22
JP2006141896A JP4940756B2 (ja) 2006-05-22 2006-05-22 マイクロ流路系
JP2006141896 2006-05-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101078031A CN101078031A (zh) 2007-11-28
CN101078031B true CN101078031B (zh) 2010-11-03

Family

ID=38461888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007101079773A Expired - Fee Related CN101078031B (zh) 2006-05-22 2007-05-22 微流路系统

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20070267336A1 (zh)
EP (1) EP1859867A2 (zh)
JP (1) JP4940756B2 (zh)
CN (1) CN101078031B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4297148B2 (ja) * 2006-09-22 2009-07-15 ソニー株式会社 核酸回収装置及び核酸回収方法
JP5115312B2 (ja) * 2008-05-02 2013-01-09 ソニー株式会社 核酸分離用担体の製造方法、及び核酸分離用担体とマイクロ流路系、並びに核酸分離方法と核酸分離装置
EP3249038B1 (en) * 2015-01-22 2019-08-21 ARKRAY, Inc. Target analysis chip and target analysis method
KR101888239B1 (ko) * 2016-05-06 2018-09-06 고려대학교 산학협력단 막힘 현상을 이용한 혈소판 검사 장치
KR101674018B1 (ko) * 2016-05-16 2016-11-08 (주)글로리바이오텍 Cd4, cd8 세포 정보를 이용한 hiv 진단 방법
US9770717B1 (en) * 2016-11-03 2017-09-26 International Business Machines Corporation Microfluidic chip with bead integration system

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000050172A1 (en) * 1999-02-23 2000-08-31 Caliper Technologies Corp. Manipulation of microparticles in microfluidic systems
CN1460036A (zh) * 2000-09-22 2003-12-03 财团法人川村理化学研究所 微型化学装置及其流量调节方法
CN1730142A (zh) * 2004-08-06 2006-02-08 日立产业有限公司 微型流体芯片

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5019270A (en) * 1989-07-06 1991-05-28 Perseptive Biosystems, Inc. Perfusive chromatography
WO1993022022A1 (fr) * 1992-04-29 1993-11-11 Institut Français Du Petrole Procede et dispositif de fractionnement d'un melange en lit mobile simule en presence d'un gaz comprime, d'un fluide supercritique ou d'un liquide subcritique
US5804384A (en) * 1996-12-06 1998-09-08 Vysis, Inc. Devices and methods for detecting multiple analytes in samples
AU2002241515A1 (en) * 2000-11-06 2002-06-18 The University Of Houston System Nucleic acid separation using immobilized metal affinity chromatography
US20030217923A1 (en) * 2002-05-24 2003-11-27 Harrison D. Jed Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis systems

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000050172A1 (en) * 1999-02-23 2000-08-31 Caliper Technologies Corp. Manipulation of microparticles in microfluidic systems
CN1460036A (zh) * 2000-09-22 2003-12-03 财团法人川村理化学研究所 微型化学装置及其流量调节方法
CN1730142A (zh) * 2004-08-06 2006-02-08 日立产业有限公司 微型流体芯片

Also Published As

Publication number Publication date
US20070267336A1 (en) 2007-11-22
CN101078031A (zh) 2007-11-28
EP1859867A2 (en) 2007-11-28
JP2007309900A (ja) 2007-11-29
JP4940756B2 (ja) 2012-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101078031B (zh) 微流路系统
Zhao et al. Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs)
US10416150B2 (en) Microfluidic isolation of tumor cells or other rare cells from whole blood or other liquids
US10717086B2 (en) Integrated system for isolation and emulsification of particles and cells
Adams et al. Highly efficient circulating tumor cell isolation from whole blood and label-free enumeration using polymer-based microfluidics with an integrated conductivity sensor
CA2874343C (en) Single-particle analysis of particle populations
EP2853893B1 (en) Method for processing blood sample
Khetani et al. Filter‐based isolation, enrichment, and characterization of circulating tumor cells
Rana et al. Advancements in microfluidic technologies for isolation and early detection of circulating cancer-related biomarkers
US20210016276A1 (en) Methods and apparatus for single biological nanoparticle analysis
JP2019193931A (ja) 溶液混合容器、及び流体デバイス
JP2008526255A (ja) 微量流体希薄細胞検出デバイス
WO2015045666A1 (ja) 流体デバイス、エキソソームの分析方法、生体分子分析方法及び生体分子検出方法
CN102439128A (zh) 用于纯化生物物质的系统和方法
US20100288689A1 (en) Microfluidic filtration unit, device and methods thereof
US20240158835A1 (en) Method for determination of cellular mrna
Kim et al. Microparticle parking and isolation for highly sensitive microRNA detection
WO2021103970A1 (zh) 一种微流控芯片的使用方法及其装置
Zhang et al. Microbial detection in microfluidic devices through dual staining of quantum dots-labeled immunoassay and RNA hybridization
AU2016405636B2 (en) Systems and methods for enriching target cells in a sample
Lay et al. Enhanced microfiltration devices configured with hydrodynamic trapping and a rain drop bypass filtering architecture for microbial cells detection
JP2012018039A (ja) マイクロ流路と核酸ハイブリダイゼーションのためのマイクロチップとカラム及び装置並びに方法
US20110076684A1 (en) Apparatus and method for acquiring, detecting, and analyzing cells in a microfluidic system
JP4626350B2 (ja) ハイブリダイゼーション検出に適する反応部などを有する流路系、該流路系を用いるハイブリダイゼーション検出装置
CN111615630A (zh) 微流体装置

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20101103

Termination date: 20130522