CN101073561A - 结构类似Combretastatin A4的化合物在制备用于抑制微管蛋白聚合或抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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冼励坚
邹永
蔡于琛
王志新
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本发明公开了结构类似Combretastatin A4的化合物在制备用于抑制微管蛋白聚合或抗肿瘤药物中的应用。本发明发现结构类似Combretastatin A4的化合物能用于制备抑制微管蛋白聚合或抗肿瘤的药物，应用前景广阔。

Description

结构类似Combretastatin A4的化合物在制备用于抑制微管蛋白聚合或抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及结构类似Combretastatin A4的化合物，具体的说，涉及结构类似Combretastatin A4的化合物在制备用于抑制微管蛋白聚合或抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
血管阻断剂(Vascular Disrupting Agents，VDA)是近年来出现的抗血管、抗肿瘤药物领域的一支重要的生力军。血管阻断剂(VDA)从机理上源自于微管蛋白结合，属于抗微管药物。研究认为，微管蛋白分子结构中有三个较为明确的小分子结合部位，即秋水仙碱结合部位(Colchicine domain)、长春碱结合部位(Vinca domain)和紫杉烷结合部位(Taxane site)，前两者定位于聚合前的微管蛋白，后者定位于聚合后的微管。与秋水仙碱及长春碱部位相结合的配体能干扰、阻断微管的形成，而与紫杉烷部位结合的配体能稳定微管，最终都能阻断有丝分裂，导致细胞死亡。
早期发现的具有抑制微管蛋白作用的化合物应属秋水仙碱(Colchicine)，但由于秋水仙碱的产生毒副作用的剂量与治疗剂量相差无几，临床应用受到极大的限制。目前，已在欧美进入临床研究、具有代表性的VDA类药物主要有：CA4P、CA1P(即Oxi-4503)、
AVE-8062(即AC-7700)、ZD-6126、DMXAA(即AS-1404)及TZT-1027等等。为更有利于血液给药及提高靶向性，这些化合物大都被设计成为水溶性前体药物，当其进入体内后，经相应的磷酸酯酶或氨基肽酶水解而释放出原药，发挥抗血管、抗肿瘤作用。
在VDA中具有开创意义和领先水平的化合物当属CA4P(Combretastatin A4 Prodrug)。CA4P是第一个进入临床研究的VDA，它是从非洲灌木Combretum Caffrum的树皮中分离得到的一种多取代二苯乙烯类化合物、高活性抗肿瘤天然产物——CA4(Combretastatin A4)的磷酸酯化前体药物。研究证实CA4是强效的微管蛋白结合剂，能与微管蛋白β亚基结合、干扰微管及纺锤体形成、阻断有丝分裂过程，CA4能区分肿瘤细胞和正常细胞在增殖特性、细胞脆性、蛋白水平等方面的差异，选择性的作用于肿瘤血管内皮细胞，导致其变形、膨胀、从基底膜上脱落、使肿瘤血管堵塞、关闭，最终导致肿瘤细胞继发性死亡。同时，对正常内皮细胞及其他非异常增殖的细胞影响很小。但CA4的水溶性极差，难以通过血管给药。1995年，Pettit等人设计合成了CA4的磷酸酯化二钠盐前体药物CA4P，极大的改善了其水溶性和药代动力学性质，利用磷酸酯酶在增殖的血管内皮细胞中的浓度高于正常细胞中的特点，使CA4P在肿瘤血管中被选择性激活，靶向的释放出CA4并发挥抗血管、抗肿瘤作用。
近年来的研究认为，由于VDA类药物作用于肿瘤血管并使其关闭，其对深部肿瘤细胞的作用较强，而对可从正常组织获取养分的外周肿瘤细胞的杀伤作用较弱，体内试验发现单独给予VDA类药物，肿瘤边缘部位细胞仍能保持活力并继续生长。但VDA类药物的作用机理及特点正好与传统的放化疗互补(传统放化疗对供氧充足的外周肿瘤细胞杀伤作用较强，而对深部肿瘤效果较差)，因此，VDA类药物适合与其他治疗方式联合应用，目前正在进行的临床研究也反应了这一点。如有关CA4P的9项临床研究中，除退行性甲状腺癌(ATC)、近视性黄斑病变(MMD)和老年性黄斑病变(AMD)以外，其用于卵巢癌(Ovarian Cancer)、乳腺癌(Breast Cancer)、肺癌(Lung Cancer，包括晚期非小细胞肺癌NSCL)、头颈癌(Head & Neck Cancer)、前列腺癌(Prostate Cancer)、结肠癌(Colorectal Cancer)、晚期复发性宫颈癌(Cervical Cancer)等的治疗均与放化疗联合应用。另外，由于CA1P作为更新一代的VDA，除保持优良的抗血管活性外，其直接作用于肿瘤细胞的细胞毒性明显提高，CA1P单独用药的疗效明显优于其他VDA。因此，需要进一步开发兼有良好抗血管作用及直接抗肿瘤作用的新型VDA药物。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供结构类似Combretastatin A4的化合物在制备用于抑制微管蛋白聚合或抗肿瘤药物中的应用。
本发明的结构类似Combretastatin A4的化合物的结构如通式(I)所示：
Figure A20071002874700061
其中，R为-OH或-OPO(ONa)2。
当R＝-OH时，名称为(Z)-3，4′，5-三甲氧基-3′-羟基二苯乙烯，简称为M286，分子式为C17H18O4，分子量为286.32，为棕色液体；其结构式如(II)所示：
Figure A20071002874700062
当R＝-OPO(ONa)2时，名称为(Z)-3，4′，5-三甲氧基二苯乙烯-3′-O-磷酸酯二钠盐，简称为M410，分子式为C17H17Na2O7P，分子量为410.27，为白色固体；其结构式如(III)所示：
Figure A20071002874700071
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明发现结构类似Combretastatin A4的化合物能用于制备抑制微管蛋白聚合或抗肿瘤的药物，应用前景广阔。
附图说明
图1为M410对微管蛋白聚合的抑制作用图；
图2为M410对人结肠癌(LoVo)在裸鼠体内生长的抑制作用图；
图3为M410单用及联合5-Fu对人肝癌(HepG2)在裸鼠体内生长的抑制作用图。
具体实施方式
实施例1：Combretastatin A4类似物的体外抗肿瘤细胞增殖实验
所选的细胞株包括：人口腔上皮癌KB-3-1，人胃腺癌MGC803，宫颈癌HeLa，乳腺癌MCF-7，肝癌HepG2，结肠癌LoVo和白血病HL-60细胞株等。取对数生长期肿瘤细胞制成一定浓度的细胞悬液接种于96孔板中，每孔加入一定浓度的待测药物，对照孔不加药物，每个浓度设4个平行孔。培养68小时加入MTT 100μg/孔，继续培养4小时，弃去培养液，加入200μL二甲基亚砜，震荡15分钟完全溶解后，用酶标仪测定570/630nm双波长吸光光度值，用Logit法计算抑制50％细胞生长时的药物浓度(IC50)。实验重复3次，结果见表1。
表1的体外药理实验表明，化合物M286和M410对多种肿瘤细胞株，包括人口腔上皮癌KB-3-1，人胃腺癌MGC803，宫颈癌HeLa，乳腺癌MCF-7，肝癌HepG2，结肠癌LoVo和白血病HL-60细胞株等，具有明显的生长抑制作用。
                                          表1
  KB-3-1   MGC803   HeLa   MCF-7   HepG2   LoVo   HL-60
  CA4*VCR*M286M410   3.8±0.99.5±3.447.3±4.54.3±6.   10.5±6.511.4±2.647.2±1.2414.1±46.9   ＞500＞100＞1000＞1000   3.8±0.667.2±29.54.3±8.257.7±6.0   3.7±0.2＞5022.2±2.43.0±2.   2.8±0.150.9±15.11.6±0.639.0±3.2   1.2±0.74.6±0.33.8±2.114.3±5.
*CA4，VCR为阳性对照，IC50为半数抑制浓度(IC50，nM)
实施例2：Combretastatin A4类似物M410体外抑制微管蛋白聚合活性实验
微管蛋白溶液在0～4℃是无色透明溶液，在37℃保温时，微管蛋白聚合成微管，溶液在340nm的吸光度(OD值)上升，并在一定时间内达到坪值。根据测得的OD值对保温时间作图，可以绘制出特征性的“S”型聚合曲线。干扰微管聚合的药物可以使曲线形态发生改变，曲线坪值也随之发生改变。
用General Tubulin Buffer将纯化的牛脑微管蛋白粉末溶解为10mg/mL的储备液并置冰浴；用General Tubulin Buffer稀释微管蛋白储备液至2mg/mL，加入GTP至1mM，加入甘油至10％，将此混合液迅速加入冰上预冷的比色杯中，在紫外分光光度计340nm下调定零点；将比色杯用37℃恒温水浴保温，每6min测定一次OD值，连续测定60min，直到OD值无明显上升为止；以时间(min)为横坐标，OD值(OD340nm)为纵坐标，绘制微管蛋白聚合曲线，即对照组曲线；配制相同的含1mM GTP和10％甘油的微管蛋白溶液，分别加入待检测化合物(M410至8μM，Taxol至8μM，Colchicine至8μM)，重复上述测定过程；分别绘制聚合曲线，实验重复3次，结果见图1。这说明化合物M410对微管蛋白聚合有明显抑制作用。
实施例3：Combretastatin A4类似物M410在裸鼠体内抑制人结肠癌(LoVo)生长实验
取对数生长期的LoVo细胞1×107/mL接种于裸鼠右腋下，每只小鼠0.2mL。一旦肿瘤长成200～300mm3，根据肿瘤大小将小鼠随机分成5组。第1组为生理盐水对照组，第2组为CA4P组(25mg/kg)，第3组为DDP组(1mg/kg)，第4组为M410组(25mg/kg)，第5组为DDP(1mg/kg)与M410(25mg/kg)联合应用组(M410用于DDP之后1小时)。每3～4天腹腔给药1次，共4次。每3～4天用游标尺测量肿瘤大小及称小鼠体重，肿瘤体积(Tumor Volume，mm3)按照(L×S×S)/2计算，其中L(mm)代表肿瘤长径，S(mm)代表肿瘤短径。给药后第20天处死小鼠，取肿瘤称重，计算肿瘤抑制率IR(IR＝1-T/C)，其中T，C分别代表用药组和对照组肿瘤平均重量。实验结果采用t检验分析，P＜0.05认为有显著性差异。结果见图2，表2。表明化合物M410体内能抑制结肠癌的生长，25mg/kg的肿瘤抑制率为44.3％(P＜0.01)。
                                           表2
组   动物数量   体重 肿瘤重量 脾重量   肿瘤抑制率
  前   后   前   后
  ControlCA4P 25mg/kgDDP 1mg/kgM410 25mg/kgDDP+M410   788810   77788   21.6±0.921.3±0.921.8±2.921.4±0.922.0±2.4   24.8±1.722.2±2.418.7±4.023.4±3.020.5±4.9   1.06±0.300.61±0.100.32±0.280.59±0.240.29±0.23   0.18±0.050.23±0.100.17±0.140.29±0.110.17±0.12 42.1％69.8％44.3％72.6％
实施例4：Combretastatin A4类似物M410在裸鼠体内抑制人肝癌(HepG2)生长实验
取对数生长期的HepG2细胞1×107/mL接种于裸鼠右腋下，每只小鼠0.2mL。一旦肿瘤长成100～200mm3，根据肿瘤大小将小鼠随机分成5组。第1组为生理盐水对照组，第2组为CA4P组(25mg/kg)，第3组为M410组(50mg/kg)，第4组为5-Fu组(25mg/kg)，第5组为5-Fu(25mg/kg)与M410(50mg/kg)联合应用组(M410用于5-Fu之后1小时)。每3～4天瘤内注射给药1次，共7次。每3～4天用游标尺测量肿瘤大小及称小鼠体重，肿瘤体积(Tumor Volume，mm3)按照(L×S×S)/2计算，其中L(mm)代表肿瘤长径，S(mm)代表肿瘤短径。给药后第24天处死小鼠，取肿瘤称重，计算肿瘤抑制率IR(IR＝1-T/C)，其中T，C分别代表用药组和对照组肿瘤平均重量。实验结果采用t检验分析，P＜0.05认为有显著性差异。结果见图3，表3。表明化合物M410体内能抑制肝癌的生长，50mg/kg的肿瘤抑制率为61.9％(P＜0.01)；5-Fu与M410联合应用组的肿瘤抑制率为61.9％，与单用5-Fu组(27.6％)相比有统计学差异(P＜0.01)。
                                     表3
组   动物数量   身体重量 肿瘤重量   肿瘤抑制率
  前   后   前   后
  ControlCA4P 25mg/kgM410 50mg/kg5-Fu 25mg/kg5-Fu+M410   910101010   9910810   22.2±1.122.3±1.523.0±1.122.6±1.323.5±1.3   25.1±2.224.9±1.524.7±1.625.4±2.023.6±2.3   1.05±0.550.71±0.260.40±0.210.76±0.320.40±0.30 32.4％61.9％27.6％61.9％

Claims (1)

1.结构类似Combretastatin A4的化合物在制备用于抑制微管蛋白聚合或抗肿瘤药物中的应用，所述结构类似Combretastatin A4的化合物的结构如通式(I)所示：
其中，R为-OH或-OPO(ONa)2。
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