CN101072881B - 细胞的评价方法和细胞测定用系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可迅速并以高可靠度进行细胞在细胞周期中的阶段的判断的细胞的评价方法。其中，具有：取得反映细胞内的染色体状态的图像的工序，和根据上述图像，计算与染色体状态相应的参数，根据上述计算结果，判断上述细胞在细胞周期中的阶段的工序。

Description

细胞的评价方法和细胞测定用系统
技术领域
本发明涉及细胞的评价方法、细胞测定用系统和细胞测定用程序。
背景技术
细胞活性的评价不仅有益于阐明细胞的生物、生化学现象和性质，而且作为化学物质的生理活性、毒性的研究方法也很有效，因此进行了活性评价的方法的研究。
一般的细胞活性的评价方法有：用吸光光度计测定锥虫蓝、中性红等色素进入细胞内的量，根据测定结果，评价细胞活性的方法；对由活性漏出到细胞外的脱氢酶等酶的量进行定量，根据定量结果，评价细胞活性的方法；向细胞悬浊液中插入电极，给电极施加一定的电位，测定来自细胞电运动的电流值，根据测定结果，评价细胞活性的方法等。
但是，由于这些方法均是间接测定细胞活性，根据相关测定结果评价细胞活性的方法，因此，在细胞活性变化微小的情况下，难以进行检测。并且，难以得知在细胞周期的哪个阶段受影响最大等细胞活性与细胞的生物学信息之间的关系。
作为解决这些问题的方法有观察细胞或细胞内小器官的形态变化的方法。细胞的形态在细胞分裂期发生变化，此时，尤其是作为细胞内小器官的染色体的凝缩状态发生很大变化，引发染色体的分离·分配。已知，染色体的分离·分配对于细胞分裂而言是必需的，细胞活性的变化对分裂期的染色体分离有影响。因此，根据染色体的形态变化状态的观察结果，可评价细胞活性。观察染色体形态变化的方法已知有使用荧光色素使染色体可见，追踪染色体的形态变化的方法(参照专利文献1)。
专利文献1：日本特开平8-136536号公报
专利文献1的方法是对处于细胞分裂期的细胞数目进行计数，将其相对于总数的百分比与对照组比较，由此判断药效的方法。此时，使用染色体的荧光图像判断细胞是否处于分裂期，但是由于采用肉眼判断，因此，不仅缺乏可靠性，而且难以做出迅速判断。另外，尽管在专利文献1的实施例1中对分裂细胞的分裂阶段也进行了判断，但是，不仅采用目测难以进行进一步详细阶段的判断，而且不得不说还缺乏可靠性。
并且，在上述专利文献1的方法中，荧光色素使用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚·二盐酸，对作为染色体组成要素的DNA进行染色，使染色体可见，但在通常的应用浓度下使用该荧光色素会使细胞死亡。一旦细胞死亡，尽管可观察到使用荧光色素时死亡状态下的细胞中的染色体的形态，但是却无法继续观察活细胞中染色体的形态变化。另外，使用荧光色素进行染色的染色体的荧光强度每当细胞分裂即减半，达到检测极限以下的荧光强度，因此，无法长时间持续观察。另外，在专利文献1的方法中，记载了通过跟踪细胞在分裂期的形态变化，可检测抗痛剂的药效的内容，但它是通过计数处于细胞分裂期的细胞数目，将相对于所有细胞的百分比作为对照组判断药效的方案，因此，考虑到一般分裂期的细胞的比率为所有细胞的4％以下，该方案是仅在分裂期整体受影响之类的具有较大效果时才可能实现检测的方法，而在毒物试验、环境激素试验等仅有极少量影响的情况下难以检测。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种用于解决上述问题，能迅速地并以高可靠性进行对细胞在细胞周期中的阶段判断的方法。本发明目的还在于，提供一种可在不使细胞死亡的存活状态下进行阶段判断的方法。并且，本发明目的还在于，提供自动判断上述细胞的阶段判断的细胞测定用系统，以及在计算机上运行细胞的阶段判断的细胞测定用程序。
本发明涉及一种细胞的评价方法，具有：(a)取得反映细胞内的染色体状态的图像的工序，和(b)根据上述图像，计算与染色体状态相应的参数，根据上述计算结果，判断上述细胞在细胞周期中的阶段的工序。
上述参数优选包括染色体的圆形度、染色体的圆度、染色体的长轴与短轴的长度之比、染色体的正圆度、染色体的费莱特直径(Feret)、染色体和与其邻近的染色体的重心之间的距离、染色体长轴和与其邻近的核染色体的长轴之间的角度，或其中的多项。本说明书所述的染色体如无特别声明，是指染色体组。并且，处于细胞分裂间歇期的染色体组也被称为“核”，本说明书所述的染色体也包括该“核”。
上述细胞的评价方法的优选实施方式之一具有(c)在上述工序(a)之前，在上述细胞内表达染色体蛋白质与发出荧光的蛋白质的融合体的工序。在此情况下，上述工序(a)中的上述图像为来自上述细胞发出的荧光的荧光图像。采用该方法，可在细胞没有死亡的情况下，取得来自染色体状态的荧光图像。
在上述细胞的评价方法中，也可以还具有(d)根据上述工序(b)的判断结果，评价上述细胞的活性度的工序。
在上述细胞的评价方法的实施方式之一中，在上述工序(a)中，取得与试样中的多个细胞对应的图像，在上述工序(b)中，针对多个细胞分别判断上述阶段，在上述工序(d)中，计算处于各阶段的细胞数的比例，根据上述计算结果，评价细胞活性度。
此外，在上述细胞的评价方法的实施方式之一中，在上述工序(a)中，每隔规定的时间间隔，取得与特定细胞对应的图像，在上述工序(b)中，判断特定细胞每隔规定的时间间隔的阶段，在上述工序(d)中，根据特定细胞的阶段变化相对于时间变化的信息，评价细胞活性度。
此外，本发明还涉及一种细胞测定用系统，其具有：检测反映细胞内染色体状态的荧光的荧光检测装置；取得来自上述荧光检测装置检测出的荧光的荧光图像的摄像装置；根据由上述摄像装置取得的荧光图像，计算与染色体状态相应的参数，根据上述计算结果，判断上述细胞在细胞周期中的阶段的图像解析装置。
在上述细胞测定用系统的实施方式之一中，上述荧光检测装置对来自试样中多个细胞的荧光同时进行检测，上述摄像装置取得含有试样中多个细胞发出的荧光的信息的荧光图像，上述图像解析装置根据由上述摄像装置取得的荧光图像分隔出与各细胞对应的荧光图像，判断各细胞在细胞周期中的阶段。
在上述细胞测定用系统的实施方式之一中，上述摄像装置每隔规定的时间间隔，取得与特定细胞相应的荧光图像，上述图像解析装置，判断特定细胞的细胞每隔规定的时间间隔在细胞周期中的阶段。
此外，本发明涉及细胞测定用程序，该程序在计算机上进行下述操作顺序：检测反映细胞内的染色体的状态的细胞发出的荧光，以荧光图像取得上述荧光，根据上述荧光图像，计算与染色体状态相应的参数，根据上述计算结果，判断上述细胞在细胞周期中的阶段。此外，本发明还涉及存储有上述细胞测定用程序的计算机可读取存储介质。
采用本发明，由于根据与染色体状态相应的参数对细胞进行评价，因此，可迅速、简便并能以高可靠性进行评价。并且，由于可得到与细胞分裂期阶段相关的信息，因此，即使在对分裂期整体没有影响的微小变化下，仍可以进行检测。同样，即使在低浓度下，也可以评价阻碍物质对细胞活性的影响。
根据权利要求3所述的发明，则可以在不从细胞外部引入可能对细胞生死有影响的化合物的情况下取得细胞的荧光图像。即不是对死亡的细胞，而是可以对活细胞的活性进行评价。
此外，根据本发明的细胞测定用系统和细胞测定用程序，可简便判断活细胞的细胞周期的阶段，该判断结果有益于评价细胞的活性度。
附图说明
图1为HeLa细胞在细胞周期各阶段中的荧光显微镜图像的示意图。
图2为实施例中细胞测定用系统的电结构的示意框图。
图3为实施例中细胞测定用系统的外观结构的一例示意图。
图4为实施例中细胞测定用系统的处理顺序示意图。
图5为实施例中细胞测定用系统中的阶段判断的处理顺序示意图。
图6为实施例中阶段判断结果显示的一例示意图。
图7为实施例的细胞测定用系统中阶段判断的其它处理顺序的示意图。
图8为实验中时移(time lapse)解析结果示意图。
符号说明
1、1a细胞测定用系统；2荧光检测装置；2a荧光显微镜；3摄像装置；3a：摄像机；4：图像解析装置；4a：个人计算机；5：输出装置；5a：监视器；6：输入装置；6a：键盘；6b：鼠标；7：辅助存储装置；8：程序存储介质；41：控制部；42：存储部
具体实施方式
下面，参照附图，说明本发明的实施方式。
本发明的细胞评价方法是取得反映细胞内的染色体状态的图像，根据上述图像，计算与染色体状态相应的参数，根据上述计算结果，判断上述细胞在细胞周期中的阶段的细胞的评价方法。根据该评价，可进行细胞活性的评价。
取得反映细胞内染色体状态的图像的方法可采用公知的各种方法，优选方法之一可举出在上述细胞内表达染色体蛋白质和发出荧光的蛋白质的融合体，以荧光图像取得上述细胞发出的荧光的方法。根据该方法，无需从细胞外部引入有可能使细胞遭受毒性的化合物，易于将活细胞用作评价对象。下面，对采用本发明的情况进行说明。
作为评价对象的细胞是即使引入荧光蛋白质，也不会死亡，具有细胞分裂活性，上述融合体正常存在于染色体上的局部的细胞。本发明方法用于例如对HeLa细胞等人体子宫颈癌细胞、CHO细胞等中国仓鼠卵巢纤维芽细胞、BY-2细胞等烟草悬浊培养细胞、Hep细胞等来自人体喉癌的细胞等的评价。
作为上述染色体蛋白质，示为在细胞分裂期，在染色体局部存在的蛋白质，通过荧光蛋白质的加成，形成上述局部分布无变化的染色体蛋白质。例如，优选使用组蛋白、凝集蛋白(condensin)、拓扑异构酶(topoisomerase)。
上述荧光蛋白质可举出绿色荧光蛋白质(GFP)、黄色荧光蛋白质(YFP)、红色荧光蛋白质(dsRed)及其突变体等。
表达染色体蛋白质与荧光蛋白质的融合体的细胞的构建方法可举出公知的方法。
由于染色体由DNA和染色体蛋白质构建，因此，由DNA的荧光图像，可得到与染色体凝集度、形态变化等相关的信息。另一方面，尽管直接观察染色体蛋白质比较困难，但如本实施方式所示，利用与染色体蛋白质融合的荧光蛋白质的荧光图像，与DNA的荧光图像相同，可得到与染色体凝集度、形态变化等相关的信息。下述说明为阐明该内容的实施例。
图1为HeLa细胞在细胞周期各阶段中的荧光显微镜图像示意图。在本说明书中，细胞周期分为间歇期和分裂期，且分裂期又进一步分为前期、前中期、中期、后期、终期等阶段。在图1中，表示的是间歇期、前中期、中期、后期的荧光显微镜图像。在取得图1的荧光显微镜图像的实验中，在细胞内表达GFP-组蛋白H1融合体，同时，用Hoechst(Hoechst33342)对细胞内的DNA进行染色。图1(a)为激发Hoechst，通过与Hoechst的荧光波长相应的滤光器取得的荧光显微镜图像，即DNA的荧光显微镜图像。图1(b)为激发GFP，通过与GFP的荧光波长相应的滤光器取得的荧光显微镜图像。图1(c)为将图1(a)的荧光显微镜图像与图1(b)的荧光显微镜图像重合的荧光显微镜图像。由此可知，图1(a)的荧光显微镜图像与图1(b)的荧光显微镜图像基本一致。即，由于染色体由DNA和染色体蛋白质构建，因此，通过得到DNA的荧光显微镜图像，可以知晓染色体的凝集度、形态变化等，而通过GFP的荧光显微镜图像，也可以知晓染色体的凝集度、形态变化等。
此外，染色体凝集度和形态变化的信息在判断细胞在细胞周期中的阶段方面很有用。本发明人等认为，通过将染色体的凝集度、形态变化等染色体的状态相关信息数值化得到结果，可简便、迅速、准确地实施细胞在细胞周期中的阶段的判断，探索了与染色体的状态相应的各种参数，研究了有益于判断细胞在细胞分裂中的阶段的参数。研究结果发现，染色体的圆形度、染色体的圆度、染色体和与其邻近的染色体的重心之间的距离、染色体长轴和与其邻近的染色体的长轴之间的角度、染色体的长轴与短轴之比、染色体的正圆度、以及染色体的费莱特直径可用作有效的参数。另外，还可知，通过选择适当的参数，将其组合，用作判断材料，可得到更详细的染色体状态的相关信息。
在下述实施例中，将这些参数中的多个用作判断材料，判断细胞在细胞周期中的阶段。然而，也不限于基于这些参数的判断。在本实施方式中，在计算与染色体相关的各参数时，以染色体组的轮廓为外周的图形被认为是与染色体相应的图形。即，以染色体组的轮廓为外周的图形的圆形度、圆度等被认为是染色体的圆形度、圆度等。
本说明书所述染色体的圆形度是指用面积的4π倍值除以外周长的2次方的商值。染色体的圆度是指用面积的4倍值除以长轴长度的0.5次方的π倍值的商值。邻近的染色体是指与作为对象的染色体的重心间距离最小的染色体。染色体的长轴与邻近的染色体的长轴的角度是指假定与各自染色体的图形最相近的椭圆，计算出的长轴间的最小角度。染色体的长轴与短轴之比为假定与染色体的图形最相近的椭圆，计算出的长轴与短轴之比。染色体的正圆度是指与理想的正圆的偏差值，当用两个同心圆夹持时，相对于使同心圆的半径之差最小的中心测定的最大半径与最小半径之差。染色体的费莱特直径是指假定染色体的图形外周上的两个点，使两点间的距离最大的长度。
然后，根据细胞在细胞周期中的阶段的判断结果，对评价细胞的活性度的本发明中的方法的具体例进行说明。例如，可举出以同一试样内所含多个细胞为对象，判断各细胞在细胞周期中的阶段，求取相对于全体细胞数的处于各阶段的细胞数的比例(下文称为“计数模式”)，根据该比例评价细胞活性度的方法；检测特定的细胞(既可以是单数，也可以是复数)相对于时间变化的阶段转移的状态(下文也称为“时移模式”)，根据上述检测结果，评价细胞活性度的方法。也可将多种方法组合使用。这些方法种的任一种方法也可通过与对照数据的比较评价细胞的活性度。例如，对为了检测细胞对试剂的响应性，适用本发明的细胞的活性评价方法的情况进行说明。在利用计数模式的情况下，求取与试剂接触的细胞相关，相对于总体的细胞数，处于各阶段的细胞的数目的比例，制作根据该比例的细胞分布图，与未经与试剂接触的细胞相关的细胞分布图比较。可知，在细胞分布图产生有效差的情况下，因试剂使细胞受到何种影响。例如，可知，在处于间隔期的细胞比例增大，处于分裂期的细胞的比例减小的情况下，细胞的细胞分裂活性降低。
上述细胞在细胞周期中的阶段的判断工序、随后的细胞的活性度的评价工序既可以利用自动实施的装置进行，也可以由观察者目测进行。在下述实施例中，表示用自动细胞测定用系统进行细胞在细胞周期中的阶段的判断，然后由观察者目测进行此后的细胞活性度的评价工序的情况。
实施例
[自动细胞测定用系统]
下面，对本实施例的细胞测定用系统进行说明。
图2为本实施例中细胞测定用系统1的电结构的示意框图。本实施例的细胞测定用系统1具有检测荧光的荧光检测装置2、对来自荧光检测装置2检测出的荧光的荧光图像进行摄影的摄影装置3、对用摄影装置3摄影的荧光图像进行解析的图像解析装置4、输出图像解析装置4的解析结果的输出装置5、和用于实施各种操作的输入装置6。图像解析装置4具备控制部41和存储部42，用于实施后述处理的细胞阶段判断程序存储在存储部42中，用控制部41根据该程序进行图像解析等，同时对各装置进行控制。
图3为图2所示的细胞测定用系统的外观结构的一例示意图。图3的细胞测定用系统1a具有检测荧光的荧光显微镜2a、对荧光检测装置2a检测出的荧光以荧光图像进行摄影的摄像机3a、对用摄像机3a摄影的荧光图像进行解析的个人计算机(下文称为PC)4a、输出PC4a的解析结果的监视器5a、用于实施各种操作的键盘6a和鼠标6b。在细胞周期的阶段判断时，将试样载置于荧光显微镜2a的载置台上。
作为细胞测定用系统1中的荧光检测装置2，只要是可检测由试样发出的荧光强度的装置即可，优选使用荧光显微镜2a，另外也可使用荧光扫描仪。摄影装置3可使用例如将来自荧光检测装置2的图像信号摄成二维黑白图像的摄像机3a。图像解析装置4包括可实时处理每隔规定间隔的摄影画面的图像处理电路，以及包括CPU、ROM、RAM和I/O接口的微型计算机。图像解析装置4也可由例如PC4a构成。图像解析装置4的存储部42包括ROM、RAM等，存储有解析用程序，也可利用作为机械读取/写入程序存储介质8的装置(Floppy(注册商标)软盘驱动器、CD-ROM驱动器)的存储介质装置7，将在Floppy(注册商标)软盘或CD-ROM等的程序存储介质8中存储的解析用程序读入存储部42。输出装置5可使用例如在CRT或液晶显示器等上显示的监视器5a，或激光打印机等打印在纸上的打印装置。输入装置6可使用键盘6a或鼠标6b等。
图4为细胞测定用系统1的处理顺序示意图。并且，在细胞测定用系统1中的控制开始之前，操作人员可使用输入装置6选择时移模式、计数模式中的任一种模式。并且，在已选择时移模式的情况下，输入追踪时间。将试样装配在荧光检测装置2上。首先，在步骤S1中，对来自荧光检测装置2检测出的荧光的荧光图像进行摄像，将该荧光图像作为图像数据引入。然后在步骤S2中，实施由图像数据分隔出细胞图像，将分隔出的细胞图像储存在图像解析装置4的存储部42的图像存储器中。通常，一份试样中含有多个细胞，但在该步骤S2中，对各细胞从No.1开始依次赋予其识别编号，将分隔出的各细胞图像与识别编号相对应储存在图像存储器中。此时，也可对各细胞的染色体的重心进行推算，与识别编号相应，将重心位置储存在图像存储器中。至于处于细胞分裂期的后期及终期的细胞，一个细胞内存在有两条染色体图像，在这种情况下，对与各染色体图像相应的重心进行推算，储存在图像存储器中。另外，当两条染色体图像的重心间距离小于规定值时，该两条染色体图像进行判断为来自一个细胞的处理，也可根据该判断，实施细胞图像的分隔。在下述步骤S3中，实施各细胞的阶段判断。
图5为步骤S3中各细胞的阶段判断的具体处理顺序的示意图。另外，图5表示作为表达GFP-组蛋白H1融合体的细胞情况下的控制顺序。细胞测定用系统1的优选实施方式是根据细胞的种类，选择各参数作为判断基准的数值。如图5所示，一旦开始阶段判断，首先根据识别编号No.1的细胞图像对识别编号No.1的细胞进行下述处理。
首先，在步骤S101中计算圆形度。然后，在步骤S102中，判断圆形度是否在0.8以下，而在判断为否(NO)的情况下，在步骤S112中，判断细胞的阶段为间歇期。作为步骤S101中的圆形度的基准值，在本例中采用0.8，可优选使用0.60～0.99范围内的数值。圆形度在0.8以下的情况下(YES)，在步骤S103中，计算染色体和与其邻近的染色体的重心间的距离。邻近的染色体既有为在同一细胞内的染色体的情况，也有为不同细胞的染色体的情况。然后，在步骤S104中，判断步骤S103中计算的染色体的重心间的距离是否在基准值以上。在步骤S104中判断不在基准值以上的情况下(NO)，进展到步骤S107。在步骤S104中的基准值根据使用的每个细胞而定。例如，在使用HeLa细胞的情况下，优选使用15～21μm范围内的值，特别优选为18μm作为基准值；而在使用CHO细胞的情况下，优选使用14～20μm范围内的值，特别优选为17μm作为基准值；在使用BY-2细胞的情况下，优选使用17～23μm范围内的值，特别优选为20μm作为基准值。另一方面，在步骤S103中计算的重心间的距离在基准值以上的情况下(YES)，在步骤S105中，计算染色体的长轴和与其邻近的染色体的长轴之间的角度。
在步骤S106中判断在S105中计算的角度是否在20度以上，在否的情况下(NO)，进展到步骤S107。另一方面，在S105中计算的角度在20度以上的情况下(YES)，进展到步骤S109。在步骤S107中，计算染色体的圆度。在步骤S108中，进一步判断圆度是否在0.5以上。在圆度为0.5以上的情况下(YES)，在步骤S115中，判断细胞阶段为终期。在圆度不在0.5以上的情况下(NO)，在步骤S114中，判断细胞阶段为后期。
在步骤S109中，计算染色体的长轴与短轴之比(长轴/短轴)，在步骤S110中，判断长轴/短轴是否在1.5以上，在否的情况下(NO)，在步骤S116中判断细胞的阶段为前期。在长轴/短轴为1.5以上的情况下(YES)，在步骤S111中计算染色体的圆度，在步骤S112中判断圆度是否在0.5以上。在圆度不在0.5以上的情况下(NO)，在步骤S117中，判断细胞阶段为中期。在圆度为0.5以上的情况下(YES)，在步骤S118中判断细胞阶段为前中期。
用步骤S113、S114、S115、S116、S117、S118中的任一步骤判断细胞的阶段之后，在步骤S119中，将判断结果与细胞的识别编号对应，存储在存储部42中，进展到步骤S120。在步骤S120中，判断是否完成了对所有细胞图像的判断，在未完成的情况下(NO)，再次回到步骤S101，对下一个识别编号的细胞实施同上所述的处理。在完成了对所有细胞图像的判断的情况下(YES)，结束阶段判断的处理。另外，在步骤S107中，对处于后期或终期的细胞计算染色体的圆度，因此，通常一个细胞图像中，包括两条染色体图像，其中，圆度既可以是两个染色体图像的平均值，也可以是基于一个染色体图像的值。在步骤S101中一个细胞图像中包括两条染色体图像的情况也同上所述。
回到图4，在步骤S3中，完成阶段判断之后，在步骤S4中显示判断结果。并且，在作为输出装置5使用监视器5a的情况下，如步骤S4所示，判断结果显示在监视器上，而在输出装置5使用打印装置的情况下，打印判断结果。图6为步骤S4中判断结果显示的一例的示意图。在图6中，处于各阶段的细胞的比例用饼图表示。由于在步骤S3中，完成对所有细胞的阶段判断，因此，根据该阶段判断的结果，如图6所示，可用饼图表示处于各阶段的细胞数的比例。
然后，在步骤S5中，由操作者判断设定的模式是时移模式还是计数模式，在计数模式的情况下，完成处理。另一方面，在时移模式的情况下，在步骤S6中，判断是否经过了设定的追踪时间。在未经过的情况下(NO)，回到步骤S1，实施同样的处理。另外，在步骤S1中的摄像设定为每隔规定时间实施一次，例如设定为一秒实施一次。在步骤S6中，判断经过了设定时间的情况下(YES)，进展到S7，对所有细胞实施时移解析。然后，根据时移解析结果，判断经过了分裂期的所有工序的细胞，仅对这些细胞在步骤S8中显示分裂期部分的时移解析结果。并且，在步骤S8中，显示的是这些细胞时移解析结果的平均值。
在图4的处理中，在计数模式的情况下，通过将步骤S4中显示的判断结果与作为对照的细胞的数据比较，可由操作者肉眼判断对象的活性程度(例如，对象是否呈活性)。另外，在图像解析装置4中，可自动实施与对照物的比较，自动判断活性的程度。
在图4的处理中，在时效模式的情况下，通过将步骤S8中显示的判断结果与作为对照的细胞的数据比较，可由操作者肉眼判断对象的活性程度(例如，对象是否呈活性)。另外，在图像解析装置4中，可自动实施与对照物的比较，自动判断活性的程度。另外，在时效模式中，也可与上述计数模式同样，根据步骤S4中显示的判断结果，判断对象的活性度。
下面，对图4的流程图的步骤S3中的处理与按照图5所示流程图的处理的不同之处的实施例进行说明。在本实施例中，仅步骤S3中的处理与上述例不同，其它部分可共用，省略对可共用部分的说明。
图7为图4的流程图的步骤S3中的各细胞阶段判断的本实施例中的具体处理顺序的示意图。另外，图7表示评价对象的细胞为HeLa细胞时的控制顺序。如图7所示，一旦开始阶段判断，首先根据识别编号No.1的细胞图像对识别编号No.1的细胞进行下述处理。在步骤S201中计算正圆度。然后，在步骤S202中，判断正圆度是否在0.875以下，而在判断为否(NO)的情况下，在步骤S212中，判断细胞的阶段为间歇期。在正圆度在0.875以下的情况下(YES)，在步骤S203中，计算染色体和与其邻近的染色体的重心间的距离。然后，在步骤S204中，判断步骤S203中计算的染色体的重心间的距离是否在17μm以上。在判断为否的情况下(NO)，进展到步骤S207。另一方面，在步骤S203中计算的重心间的距离在17μm以上的情况下(YES)，在步骤S205中，计算染色体的长轴和与其邻近的染色体的长轴之间的角度。然后，在步骤S206中判断在S205中计算的角度是否在20度以上，在否的情况下(NO)，进展到步骤S207。另一方面，在S205中计算的角度在20度以上的情况下(YES)，进展到步骤S208。
在步骤S207中，判断步骤S203中计算的重心间的距离是否在12μm以上。在重心间的距离在12μm以上的情况下(YES)，在步骤S214中判断细胞的阶段为终期。分裂期染色体重心间的距离并非在12μm以上时(NO)，在步骤S213中，判断细胞的阶段为后期。在步骤S208中，计算染色体的长轴与短轴之比(长轴/短轴)，在步骤S209中，判断长轴/短轴是否在2.3以下，在否的情况下(NO)，在步骤S215中判断细胞的阶段为中期。在长轴/短轴为2.3以下的情况下(YES)，在步骤S210中计算染色体的费莱特直径，在步骤S211中判断费莱特直径是否在17μm以上。在费莱特直径不在17μm以上的情况下(NO)，在步骤S216中，判断细胞阶段为前期。在费莱特直径在17μm以上的情况下(YES)，在步骤S217中判断细胞阶段为前中期。用步骤S212、S213、S214、S215、S216、S217中的任一步骤判断细胞的阶段之后，在步骤S218中，将判断结果与细胞的识别编号对应，存储在存储部42中，进展到步骤S219。在步骤S219中，判断是否完成了对所有细胞图像的判断，在未完成的情况下(NO)，再次回到步骤S201，对下一个识别编号的细胞实施同上所述的处理。在完成了对所有细胞图像的判断的情况下(YES)，结束阶段判断的处理。另外，在步骤S201中，一个细胞图像中包括两条染色体图像，在此情况下，既可以是两个染色体图像的平均值，也可以是基于一个染色体图像的数据的值。
[实验]
1.GFP-组蛋白H1表达HeLa细胞的构建
染色体由DNA和染色体蛋白质构成，在本实施例中，作为主要的染色体蛋白质的组蛋白H1与作为荧光蛋白质的GFP融合，选择使活细胞中的染色体可见性几乎在所有的组织中均稳态表现(Meergans et al.，1997)的组蛋白H1.2。
利用PCR，由人体基因组获得组蛋白H1.2基因，在pUC18进行亚克隆之后，经过利用受限酶处理的分隔，实施向作为对动物细胞中GFP融合蛋白质表达载体的pEGFP-C1(Clontech公司)的克隆。
用Lipofectamine(Invitrogen公司)将构建的载体引入HeLa细胞。进行利用抗生物质G418(最终浓度800mg/mL)的转化体的选择。选出的克隆因确认了即使进行4次继承(每次稀释到1/10浓度)也可在所有细胞中表达融合蛋白质，由此判断稳态表达GFP-组蛋白H1融合蛋白质的克隆。另外，确认本克隆即使在实施了液态氮中的冷冻保藏、融解之后，也能维持着融合基因的表达能力。
2.用染色体结构变化识别法进行细胞活性评价
对GFP-组蛋白H1表达HeLa细胞，利用上述细胞测定用系统内图4中的步骤S3的阶段判断采用了图7所示流程图的系统，在时移模式下进行测定。图8表示图4的步骤S8中的平均值的时移解析结果。图8(a)表示对照的时移解析结果，图8(b)表示添加中期抑制剂Nocodazol，使其最终浓度为15ng/ml的目标的时移解析结果，图8(c)表示添加中期抑制剂Nocodazol，使其最终浓度为150ng/ml的目标的时移解析结果。另外，在图8(a)～(c)中，横轴表示时间，P1表示间歇期、P2表示前期、P3表示前中期、P4表示中期、P5表示后期、P6表示终期。由图8(c)可知，以最终浓度为150ng/ml添加中期抑制剂Nocodazol，则在前中期下呈细胞分裂停止的状态。且由图8(b)可知，以最终浓度为15ng/ml添加中期抑制剂Nocodazol，则在前中期发生延迟。这样，显示出以处于细胞分裂期的特定的阶段的时间的变化捕捉细胞活性的降低，可评价在现有的固定细胞的细胞活性评价法中未能检测出的对低浓度下的抑制物质的细胞活性的影响。
产业实用性
本发明的细胞的评价方法、细胞测定用系统、以及细胞测定用程序在毒物试验、环境激素试验、药品响应性试验等方面十分有效。

Claims (8)

1.一种细胞的评价方法，其特征在于，具有(a)取得反映细胞内的染色体状态的图像的工序，和(b)根据所述图像，计算与染色体状态相应的参数，根据所述计算结果，判断所述细胞在细胞周期中的阶段的工序，
所述参数包括染色体的圆形度、染色体的圆度、染色体的长轴与短轴的长度之比、染色体的正圆度、染色体的费莱特直径、染色体和与其邻近的染色体的重心之间的距离、染色体长轴和与其邻近的染色体的长轴之间的角度，或其中的多个。
2.如权利要求1所述的细胞的评价方法，其特征在于，具有(c)在所述工序(a)之前，在所述细胞内表达染色体蛋白质与发出荧光的蛋白质的融合体的工序，
在所述工序(a)中，所述图像为来自所述细胞发出的荧光的荧光图像。
3.如权利要求1或2所述的细胞的评价方法，其特征在于，还具有(d)根据所述工序(b)的判断结果，评价所述细胞的活性度的工序。
4.如权利要求3所述的细胞的评价方法，其特征在于，
在所述工序(a)中，取得与试样中的多个细胞对应的图像，
在所述工序(b)中，针对多个细胞分别判断所述阶段，
在所述工序(d)中，计算处于各阶段的细胞数的比例，根据所述计算结果，评价细胞活性度。
5.如权利要求3所述的细胞的评价方法，其特征在于，
在所述工序(a)中，每隔规定的时间间隔，取得与特定细胞对应的图像，
在所述工序(b)中，判断特定细胞每隔规定的时间间隔的阶段，
在所述工序(d)中，根据特定细胞的阶段变化相对于时间变化的信息，评价细胞活性度。
6.一种细胞测定用系统，其特征在于，具备：检测反映细胞内染色体状态的荧光的荧光检测装置；取得来自所述荧光检测装置检测出的荧光的荧光图像的摄像装置；根据由所述摄像装置取得的荧光图像，计算与染色体状态相应的参数，根据所述计算结果，判断所述细胞在细胞周期中的阶段的图像解析装置，
所述参数包括染色体的圆形度、染色体的圆度、染色体的长轴与短轴的长度之比、染色体的正圆度、染色体的费莱特直径、染色体和与其邻近的染色体的重心之间的距离、染色体长轴和与其邻近的染色体的长轴之间的角度，或其中的多个。
7.如权利要求6所述的细胞测定用系统，其特征在于，
所述荧光检测装置对来自试样中多个细胞的荧光同时进行检测，
所述摄像装置取得含有试样中多个细胞发出的荧光的信息的荧光图像，
所述图像解析装置根据由所述摄像装置取得的荧光图像分隔出与各细胞对应的荧光图像，判断各细胞在细胞周期中的阶段。
8.如权利要求6所述的细胞测定用系统，其特征在于，
所述摄像装置每隔规定的时间间隔，取得与特定细胞相应的荧光图像，所述图像解析装置判断特定细胞每隔规定的时间间隔的阶段。
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